CN113151023B - 一种增香型直投式发酵剂及其制备方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及发酵食品加工技术领域。尤其是一种增香型直投式发酵剂的制备方法及其应用，所述增香型直投式发酵剂由酿酒酵母冻干粉与东方萨伊酵母冻干粉按照质量比1：(0.5～3)复合而成。酿酒酵母于2020年12月03日保藏于“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”，保藏号为CGMCC 21289。本发明提供的增香型直投式发酵剂配制方便，可以达到显著增强产品酯类含量的目的，尤其是辛酸乙酯、癸酸乙酯、丙酸乙酯、棕榈酸乙酯、己酸乙酯和乙酸苯乙酯的含量，分别提高到1.5～3.5倍、1.2～2.8倍、1.0～3.8倍、1.2～2.1倍、1.5～2.5倍、1.3～2.7倍。
Description
技术领域
本发明涉及一种增香型直投式发酵剂的制备方法及其应用，属于发酵食品 加工技术领域。
背景技术
发酵是千百年来人们利用微生物对食品进行保藏的方法。它利用了微生物 的代谢，在增强其营养价值的同时，还赋予了食品独特的风味。在发酵过程中， 微生物除了能够将大分子物质分解为小分子氨基酸，增加营养外，还能够产生 独特的风味。大分子水解过程中形成小分子的风味肽、游离氨基酸，这些氨基 酸可以直接作为风味物质的前体物质，通过微生物催化脱氨、脱羧、转氨、氨 基酸侧链的裂解形成醛、酸、醇、酯等芳香成分。
传统发酵食品，如奶酪、豆瓣酱等，大多属于固态发酵，与现有较为发达 的液态发酵不同，其发酵过程中存在体系不均一，反应存在空间位阻等缺点， 发酵过程常常不可控，发酵产品质量不同。现有加工方式多为作坊式自然发酵， 受环境因素影响非常大。因此导致生产品质不稳定，生产效率低下，难以进行 标准化的控制等问题。选育具有特定风味生产的菌株以及开发方便易使用的直 投式发酵剂，能够大大提高产品的质量和稳定性，是对生产过程进行规范，实 现标准化生产的优选方案。
酯类物质是微生物在发酵过程中形成的重要的风味物质。由于具有较低的 气味阈值，在合适的浓度下，酯类化合物为整体风味贡献了令人愉悦的果香， 是发酵食品中的重要风味物质。例如，辛酸乙酯具有类似白兰地的香气，并有 甜味等，癸酸乙酯具有椰子香味，丙酸乙酯具有菠萝香味，棕榈酸乙酯具有奶 油香味，己酸乙酯具有水果香味，乙酸苯乙酯具有蜂蜜样和玫瑰样的香气等。 现大多数的研究仍集中于总酯类含量的提高，或者单一酯类，尤其是乙酸乙酯 含量的提高上。然而，还未有能够同时提高多种酯类物质的含量优良发酵剂。
发明内容
为解决缺少同时提高多种酯类含量的优质发酵剂的问题，本发明提供一种 增香型直投式发酵剂及其制备方法与应用，其技术方案如下：
一种增香型直投式发酵剂，其中所述发酵剂由酿酒酵母冻干粉和东方伊萨 酵母冻干粉按质量比1:(0.5～3)复合而成。
优选的是，本发明所述酿酒酵母为CGMCC 21289，为之前筛选出的具有产 酯特性的一种酿酒酵母，该酵母菌于2020年12月03日保藏于“中国微生物菌 种保藏管理委员会普通微生物中心”，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3 号，中国科学院微生物研究所。保藏号为CGMCC 21289，分类命名为酿酒酵母 菌(Saccharomyces cerevisiae)；所述东方伊萨酵母冻干粉包括为东方伊萨酵母 与东方伊萨酵母冷冻保护剂，所述东方伊萨酵母为CICC 31431，其特征是一种 耐高温生香酵母。
优选的是，所述酿酒酵母冻干粉及所述东方萨伊酵母菌冻干粉以质量比1: (0.5～3)进行混合，最终制成含有所述酿酒酵母和所述东方萨伊酵母的菌种浓 度为(1010～1012)CFU/g保护剂固形物的发酵剂。
优选的是，所述增香型直投式发酵剂的制备方法，其特征在于，包括以下 步骤：
S1、酿酒酵母菌体、东方萨伊酵母菌体的制备；
当制备酿酒酵母菌体时，其制备方法为：酿酒酵母菌株经过MRS琼脂平板 活化，MRS肉汤一级培养，获得OD600nm＝1.0～10.0的菌液，用无菌生理盐水洗 涤1～2次，离心搜集后，用适量无菌水悬浮，备用。
当制备东方萨伊酵母菌体时，其制备方法为：东方萨伊酵母菌株经过YPD 琼脂平板活化，YPD肉汤一级培养后，获得OD600nm＝1.0～10.0的菌液，用无菌 生理盐水洗涤1～2次，离心搜集后，用适量无菌水悬浮，备用。
