CN113121663B - 玉米crr1蛋白及其编码基因在调控玉米耐受低温胁迫中的应用 - Google Patents

玉米crr1蛋白及其编码基因在调控玉米耐受低温胁迫中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及植物基因工程技术领域，具体公开了玉米CRR1蛋白及其编码基因在调控玉米耐受低温胁迫中的应用。本发明发现在玉米中过表达CRR1基因，可增强植物的耐低温能力。本发明克隆了CRR1基因，并构建过表达CRR1基因的转基因植物，对获得的转基因玉米进行抗寒性分析发现，过表达CRR1能够提高冷响应基因表达，使玉米获得更强的低温耐受能力。本发明为培育耐低温植物新品种提供了新的基因资源，同时为研究玉米应答低温胁迫的机制奠定一定的理论基础。

Description

玉米CRR1蛋白及其编码基因在调控玉米耐受低温胁迫中的 应用
技术领域
本发明涉及植物基因工程技术领域，具体地说，涉及一种玉米 CRR1蛋白及其编码基因在调控玉米耐受低温胁迫中的应用。
背景技术
玉米(Zea mays L.)是一种来自(亚热带)热带的作物。在上个世纪的后期，它的种植已经转移到更高的地理纬度，但是在温带气候地区扩大玉米种植仍然需要进行耐冷玉米基因型的培育。玉米对低温的敏感性主要是由于光合作用和代谢物运输的下降。玉米幼苗短期暴露于低温度下会导致光合作用活性降低，随后耗散机制和抗氧化***的参与，影响同化物的输运。转基因技术可以把植物的抗逆基因导入需要改良的玉米遗传物质中，并使其后代表现出稳定遗传的抗逆能力，为农业生产提供优良品种资源。
因此，有必要提供一种玉米CRR1蛋白及其编码基因在调控玉米耐受低温胁迫中的应用以解决现有技术的问题。
发明内容
本发明的目的是提供玉米耐低温基因CRR1及其编码蛋白的应用。玉米CRR1与拟南芥中的ARR8同源性最高，但目前未发现拟南芥中的ARR8具有低温表型。本发明通过对玉米冷相关基因CRR1 的研究，发现过表达该基因的转基因植株较野生型植株具有明显抗低温的表型。过表达植株中，ZmDREB1基因表达量发生明显上调。本发明的有益效果在于提供的CRR1基因为培育抗低温植物新品种提供了基因资源。
本发明的目的是提供CRR1蛋白及其编码基因在玉米抗寒中的应用。为发掘玉米抗寒相关基因，本发明筛选了转基因过表达株系的玉米库，并且观察它们的表型，发现不同的过表达基因株系的表型各异，进一步发现过表达CRR1基因的若干株系，都表现为明显的耐冷表型。
具体地，本发明对过表达玉米群体进行筛选，以叶片相对受伤面积为指标，进行低温表型的初步筛选，对初筛有表型的过表达株系进行复筛，确定其低温相关表型，通过查阅过表达信息表发现该株系过表达基因的基因号为GRMZM2G040736，进一步根据gramene网站上的基因注释确定为玉米响应调节子CRR1，统一比对发现CRR1 属于A型响应调节因子，但其功能未见任何报道。通过本发明研究确定CRR1基因可能为玉米抗寒的关键基因。为了实现本发明目的，本发明提供了玉米耐低温基因CRR1，通过在玉米中过表达CRR1基因，获得抗低温的转基因植物。
本发明中涉及的玉米CRR1蛋白的cDNA序列为：i)SEQ ID No.1所示的核苷酸序列；或ii)SEQ ID No.1所示的核苷酸序列经取代、缺失和/或增加一个或多个核苷酸且表达相同功能蛋白质的核苷酸序列；或iii)在严格条件下与SEQ ID No.1所示序列杂交的核苷酸序列。
玉米CRR1 cDNA由783个碱基组成，序列如SEQ ID No.1所示。该基因的读码框为cDNA自5’端第74位到第783位碱基。该基因读码框只由1个外显子组成。由玉米CRR1基因编码的氨基酸序列如 SEQ ID No.2所示。
本发明所述的玉米CRR1蛋白具有以下任意一种氨基酸序列：
1)SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列；或
2)SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列经过一个或多个氨基酸残基的替换、缺失或***获得的具有相同功能蛋白的氨基酸序列。
应当理解，本领域技术人员可根据本发明公开的氨基酸序列，在不影响其活性的前提下，取代、缺失和/或增加一个或几个氨基酸，得到所述蛋白的突变序列。
本发明提供了玉米CRR1蛋白或其编码基因、或含有其编码基因的生物材料在提高植物抗寒性中的应用。
本发明提供了玉米CRR1蛋白或其编码基因、或含有其编码基因的生物材料在选育抗寒性提高的转基因植物中的应用。
本发明提供了玉米CRR1蛋白或其编码基因、或含有其编码基因的生物材料在植物耐冷种质资源改良中的应用。
本发明提供了玉米CRR1蛋白或其编码基因、或含有其编码基因的生物材料在提高低温环境下植物存活率中的应用。
本发明提供了玉米CRR1蛋白或其编码基因、或含有其编码基因的生物材料在正调控冷响应基因ZmDREB1s中的应用。
