CN113151040B - 一种增香型直投式发酵剂及其制备方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种增香型直投式发酵剂及其制备方法与应用，属于发酵食品加工技术领域。所述增香型直投式发酵剂由植物乳杆菌冻干粉和东方伊萨酵母冻干粉按质量比1:0.5～3复合而成。植物乳杆菌于2020年12月03日保藏于“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”，保藏号为CGMCC21288。本发明提供的增香型直投式发酵剂组分简单，配制方便，使用方法简便，能够显著增强产品酯类含量。其中丙酸乙酯、丁酸乙酯、己酸乙酯、辛酸乙酯、癸酸乙酯和乙酸苯乙酯含量，分别提高到1.1～8.0倍、1.1～4.4倍、1.0～4.0倍、1.0～4.8倍、1.0～7.5倍、1.1～6.0倍。
Description
技术领域
本发明涉及一种增香型直投式发酵剂的制备方法及其应用，属于发酵食品 加工技术领域。
背景技术
发酵是千百年来人们利用微生物对食品进行保藏的方法。它利用了微生物 的代谢，在增强其营养价值的同时，还赋予了食品独特的风味。在发酵过程中， 微生物除了能够将大分子物质分解为小分子氨基酸，增加营养外，还能够产生 独特的风味。大分子水解过程中形成小分子的风味肽、游离氨基酸，这些氨基 酸可以直接作为风味物质的前体物质，通过微生物催化脱氨、脱羧、转氨、氨基酸侧链的裂解形成醛、酸、醇、酯等芳香成分。
传统发酵食品，如奶酪、豆瓣酱等，大多属于固态发酵，与现有较为发达 的液态发酵不同，其发酵过程中存在体系不均一，反应存在空间位阻等缺点， 发酵过程常常不可控，发酵产品质量不同。现有加工方式多为作坊式自然发酵， 受环境因素影响非常大。因此导致生产品质不稳定，生产效率低下，难以进行 标准化的控制等问题。选育具有特定风味生产的菌株以及开发方便易使用的直投式发酵剂，能够大大提高产品的质量和稳定性，是对生产过程进行规范，实 现标准化生产的优选方案。
酯类物质是微生物在发酵过程中形成的重要风味物质。由于具有较低的气 味阈值，在合适的浓度下，酯类化合物为整体风味贡献了令人愉悦的果香，是 发酵食品中的重要风味物质。例如，丙酸乙酯具有菠萝香味，丁酸乙酯具有果 香和菠萝香味，己酸乙酯具有水果香味，辛酸乙酯具有类似白兰地的香气，并 有甜味等，癸酸乙酯具有椰子香味，乙酸苯乙酯具有蜂蜜样和玫瑰样的香气等。现大多数的研究仍集中于总酯类含量的提高，或者单一酯类，尤其是乙酸乙酯 含量的提高上。然而，还未有能够同时提高多种酯类物质的含量优良发酵剂。
发明内容
为解决现有缺少同时提高多种酯类含量的优质发酵剂的问题，基于现有技 术，本发明有针对性地选育产酯能力高的优良微生物，并将这些微生物制备成 直投式发酵剂，用于发酵食品中。
本发明提供一种增香型直投式发酵剂及其制备方法和应用，其技术方案如 下：
一种增香型直投式发酵剂，所述增香型直投式发酵剂由植物乳杆菌冻干粉 和东方伊萨酵母冻干粉按质量比1:(0.5～3)复合而成，所述增香型直投式发酵剂 的总活菌数为(1010～1012)CFU/g保护剂固形物；所述植物乳杆菌冻干粉包括植物乳杆菌 与植物乳杆菌冷冻保护剂，所述植物乳杆菌为CGMCC 21288，该乳酸菌于2020 年12月03日保藏于“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”，地址是北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏号为CGMCC 21288，分类命名为植 物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)；所述东方伊萨酵母冻干粉包括东方萨伊酵 母与东方萨伊酵母冷冻保护剂，所述东方伊萨酵母为CICC31431，其特征是一 种耐高温生香酵母。
优选的是，所述增香型直投式发酵剂的制备方法包括以下步骤：
S1、植物乳杆菌菌体、东方萨伊酵母菌体的制备：
当制备植物乳杆菌菌体时，其制备方法为：植物乳杆菌菌株经过MRS琼脂 平板活化，MRS肉汤一级培养，获得OD600nm＝1.0～10.0的菌液，菌体用无菌生 理盐水洗涤1～2次，离心收集后，用适量无菌水悬浮，备用；
