CN101921774A

CN101921774A - 一种拟南芥DnaJ-like蛋白及其编码基因的应用

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Publication number: CN101921774A
Application number: CN201010180453.9A
Authority: CN
Inventors: 卢山; 杨海燕; 王彦文
Original assignee: Nanjing University
Current assignee: Nanjing University
Priority date: 2010-05-24
Filing date: 2010-05-24
Publication date: 2010-12-22
Anticipated expiration: 2030-05-24
Also published as: CN101921774B

Abstract

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种拟南芥DnaJ-like蛋白及其编码基因在植物抵抗干旱、低温以及外源脱落酸等非生物胁迫过程中的应用。拟南芥DnaJ-like蛋白基因是下列核苷酸序列之一：1)序列表中SEQ ID №：1的DNA序列；2)编码序列表中SEQ ID №：2蛋白质的多核苷酸；3)与序列表中SEQ ID№：1限定的DNA序列具有80％以上同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA序列。本发明所述拟南芥DnaJ-like蛋白是具有序列表中SEQ ID №：2氨基酸残基序列的蛋白质，或者是将SEQ ID №：2的氨基酸经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加且具有与SEQ ID №：2的氨基酸序列相同活性的由SEQ ID №：2衍生的蛋白质。本发明所述基因对植物的耐旱、耐脱落酸等耐逆性及相关性状的改良有重要的意义。

Description

一种拟南芥DnaJ-like蛋白及其编码基因的应用

一、技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种拟南芥DnaJ-like蛋白及其编码基因在植物抵抗干旱、低温以及外源脱落酸等非生物胁迫过程中的应用。

二、背景技术

植物生长在自然环境中，不可避免地会遇到冷、热、旱、涝、盐碱、大气污染等诸多不良环境的影响。当不良环境作用于植物时，会引起植物体内发生一系列的生理代谢反应，表现为代谢和生长的可逆性抑制，严重时甚至会引起各个组织的不可逆伤害，导致整个植株死亡。在各种环境胁迫中，干旱、低温和高盐等非生物胁迫对植物的影响尤为突出，这些环境胁迫因子通过对植物体内水分状况的不同程度的影响，从而制约植物的生长和农作物的产量，成为全球农业减产的主要因素。

然而，植物在长期的进化中，逐渐形成了一系列应答逆境胁迫的生理、代谢以及防御***。当植物在受到胁迫时，许多基因的表达会发生改变，是多个基因相互作用共同协调的过程，由此产生了一系列的从细胞到生理水平的应答性反应和适应性调整，如膜组分的改变，可溶性蛋白的增加，糖分与脯氨酸的积累等，从而降低或消除这些不良环境给植株带来的危害，使植物的耐逆性增强(Bray E.A.et al.(2002)Response to Abiotic Stress In B Buchanan，WGruissem，R Jones，eds，Biochemistry and Molecular Biology of Plants.Academic Press，pp 1158-1204)。部分逆境反应基因往往就是耐逆功能基因，参与植物的耐逆适应过程，从而达到抵抗逆境、保护细胞正常活动的目的。通过对这些基因及其编码产物的分析研究有助于人们从分子水平上了解植物耐受胁迫的调控机制，从而帮助人们用分子生物学方法合理地改造和优化胁迫耐受性状以提高作物的生产力。

揭示植物胁迫应答过程的分子机理一直是人们长期探索的重大课题，研究发现，外界环境胁迫可以诱导植物体内DnaJ-like蛋白的表达，这些J蛋白能够与变性或异常状态的蛋白质结合来防止蛋白质凝集，保护细胞结构的完整性，因而在植物对高温胁迫、盐胁迫和重金属胁迫等方面的顺应过程中发挥要作用。而DnaJ-like蛋白中富含半胱氨酸的结构域CRR(Cysteine-rich region)参与了很多高度保守的细胞过程，包括蛋白质的折叠，蛋白质复合体的组装与分解等，在植物生长发育过程中具有十分重要的生理功能(Lu S et al.(2006)TheCauliflower Or Gene Encodes a DnaJ Cysteine-Rich Domain-ContainingProtein That Mediates High-Levels of b-Carotene Accumulation.Plant Cell18：3594-3605)。