所述生物材料为表达盒、载体、宿主细胞或重组菌。
本发明还提供含有植物耐低温的CRR1基因序列或其片段的克隆载体或各类表达载体，含有所述载体的宿主细胞，含有所述基因序列或其特异片段的转化植物细胞和转基因植物。其中，含有CRR1 基因的过表达载体为含有Ubi启动子的pBCXUN载体。
本发明还提供了一种转基因植物的制备方法，通过转基因方法提高CRR1基因的表达量，获得具有提高的抗寒能力提高的植物。
具体所述转基因植物的制备方法包括如下步骤：
(1)扩增CRR1基因的全长基因cDNA序列(如SEQ ID NO.1 所示)；
(2)构建CRR1基因的过表达载体；
(3)构建含有CRR1基因的过表达载体的重组农杆菌；
(4)采用农杆菌侵染法，构建CRR1基因过表达的转基因植物。
本发明提供的CRR1蛋白及其编码基因在植物中的应用，其中，所述的植物为单子叶植物或双子叶植物，优选为水稻、小麦、大豆、高粱、小米、棉花、大麦或玉米。
本发明还提供了构建抗寒的转基因玉米的方法，通过转基因、杂交、回交、自交或无性繁殖的方法，使玉米表达或过表达玉米 CRR1基因。
所述转基因包括利用Ti质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、基因枪、电导、农杆菌介导的方法将包含CRR1基因的重组表达载体导入玉米，获得转基因玉米株系。
在本发明的实施例中，构建抗低温的转基因植物的具体方法为：
1)提取玉米总RNA，反转录获得cDNA，以cDNA为模板，F 和R为引物，扩增CRR1基因，将扩增产物构建到表达载体 pBCXUN上，获得的重组表达载体命名为pBCXUN-CRR1；
2)用pBCXUN-CRR1转化农杆菌EHA105，然后利用转化的农杆菌侵染玉米愈伤组织，获得抗低温的转基因玉米幼苗。其中，步骤1)中所述引物F和R的核苷酸序列如SEQ ID No.3和4所示。所述玉米优选为LH244纯合基因型的玉米植株。将本发明的CRR1基因过表达后，玉米表现为抗低温的表型。
所述表达载体为pBCXUN载体，该pBCXUN载体改造自质粒 pCAMBIA1300，为在pCAMBIA1300中连入潮霉素抗性基因得到。
本发明克隆了CRR1基因，并构建过表达CRR1基因的转基因植物，对获得的转基因玉米进行抗寒性分析发现，过表达CRR1能够提高冷响应基因表达，使玉米获得更强的低温耐受能力。本发明为培育耐低温植物新品种提供了新的基因资源，同时为研究玉米应答低温胁迫的机制奠定一定的理论基础。
附图说明
图1为本发明实施例2中CK组和玉米过表达株系的CRR1基因过量表达测试结果图；
图2为本发明实施例3中CK组和玉米过表达株系低温处理恢复后植株生长情况照片；
图3为本发明实施例3中CK组和玉米过表达株系离子渗漏率统计图；
图4为本发明实施例4中2个类型的CRR1基因敲除示意图；
图5为本发明实施例4中CK组和玉米CRR1基因敲除株系低温处理恢复后植株生长情况照片；
图6为本发明实施例4中CK组和玉米CRR1基因敲除株系离子渗漏率统计图；
图7为本发明实施例5中CK组和玉米过表达株系低温处理后 ZmDREB1.1基因表达量测试结果图；
图8为本发明实施例5中CK组和玉米过表达株系低温处理后 ZmDREB1.2基因表达量测试结果图。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的优选实施方式进行详细说明。需要理解的是以下实施例的给出仅是为了起到说明的目的，并不是用于对本发明的范围进行限制。本领域的技术人员在不背离本发明的宗旨和精神的情况下，可以对本发明进行各种修改和替换。
下述实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册(Sambrook J&Russell DW,Molecular cloning:a laboratory manual,21)，或按照制造厂商说明书建议的条件。
以下实施例中的主要试剂为：各种限制性内切酶、Taq DNA聚合酶、T4连接酶、Pyrobest Taq酶、KOD购自NEB、Toyobo等生物公司；dNTPs购自Genestar公司；质粒小提试剂盒和琼脂糖凝胶回收试剂盒购自上海捷瑞生物工程公司；琼脂粉、琼脂糖、氨苄青霉素(Amp)、卡那霉素(Kan)、硫酸庆大霉素(Gen)、利福平(Rif)等抗生素以及Glucose、BSA、LBMedium等购自Sigma、Bio-Rad等公司；实时定量PCR所用的试剂购自于TaKaRa，实施例中所使用的各种其它化学试剂均为进口或国产分析纯试剂。实施例中所使用的引物由六合华大公司合成，并进行相关测序。
实施例1CRR1基因过表达载体的构建和检测
从B73玉米(Zea mays L.)提取总RNA，反转录获得cDNA，以 cDNA为模板，F和R为引物，扩增CRR1基因，引物带有酶切位点，酶切后连到过表达载体上。CRR1基因过表达载体构建方法如下：
(1)用Magen公司的RNA提取试剂盒提取B73玉米总RNA，具体步骤参照试剂盒说明书。