当制备东方萨伊酵母菌体时，其制备方法为：东方萨伊酵母菌株经过YPD 琼脂平板活化，YPD肉汤一级培养后，获得OD600nm＝1.0～10.0的菌液，菌体用 无菌生理盐水洗涤1～2次，离心收集后，用适量无菌水悬浮，备用；
S2、利用S1步骤制备完成的所述植物乳杆菌菌体、东方萨伊酵母菌体，制 备植物乳杆菌冻干粉、东方萨伊酵母冻干粉：
当制备植物乳杆菌冻干粉时，其制备方法为：所述S1步骤获得的植物乳杆 菌菌体与植物乳杆菌冷冻保护剂混合后，经过冷冻干燥，制成菌种浓度达到 (1010～1012)CFU/g的保护剂固形物；
当制备东方萨伊酵母冻干粉时，其制备方法为：所述S1步骤获得的东方萨 伊酵母菌体与东方萨伊酵母冷冻保护剂混合后，经过冷冻干燥，制成菌种浓度 为(1010～1012)CFU/g的保护剂固形物；
S3、增香型直投式发酵剂的配制：由S2步骤所述植物乳杆菌冻干粉及所述 东方萨伊酵母冻干粉按质量比1:(0.5～3)混合。
优选的是，所述植物乳杆菌冷冻保护剂包含10～15％(w/w)蛋白胨、 20～30％(w/w)菊粉、20～30％(w/w)海藻糖、5～10％(w/w)海葡萄多糖；所述东方萨 伊酵母冷冻保护剂包含25～35％(w/w)蛋白胨、20～30％(w/w)脱脂乳粉、 10～20％(w/w)海藻糖、5～10％(w/w)海葡萄多糖。
优选的是，所述的增香型直投式发酵剂可以应用于发酵食品制作中，尤其 是固态发酵食品的发酵，如酸鲊鱼(即酸鱼)、酸鲊辣椒、奶酪、豆瓣酱等的发 酵制作中。
优选的是，所述的增香型直投式发酵剂在酸鲊鱼、酸鲊辣椒、奶酪、豆瓣 酱的发酵制作中的添加量为(106～109)CFU/g物料。
与现有技术相比，本发明的有益效果如下：
本发明的增香型直投式发酵剂，可以用于固态发酵食品中，特别是酸鲊鱼、 酸鲊辣椒、奶酪、豆瓣酱等发酵过程中，产生的酯类物质具有芳香气味，丙酸 乙酯具有菠萝香味，丁酸乙酯具有果香和菠萝香味，己酸乙酯具有水果香味， 辛酸乙酯具有类似白兰地的香气，并有甜味等，癸酸乙酯具有椰子香味，乙酸 苯乙酯具有蜂蜜样和玫瑰样的香气，增强了这些发酵食品的风味。
本发明的增香型直投式发酵剂使用简便，利用本发明提供的增香型直投式 发酵剂进行发酵，克服发酵制品酯类风味生产不稳定的缺点，达到显著增强产 品中酯类物质的含量的目的。其中丙酸乙酯、丁酸乙酯、己酸乙酯、辛酸乙酯、 癸酸乙酯和乙酸苯乙酯含量，分别提高到1.1～8.0倍、1.1～4.4倍、1.0～4.0倍、 1.0～4.8倍、1.0～7.5倍、1.1～6.0倍。
本发明的增香型直投式发酵剂，还具有组分简单，配制方便，使用方法简 便的优点。
具体实施方式
使用以下实施例对本发明的技术方案做进一步的说明，有助于了解本专利， 但本发明的实施方案不受所述实施例的限制，本发明的保护范围由权利要求来 决定。
实施例1～4中使用的MRS琼脂培养基、MRS肉汤培养基、YPD琼脂培养 基与YPD肉汤培养基均购于青岛海博生物技术有限公司。
实施例1～4中使用的东方萨伊酵母CICC 31431、东方萨伊酵母CICC 1344、 植物乳杆菌CICC 22696、植物乳杆菌CICC 20022、木糖葡萄球菌CICC 22943、 酿酒酵母CICC1229、乳酸片球菌CICC 24367、酿酒酵母CICC 1049与东方萨 伊酵母CICC 1926购自中国工业微生物菌种保藏管理中心；米曲霉CGMCC 3.2792购自中国普通微生物保藏管理中心；弯曲乳杆菌GDMCC 1.725购自广东省微生物菌种保藏中心。植物乳杆菌CGMCC 21288，为之前筛选出的具有产酯 特性的一种乳酸菌，该乳酸菌于2020年12月03日保藏于“中国微生物菌种保 藏管理委员会普通微生物中心”，地址是北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
实施例1
一种增香型直投式发酵剂的制备与其在酸鱼中的应用，步骤如下：
S1、制备植物乳杆菌菌体与东方萨伊酵母菌体：
当制备植物乳杆菌CGMCC 21288时，其菌体制备方式为：挑取保存于-80℃ 的菌株在MRS琼脂培养基上划线。划线后的平板置于37℃恒温培养箱中培养 36h。将平板上的单菌落挑入MRS肉汤培养基中，在37℃，200rpm条件下， 摇床培养16h，然后以10％的接种量接种至MRS肉汤培养基中，37℃、160rpm条件下摇床培养16h。离心收集菌体，用无菌生理盐水洗涤菌体2次，再次离 心收集菌体，用适量无菌水悬浮，备用。