三、发明内容

本发明需要解决的问题是提供一种拟南DnaJ-like蛋白及其编码基因在植物抵抗干旱、低温以及外源脱落酸等非生物胁迫过程中的应用。

本发明所提供的与抗逆性相关的DnaJ-like蛋白基因，特征是来源于拟南芥(Arabidopsis thaliana)，名称为CRR1，是下列核苷酸序列之一；

(1)多核苷酸序列为：

1 atgagtccga tcgtcataac ccagttagct acaggaatca gcgttttagc 50

51 cggtgcggtc tttatcaaat cagtcatgga ccaaaagcct atggctggtc 100

101 aattccctcg ttgtccgact tgtaacggta ctggacgagt cacgtgtttc 150

151 tgttctcgat ggtccgatgg tgacgttgga tgtcgtaggt gttctggttc 200

201 aggtcgtgcg gcttgtagca attgtggtgg ttctggaact ggtagacctt 250

251 taccggctca gattacggtt cagccaccga atcgtcctta ttga 294

(2)编码下面所述蛋白质氨基酸序列的多核苷酸序列：

Met Ser Pro Ile Val Ile Thr Gln Leu Ala Thr Gly Ile Ser Val Leu

1 5 10 15

Ala Gly Ala Val Phe Ile Lys Ser Val Met Asp Gln Lys Pro Met Ala

20 25 30

Gly Gln Phe Pro Arg Cys Pro Thr Cys Asn Gly Thr Gly Arg Val Thr

35 40 45

Cys Phe Cys Ser Arg Trp Ser Asp Gly Asp Val Gly Cys Arg Arg Cys

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Arg Ala Ala Cys Ser Asn Cys Gly Gly Ser Gly Thr

65 70 75 80

Gly Arg Pro Leu Pro Ala Gln Ile Thr Val Gln Pro Pro Asn Arg Pro

85 90 95

Tyr

97

(3)与(1)所述多核苷酸序列具有80％以上同源性，且编码相同功能蛋白质的多核苷酸序列。

本发明所提供的与抗逆性相关的DnaJ-like蛋白，其特征是来源于拟南芥(Arabidopsis thaliana)，名称为CRR1，是下列氨基酸残基序列之一：

(1)氨基酸序列为：

Met Ser Pro Ile Val Ile Thr Gln Leu Ala Thr Gly Ile Ser Val Leu

1 5 10 15

Ala Gly Ala Val Phe Ile Lys Ser Val Met Asp Gln Lys Pro Met Ala

20 25 30

Gly Gln Phe Pro Arg Cys Pro Thr Cys Asn Gly Thr Gly Arg Val Thr

35 40 45

Cys Phe Cys Ser Arg Trp Ser Asp Gly Asp Val Gly Cys Arg Arg Cys

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Arg Ala Ala Cys Ser Asn Cys Gly Gly Ser Gly Thr

65 70 75 80

Gly Arg Pro Leu Pro Ala Gln Ile Thr Val Gln Pro Pro Asn Arg Pro

85 90 95

Tyr

97

(2)将(1)所述蛋白的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与(1)所述蛋白的氨基酸残基序列相同活性的衍生的蛋白质氨基酸序列。

本发明所述拟南芥与抗逆性相关的DnaJ-like蛋白的基因CRR1的启动子(pCRR1)，其特征是来源于拟南芥(Arabidopsis thaliana)，是下列核苷酸序列之一：