S2、酿酒酵母冻干粉、东方萨伊酵母冻干粉的制备；
当制备酿酒酵母冻干粉时，其制备方法为所述S1步骤制备的酿酒酵母菌体 与酿酒酵母冷冻保护剂混合后，经过冷冻干燥，制成菌种浓度为(1010～1012)CFU/g 保护剂固形物的酿酒酵母冻干粉；
当制备东方萨伊酵母冻干粉时，其制备方法为所述S1步骤制备的东方萨伊 酵母菌体与东方萨伊酵母冷冻保护剂混合后，经过冷冻干燥，制成菌种浓度为 (1010～1012)CFU/g保护剂固形物的东方萨伊酵母冻干粉；
S3、增香型直投式发酵剂的制备：由S2步骤所述酿酒酵母冻干粉及所述东 方萨伊酵母冻干粉按质量比1:(0.5～3)的比例混合而成。
优选的是，所述酿酒酵母冷冻保护剂包括10～15％(w/w)蛋白胨、20～30％(w/w)菊粉、20～30％(w/w)海藻糖、5～10％(w/w)海葡萄多糖；所述东方萨伊酵母冷冻 保护剂包括25～35％(w/w)蛋白胨、20～30％(w/w)脱脂乳粉、10～20％(w/w)海藻糖、 5～10％(w/w)海葡萄多糖。
优选的是，所述增香型直投式发酵剂应用于发酵食品制作，尤其是固态发 酵食品，如酸鲊鱼、酸鲊辣椒、奶酪、豆瓣酱等的制作中。
酸鱼(即所述酸鲊鱼)的制作工艺包括以下步骤：将鲤鱼块与3％(w/w) 食盐和2％(w/w)白砂糖搅拌均匀，放置在4℃的冰箱中腌制48h后，再恒 温恒湿(50℃、65％湿度)干燥3h。期间，将添加3％(w/w)食盐和2％(w/w) 的玉米粉炒熟后放至室温，添加增香型直投式发酵剂，其添加量总活菌数为 107CFU/g鱼，最后将烘干的鱼片和处理好的25％(w/w)玉米粉混匀，按照一层 鱼块一层玉米粉的方式装于5L玻璃坛中，加盖水封后放置在25℃培养箱中发酵，发酵时长7d。
奶酪的制作工艺包括以下步骤：将无抗生素新鲜牛乳离心处理除去杂质， 在压力为30MPa、温度为65℃的条件下进行均质，再进行巴氏杀菌(温度65℃， 时间30min)，然后迅速冷却至35℃。添加发酵剂(DOM1乳酸菌，意大利， 科莱里奇公司)0.10g/L牛奶，增香型直投式发酵剂，其添加量总活菌数为108CFU/g 奶酪，在35℃条件下发酵30min。凝乳酶(皱胃酶、牛胃蛋白酶，意大利)与水 混合均匀，混合比例1：40(w/w)，发酵结束后，将酶溶液添加至牛奶，添加 量0.05g/L牛奶，搅拌30s，静置待牛奶凝结。将凝乳切割成1.5cm×1.5cm×1.5 cm立方体，搅拌并加温至43℃，在43℃下恒温蒸煮30～60min并持续搅拌， 待乳清PH降至6.15停止蒸煮，初次排乳清。此后每15min排一次乳清并对凝 块进行堆酿，乳清PH降低至5.45时将凝块切割为拇指大小。添加食盐，剂量 为3.0g/L牛奶，食盐分三次加入凝块并使其分布均匀，盐渍后的凝块放入模具压 制12～24h，使奶酪成型。
酸鲊辣椒的制作工艺包括以下步骤：将洗干净的红辣椒切成大小为5mm× 5mm小块，生姜、大蒜切成大小为3mm×3mm的小块，籼米粉碎过筛制得米 粉，再将辣椒预腌1h，将经预腌的辣椒和少量生姜、大蒜等辅料混合后，加米 粉，添加增香型直投式发酵剂，其添加量总活菌数为108CFU/g辣椒，搅拌均匀后 放入发酵罐中，将罐口用稻草固定，倒置液封，进行发酵。发酵工艺条件为红 辣椒：籼米粉1.0：1.0(w/w)，发酵时间15d，发酵温度30℃，米粉粒度20 目。
豆瓣酱的制作工艺包括以下步骤：将孢子浓度为107个/mL的米曲霉和黑 曲霉菌悬液按1％(v/w)接种量分别接种到种曲培养基上，30℃培养72h，24h 翻曲一次，制作种曲备用。将蚕豆与水按1:2(w/w)比例混合浸泡16h脱壳， 然后于高压灭菌锅中121℃下蒸20min，排气出锅，冷却。蚕豆与面粉质量比 为4:1，将面粉与种曲按0.5％(种曲质量占蚕豆与面粉总质量)接种量(米曲霉 与黑曲霉配比3:1)混合均匀，添加增香型直投式发酵剂，其添加量总活菌数为 107CFU/g豆瓣酱，再装入三角瓶与蚕豆充分混合，八层纱布包扎，放入30℃恒温 培养箱中培养5d，每天摇匀2次，待蚕豆瓣表面长满孢子后即得到所需的蚕豆 曲。将蚕豆曲与浓度16％的盐水在瓦罐中以质量体积比1:1.5的比例混匀，放置 于45℃恒温箱培养30d成熟，每天翻酱一次。
优选的是，所述的增香型直投式发酵剂在酸鲊鱼、酸鲊辣椒、奶酪、豆瓣 酱制品发酵制作中的应用中，使用所述增香型直投式发酵剂进行发酵时，其添 加量为(106～109)CFU/g物料。
与现有技术相比，本发明的有益效果如下：