当制备东方伊萨酵母CICC 31431时，其菌体制备方式为：挑取保存于-80℃ 的菌株在YPD琼脂培养基上划线。划线后的平板置于28℃恒温培养箱中培养 48h。将平板上的单菌落挑入YPD肉汤培养基中，在28℃，100rpm条件下， 摇床培养24h，然后以5％的接种量接种至YPD肉汤培养基中，28℃、160rpm条件下摇床培养24h。离心收集菌体，用无菌生理盐水洗涤菌体1次，再次离 心收集菌体，用适量无菌水悬浮，备用。
S2、制备植物乳杆菌冻干粉与东方萨伊酵母冻干粉：
当制备植物乳杆菌冻干粉时，其制备方法为：S1步骤获得的植物乳杆菌菌 体采用15％(w/w)蛋白胨、30％(w/w)菊粉、30％(w/w)海藻糖、5％(w/w) 海葡萄多糖作为冷冻保护剂，冷冻保护剂经灭菌(121℃，15min)后，冷却至 一定程度与植物乳杆菌菌体混匀，置于玻璃平板中在-80℃超低温冰箱中预冻 24h，然后放入冻干机进行冻干：真空度为1Pa，冷阱为-83℃的条件下冷冻干燥 70h。经过冷冻干燥的菌粉存活率高达90％，制成含有活菌数1012CFU/g保护剂固形物；
当制备东方萨伊酵母的菌体冻干粉时，其制备方法为：S1步骤获得的东方 萨伊酵母菌体采用35％(w/w)蛋白胨、30％(w/w)脱脂乳粉、20％(w/w)海 藻糖、10％(w/w)海葡萄多糖作为冷冻保护剂，冷冻保护剂经灭菌(121℃， 15min)后，冷却至一定程度与东方萨伊酵母菌体混匀，置于玻璃平板中在-80℃ 超低温冰箱中预冻24h，然后放入冻干机进行冻干：真空度为1Pa，冷阱为-83℃ 的条件下冷冻干燥70h。经过冷冻干燥的菌粉其存活率高达89％，制成含有活菌 数9×1011CFU/g保护剂固形物。
S3、配制各组发酵剂：
表1酸鱼发酵组别方案
实施例1中使用的酸鱼发酵剂组别方案如表1所示，按表1所示比例混合 菌体冻干粉，配制好各组发酵剂。
S4、发酵酸鱼：
传统酸鱼(组别11)的制备方法参照“酸鱼发酵过程中特征风味形成与微 生物的关系研究。江南大学博士论文。臧金红”进行制作。具体为：将鲤鱼块 100份与3份食盐和2份白砂糖搅拌均匀，放置在4℃的冰箱中腌制48h后， 在恒温恒湿(50℃、65％湿度)条件下干燥3h。期间，将添加3份食盐和2份 白砂糖的100份玉米粉炒熟后放至室温，将烘干的鱼片100份和炒熟的玉米粉 25份混匀，按照一层鱼块一层玉米粉的方式装于5L玻璃坛中，加盖水封后放 置在25℃培养箱中发酵。
组别1～10组中酸鱼的制作方法参考组别11，具体为：将鲤鱼块100份与3 份食盐和2份白砂糖搅拌均匀，放置在4℃的冰箱中腌制48h后，在恒温恒湿 (50℃、65％湿度)条件下干燥3h。期间，将添加3份食盐和2份白砂糖的100 份玉米粉炒熟后放至室温，添加直投式发酵剂(如表1所示)，其添加量总活菌 数为107CFU/g鱼，最后将烘干的鱼片100份和炒熟的的玉米粉25份混匀，按照 一层鱼块一层玉米粉的方式装于5L玻璃坛中，加盖水封后放置在25℃培养箱 中发酵23天。
使用GC-MS 7890B-7010B(美国Agilent公司)分析酸鱼中的风味物质，采 用固相微萃取(SPME)萃取样品中的挥发性有机化合物，并在MRM模式下对 酸鱼中6种主要的酯类物质(丙酸乙酯、丁酸乙酯、己酸乙酯、辛酸乙酯、癸 酸乙酯和乙酸苯乙酯)含量进行测定。色谱条件如下，毛细管色谱柱：HP-5MS (30m×250μm×0.25μm)；梯度程序：30℃用于5min；3℃/min升至50℃保持 3min；5℃/min升至150℃，20℃/min升至250℃保持5min；载气为He，流速为1.0mL/min，选用不分流模式。
表2发酵酸鱼中酯类物质的含量
酸鱼中酯类物质含量结果如表2所示，可知组别1(植物乳杆菌CGMCC 21288菌体冻干粉，东方萨伊酵母CICC 31431菌体冻干粉以质量比1：1混合) 中酯类物质总量最高，且丙酸乙酯、丁酸乙酯、己酸乙酯、辛酸乙酯、癸酸乙 酯和乙酸苯乙酯的含量均高于组别2～11，其含量约提高到对照组的1.2～4.7倍、 1.1～3.9倍、1.0～3.8倍、1.0～2.3倍、1.0～2.2倍、1.3～3.4倍，达到了更好的风味增强效果。其原因可能是植物乳杆菌CGMCC 21288和东方萨伊酵母CICC 31431 起到了协同的作用，促进了酯类物质的生成。此6种酯类物质具有菠萝味、苹 果味、花香味、奶油味等令人愉悦的香气，且阈值较低，对酸鱼的特征风味具 有重要的贡献作用。因此，采用该增香型直投式发酵剂能够显著提高酸鱼中酯 类的含量，从而改善产品的风味品质。