(1)核苷酸序列为：

1 ccaactctct cctacaactt gacacatcag cacatgagag cttcccacct 50

51 aaacttcata aaataaataa tacataaata gtaattaatt caacataata 100

101 actaaaatag gaggatataa ttaatcagaa cttgaaccat cactctttct 150

151 acatttttta attcaatata tcctttttaa ttttgagatc caaacatgtt 200

201 acacatattc cttgcctaaa aattacacga ttattatgaa agaaactaaa 250

251 tgaatatgca gattaaatat atctaagctt ttcaagattt atgctaagaa 300

301 aacaagtaat ttgaaagatg tttgaggagt tatccttaaa actaatacgt 350

351 aagatagaag attatgacaa gaacttaact aaactttcca agaacatcaa 400

401 gttgaatatg attagattgg ttatgcagag acatggttaa taaaaacatg 450

451 ttatatttta aatgtaagaa agaaattttc taaaatttca ccgtttcaca 500

501 aactaaatat ataaccaaaa gaacaaggat atataaatta aaaaaaaaaa 550

551 ctgagaatct agaacaacaa taaaaaataa ctcaagcatt ttcgttttca 600

601 gatgaactaa tatagttgga ctttttgaaa acaattacaa atcatattta 650

651 tgtttcaaaa ccgatgcatt taactttact ttatatgaac agacattata 700

701 taaaacaatt tgtaaatagt aatacataaa cccgcacgta gtgcgggtac 750

751 tcatctagta tacaataata aaaacttcaa aatgatgcaa caatagctca 800

801 gaatcttcat atatgggcca ctcggcccac gccgaatttg aaaagcccga 850

851 tattggaagt aagcacgtgc ggttgtgaga attgcttctt cgtccaccat 900

901 tggacatgtt tatggctgcg ttcgacgcgt gatttgtttg tggagaagag 950

951 tgcatcgcct gataattcaa gcaacctagt tatagtacaa acgtgaaaga 1000

1001 aacaaaatta acccaaaaaa tgaaatggaa ggttacaatt gcaacccttg 1050

1051 caagatagta caacaatata atagtaacaa tagaacaata aaccctaacc 1100

1101 aaacaaagta agaattacat tcctctaatt ttagtgcatg taagttcggt 1150

1151 tatcactgca aacttaatca tttccctatt gactaattcg taacatagtt 1200

1201 tatactttcg attaatcaat taattaattt acagtgaatt tgtgaaaaac 1250

1251 ttctaacgag aaacttatta tgttataaaa gtcaacaaaa gaactgtatc 1300

1301 acacagaaca tatatattgg gtctgattgg taaccaaaaa ctatacaagt 1350

1351 tatttagctg ttagctttat cggaatagtg taaaactgtt aaaatgagct 1400

1401 gtacaaaaaa actgagagta aatttttttg taacgctttt gataaagttt 1450

1451 ttgtgattag taactgtcaa aattgtattg ttattaaaat ggttaccatt 1500

1501 caaatctatt aggtaaaata cagagccgtc cataagtaca agcgggtcaa 1550

1551 acacaagctt gtggcctcaa ttactataaa taaaattttg atttttttta 1600

1601 gtagaaaaat tagttgcttg cttctttgat gacaaaaaaa aaaaagcaag 1650

1651 cagtcagata aatcaatgat aatctaaaaa aaagaaaaat ctgacgaaaa 1700

1701 aaaaaaagaa aaaaaagaaa aatctgaagg ttgtacactt gtagaagata 1750

1751 ttttacacac acagcccaat aaaaacccaa atccaaaaac tggagtatcc 1800

1801 aaaaaaaaca cggctgtttc attcatctcc tcacacaaca acttaaccct 1850

1851 cactagccca cgtgtttact ttctcaacca ttcccttatc tcccaaaatt 1900

1901 gtatttactt caaaaataaa ccgaaccgta tcaaattaaa acaagaccac 1950

1951 acttttgtct gaacacaaaa aaaaaaaaaa cttttatttt ttcctcgaga 2000

2001 cgtctctctt cttcaatttc ttcacgattc tacttttgcg ttatccccaa 2050

2051 aattggcaac caaaaccaaa cctctctctc ttattgaaac caaca 2095

(2)与(1)所述的DNA序列具有80％以上同源性且具有启动所述编码拟南芥与耐逆性相关的DnaJ-like蛋白的基因转录功能的核苷酸序列。

含有本发明基因和/或启动子的重组表达载体、转基因细胞系及宿主菌均属本发明的保护范围。

扩增本发明基因和/或启动子中任一片段的引物对也在本发明的保护范围之内。

本发明的技术方案为：

1)总RNA的提取

选用RNAiso试剂(Takara公司)提取拟南芥总RNA，经电泳检测和紫外分光光度计检测确认RNA的完整性、纯度以及浓度，于-80℃保存；

2)拟南芥DnaJ-like蛋白基因CRR1的克隆

根据DnaJ-like蛋白基因CRR1的全长编码序列，设计两端引物并在上游和下游分别引入EcoRI和XhoI限制性内切酶位点：

上游引物：CCATCCATGAGTCCGATCGTCATAACCCAG

下游引物：CTCGAGTCAATAAGGACGATTCGGTGGC

用1μg步骤1)获得的总RNA作为反转录的模板，经反转录合成cDNA第一链后，进行PCR扩增，PCR程序如下：94℃预变性2min；94℃变性30s，58℃退火1min，72℃延伸30s，35个循环后，72℃10min，将PCR产物连接至pGEM-T(Promega公司)载体，测序后将获得具有完整编码区的拟南芥DnaJ-like蛋白基因CRR1的cDNA序列SEQ ID No：1。

3)植物表达载体的构建

将步骤2)获得的含有CRR1完整编码区的pGEM-T重组载体用限制性内切酶EcoRI和XhoI(Takara公司)进行酶切，并连接到中间载体pRTL2的CaMV35S启动子后，而后利用内切酶HindIII(Takara公司)进一步克隆到双元转化载体pCAMBIA1300中；

4)转基因植株的获得

将步骤3)获得的表达载体转入农杆菌，进一步转入野生型拟南芥，对获得的转基因植株进行抗性筛选、PCR以及RT-PCR验证后进行植物的耐逆性评价，转基因植株和野生型对照植株进行耐逆性分析。

本发明提供的CRR1基因功能是参与植物的低温、干旱和脱落酸胁迫应答反应，半定量反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)分析表明CRR1在低温(4℃)、干旱(不浇水两周)和脱落酸(4uM)诱导条件下表达增强。

本发明提供的CRR1蛋白功能是通过与myb类转录因子相结合参与植物对低温、干旱和脱落酸胁迫的应答反应，酵母双杂交筛库实验表明CRR1与拟南芥中一个myb家族转录因子有相互作用。

本发明的CRR1基因来源于拟南芥，具有适合拟南芥等双子叶植物表达的优化密码子，其基因工程受体植物除了水稻、玉米、小麦等单子叶植物，更适合于烟草、大豆、棉花等双子叶植物。

利用本法发明的CRR1基因作为目的基因构建植物表达载体，可以利用花椰菜花叶病毒CAMV35S启动子、乙醇诱导启动子等，必要时可以包括增强子。为了简化转化植株的鉴定，可使用选择性标记(如抗生素酶)。所用的表达载体可使用Ti质粒、Ri质粒以及植物病毒载体等。转化方法可用农杆菌介导法或其他方法转化植物。

本发明与现有技术相比其有益效果是：

本发明的基因不但可以用来改良农作物的耐逆性，而且对植物抵抗逆境的应答反应的分子机制研究具有十分重要的价值。该基因在植物中过表达后可以提高植物的耐旱性和耐外源脱落酸性等耐逆功能，对植物品种的改良有重要意义。