本发明提供一种发酵生产酯类风味物质的方法，所述方法是利用所述的一 种增香型直投式发酵剂进行发酵，可以克服酸鲊制品酯类风味生产不稳定的缺 点，达到显著增强产品酯类含量的目的。
本发明的增香型直投式发酵剂，可以用于固态发酵食品中，特别是酸鲊鱼， 酸鲊辣椒、奶酪、豆瓣酱等发酵过程中。发酵产生的酯类物质具有芳香气味， 辛酸乙酯具有类似白兰地的香气，癸酸乙酯具有椰子香味，并有甜味，丙酸乙 酯具有菠萝香味，棕榈酸乙酯具有奶油香味，己酸乙酯具有水果香味，乙酸苯 乙酯具有蜂蜜样和玫瑰样的香气等。利用本发明所述的增香型直投式发酵剂发 酵后，酯类含量得到了极大的提升，其中辛酸乙酯、癸酸乙酯、丙酸乙酯、棕 榈酸乙酯、己酸乙酯和乙酸苯乙酯含量分别提高到1.5～3.5倍、1.2～2.8倍、1.0～3.8 倍、1.2～2.1倍、1.5～2.5倍、1.3～2.7倍。
本发明的增香型直投式发酵剂还具有组分简单，配制方便，使用方法简单 的优点。
具体实施方式
为更好理解本发明，下面结合实施例对本发明做出详细说明，但本发明的 实施方案不受所述实施例的限制。
实施例1～4中使用的MRS琼脂培养基、MRS肉汤培养基、YPD琼脂培养 基与YPD肉汤培养基均购于青岛海博生物技术有限公司。
实施例1～4中使用的东方萨伊酵母CICC 31431、酿酒酵母CICC 1012、东 方萨伊酵母CICC 1344、植物乳杆菌CICC 22696、植物乳杆菌CICC 20022、木 糖葡萄球菌CICC22943、酿酒酵母CICC 1229、乳酸片球菌CICC 24367、酿酒 酵母CICC 1049、东方萨伊酵母CICC 1926均购自中国工业微生物菌种保藏管 理中心；东方萨伊酵母CGMCC M 4741、米曲霉CGMCC 3.2792购自中国普通 微生物保藏管理中心；弯曲乳杆菌GDMCC 1.725购自与广东省微生物菌种保藏 中心。
实施例1：增香型直投式发酵剂的制备与其在酸鱼(即酸鲊鱼)中的应用
S1、酿酒酵母菌体、东方萨伊酵母菌体的制备
制备酿酒酵母菌体，其制备方式为：挑取保存于-80℃的菌株在YPD琼脂 培养基上划线。划线后的平板置于28℃恒温培养箱中培养48h。将平板上的单 菌落挑入YPD肉汤培养基中，在28℃，100rpm条件下，摇床培养24h，然后 以5％的接种量接种至YPD肉汤培养基中，28℃、160rpm条件下摇床培养24h。 离心搜集菌体，用无菌生理盐水洗涤菌体1次，再次离心搜集菌体，用适量无 菌水悬浮，备用。
制备东方萨伊酵母菌体，其制备方式为：挑取保存于-80℃的菌株在YPD 琼脂培养基上划线。划线后的平板置于28℃恒温培养箱中培养48h。将平板上 的单菌落挑入YPD肉汤培养基中，在28℃，100rpm条件下，摇床培养24h， 然后以5％的接种量接种至YPD肉汤培养基中，28℃、160rpm条件下摇床培 养24h。离心搜集菌体，用无菌生理盐水洗涤菌体1次，再次离心搜集菌体， 用适量无菌水悬浮，备用。
S2、酿酒酵母冻干粉、东方萨伊酵母冻干粉的制备
酿酒酵母菌体冻干粉的制备方法为：S1步骤获得的酿酒酵母菌体采用15％ 蛋白胨(w/w)、30％菊粉(w/w)、30％海藻糖(w/w)、5％海葡萄多糖(w/w) 作为冷冻保护剂，经过冷冻干燥(将酵母菌体置于保护剂中混匀，于超低温冰 箱内预冷，然后将冻结的物质置于冻干机中冻干72h，其存活率高达90％，制 成含有活菌数1012CFU/g保护剂固形物；
东方萨伊酵母菌体冻干粉的制备方法为：S1步骤获得的东方萨伊酵母菌体 采用35％蛋白胨(w/w)、30％脱脂乳粉(w/w)、20％海藻糖(w/w)、10％海葡 萄多糖(w/w)作为冷冻保护剂，于-80℃下预冷2h，将冻结物置于冻干机中冻 干72h，其存活率高达89％，制成含有活菌数9×1011CFU/g保护剂固形物。
S3、增香型直投式发酵剂的制备
表1酸鱼发酵组别方案
酸鱼发酵剂组别方案如表1所示，按表1所示比例混合菌体冻干粉，配制 好各组发酵剂。
S4、发酵酸鱼
表1组别11(即传统酸鱼)的制作方法参照“酸鱼发酵过程中特征风味形 成与微生物的关系研究。江南大学博士论文。臧金红”进行制作。具体为：以 重量份数计，将鲤鱼块100份与食盐3份和白砂糖2份搅拌均匀，放置在4℃ 的冰箱中腌制48h后，恒温恒湿(50℃、65％湿度)条件下干燥3h。期间， 取100份玉米粉，添加食盐3份和白砂糖2份后炒熟冷却至室温，将100份烘 干的鱼片和25份处理好的玉米粉混匀，按照一层鱼块一层玉米粉的方式装于5L 玻璃坛中，加盖水封后放置在25℃培养箱中发酵，发酵时长7d。