(2)用thermo公司的反转录试剂盒将RNA反转录出cDNA，具体步骤参照试剂盒说明书。
(3)以cDNA为模板，F和R为引物，扩增CRR1基因的cDNA(如 SEQ ID NO.1所示，其编码氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示)，将扩增产物跑电泳切胶回收，回收方法参照天根公司试剂盒说明书。
所用扩增CRR1基因cDNA的引物为：
上游引物F：5’-ATG GCC GCT GCA GCC GCC GC-3’(SEQ ID No.3)
下游引物R：5’-CCG GAT CCG GCT GCA GAG GC-3’(SEQ ID No.4)
(4)将回收的CRR1基因cDNA和pBCXUN载体(pBCXUN载体是以商业化载体pCAMBIA1300为骨架，在pCAMBIA1300中连入潮霉素抗性基因所得到的(Guo et al.,2018Stepwise cis-regulatory changes in ZCN8 contribute to maize flowering-time adaptation.Current Bio.28,3005–3015)；同时将玉米泛素基因Ubi的启动子通过酶切连接的方式克隆到载体上，驱动下游过表达基因的转录)用Xba I和Cla I双酶切，酶切产物跑电泳切胶回收。回收产物用T4连接酶连接。将 CRR1基因连接至pBCXUN载体，以Ubi启动子驱动CRR1基因的表达。
(5)取5μL酶切-连接体系的产物，转化大肠杆菌感受态。在含有50μg/mL卡那霉素的LB平板上筛选。菌落PCR鉴定单克隆，挑选阳性克隆测序。获得的测序正确的重组表达载体命名为 pBCXUN-CRR1。将上一步所得的质粒酶切后，进行电泳检测，具体的方法为：用XbaI和Cla I酶切pBCXUN-CRR1，用1％琼脂糖凝胶， 120V，50mA电泳后，UVP GelDocumentation凝胶分析***扫描成像。
实施例2CRR1基因过表达植物的构建和检测
将实施例1所述含有CRR1基因的pBCXUN载体转化到农杆菌 EHA105菌株中(Ma etal.,2009,Enhanced tolerance to chilling stress in OsMYB3R-2transgenic rice ismediated by alteration in cell cycle and ectopic expression of stressgenes.Plant Physiol.150,244–256)，再侵染玉米愈伤组织，得到转基因幼苗。具体方法为：将含有目的载体的农杆菌接种于100mL LB三抗液体培养液(Kan 50μg/mL，Rif 50 μg/mL，Gen 50μg/mL)中，28℃振荡培养过夜，待OD6值为1.0-2.0，以50g，室温离心15min，收集菌体；用2mL转化液(1/2MS，5％蔗糖，40μL Silwet L-77)悬浮菌体；将玉米愈伤组织浸泡在农杆菌的转化液中，封口。放回光照培养架上正常生长至长出植株。然后进行筛选得到的种子进行低温逆境处理实验。
本实施例中分离得到过表达株系OE-2、OE-3、OE-5、OE-6采用实时定量PCR检测所得过表达株系OE-2、OE-3、OE-5、OE-6中 CRR1的基因表达。具体方法如下：
1)提取植物总RNA，并反转录获得cDNA。
2)将反转录得到的cDNA稀释5倍后，用Takara试剂盒进行实时定量PCR，所用反应体系包括：2×SYBR Premix ExTaq buffer， 0.2μL DyII，0.4μL Primer(F1/R1)，2μL cDNA模板，最后用ddH2O补齐至20μL，充分混匀后放入ABI PRISM 75实时定量PCR仪中进行两步法进行PCR扩增，反应条件为：95℃30s；95℃5s；60℃40s； 40cycles。
其中，引物F1、R1(qRT-PCR的引物)的序列如下：
F1：CAG CCG CCG CTC CAG CAT CT(SEQ ID No.5)
R1：GAC TCC ACG GCG GTC ACC TT(SEQ ID No.6)
PCR反应完成后根据2-Δ(ΔCt)的原理计算出野生型(CK组)和过表达株系(OE)之间相对表达量并作图分析，进行三次生物学重复，三次趋势相近。在扩增所鉴定基因的同时，每个样品以UBI基因作为内参同时扩增。测试结果见图1，从图1中可知，过表达株系的表达量显著高于CK。
实施例3过表达CRR1基因植物的抗低温能力检测
首先将CK组(野生型玉米)和实施例2中获得的OE-2、OE-3、 OE-5、OE-6的种子播种在黑土，进口土和蛭石(质量比1:1:1)的长 10cm，宽10cm，高10cm的小盆里，每个盆里放5粒，再覆2cm土放置于托盘中，浇水至土完全湿润，放置于23℃的培养室中，16小时光照，8小时黑暗。生长14天后进行4℃低温处理2-3天直到第二叶皱缩萎蔫后，拿出来放到23℃培养室恢复两天后拍照以及取材进行离子渗漏率的统计。