四、附图说明

图1：不同逆境胁迫对基因CRR1、RD22、RD29A以及KIN1表达的影响

A：用浓度为250mM的NaCl溶液处理野生型拟南芥后各基因的表达情况。3h，6h，9h表示NaCl溶液对植物处理的时间，c表示对照组，对照组用水处理。

B：野生型拟南芥在4℃环境中各基因的表达情况。1d，2d，3d表示植物在4℃环境中处理的时间，c表示对照组，对照组为22℃下生长的植物。

C：用浓度为4uM的脱落酸溶液处理野生型拟南芥后各基因的表达情况。2h，4h，6h表示脱落酸溶液对植物处理的时间，c表示对照组，对照组用水处理。

D：对野生型拟南芥进行干旱处理后各基因的表达情况。12d表示植物连续12天不浇水，c表示对照组，对照组正常浇水。

图2CRR1过表达突变体中各个基因的表达情况以及耐旱性实验

A，C：耐旱实验前，CRR1过表达突变体9号品系与野生型的生长状况

B，D：干旱结束，恢复浇水后CRR1过表达突变体9号品系与野生型的生长状况

干旱前：生长三周的幼苗在干旱实验前最后一次浇水时的生长状况

干旱后：耐旱实验(从干旱前最后一次浇水起计算，连续两周不浇水)后恢复浇水第三天时幼苗的生长状况。

E：CRR1以及胁迫诱导基因在CRR1的过表达突变体和野生型中的表达情况

实验所用植物为生长3周左右的拟南芥幼苗叶子，其中，1：野生型拟南芥，2：CRR1过表达突变体的9号品系，3：CRR1过表达突变体的11号品系。RD22、RD29A、DREB2A以及KIN1为胁迫诱导基因，ACT8为内参基因。

图3CRR1过表达突变体与野生型拟南芥的脱落酸耐受性比较

突变体：CRR1过表达突变体9号品系

培养基为含有0.5uM脱落酸的MS固体培养基，幼苗生长时间为两周左右

图4CRR1的组织表达特异性

实验材料为CRR1启动子驱动GUS表达的转基因拟南芥(Pcrr1-GUS)

A：两片子叶时期幼苗B：已抽苔植物的花苞

C：刚刚的抽苔植株D：开始结种子时期的植株

图5CRR1的亚细胞定位

A，B：20×物镜下激光扫描叶片表皮，绿色荧光蛋白集中在叶片的气孔保卫细胞中表达

C：40×物镜下激光扫描叶片表皮，绿色荧光蛋白在叶片细胞的质体中表达

实验所用材料均为生长三周的CRR1启动子驱动GFP表达的转基因拟南芥(Pcrr1-GFP)幼苗叶片，激发波长为405nm，发射波长为513nm

图6酵母双杂交验证CRR1与其它蛋白的相互作用

pGBKT7空载体和CRR-pGBKT7分别热激转入酵母AH109菌株中；

AT1G12050-pGADT7，AT1G32100-pGADT7，AT1G70760-pGADT7，

AT5G29000-pGADT7分别热激转入酵母Y187菌株中。用酵母杂交法验证空载体以及CRR1蛋白与其他蛋白的相互作用。

A：空载体和CRR1与其他蛋白的杂交产物在缺少丝氨酸和亮氨酸的SD平板上的生长情况

B：空载体和CRR1与其他蛋白杂交产物在缺少丝氨酸、亮氨酸和组氨酸并加入腺嘌呤的SD平板上的生长情况

图中AT1G12050、AT1G32100、AT1G70760和AT5G29000分别代表重组载体AT1G12050-pGADT7、AT1G32100-pGADT7、AT1G70760-pGADT7和AT5G29000-pGADT7。

五、具体实施方式

1)拟南芥CRR1基因编码序列的克隆

取若干拟南芥野生型种子于1.5mL离心管中，首先用75％乙醇表面杀菌2～3次，再经无菌水清洗2～3次去除残余乙醇，锡箔包裹装有种子的离心管避光置于4℃同步化3天，播种于含有蛭石的土壤中(蛭石与土壤的体积比为1∶4)，植物生长的光周期为14h光照/10h黑暗，环境温度为22℃。

选用RNAiso试剂(Takara公司)提取野生型拟南芥叶片总RNA，经电泳检测和紫外分光光度计检测确认RNA的完整性、纯度以及浓度，于-80℃保存。用1μg总RNA作为反转录模板，使用Takara公司的“PrimeScript^TM 1stStrand cDNA SynthesisKit”试剂盒反转合成cDNA第一链。

根据DnaJ-like蛋白基因CRR1的全长编码序列，设计两端引物并在上游和下游分别引入EcoRI和XhoI限制性内切酶位点(引物由Genscript公司合成)：