表1组别1～10中酸鱼的制作方法具体为：以重量份数计，将鲤鱼块100份 与食盐3份和白砂糖2份搅拌均匀，放置在4℃的冰箱中腌制48h后，再在恒 温恒湿(50℃、65％湿度)条件下干燥3h；干燥后添加直投式发酵剂(如表1 所示)，其添加量总活菌数为107CFU/g鱼；取100份玉米粉，添加食盐3份和白 砂糖2份后炒熟冷却至室温；将100份烘干的鱼片和25份处理好的玉米粉混匀， 按照一层鱼块一层玉米粉的方式装于5L玻璃坛中，加盖水封后放置在25℃培 养箱中发酵7天。
使用GC-MS 7890B-7010B(美国Agilent公司)分析酸鱼中的风味物质，采 用固相微萃取(SPME)萃取样品中的挥发性有机化合物，并在MRM模式下对 酸鱼中6种主要的酯类物质(辛酸乙酯、癸酸乙酯、丙酸乙酯、棕榈酸乙酯、 己酸乙酯和乙酸苯乙酯)含量进行测定。色谱条件如下，毛细管色谱柱：HP-5MS (30m×250μm×0.25μm)；梯度程序：30℃用于5min；3℃/min升至50 ℃保持3min；5℃/min升至150℃，20℃/min升至250℃保持5min；载气为He，流速为1.0mL/min，选用不分流模式。
表2发酵酸鱼中酯类物质的含量
酸鱼中酯类物质含量结果如表2所示，可知组别1中酯类物质总量最高， 且辛酸乙酯、癸酸乙酯、丙酸乙酯、棕榈酸乙酯、己酸乙酯和乙酸苯乙酯的含 量均高于组别2～11，其含量约提高至对照组的2.2～7.7倍、1.0～3.5倍、1.0～3.4 倍、2.0～4.4倍、1.1～4.8倍、1.2～3.3倍，达到了更好的风味增强效果。其中，组 别7～11中辛酸乙酯含量低于70μg/100g、丙酸乙酯含量低于35μg/100g、棕榈 酸乙酯含量低于23μg/100g、己酸乙酯含量低于280μg/100g，明显低于组别1～3， 其原因可能是酿酒酵母CGMCC 21289和东方萨伊酵母CICC 31431起到了协同 的作用，促进了酯类物质的生成。此六种酯类物质具有菠萝味、苹果味、花香 味、奶油味等令人愉悦的香气，且阈值较低，对酸鱼的特征风味具有重要的贡献作用。因此，采用该增香型直投式发酵剂能够显著提高酸鱼中酯类的含量， 从而改善产品的风味品质。
实施例2：增香型直投式发酵剂的制备与其在奶酪中的应用
S1、酿酒酵母菌体、东方萨伊酵母菌体的制备
制备酿酒酵母菌体，其制备方式为：挑取保存于-80℃的菌株在YPD琼脂 培养基上划线。划线后的平板置于28℃恒温培养箱中培养48h。将平板上的单 菌落挑入YPD肉汤培养基中，在28℃，100rpm条件下，摇床培养24h，然后 以5％的接种量接种至YPD肉汤培养基中，28℃、160rpm条件下摇床培养24h。 离心搜集菌体，用无菌生理盐水洗涤菌体1次，再次离心搜集菌体，用适量无 菌水悬浮，备用。
制备东方萨伊酵母菌体，其制备方式为：挑取保存于-80℃的菌株在YPD 琼脂培养基上划线。划线后的平板置于28℃恒温培养箱中培养48h。将平板上 的单菌落挑入YPD肉汤培养基中，在28℃，100rpm条件下，摇床培养24h， 然后以5％的接种量接种至YPD肉汤培养基中，28℃、160rpm条件下摇床培 养24h。离心搜集菌体，用无菌生理盐水洗涤菌体1次，再次离心搜集菌体， 用适量无菌水悬浮，备用。
S2、酿酒酵母冻干粉、东方萨伊酵母冻干粉的制备
酿酒酵母菌体冻干粉的制备方法为：S1步骤获得的酿酒酵母菌体采用15％ 蛋白胨(w/w)、30％菊粉(w/w)、30％海藻糖(w/w)、5％海葡萄多糖(w/w) 作为冷冻保护剂，经过冷冻干燥(将酵母菌体置于保护剂中混匀，于超低温冰 箱内预冷，然后将冻结的物质置于冻干机中冻干72h，其存活率高达90％，制 成含有活菌数1012CFU/g保护剂固形物；
东方萨伊酵母菌体冻干粉的制备方法为：S1步骤获得的东方萨伊酵母菌体 采用35％蛋白胨(w/w)、30％脱脂乳粉(w/w)、20％海藻糖(w/w)、10％海葡 萄多糖(w/w)作为冷冻保护剂，于-80℃下预冷2h，将冻结物置于冻干机中冻 干72h，其存活率高达89％，制成含有活菌数9×1011CFU/g保护剂固形物。
S3、增香型直投式发酵剂的制备
表3奶酪发酵剂组别方案
奶酪发酵剂组别方案如表3所示，按表3所示比例混合菌体冻干粉，配制 好各组发酵剂。
S4、发酵奶酪