CK组和玉米过表达株系低温处理恢复后植株生长情况如图2所示。结果显示，野生型CK叶片严重萎蔫，干枯甚至无法直立，而过表达株系OE-2、OE-3、OE-5、OE-6只有叶尖轻微受伤，且依然保持挺拔直立，表现出抗低温的表型。
本实施例中离子渗漏率的统计通过测叶片的相对电导率 L＝(S1-S0)/(S2-S0)进行。将低温处理后玉米的一整棵植株全部放到装有10ml蒸馏水的15ml离心管中，用真空泵抽气30min，然后置于摇床室温摇1h，之后用电导仪测其初电导值为S1，然后再将样品置于沸水中水浴15min，取出置于摇床摇2h，再测电导率记为S2。S0为空白对照蒸馏水的电导率。
结果显示如图3所示，与野生型植株相比，过表达株系OE-2、 OE-3、OE-5和OE-6的离子渗漏率分别降低32％，30％，27％和40％，达到显著性差异，P<0.01，表明过表达CRR1基因能够使得玉米抗寒能力增强。每次过表达株系(OE)和CK都各取三株苗进行测定，并进行三次生物学重复。
实施例4敲除CRR1基因植物的抗低温能力检测
为了进一步探究CRR1对玉米耐冷性的调控作用，利用 CRISPR/Cas9技术对CRR1基因进行基因敲除。共获得2个类型的突变形式的突变株系(敲除示意图参见图4)。其中，#999株系缺失了 24bp，#618和#651为单碱基***突变。
对CK组以及基因敲除株系#999、#618和#651进行低温处理，具体实验方式为：将CK组(野生型玉米)和基因敲除株系#999、#618 和#651的种子播种在黑土，进口土和蛭石(质量比1:1:1)的长10cm，宽10cm，高10cm的小盆里，每个盆里放5粒，再覆2cm土放置于托盘中，浇水至土完全湿润，放置于23℃的培养室中，16小时光照，8小时黑暗，生长14天后进行4℃低温处理1-2天直到第二叶皱缩萎蔫后，拿出来放到23℃培养室恢复两天后拍照以及取材进行离子渗漏率的统计。受伤情况以第二叶子的受伤比例进行判断。每次敲除株系和CK 都各取三株苗进行测定，并进行三次生物学重复。
本实施例中离子渗漏率的统计通过测叶片的相对电导率 L＝(S1-S0)/(S2-S0)进行。将低温处理后玉米的一整棵植株全部放到装有10ml蒸馏水的15ml离心管中，用真空泵抽气30min，然后置于摇床室温摇1h，之后用电导仪测其初电导值为S1，然后再将样品置于沸水中水浴15min，取出置于摇床摇2h，再测电导率记为S2。S0为空白对照蒸馏水的电导率。
测试结果如图5、图6所示，与CK相比，敲除株系(#651、#999 和#618)叶子萎蔫、干枯卷起，表明对低温敏感。离子渗漏率反应细胞膜的完整性。与CK相比，敲除株系#999、#618、#651的离子渗漏率分别增加40％，33％，24％，达到显著性差异，P<0.01，表明细胞受损伤程度明显高于CK，敲除CRR1基因能够使得玉米抗寒能力减弱。进一步说明CRR1敲除对低温敏感。
实施例5
DREB1s能够被低温快速诱导，是植物响应低温胁迫的关键调控机制。我们对对照(CK)以及CRR1过表达株系中的ZmDREB1家族成员ZmDREB1.1和ZmDREB1.2的冷诱导情况进行了检测。
具体地，本实施例中将CK组和实施例2中获得的过表达株系OE-2、 OE-3分别进行4℃处理0，6，9，12h，并取材提取RNA，反转录得到cDNA。再采用实时定量PCR检测ZmDREB1.1、ZmDREB1.2的基因表达。具体方法如下：
1)提取植物总RNA，并反转录获得cDNA。
2)将反转录得到的cDNA稀释5倍后，用Takara试剂盒进行实时定量PCR，所用反应体系包括：2×SYBR Premix ExTaq buffer， 0.2μL DyII，0.4μL Primer(F1.1/R1.1或F1.2/R1.2)，2μL cDNA模板，最后用ddH2O补齐至20μL，充分混匀后放入ABI PRISM 75实时定量 PCR仪中用两步法进行PCR扩增，反应条件为：95℃30s；95℃5s； 60℃40s；40cycles。
其中，引物(qRT-PCR的引物)F1.1、R1.1用于检测ZmDREB1.1，引物F1.2、R1.2用于检测ZmDREB1.2，它们的序列如下：
F1.1：ATGGACACGGCCGGCCTC(SEQ ID No.7)
R1.1：CTAGTAGTAGCTCCAGAG(SEQ ID No.8)
F1.2：ATGGACATGGGCCGGCAC(SEQ ID No.9)
R1.2：CTAGTAGCTCCAGAGCGCGAC(SEQ ID No.10)