上游引物：CCATCCATGAGTCCGATCGTCATAACCCAG

下游引物：CTCGAGTCAATAAGGACGATTCGGTGGC

用1μg步骤1)获得的总RNA作为反转录的模板，经反转录合成cDNA第一链后，进行PCR扩增，PCR程序如下：94℃预变性2min；94℃变性30s，58℃退火1min，72℃延伸30s，35个循环后，72℃10min。反应结束后将PCR产物连接至pGEM-T载体(Promega公司)，连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞后筛选阳性克隆，得到携带CRR1的重组载体，命名为pGEM-T-CRR1，对其进行测序(Genscript公司完成)，测序表明获得序列表中SEQ ID No：1的核苷酸序列，由294个碱基组成，编码序列表中SEQ ID No：2的氨基酸残基序列，该序列含有三个串联的CxxCxGxG锌指结构。

运用Genevestigator数据库对它们在不同生长阶段的表达情况进行分析，发现CRR1在整个生长过程中表达量都比较低，而当植物的种子开始成熟，即整个植株发生衰老时表达突然增高；对CRR1在不同组织中的表达情况进行分析，发现CRR1在花的萼片中表达很高，而在植株的其他组织中表达量都比较低，在根中几乎不表达；对CRR1在不同刺激条件下的表达情况进行分析，结果表明，CRR1在干旱、冷、脱落酸等非生物因素引起的水分胁迫条件下表达增高。最后，对CRR1上游1000bp的启动子序列进行分析，发现序列上存在多个如TATA box、CAAT box、ABRE-like sequence、MYB/MYC recognition site、Binding sitefor MYB/MYC、DPBF-1/2binding core sequence、ABRE-related sequence以及ARR1-bindingelement等顺式作用元件，这些元件参与了植物抵抗干旱胁迫或者脱落酸胁迫的转录调控。由以上结果，我们推测CRR1参与了植株抵抗包括衰老在内的与水分胁迫相关的生理过程。

2)环境胁迫诱导CRR1的表达

为了检测CRR1基因与逆境胁迫的应答关系，我们选取NaCl、脱落酸、低温以及干旱这四种逆境对拟南芥CRR1基因在转录水平上的表达特性进行了研究。

进行胁迫处理的植物材料为生长四周左右的野生型拟南芥。进行脱落酸和NaCl处理时，在正常生长条件下选择用4uM的脱落酸溶液或者250mM的NaCl溶液直接喷洒到需要进行处理的拟南芥幼苗上，对照组喷洒水。进行冷处理时，将幼苗放置于4℃环境中，对照组置于正常生长温度(22℃)环境中。将需要进行干旱处理的植物置于正常生长条件下不予浇水两周左右，对照组正常浇水。用RT-PCR分析CRR1以及脱水响应基因RD29A、RD22和KIN1的表达差异(图1)。实验结果表明，CRR1与RD29A、RD22和KIN1一样都可以被干旱，冷以及脱落酸胁迫诱导表达，但是盐胁迫可以诱导RD29A、RD22和KIN1的表达却对CRR1表达基本没有影响。同时RT-PCR结果表明，CRR1在冷胁迫和干旱胁迫的后期被诱导表达(图1-B，图1-D)，而在脱落酸胁迫2小时就被大量诱导表达，4小时和6小时后表达量基本恢复到诱导前的水平(图1-C)。以上结果说明CRR1参与了植物抵抗冷、干旱和脱落酸胁迫的生理过程，并且，CRR1的诱导表达需要植物内脱落酸的积累，因此推测CRR1是通过脱落酸信号途径参与植物抵抗水分胁迫的应答反应。实验中盐胁迫条件下CRR1的表达基本不受影响，这是因为CRR1可能位于调控途径的下游，在轻度胁迫条件下几乎不被诱导表达。

3)CRR1过表达突变体增强植物的耐旱性

当植物蒸腾速率超过水分吸收速率或土壤缺乏植物可利用的水分时，植物受到干旱胁迫。干旱胁迫是植物逆境最普遍的形式，在许多地区是农业发展的瓶颈。植物为了适应干旱胁迫，一些与干旱胁迫有关的保护性物质及其基因被诱导增加表达。我们可以通过分析CRR1的过表达突变体中与逆境相关的其它基因的表达情况，从而确定CRR1的转入直接或间接的影响各个基因的信号转导过程。RT-PCR结果表明，在CRR1过表达突变体的两个品系中，干旱相关基因RD29A、DREB2A和KIN1与野生型相比表达均有上升，RD22变化不明显(图2-E)。

为了进一步研究CRR1基因在植物应对干旱胁迫过程的作用，我们对CRR1过表达突变体以及野生型拟南芥进行耐旱实。进行耐旱实验的拟南芥野生型及突变体均为生长四周大小的幼苗，生长条件不改变，从最后一次浇水计算起连续两周不浇水进行干旱胁迫，观察幼苗的生长情况，而后在恢复浇水的第三天再次观察幼苗的生长情况，统计存活率(图2A-D)。

实验表明在正常条件下，突变体与野生型的生长状态基本一致。在干旱胁迫下，CRR1基因的过表达突变体较野生型更晚萎蔫，存活率也高于野生型。过表达突变体的干旱两周后浇水之后的存活率为40％左右，而野生型的存活率为2％左右。以上结果说明CRR1基因对植物的耐旱性有增强作用。