实施例2
一种产酯增香型直投式发酵剂的制备与其在奶酪中的应用，步骤如下：
S1、制备植物乳杆菌菌体与东方萨伊酵母菌体：
当制备植物乳杆菌CGMCC 21288时，其菌体制备方式为：挑取保存于-80℃ 的菌株在MRS琼脂培养基上划线。划线后的平板置于37℃恒温培养箱中培养 36h。将平板上的单菌落挑入MRS肉汤培养基中，在37℃，200rpm条件下， 摇床培养16h，然后以10％的接种量接种至MRS肉汤培养基中，37℃、160rpm条件下摇床培养16h。离心收集菌体，用无菌生理盐水洗涤菌体2次，再次离 心收集菌体，用适量无菌水悬浮，备用。
当制备东方伊萨酵母CICC 31431时，其菌体制备方式为：挑取保存于-80℃ 的菌株在YPD琼脂培养基上划线。划线后的平板置于28℃恒温培养箱中培养 48h。将平板上的单菌落挑入YPD肉汤培养基中，在28℃，100rpm条件下，摇床培养24h，然后以5％的接种量接种至YPD肉汤培养基中，28℃、160rpm 条件下摇床培养24h。离心收集菌体，用无菌生理盐水洗涤菌体1次，再次离心收集菌体，用适量无菌水悬浮，备用。
S2、制备植物乳杆菌冻干粉与东方萨伊酵母冻干粉：
当制备植物乳杆菌冻干粉时，其制备方法为：S1步骤获得的植物乳杆菌菌 体采用15％(w/w)蛋白胨、30％(w/w)菊粉、30％(w/w)海藻糖、5％(w/w) 海葡萄多糖作为冷冻保护剂，冷冻保护剂经灭菌(121℃，15min)后，冷却至 一定程度与植物乳杆菌菌体混匀，置于玻璃平板中在-80℃超低温冰箱中预冻 24h，然后放入冻干机进行冻干：真空度为1Pa，冷阱为-83℃的条件下冷冻干燥 70h。经过冷冻干燥的菌粉其存活率高达90％，制成含有活菌数1012CFU/g保护剂固形物；
当制备东方萨伊酵母的菌体冻干粉时，其制备方法为：S1步骤获得的东方 萨伊酵母菌体采用35％(w/w)蛋白胨、30％(w/w)脱脂乳粉、20％(w/w)海 藻糖、10％(w/w)海葡萄多糖作为冷冻保护剂，保护剂经灭菌(121℃，15min) 后，冷却至一定程度与东方萨伊酵母菌体混匀，置于玻璃平板中在-80℃超低温 冰箱中预冻24h，然后放入冻干机进行冻干：真空度为1Pa，冷阱为-83℃的条件 下冷冻干燥70h。经过冷冻干燥的菌粉其存活率高达89％，制成含有活菌数9× 1011CFU/g保护剂固形物。
S3、配制各组发酵剂：
表3奶酪发酵组别方案
实施例2使用的奶酪发酵剂组别方案如表3所示，按表3所示比例混合菌 体冻干粉，配制好各组发酵剂。
S4、发酵奶酪：
传统奶酪(组别11)的制备方法参照“牦牛切达奶酪制作技术流规程。中 国乳业，2020，02:77-80。”进行制作。具体为：将无抗生素新鲜牛乳离心处理 除去杂质，在压力为30MPa、温度为65℃的条件下进行均质，再在温度65℃下 巴氏杀菌30min，然后迅速冷却至35℃。添加发酵剂(DOM1乳酸菌，意大利， 科莱里奇公司)0.10g/L牛奶，35℃下发酵30min。将凝乳酶(皱胃酶、牛胃蛋白 酶，意大利)与水以1:40的比例混合3min，发酵结束后添加至牛奶，添加量为 0.05g/L牛奶。凝乳酶添加后，搅拌30s，静置待牛奶凝结。凝乳结束后将其切割成1.5cm×1.5cm×1.5cm立方体，搅拌并加温至43℃，恒温蒸煮30～60min并持 续搅拌，待析出的乳清PH降至6.15时停止蒸煮，进行初次排乳清。此后，每 15min排一次乳清并将凝块堆酿60min。排出的乳清PH降至5.45时将凝块切割 成拇指大小。在切割完的凝块中添加食盐3.0g/L牛奶进行盐渍，食盐分三次加入， 每次揉5min，使盐分布均匀。盐渍后的凝块放入模具压制12～24h使奶酪成型。