传统奶酪(组别11)的制备方法参照“牦牛切达奶酪制作技术流规程。中 国乳业，2020，02:77-80。”进行制作。具体为：将无抗生素新鲜牛乳离心处理 除去杂质，在压力为30MPa、温度为65℃的条件下进行均质，再进行巴氏杀菌 (温度65℃，时间30min)，然后迅速冷却至35℃。添加发酵剂(DOM1乳酸 菌，意大利，科莱里奇公司)0.10g/L牛奶，在35℃条件下发酵30min。凝乳酶 (皱胃酶、牛胃蛋白酶，意大利)与水混合均匀，混合比例1：40(w/w)，发酵 结束后，将酶溶液添加至牛奶，添加量0.05g/L牛奶，搅拌30s，静置待牛奶凝 结。将凝乳切割成1.5cm×1.5cm×1.5cm立方体，搅拌并加温至43℃，在43℃ 下恒温蒸煮30～60min并持续搅拌，待乳清PH降至6.15停止蒸煮，初次排乳清。 此后，每15min排一次乳清并对凝块进行堆酿，乳清PH降低至5.45时将凝块 切割为拇指大小。添加食盐，剂量为3.0g/L牛奶，食盐分三次加入凝块并使其 分布均匀，盐渍后的凝块放入模具压制12～24h，使奶酪成型。
组别1～10组中奶酪的制作方法参考组别11，具体为：将无抗生素新鲜牛乳 离心处理除去杂质，在压力为30MPa、温度为65℃的条件下进行均质，再进行 巴氏杀菌(温度65℃，时间30min)，然后迅速冷却至35℃。添加发酵剂0.10 g/L牛奶(DOM1乳酸菌，意大利，科莱里奇公司)、直投式发酵剂(如表3所示) 108CFU/g奶酪，其添加量总活菌数为，在35℃条件下发酵30min。凝乳酶(皱 胃酶、牛胃蛋白酶，意大利)与水混合均匀，混合比例1：40(w/w)，发酵结束 后，将酶溶液添加至牛奶，添加量0.05g/L牛奶，搅拌30s，静置待牛奶凝结。 将凝乳切割成1.5cm×1.5cm×1.5cm立方体，搅拌并加温至43℃，在43℃下 恒温蒸煮30～60min并持续搅拌，待乳清PH降至6.15停止蒸煮，初次排乳清。 此后每15min排一次乳清并对凝块进行堆酿，乳清PH降低至5.45时将凝块切 割为拇指大小。添加食盐，剂量为3.0g/L牛奶，食盐分三次加入凝块并使其分 布均匀，盐渍后的凝块放入模具压制12～24h，使奶酪成型。
使用GC-MS 7890B-7010B(美国Agilent公司)分析奶酪中的风味物质，采 用固相微萃取(SPME)萃取样品中的挥发性有机化合物，并在MRM模式下对 酸鱼中6种主要的酯类物质(辛酸乙酯、癸酸乙酯、丙酸乙酯、棕榈酸乙酯、 己酸乙酯和乙酸苯乙酯)含量进行测定。色谱条件如下，毛细管色谱柱：HP-5MS (30m×250μm×0.25μm)；梯度程序：30℃用于5min；3℃/min升至50℃ 保持3min；5℃/min升至150℃，20℃/min升至250℃保持5min；载气为 He，流速为1.0mL/min，选用不分流模式。
表4发酵奶酪中酯类物质的含量
奶酪中酯类物质含量结果如表4所示，可知组别1中酯类物质总量最高， 且辛酸乙酯、癸酸乙酯、丙酸乙酯、棕榈酸乙酯、己酸乙酯和乙酸苯乙酯的含 量均高于组别2～11，其含量约提高至对照组的1.5～2.8倍、1.3～2.3倍、1.7～4.8 倍、1.3～6.3倍、1.5～3.2倍、1.3～3.5倍，达到了更好的风味增强效果。其中，组 别7～11中丙酸乙酯含量低于150μg/100g、棕榈酸乙酯含量低于100μg/100g， 明显低于组别1～3，其原因可能是酿酒酵母CGMCC21289和东方萨伊酵母CICC 31431起到了协同的作用，促进了酯类物质的生成。此六种酯类物质具有菠萝味、 苹果味、花香味、奶油味等令人愉悦的香气，且阈值较低，对奶酪的特征风味 具有重要的贡献作用。因此，采用该增香型直投式发酵剂能够显著提高奶酪中 酯类的含量，从而改善产品的风味品质。
实施例3：增香型直投式发酵剂的制备与其在酸鲊辣椒(即“鲊辣椒”)中 的应用
S1、酿酒酵母菌体、东方萨伊酵母菌体的制备
制备酿酒酵母菌体，其制备方式为：挑取保存于-80℃的菌株在YPD琼脂 培养基上划线。划线后的平板置于28℃恒温培养箱中培养48h。将平板上的单 菌落挑入YPD肉汤培养基中，在28℃，100rpm条件下，摇床培养24h，然后 以5％的接种量接种至YPD肉汤培养基中，28℃、160rpm条件下摇床培养24h。 离心搜集菌体，用无菌生理盐水洗涤菌体1次，再次离心搜集菌体，用适量无 菌水悬浮，备用。