4)CRR1过表达突变体增强植物的耐脱落酸性

根据RT-PCR的实验结果，野生型拟南芥在受到外源脱落酸胁迫时CRR1、RD22和KIN1基因的表达均上调，说明CRR1参与了植物应对脱落酸胁迫的应答过程(图1-C)。为了进一步研究CRR1在植物应对脱落酸的胁迫过程中发挥的作用，我们对CRR1的过表达突变体和野生型拟南芥进行了脱落酸耐性实验，进行脱落酸耐受性实验时，配置含有0.5uM脱落酸的MS固体培养基，种子经过消毒以及同步化处理后播种于培养基表面，放置于正常生长环境中，定期进行观察(图3)。实验结果表明：在含有0.5uM脱落酸的MS培养基上，CRR1过表达突变体和野生型的生长都比较缓慢，但是突变体较野生型更早萌发，且根系生长明显好于野生型，植株生长更加健康。以上结果说明，CRR1基因可以增强植物对脱落酸的耐受性。

5)CRR1的组织表达特异性

为了考察CRR1启动子是否具有组织表达特异性，我们构建了CRR1启动子(CRR1上游2095bp，序列表中SEQ ID No：3)连同去掉终止密码子的CRR1与GUS报告基因融合表达的重组载体，并通过农杆菌的介导将其转入到野生型拟南芥中，利用潮霉素(Hygromycin B，购于BBI)筛选得到阳性植株(Pcrr1-GUS)。选择不同生长时期的CRR1启动子驱动GUS表达的转基因拟南芥植株(Pcrr1-GUS)置于1.5mL或10mL离心管中(视植株大小而定)，室温下用90％丙酮脱色处理20min，然后浸没在染色液(10mL配方：0.5mL 1mol/L磷酸钠缓冲液，pH7.2，0.2mL10％Triton X-100，0.4mL 50mmol/L铁***，0.4mL 50mmol/L亚铁***，1mL 20mmol/L X-Gluc，7.5mL H2O)中冰浴10min，而后真空抽吸15～20min。样品于37℃避光染色过夜(约20h)。用70％乙醇进行冲洗脱色后即可直接观察或用显微镜进行观察(图4)。

实验结果表明：CRR1启动子驱动的GUS基因在根中几乎不表达，其他组织均有表达；两片叶子至六片叶子时期叶子的各个部分都有GUS的表达，且叶脉处表达较多(图4-A)；当植株成熟后，植株的各个部分都有GUS的表达，但叶片中的表达比较集中于叶片的边缘，茎里的表达集中于有花苞和有果荚的部分，花苞的表达集中在萼片上(图4B-D)。以上结果表明CRR1通过感受由成熟以及衰老引起的植物水分变化参与了植物的衰老过程。

6)CRR1的亚细胞定位

为了考察CRR1在植物细胞中的亚细胞定位，我们同样构建了CRR1启动子(CRR1上游2095bp，SEQ ID No：3)连同去掉终止密码子的CRR1与绿色荧光蛋白GFP报告基因融合表达的重组载体，通过农杆菌的介导将其转入到野生型拟南芥中，利用潮霉素(Hygromycin B)筛选得到阳性植株(Pcrr1-GFP)。选取生长四周左右的不同品系含有CRR1启动子驱动GFP的转基因拟南芥植株(Pcrr1-GFP)不同组织在共聚焦显微镜下观察(图5)。激光扫描时，激发波长为405nm，发射波长为513nm。实验结果表明：低倍镜下GFP在叶片气孔的保卫细胞中表达(图5-A，图5-B)，提高物镜倍数后发现，围绕细胞壁有GFP表达(图5-C)，表明GFP在质体上表达，这说明CRR1通过调节气孔参与植物对水分胁迫的应答，

7)芯片结果分析

选用生长四周左右的野生型和CRR1过表达突变体(9号和11号品系)拟南芥幼苗莲座叶作为芯片材料。由上海生物芯片有限公司(SBC)进行芯片杂交等实验。

实验结果显示：CRR1过表达突变体9号品系与野生型相比上调基因为1038个，下调的基因为758个；CRR1过表达突变体11号品系与野生型相比上调基因为583个，下调的基因为423个；其中共同上调的基因为67个，共同下调的基因为49个。