组别1～10组中奶酪的制作方法参考组别11，具体为：将无抗生素的新鲜牛 乳离心处理除去杂质，在压力为30Mpa、温度为65℃的条件下进行均质，再在 温度65℃下巴氏杀菌30min，然后迅速冷却至35℃。添加发酵剂(DOM1乳酸 菌，意大利，科莱里奇公司)0.10g/L牛奶，添加直投式发酵剂(如表3所示)，其 添加量总活菌数为109CFU/g牛奶，35℃下发酵30min。将凝乳酶(皱胃酶、牛胃 蛋白酶，意大利)与水以1:40的比例混合3min，发酵结束后添加至牛奶，添加 量为0.05g/L牛奶。凝乳酶添加后，搅拌30s，静置待牛奶凝结。凝乳结束后将其 切割成1.5cm×1.5cm×1.5cm立方体，搅拌并加温至43℃，恒温蒸煮30～60min 并持续搅拌，待析出的乳清PH降至6.15时停止蒸煮，进行初次排乳清。此后， 每15min排一次乳清并将凝块堆酿60min。排出的乳清PH降至5.45时将凝块切 割成拇指大小。在切割完的凝块中添加食盐3.0g/L牛奶进行盐渍，食盐分三次加 入，每次揉5min，使盐分布均匀。盐渍后的凝块放入模具压制12～24h使奶酪成 型。
使用GC-MS 7890B-7010B(美国Agilent公司)分析奶酪中的风味物质，采 用固相微萃取(SPME)萃取样品中的挥发性有机化合物，并在MRM模式下对 奶酪中6种主要的酯类物质(丙酸乙酯、丁酸乙酯、己酸乙酯、辛酸乙酯、癸 酸乙酯和乙酸苯乙酯)含量进行测定。色谱条件如下，毛细管色谱柱：HP-5MS (30m×250μm×0.25μm)；梯度程序：30℃用于5min；3℃/min升至50℃保 持3min；5℃/min升至150℃，20℃/min升至250℃保持5min；载气为He，流速为1.0mL/min，选用不分流模式。
表4奶酪中酯类物质的含量
奶酪中酯类物质含量结果如表4所示，可知组别1(植物乳杆菌CGMCC 21288菌体冻干粉，东方萨伊酵母CICC 31431菌体冻干粉以质量比1：1进行混 合；)中酯类物质总量最高，且丙酸乙酯、丁酸乙酯、己酸乙酯、辛酸乙酯、癸 酸乙酯和乙酸苯乙酯的含量均高于组别2～11，其含量约提高到对照组的1.3～3.9 倍、1.4～2.7倍、1.4～2.6倍、1.3～1.6倍、1.3～1.7倍、1.1～1.9倍，达到了更好的风味增强效果。其原因可能是植物乳杆菌CGMCC21288和东方萨伊酵母CICC 31431起到了协同的作用，促进了酯类物质的生成。此6种酯类物质具有菠萝味、 苹果味、花香味、奶油味等令人愉悦的香气，且阈值较低，对奶酪的特征风味 具有重要的贡献作用。因此，采用该增香型直投式发酵剂能够显著提高奶酪中酯类的含量，从而改善产品的风味品质。
实施例3
一种产酯增香型直投式发酵剂的制备与其在酸鲊辣椒(即鲊辣椒)中的应 用，步骤如下：
S1、制备植物乳杆菌菌体与东方萨伊酵母菌体：
当制备植物乳杆菌CGMCC 21288时，其菌体制备方式为：挑取保存于-80℃ 的菌株在MRS琼脂培养基上划线。划线后的平板置于37℃恒温培养箱中培养 36h。将平板上的单菌落挑入MRS肉汤培养基中，在37℃，200rpm条件下， 摇床培养16h，然后以10％的接种量接种至MRS肉汤培养基中，37℃、160rpm条件下摇床培养16h。离心收集菌体，用无菌生理盐水洗涤菌体2次，再次离 心收集菌体，用适量无菌水悬浮，备用。
当制备东方伊萨酵母时，其菌体制备方式为：挑取保存于-80℃的菌株在 YPD琼脂培养基上划线。划线后的平板置于28℃恒温培养箱中培养48h。将平 板上的单菌落挑入YPD肉汤培养基中，在28℃，100rpm条件下，摇床培养24 h，然后以5％的接种量接种至YPD肉汤培养基中，28℃、160rpm条件下摇床 培养24h。离心收集菌体，用无菌生理盐水洗涤菌体1次，再次离心收集菌体， 用适量无菌水悬浮，备用。
S2、制备植物乳杆菌冻干粉与东方萨伊酵母冻干粉：
当制备植物乳杆菌冻干粉时，其制备方法为：经培养后的植物乳杆菌菌体 采用12％(w/w)蛋白胨、25％(w/w)菊粉、20％(w/w)海藻糖、10％(w/w) 海葡萄多糖作为冷冻保护剂，保护剂经灭菌(121℃，15min)后，冷却至一定 程度与植物乳杆菌菌体混匀，置于玻璃平板中在-80℃超低温冰箱中预冻24h， 然后放入冻干机进行冻干：真空度为1Pa，冷阱为-83℃的条件下冷冻干燥70h。 经过冷冻干燥的菌粉其存活率高达90％，制成含有活菌数9×1011CFU/g保护剂固形物；