制备东方萨伊酵母菌体，其制备方式为：挑取保存于-80℃的菌株在YPD 琼脂培养基上划线。划线后的平板置于28℃恒温培养箱中培养48h。将平板上 的单菌落挑入YPD肉汤培养基中，在28℃，100rpm条件下，摇床培养24h， 然后以5％的接种量接种至YPD肉汤培养基中，28℃、160rpm条件下摇床培 养24h。离心搜集菌体，用无菌生理盐水洗涤菌体1次，再次离心搜集菌体， 用适量无菌水悬浮，备用。
S2、酿酒酵母冻干粉、东方萨伊酵母冻干粉的制备
酿酒酵母菌体冻干粉的制备方法为：S1步骤获得的酿酒酵母菌体采用10％ 蛋白胨(w/w)、20％菊粉(w/w)、20％海藻糖(w/w)、10％海葡萄多糖(w/w)) 作为冷冻保护剂，经过冷冻干燥(将酵母菌体置于保护剂中混匀，于超低温冰 箱内预冷，然后将冻结的物质置于冻干机中冻干72h，其存活率高达90％，制 成含有活菌数8×1011CFU/g保护剂固形物；
东方萨伊酵母菌体冻干粉的制备方法为：S1步骤获得的东方萨伊酵母菌体 采用29％蛋白胨(w/w)、28％脱脂乳粉(w/w)、18％海藻糖(w/w)、9％海葡萄 多糖(w/w)作为冷冻保护剂，于-80℃下预冷2h，将冻结物置于冻干机中冻干 72h，其存活率高达89％，制成含有活菌数6×1011CFU/g保护剂固形物。
S3、增香型直投式发酵剂的制备
表5酸鲊辣椒发酵组别方案
酸鲊辣椒发酵剂组别方案如表5所示，按表5所示比例混合菌体冻干粉， 配制好各组发酵剂。
S4、发酵酸鲊辣椒
表5组别11(即传统酸鲊辣椒)的制作方法参照“响应面法优化鲊辣椒的 发酵工艺。中国酿造。2018,10:106-110.”进行制作。具体为:将洗干净的红辣椒 切成大小为5mm×5mm小块，生姜、大蒜切成大小为3mm×3mm的小块， 籼米粉碎过筛制得米粉，再将辣椒预腌1h，将经预腌的辣椒和少量生姜、大蒜 等辅料混合后，加米粉，搅拌均匀后放入发酵罐中，将罐口用稻草固定，倒置 液封，进行发酵。发酵工艺条件为红辣椒：籼米粉＝1.0:1.0(w/w)，发酵时间15 d，发酵温度30℃，米粉粒度20目。
表5组别1～10中酸鲊辣椒的制作方法具体为：将洗干净的红辣椒切成大小 为5mm×5mm小块，生姜、大蒜切成大小为3mm×3mm的小块，籼米粉碎 过筛制得米粉，再将辣椒预腌1h，将经预腌的辣椒和少量生姜、大蒜等辅料混 合后，加米粉，添加直投式发酵剂(如表5所示)，其添加量总活菌数为108CFU/g 辣椒，搅拌均匀后放入发酵罐中，将罐口用稻草固定，倒置液封，进行发酵。发 酵工艺条件为红辣椒：籼米粉＝1.0:1.0(w/w)，发酵时间15d，发酵温度30℃， 米粉粒度20目。
使用GC-MS 7890B-7010B(美国Agilent公司)分析酸鲊辣椒中的风味物质， 采用固相微萃取(SPME)萃取样品中的挥发性有机化合物，并在MRM模式下 对酸鲊辣椒中6种主要的酯类物质(辛酸乙酯、癸酸乙酯、丙酸乙酯、棕榈酸 乙酯、己酸乙酯和乙酸苯乙酯)含量进行测定。色谱条件如下，毛细管色谱柱：HP-5MS(30m×250μm×0.25μm)；梯度程序：30℃用于5min；3℃/min升 至50℃保持3min；5℃/min升至150℃，20℃/min升至250℃保持5min；载气为He，流速为1.0mL/min，选用不分流模式。
表6发酵酸鲊辣椒中酯类物质的含量
酸鲊辣椒中酯类物质含量结果如表6所示，可知组别1中酯类物质总量最 高，且辛酸乙酯、癸酸乙酯、丙酸乙酯、棕榈酸乙酯、己酸乙酯和乙酸苯乙酯 的含量均高于组别2～11，其含量约提高至对照组的1.3～5.2倍、1.2～3.8倍、1.0～2.4 倍、1.1～3.4倍、1.5～2.6倍、1.0～3.0倍，达到了更好的风味增强效果。其中，组 别7～11中辛酸乙酯含量低于40μg/100g,丙酸乙酯含量低于40μg/100g、棕榈酸 乙酯含量低于20μg/100g、己酸乙酯含量低于150μg/100g，明显低于组别1～3， 原因可能是酿酒酵母CGMCC 21289和东方萨伊酵母CICC 31431起到了协同的 作用，促进了酯类物质的生成。此六种酯类物质具有菠萝味、苹果味、花香味、 奶油味等令人愉悦的香气，且阈值较低，对酸鲊辣椒的特征风味具有重要的贡 献作用。因此，采用该增香型直投式发酵剂能够显著提高酸鲊辣椒中酯类的含 量，从而改善产品的风味品质。
实施例4：增香型直投式发酵剂的制备与其在豆瓣酱中的应用
S1、酿酒酵母菌体、东方萨伊酵母菌体的制备
制备酿酒酵母菌体，其制备方式为：挑取保存于-80℃的菌株在YPD琼脂 培养基上划线。划线后的平板置于28℃恒温培养箱中培养48h。将平板上的单 菌落挑入YPD肉汤培养基中，在28℃，100rpm条件下，摇床培养24h，然后 以5％的接种量接种至YPD肉汤培养基中，28℃、160rpm条件下摇床培养24h。 离心搜集菌体，用无菌生理盐水洗涤菌体1次，再次离心搜集菌体，用适量无 菌水悬浮，备用。