共同上调的67个基因包括：

AT1G73330 AT1G02340 AT2G18050 AT3G28270 AT5G43260 AT3G48360

AT5G04950 AT5G42900 AT3G16450 AT1G01720 AT4G14020 AT1G80130

AT5G54080 AT2G33380 AT3G59350 AT1G08230 AT5G01600 AT1G23040

AT3G19030 AT4G37610 AT5G39610 AT2G30360 AT1G56600 AT3G57520

AT4G15530 AT1G32170 AT2G39310 AT1G22190 AT1G21910 AT4G37410

AT5G09440 AT3G45730 AT1G31820 AT5G65870 AT5G57560 AT4G08950

AT4G11310 AT5G58650 AT5G44260 AT3G11410 AT2G27830 AT5G59820

AT1G61890 AT1G28330 AT5G64260 AT4G10960 AT4G27280 AT4G35750

AT3G50910 AT1G32920 AT3G62260 AT5G11650 AT2G40000 AT3G57450

AT2G37130 AT1G27200 AT1G44100 AT5G62020 AT3G61990 AT1G21000

AT5G49450 AT3G19580 AT5G01520 AT4G01950 AT1G66180 AT5G25350

AT2G30040

共同下调的49个基因包括：

AT2G02810 AT3G57460 AT3G18000 AT2G03260 AT1G13470 AT1G10990

AT3G13950 AT2G19400 AT2G04450 AT1G69720 AT3G17990 AT4G04190

AT3G15140 AT3G04220 AT1G13750 AT1G23790 AT4G24190 AT2G35980

AT5G59680 AT2G30770 AT3G49620 AT3G49320 AT5G48470 AT3G48500

AT5G62550 AT2G44040 AT3G28540 AT4G23310 AT5G55450 AT2G02850

AT1G59980 AT4G25110 AT2G04530 AT4G10500 AT2G18660 AT3G57240

AT5G24530 AT5G60950 AT1G18370 AT3G20440 AT5G17160 AT1G15520

AT2G43570 AT4G23800 AT2G26400 AT2G29350 AT3G28510 AT2G14610

AT2G44240

对实验结果进行聚类分析，表明共同上调基因与下调基因所属分类很相似，包括刺激应答基因、转移酶、受体结合蛋白转录因子及形成细胞壁和细胞外物质的相关基因等。将共同上调的基因和共同下调的基因与genevestigator数据库中的这些基因在不同刺激条件和突变体中的表达情况进行比对分析，结果表明：共同上调的基因在渗透压、盐、低二氧化碳以及干旱胁迫中表达上调，对突变体Aox1A进行干旱处理表达也是上调的；共同下调的基因在干旱胁迫下表达下调，对突变体Aox1A进行干旱处理表达也是下调的。突变体Aox1A是氧化酶基因AT3G22370***突变体，该基因参与植物冷和压力胁迫的应答反应、细胞呼吸以及线粒体信号途径等。综上所述，基因CRR1主要参与了植物对非生物因素引起的水分胁迫的应答反应。

8)CRR1与MYB转录因子的相互作用

根据clontch提供的试剂盒，构建CRR1作为诱饵蛋白(bait protein)与Gal4DNA-binding domain(DNA-BD)融合表达的载体CRR1-PGBKT7，使用热激法转入酵母菌株AH109中，在缺少丝氨酸(-Trp)的SD平板上筛选阳性克隆。筛得的阳性克隆在50mlYPDA中扩大培养，离心后将菌体与转化了拟南芥蛋白载体库(prey-pGADT7)的Y187酵母菌体加入到50ml 2×YPDA中，杂交过夜。将杂交后的菌液离心后用10ml 0.5×YPDA重悬。取其中的100ul分别稀释为1/10、1/100、1/1000和1/10000，涂缺少亮氨酸或/和丝氨酸的SD平板，计算酵母杂交效率；剩余菌液涂缺少亮氨酸和丝氨酸的SD平板以及缺少亮氨酸、丝氨酸、组氨酸并加入腺嘌呤的SD平板筛选阳性克隆。由酵母杂交效率的计算公式得到两次实验的杂交效率均为5％左右。杂交过程中，如果诱饵蛋白(bait)与猎物蛋白(prey)有相互作用，那么DNA-BD与AD相互靠近，从而启动GAL启动子后面4个不同的报告基因(HIS3，ADE2，AUB1-C以及MEL1)的转录，从而使酵母可以在缺陷平板上生长。从缺少亮氨酸、丝氨酸、组氨酸并加入腺嘌呤的SD平板上筛得的阳性克隆扩大培养后提取质粒，利用PCR扩增(引物为T7和3’-DNA-AD)后对产物进行测序，从而确定与CRR1发生相互作用的蛋白，同时将从酵母中抽提的质粒转入酵母菌株Y187，在缺亮氨酸的SD平板上筛选阳性克隆。将这些阳性克隆提取质粒并进行测序鉴定，得到四个与CRR1有相互作用的蛋白，分别是AT1G12050，AT1G32100，AT1G70760和AT5G29000，其中，AT1G32100为松脂醇还原酶(pinoresinol reductase)，AT1G70760是组成叶绿体NAD(P)H脱氢酶复合物的一个亚基，AT5G2900编码一个MYB家族的转录因子。获得的阳性克隆与转化了CRR1-pGBKT7或pGBKT7空载体的AH109阳性克隆进行杂交，验证蛋白间的相互作用是否稳定存在。在验证CRR1与这些蛋白相互作用的酵母双杂交实验(图6)时发现，AT1G12050与空载体pGBKT7也有相互作用，说明它与CRR1的相互作用是假阳性。AT1G32100编码松脂醇还原酶(pinoresinol reductase)，该酶参与植物中木酚素(lignan)的生物合成。木酚素是一种植物***，也是一种抗氧化剂，具有一定的抗氧化活性。AT1G70760是组成叶绿体NAD(P)H脱氢酶复合物的一个亚基，参与PSI的循环电子传递过程。AT5G2900编码一个MYB家族的转录因子。MYB转录因子是最大的植物转录因子家族成员之一，参与了细胞分化、细胞周期的调节，激素和环境因子应答，并对植物次生代谢以及叶片等器官形态建成具有重要的调节作用。在逆境胁迫的转录调控过程中，MYB转录因子通过N端保守的DNA结合域与靶序列特异结合来实现对靶基因的精确调控，而MYB类转录因子的诱导表达通常需要内源脱落酸的积累。结合CRR1在植物对低温、脱落酸和干旱等胁迫应答反应中的实验结果，表明CRR1通过与MYB转录因子相结合参与植物依赖脱落酸信号途径的干旱、低温等胁迫应答反应。