PCR反应完成后根据2-Δ(ΔCt)的原理计算出野生型(CK组)和过表达株系(OE-2、OE-3)之间相对表达量并作图分析，进行三次生物学重复，三次趋势相近。在扩增所鉴定基因的同时，每个样品以 UBI基因作为内参同时扩增。ZmDREB1.1基因表达量测试结果见图7，ZmDREB1.2基因表达量测试结果见图8。从图7、图8中可知，过表达株系ZmDREB1.1和ZmDREB1.2的受低温诱导的倍数明显显著高于CK。在低温处理6h的时候，ZmDREB1.1基因在CK中诱导了5倍，而在OE 中诱导了30倍以上，显著高于CK，P<0.01。同样ZmDREB1.2在低温处理6h后CK中诱导了50倍，而在OE-2中诱导了150倍，在OE-3中诱导了120倍，表达量显著显著高于CK，P<0.01。表明过表达CRR1基因能够使得ZmDERB1基因显著上调。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
序列表
<110> 中国农业大学
<120> 玉米CRR1蛋白及其编码基因在调控玉米耐受低温胁迫中的应用
<130> KHP191116555.4
<160> 10
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 783
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gctgcagcct gactgtctgt tttcagcacc cgcaccacct gactgtctgt tcgcagcacc 60
cggacctgtg tcaatggccg ctgcagccgc cgctccagca tctgtggcgc cgtcctcgcc 120
caaggccgcc ggcgacaaca ggaagacggt ggtgtccgtg gacgcgtcgg agctggagaa 180
gcacgtccta gcggtggacg acagctctgt ggaccgtgcc gtgatcgcca ggatcctgcg 240
tggctccagg tacaaggtga ccgccgtgga gtcagcgacg cgcgcgctgg agctgctcgc 300
gctaggcctg ctccccgacg tcagcatgat catcaccgac tactggatgc ccgggatgac 360
tgggtacgag ctgctcaaac gcgtcaagga gtcggcggcg ctcagaggca tccccgtcgt 420
catcatgtca tcggagaacg tgtccacccg tatcacccgc tgcctggagg agggcgccga 480
gggcttcctc ctcaagcccg tccgccccgc cgacgtctcc cgcctctgca gccggatccg 540
gtgactgcgt gtggtgctat gttaggagct aggatcctca accaaaaaaa aaaagattcc 600
tcttctttct ttctttctct cctgcttgga catagatctt caaacaagga gctaacattt 660
ggggggagac tttttagctt tagggatctc aacaagttgt tcggaacggg ggggatggag 720
cacagcgttg gctgttcttt tctccattcc tcttaataac atcaggtgtc aatgtcatgc 780
acg 783
<210> 2
<211> 156
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Met Ala Ala Ala Ala Ala Ala Pro Ala Ser Val Ala Pro Ser Ser Pro
1 5 10 15
Lys Ala Ala Gly Asp Asn Arg Lys Thr Val Val Ser Val Asp Ala Ser
20 25 30
Glu Leu Glu Lys His Val Leu Ala Val Asp Asp Ser Ser Val Asp Arg
35 40 45
Ala Val Ile Ala Arg Ile Leu Arg Gly Ser Arg Tyr Lys Val Thr Ala
50 55 60
Val Glu Ser Ala Thr Arg Ala Leu Glu Leu Leu Ala Leu Gly Leu Leu
65 70 75 80
Pro Asp Val Ser Met Ile Ile Thr Asp Tyr Trp Met Pro Gly Met Thr
85 90 95
Gly Tyr Glu Leu Leu Lys Arg Val Lys Glu Ser Ala Ala Leu Arg Gly
100 105 110
Ile Pro Val Val Ile Met Ser Ser Glu Asn Val Ser Thr Arg Ile Thr
115 120 125
Arg Cys Leu Glu Glu Gly Ala Glu Gly Phe Leu Leu Lys Pro Val Arg