制备东方萨伊酵母菌体，其制备方式为：挑取保存于-80℃的菌株在YPD 琼脂培养基上划线。划线后的平板置于28℃恒温培养箱中培养48h。将平板上 的单菌落挑入YPD肉汤培养基中，在28℃，100rpm条件下，摇床培养24h， 然后以5％的接种量接种至YPD肉汤培养基中，28℃、160rpm条件下摇床培 养24h。离心搜集菌体，用无菌生理盐水洗涤菌体1次，再次离心搜集菌体， 用适量无菌水悬浮，备用。
S2、酿酒酵母冻干粉、东方萨伊酵母冻干粉的制备
酿酒酵母菌体冻干粉的制备方法为：S1步骤获得的酿酒酵母菌体采用13％ 蛋白胨(w/w)、25％菊粉(w/w)、25％海藻糖(w/w)、8％海葡萄多糖(w/w) 作为冷冻保护剂，经过冷冻干燥(将酵母菌体置于保护剂中混匀，于超低温冰 箱内预冷，然后将冻结的物质置于冻干机中冻干72h，其存活率高达90％，制 成含有活菌数1011CFU/g保护剂固形物；
东方萨伊酵母菌体冻干粉的制备方法为：S1步骤获得的东方萨伊酵母菌体 采用30％蛋白胨(w/w)、25％脱脂乳粉(w/w)、10％海藻糖(w/w)、8％海葡萄 多糖(w/w)作为冷冻保护剂，于-80℃下预冷2h，将冻结物置于冻干机中冻干 72h，其存活率高达89％，制成含有活菌数1011CFU/g保护剂固形物。
S3、增香型直投式发酵剂的制备
表7豆瓣酱发酵组别方案
豆瓣酱发酵剂组别方案如表7所示，按表7所示比例混合菌体冻干粉，配 制好各组发酵剂。
S4、发酵豆瓣酱
传统豆瓣酱(组别11)的制备方法参照“不同原料预处理工艺对豆瓣酱品 质的影响。食品工业科技，2020，41(7):301-308。”进行制作。具体为：将孢 子浓度为107个/mL的米曲霉和黑曲霉菌悬液按1％(v/w)接种量分别接种到种 曲培养基上，30℃培养72h，24h翻曲一次，制作种曲备用。将蚕豆与水按1:2 (w/w)比例混合浸泡16h脱壳，然后于高压灭菌锅中121℃下蒸20min，排气 出锅，冷却。蚕豆与面粉质量比为4:1，将面粉与种曲按0.5％(种曲质量占蚕豆 与面粉总质量)接种量(米曲霉与黑曲霉配比3:1)混合均匀，再装入三角瓶与蚕豆充分混合，八层纱布包扎，放入30℃恒温培养箱中培养5d，每天摇匀2 次，待蚕豆瓣表面长满孢子后即得到所需的蚕豆曲。将蚕豆曲与浓度16％的盐 水在瓦罐中以质量体积比1:1.5的比例混匀，放置于45℃恒温箱培养30d成熟， 每天翻酱一次。
组别1～10组中豆瓣酱的制作方法参考组别11，具体为：将孢子浓度为107个/mL的米曲霉和黑曲霉菌悬液按1％(v/w)接种量分别接种到种曲培养基上， 30℃培养72h，24h翻曲一次，制作种曲备用。将蚕豆与水按1:2(w/w)比例混 合浸泡16h脱壳，然后于高压灭菌锅中121℃下蒸20min，排气出锅，冷却。 蚕豆与面粉质量比为4:1，将面粉与种曲按0.5％(种曲质量占蚕豆与面粉总质量) 接种量(米曲霉与黑曲霉配比3:1)混合均匀，添加直投式发酵剂(如表7所示)， 其添加量总活菌数为107CFU/g豆瓣酱，再装入三角瓶与蚕豆充分混合，八层纱布 包扎，放入30℃恒温培养箱中培养5d，每天摇匀2次，待蚕豆瓣表面长满孢 子后即得到所需的蚕豆曲。将蚕豆曲与浓度16％的盐水在瓦罐中以质量体积比 1:1.5的比例混匀，放置于45℃恒温箱培养30d成熟，每天翻酱一次。
使用GC-MS 7890B-7010B(美国Agilent公司)分析豆瓣酱中的风味物质， 采用固相微萃取(SPME)萃取样品中的挥发性有机化合物，并在MRM模式下 对酸鲊辣椒中6种主要的酯类物质(辛酸乙酯、癸酸乙酯、丙酸乙酯、棕榈酸 乙酯、己酸乙酯和乙酸苯乙酯)含量进行测定。色谱条件如下，毛细管色谱柱： HP-5MS(30m×250μm×0.25μm)；梯度程序：30℃用于5min；3℃/min升 至50℃保持3min；5℃/min升至150℃，20℃/min升至250℃保持5min；载气为He，流速为1.0mL/min，选用不分流模式。
表8发酵豆瓣酱中酯类物质的含量