当制备东方萨伊酵母的菌体冻干粉时，其制备方法为：经培养后的酵母菌 体采用28％(w/w)蛋白胨、23％(w/w)脱脂乳粉、20％(w/w)海藻糖、5％ (w/w)海葡萄多糖作为冷冻保护剂，保护剂经灭菌(121℃，15min)后，冷却 至一定程度与东方萨伊酵母菌体混匀，置于玻璃平板中在-80℃超低温冰箱中预 冻24h，然后放入冻干机进行冻干：真空度为1Pa，冷阱为-83℃的条件下冷冻干 燥70h。经过冷冻干燥的菌粉其存活率高达89％，制成含有活菌数1012CFU/g保护剂固形物。
S3、配制各组发酵剂：
表5酸鲊辣椒发酵组别方案
实施例3使用的酸鲊辣椒发酵剂组别方案如表5所示，按表5所示比例混 合菌体冻干粉，配制好各组发酵剂。
S4、发酵酸鲊辣椒：
传统酸鲊辣椒(组别11)的制备方法参照“响应面法优化鲊辣椒的发酵工 艺。中国酿造，2018，10:106-110。”进行制作。具体为：将洗干净的红辣椒切 成大小为5mm×5mm小块，生姜，大蒜切成大小为3mm×3mm的小块，籼米 粉碎过筛制得米粉，再将辣椒预腌1h，将经预腌的辣椒和少量生姜，大蒜等辅 料混合后，加米粉，搅拌均匀后放入发酵罐中，将罐口用稻草固定，倒置液封，进行发酵。发酵工艺条件为红辣椒：籼米粉1.0：1.0(w/w)，发酵时间15d， 发酵温度30℃，米粉粒度20目。
组别1～10组中酸鲊辣椒的制作方法参考组别11，具体为：将洗干净的红辣 椒切成大小为5mm×5mm小块，生姜，大蒜切成大小为3mm×3mm的小块， 籼米粉碎过筛制得米粉，再将辣椒预腌1h，将经预腌的辣椒和少量生姜，大蒜 等辅料混合后，加米粉，添加直投式发酵剂(如表5所示)，其添加量总活菌数 为108CFU/g辣椒，搅拌均匀后放入发酵罐中，将罐口用稻草固定，倒置液封，进 行发酵。发酵工艺条件为红辣椒：籼米粉1.0：1.0(w/w)，发酵时间15d，发 酵温度30℃，米粉粒度20目。
使用GC-MS 7890B-7010B(美国Agilent公司)分析酸鲊辣椒中的风味物质， 采用固相微萃取(SPME)萃取样品中的挥发性有机化合物，并在MRM模式下 对酸鲊辣椒中6种主要的酯类物质(丙酸乙酯、丁酸乙酯、己酸乙酯、辛酸乙 酯、癸酸乙酯和乙酸苯乙酯)含量进行测定。色谱条件如下，毛细管色谱柱： HP-5MS(30m×250μm×0.25μm)；梯度程序：30℃用于5min；3℃/min升至 50℃保持3min；5℃/min升至150℃，20℃/min升至250℃保持5min；载气为 He，流速为1.0mL/min，选用不分流模式。
表6发酵酸鲊辣椒中酯类物质的含量
酸鲊辣椒中酯类物质含量结果如表6所示，可知组别1(植物乳杆菌CGMCC 21288菌体冻干粉，东方萨伊酵母CICC 31431菌体冻干粉以质量比1：1进行混 合；)中酯类物质总量最高，且丙酸乙酯、丁酸乙酯、己酸乙酯、辛酸乙酯、癸 酸乙酯和乙酸苯乙酯的含量均高于组别2～11，其含量约提高到对照组的1.2～5.2 倍、1.5～4.4倍、1.2～2.6倍、2.0～3.6倍、1.0～2.9倍、1.5～6.0倍，达到了更好的风味增强效果。其原因可能是植物乳杆菌CGMCC21288和东方萨伊酵母CICC 31431起到了协同的作用，促进了酯类物质的生成。此6种酯类物质具有菠萝味、 苹果味、花香味、奶油味等令人愉悦的香气，且阈值较低，对酸鲊辣椒的特征 风味具有重要的贡献作用。因此，采用该增香型直投式发酵剂能够显著提高酸 鲊辣椒中酯类的含量，从而改善产品的风味品质。
实施例4
一种产酯增香型直投式发酵剂的制备与其在豆瓣酱中的应用，步骤如下：
S1、制备植物乳杆菌菌体与东方萨伊酵母菌体：
当制备植物乳杆菌CGMCC 21288时，其菌体制备方式为：挑取保存于-80℃ 的菌株在MRS琼脂培养基上划线。划线后的平板置于37℃恒温培养箱中培养 36h。将平板上的单菌落挑入MRS肉汤培养基中，在37℃，200rpm条件下， 摇床培养16h，然后以10％的接种量接种至MRS肉汤培养基中，37℃、160rpm条件下摇床培养16h。离心收集菌体，用无菌生理盐水洗涤菌体2次，再次离 心收集菌体，用适量无菌水悬浮，备用。
当制备东方伊萨酵母时，其菌体制备方式为：挑取保存于-80℃的菌株在 YPD琼脂培养基上划线。划线后的平板置于28℃恒温培养箱中培养48h。将平 板上的单菌落挑入YPD肉汤培养基中，在28℃，100rpm条件下，摇床培养24 h，然后以5％的接种量接种至YPD肉汤培养基中，28℃、160rpm条件下摇床 培养24h。离心收集菌体，用无菌生理盐水洗涤菌体1次，再次离心收集菌体， 用适量无菌水悬浮，备用。