130 135 140
Pro Ala Asp Val Ser Arg Leu Cys Ser Arg Ile Arg
145 150 155
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
atggccgctg cagccgccgc 20
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
ccggatccgg ctgcagaggc 20
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
cagccgccgc tccagcatct 20
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
gactccacgg cggtcacctt 20
<210> 7
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
atggacacgg ccggcctc 18
<210> 8
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
ctagtagtag ctccagag 18
<210> 9
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
atggacatgg gccggcac 18
<210> 10
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
ctagtagctc cagagcgcga c 21

Claims (10)

1.玉米CRR1蛋白或其编码基因、或含有其编码基因的生物材料在提高植物抗寒性中的应用，所述玉米CRR1蛋白具有SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列，所述生物材料为表达盒、载体、宿主细胞或重组菌。
2.玉米CRR1蛋白或其编码基因、或含有其编码基因的生物材料在选育抗寒性提高的转基因植物中的应用，所述玉米CRR1蛋白具有SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列，所述生物材料为表达盒、载体、宿主细胞或重组菌。
3.玉米CRR1蛋白或其编码基因、或含有其编码基因的生物材料在植物耐冷种质资源改良中的应用，所述玉米CRR1蛋白具有SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列，所述生物材料为表达盒、载体、宿主细胞或重组菌。
4.玉米CRR1蛋白或其编码基因、或含有其编码基因的生物材料在提高低温环境下植物存活率中的应用，所述玉米CRR1蛋白具有SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列，所述生物材料为表达盒、载体、宿主细胞或重组菌。
5.玉米CRR1蛋白或其编码基因、或含有其编码基因的生物材料在正调控冷响应基因ZmDREB1s中的应用，所述玉米CRR1蛋白具有SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列，所述生物材料为表达盒、载体、宿主细胞或重组菌。
6.根据权利要求1-5任一所述的应用，其特征在于，所述玉米CRR1蛋白的cDNA具有以下任一种核苷酸序列：
(1)SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列，或
(2)SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列经过一个或多个核苷酸的替换、缺失或***获得的具有相同功能蛋白的编码核苷酸序列。
7.如权利要求1-4任一所述的应用，其特征在于，所述植物为单子叶植物或双子叶植物。
8.如权利要求7所述的应用，其特征在于，所述植物为水稻、小麦、大豆、高粱、小米、棉花、大麦或玉米。
9.构建抗寒的转基因玉米的方法，其特征在于，通过转基因、杂交、回交、自交或无性繁殖的方法，使玉米过表达玉米CRR1基因，所述玉米CRR1基因编码的蛋白具有SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列。
10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，所述转基因包括利用Ti质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、基因枪、电导或农杆菌介导的方法将包含所述玉米CRR1基因的重组表达载体导入玉米，获得转基因玉米株系。
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