豆瓣酱中酯类物质含量结果如表8所示，可知组别1中酯类物质总量最高， 且辛酸乙酯、癸酸乙酯、丙酸乙酯、棕榈酸乙酯、己酸乙酯和乙酸苯乙酯的含 量均高于组别2～11，其含量约提高至对照组的1.3～2.1倍、1.8～4.6倍、1.0～1.5 倍、1.0～2.7倍、1.2～2.5倍、1.3～2.5倍，达到了更好的风味增强效果。其中，组 别7～11中辛酸乙酯含量低于230μg/100g,棕榈酸乙酯含量低于120μg/100g、己 酸乙酯含量低于100μg/100g，明显低于组别1～3，其原因可能是酿酒酵母CGMCC 21289和东方萨伊酵母CICC 31431起到了协同的作用，促进了酯类物 质的生成。此六种酯类物质具有菠萝味、苹果味、花香味、奶油味等令人愉悦的香气，且阈值较低，对豆瓣酱的特征风味具有重要的贡献作用。因此，采用 该增香型直投式发酵剂能够显著提高豆瓣酱中酯类的含量，从而改善产品的风 味品质。
综上，该增香型直投式发酵剂能够显著提高发酵制品，特别是酸鲊鱼、酸 鲊辣椒、奶酪、豆瓣酱中辛酸乙酯、癸酸乙酯、丙酸乙酯、棕榈酸乙酯、己酸 乙酯和乙酸苯乙酯这六种酯的含量，从而改善产品的风味品质。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局 限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明披露的技术范围内，根据本 发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护 范围之内。
Claims (5)
1.一种增香型直投式发酵剂，其特征在于，所述增香型直投式发酵剂由酿酒酵母冻干粉和东方伊萨酵母冻干粉按质量比1:(0.5～3)复合而成，所述增香型直投式发酵剂的菌种浓度为(1010～1012)CFU/g保护剂固形物；所述酿酒酵母冻干粉包括酿酒酵母与酿酒酵母冷冻保护剂，所述酿酒酵母为CGMCC 21289，该酵母菌于2020年12月03日保藏于“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”，保藏号为CGMCC 21289，分类命名为酿酒酵母菌(Saccharomyces cerevisiae)；所述东方伊萨酵母冻干粉包括为东方伊萨酵母与东方伊萨酵母冷冻保护剂，所述东方伊萨酵母为CICC 31431。
2.一种权利要求1所述的增香型直投式发酵剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、酿酒酵母菌体、东方萨伊酵母菌体的制备；
当制备酿酒酵母菌体时，其制备方法为：酿酒酵母菌株经过MRS琼脂平板活化，MRS肉汤一级培养，获得OD600nm＝1.0～10.0的菌液，用无菌生理盐水洗涤1～2次，离心搜集后，用适量无菌水悬浮，备用；
当制备东方萨伊酵母菌体时，其制备方法为：东方萨伊酵母菌株经过YPD琼脂平板活化，YPD肉汤一级培养后，获得OD600nm＝1.0～10.0的菌液，用无菌生理盐水洗涤1～2次，离心搜集后，用适量无菌水悬浮，备用；
S2、酿酒酵母冻干粉、东方萨伊酵母冻干粉的制备；
当制备酿酒酵母冻干粉时，其制备方法为所述S1步骤制备的酿酒酵母菌体与酿酒酵母冷冻保护剂混合后，经过冷冻干燥，制成菌种浓度为(1010～1012)CFU/g 保护剂固形物的酿酒酵母冻干粉；
当制备东方萨伊酵母冻干粉时，其制备方法为所述S1步骤制备的东方萨伊酵母菌体与东方萨伊酵母冷冻保护剂混合后，经过冷冻干燥，制成菌种浓度为(1010～1012)CFU/g保护剂固形物的东方萨伊酵母冻干粉；
S3、增香型直投式发酵剂的制备：由S2步骤所述酿酒酵母冻干粉及所述东方萨伊酵母冻干粉按质量比1:(0.5～3)的比例混合。
3.根据权利要求2所述的增香型直投式发酵剂的制备方法，其特征在于，所述酿酒酵母冷冻保护剂包括10～15％(w/w)蛋白胨、20～30％(w/w)菊粉、20～30％(w/w)海藻糖、5～10％(w/w)海葡萄多糖；所述东方萨伊酵母冷冻保护剂包括25～35％(w/w)蛋白胨、20～30％(w/w)脱脂乳粉、10～20％(w/w)海藻糖、5～10％(w/w)海葡萄多糖。
4.一种权利要求1所述的增香型直投式发酵剂在发酵食品制作中的应用，其特征在于，所述增香型直投式发酵剂应用于酸鲊鱼、酸鲊辣椒、奶酪、豆瓣酱等的发酵制作。
5.根据权利要求4所述的增香型直投式发酵剂的应用，其特征在于，使用权利要求1所述的增香型直投式发酵剂进行发酵时，其添加量为(106～109)CFU/g 物料。
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