S2、制备植物乳杆菌冻干粉与东方萨伊酵母冻干粉：
当制备植物乳杆菌冻干粉时，其制备方法为：经培养后的植物乳杆菌菌体 采用12％(w/w)蛋白胨、20％(w/w)菊粉、27％(w/w)海藻糖、7％(w/w) 海葡萄多糖作为冷冻保护剂，保护剂经灭菌(121℃，15min)后，冷却至一定 程度与植物乳杆菌菌体混匀，置于玻璃平板中在-80℃超低温冰箱中预冻24h， 然后放入冻干机进行冻干：真空度为1Pa，冷阱为-83℃的条件下冷冻干燥70h。 经过冷冻干燥的菌粉其存活率高达90％，制成含有活菌数7×1011CFU/g保护剂固形物；
当制备东方萨伊酵母的菌体冻干粉时，其制备方法为：经培养后的酵母菌 体采用30％(w/w)蛋白胨、30％(w/w)脱脂乳粉、15％(w/w)海藻糖、8％ (w/w)海葡萄多糖作为冷冻保护剂，保护剂经灭菌(121℃，15min)后，冷却 至一定程度与东方萨伊酵母菌体混匀，置于玻璃平板中在-80℃超低温冰箱中预 冻24h，然后放入冻干机进行冻干：真空度为1Pa，冷阱为-83℃的条件下冷冻干 燥70h。经过冷冻干燥的菌粉其存活率高达89％，制成含有活菌数6×1011CFU/g保护剂固形物。
S3、配制各组发酵剂：
表7豆瓣酱发酵组别方案
实施例4使用的豆瓣酱发酵剂组别方案如表7所示，按表7所示比例混合 菌体冻干粉，配制好各组发酵剂。
S4、发酵豆瓣酱：
传统豆瓣酱(组别11)的制备方法参照“不同原料预处理工艺对豆瓣酱品 质的影响。食品工业科技，2020，41(7):301-308。”进行制作。具体为：将孢 子浓度为107个/mL的米曲霉和黑曲霉菌悬液按1％(v/w)接种量分别接种到种 曲培养基上，30℃培养72h，24h翻曲一次，制作种曲备用。将蚕豆与水按1:2 (w/w)比例混合浸泡16h脱壳，然后于高压灭菌锅中121℃压力下蒸20min， 排气出锅，冷却。蚕豆与面粉质量比为4:1，将面粉与种曲按0.5％(种曲质量占 蚕豆与面粉总质量)接种量(米曲霉与黑曲霉配比3:1)混合均匀，再装入三角瓶与蚕豆充分混合，八层纱布包扎，放入30℃恒温培养箱中培养5d，每天摇 匀2次，待蚕豆瓣表面长满孢子后即得到所需的蚕豆曲。将蚕豆曲与浓度16％ 的盐水在瓦罐中以质量体积比1:1.5的比例混匀，放置于45℃恒温箱培养30d 成熟，每天翻酱一次。
组别1～10组中豆瓣酱的制作方法参考组别11，具体为：将孢子浓度为107个/mL的米曲霉和黑曲霉菌悬液按1％(v/w)接种量分别接种到种曲培养基上， 30℃培养72h，24h翻曲一次，制作种曲备用。将蚕豆与水按1:2(w/w)比例 混合浸泡16h脱壳，然后于高压灭菌锅中121℃压力下蒸20min，排气出锅， 冷却。蚕豆与面粉质量比为4:1，将面粉与种曲按0.5％(种曲质量占蚕豆与面粉 总质量)接种量(米曲霉与黑曲霉配比3:1)混合均匀，添加直投式发酵剂(如 表7所示)，其添加量总活菌数为106CFU/g豆瓣酱，再装入三角瓶与蚕豆充分混合，八层纱布包扎，放入30℃恒温培养箱中培养5d，每天摇匀2次，待蚕豆瓣表 面长满孢子后即得到所需的蚕豆曲。将蚕豆曲与浓度16％的盐水在瓦罐中以质量体积比1:1.5的比例混匀，放置于45℃恒温箱培养30d成熟，其间每天翻酱 一次。
使用GC-MS 7890B-7010B(美国Agilent公司)分析豆瓣酱中的风味物质， 采用固相微萃取(SPME)萃取样品中的挥发性有机化合物，并在MRM模式下 对豆瓣酱中6种主要的酯类物质(丙酸乙酯、丁酸乙酯、己酸乙酯、辛酸乙酯、 癸酸乙酯和乙酸苯乙酯)含量进行测定。色谱条件如下，毛细管色谱柱：HP-5MS (30m×250μm×0.25μm)；梯度程序：30℃用于5min；3℃/min升至50℃ 保持3min；5℃/min升至150℃，20℃/min升至250℃保持5min；载气为 He，流速为1.0mL/min，选用不分流模式。
表8发酵豆瓣酱中酯类物质的含量
豆瓣酱中酯类物质含量结果如表8所示，可知组别1(植物乳杆菌CGMCC 21288菌体冻干粉，东方萨伊酵母CICC 31431菌体冻干粉以质量比1：1进行混 合；)中酯类物质总量最高，且丙酸乙酯、丁酸乙酯、己酸乙酯、辛酸乙酯、癸 酸乙酯和乙酸苯乙酯的含量均高于组别2～11，其含量约提高到对照组的1.1～8.0 倍、1.2～2.4倍、1.0～4.0倍、1.2～4.8倍、1.1～7.5倍、1.0～5.0倍，达到了更好的风味增强效果。其原因可能是植物乳杆菌CGMCC21288和东方萨伊酵母CICC 31431起到了协同的作用，促进了酯类物质的生成。此6种酯类物质具有菠萝味、 苹果味、花香味、奶油味等令人愉悦的香气，且阈值较低，对豆瓣酱的特征风 味具有重要的贡献作用。因此，采用该增香型直投式发酵剂能够显著提高豆瓣 酱中酯类的含量，从而改善产品的风味品质。
综上所述，本发明制备的产酯增香型直投式发酵剂具有配制简单、使用方 便、活菌数高、发酵性能优良的特点。且本发明制备的产酯增香型直投式发酵 剂能够显著提高发酵制品，特别是酸鱼、奶酪、酸鲊辣椒与豆瓣酱中酯类的含 量，从而提升发酵产品的风味品质。
以上所述仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限 于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明披露的技术范围内，根据本发 明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范 围之内。
Claims (3)
1.一种增香型直投式发酵剂，其特征在于，所述增香型直投式发酵剂由植物乳杆菌冻干粉和东方伊萨酵母冻干粉按质量比1:(0.5~3)复合而成，所述增香型直投式发酵剂的总活菌数为(1010~1012)CFU/g保护剂固形物；所述植物乳杆菌冻干粉包括植物乳杆菌与植物乳杆菌冷冻保护剂，所述植物乳杆菌为CGMCC 21288，该乳酸菌于2020年12月03日保藏于“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”，保藏号为CGMCC 21288，分类命名为植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)；所述东方伊萨酵母冻干粉包括东方萨伊酵母与东方萨伊酵母冷冻保护剂，所述东方伊萨酵母为CICC 31431；所述增香型直投式发酵剂应用于酸鲊鱼、酸鲊辣椒、奶酪、豆瓣酱的发酵制作；所述增香型直投式发酵剂进行发酵时，其添加量为(106~109)CFU/g物料。
2.一种权利要求1所述增香型直投式发酵剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、植物乳杆菌菌体、东方萨伊酵母菌体的制备：
当制备植物乳杆菌菌体时，其制备方法为：植物乳杆菌菌株经过MRS琼脂平板活化，MRS肉汤一级培养，获得OD600nm＝1.0~10.0的菌液，菌体用无菌生理盐水洗涤1~2次，离心收集后，用适量无菌水悬浮，备用；
当制备东方萨伊酵母菌体时，其制备方法为：东方萨伊酵母菌株经过YPD琼脂平板活化，YPD肉汤一级培养后，获得OD600nm＝1.0~10.0的菌液，菌体用无菌生理盐水洗涤1~2次，离心收集后，用适量无菌水悬浮，备用；
S2、利用S1步骤制备完成的所述植物乳杆菌菌体、东方萨伊酵母菌体，制备植物乳杆菌冻干粉、东方萨伊酵母冻干粉：
当制备植物乳杆菌冻干粉时，其制备方法为：所述S1步骤获得的植物乳杆菌菌体与植物乳杆菌冷冻保护剂混合后，经过冷冻干燥，制成菌种浓度达到(1010~1012)CFU/g的保护剂固形物；
当制备东方萨伊酵母冻干粉时，其制备方法为：所述S1步骤获得的东方萨伊酵母菌体与东方萨伊酵母冷冻保护剂混合后，经过冷冻干燥，制成菌种浓度为(1010~1012)CFU/g的保护剂固形物；
S3、增香型直投式发酵剂的配制：由S2步骤所述植物乳杆菌冻干粉及所述东方萨伊酵母冻干粉按质量比1:(0.5~3)混合。
3.根据权利要求2所述的增香型直投式发酵剂的制备方法，其特征在于，所述植物乳杆菌冷冻保护剂包括质量百分比10~15%蛋白胨、20~30%菊粉、20~30%海藻糖、5~10%海葡萄多糖；所述东方萨伊酵母冷冻保护剂包括质量百分比25~35%蛋白胨、20~30%脱脂乳粉、10~20%海藻糖、5~10%海葡萄多糖，所述质量百分比为：w/w。
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