序列表

<110>南京大学

<120>一种拟南芥DnaJ-like蛋白及其编码基因的应用

<160>3

<210>1

<211>294

<212>DNA

<213>拟南芥属拟南芥(Arabidopsis Thaliana)

<400>1

1 atgagtccga tcgtcataac ccagttagct acaggaatca gcgttttagc 50

51 cggtgcggtc tttatcaaat cagtcatgga ccaaaagcct atggctggtc 100

101aattccctcg ttgtccgact tgtaacggta ctggacgagt cacgtgtttc 150

151tgttctcgat ggtccgatgg tgacgttgga tgtcgtaggt gttctggttc 200

201aggtcgtgcg gcttgtagca attgtggtgg ttctggaact ggtagacctt 250

251taccggctca gattacggtt cagccaccga atcgtcctta ttga 294

<210>2

<211>97

<212>PRT

<213>拟南芥属拟南芥(Arabidopsis Thaliana)

<400>2

Met Ser Pro Ile Val Ile Thr Gln Leu Ala Thr Gly Ile Ser Val Leu

1 5 10 15

Ala Gly Ala Val Phe Ile Lys Ser Val Met Asp Gln Lys Pro Met Ala

20 25 30

Gly Gln Phe Pro Arg Cys Pro Thr Cys Asn Gly Thr Gly Arg Val Thr

35 40 45

Cys Phe Cys Ser Arg Trp Ser Asp Gly Asp Val Gly Cys Arg Arg Cys

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Arg Ala Ala Cys Ser Asn Cys Gly Gly Ser Gly Thr

65 70 75 80

Gly Arg Pro Leu Pro Ala Gln Ile Thr Val Gln Pro Pro Asn Arg Pro

85 90 95

Tyr

97

<210>3

<211>2095

<212>DNA

<213>拟南芥属拟南芥(Arabidopsis Thaliana)

<400>3

1 ccaactctct cctacaactt gacacatcag cacatgagag cttcccacct 50

51 aaacttcata aaataaataa tacataaata gtaattaatt caacataata 100

101 actaaaatag gaggatataa ttaatcagaa cttgaaccat cactctttct 150

151 acatttttta attcaatata tcctttttaa ttttgagatc caaacatgtt 200

201 acacatattc cttgcctaaa aattacacga ttattatgaa agaaactaaa 250

251 tgaatatgca gattaaatat atctaagctt ttcaagattt atgctaagaa 300

301 aacaagtaat ttgaaagatg tttgaggagt tatccttaaa actaatacgt 350

351 aagatagaag attatgacaa gaacttaact aaactttcca agaacatcaa 400

401 gttgaatatg attagattgg ttatgcagag acatggttaa taaaaacatg 450

451 ttatatttta aatgtaagaa agaaattttc taaaatttca ccgtttcaca 500

501 aactaaatat ataaccaaaa gaacaaggat atataaatta aaaaaaaaaa 550

551 ctgagaatct agaacaacaa taaaaaataa ctcaagcatt ttcgttttca 600

601 gatgaactaa tatagttgga ctttttgaaa acaattacaa atcatattta 650

651 tgtttcaaaa ccgatgcatt taactttact ttatatgaac agacattata 700

701 taaaacaatt tgtaaatagt aatacataaa cccgcacgta gtgcgggtac 750

751 tcatctagta tacaataata aaaacttcaa aatgatgcaa caatagctca 800

801 gaatcttcat atatgggcca ctcggcccac gccgaatttg aaaagcccga 850

851 tattggaagt aagcacgtgc ggttgtgaga attgcttctt cgtccaccat 900

901 tggacatgtt tatggctgcg ttcgacgcgt gatttgtttg tggagaagag 950

951 tgcatcgcct gataattcaa gcaacctagt tatagtacaa acgtgaaaga 1000

1001aacaaaatta acccaaaaaa tgaaatggaa ggttacaatt gcaacccttg 1050

1051caagatagta caacaatata atagtaacaa tagaacaata aaccctaacc 1100

1101aaacaaagta agaattacat tcctctaatt ttagtgcatg taagttcggt 1150

1151tatcactgca aacttaatca tttccctatt gactaattcg taacatagtt 1200

1201tatactttcg attaatcaat taattaattt acagtgaatt tgtgaaaaac 1250

1251 ttctaacgag aaacttatta tgttataaaa gtcaacaaaa gaactgtatc 1300

1301 acacagaaca tatatattgg gtctgattgg taaccaaaaa ctatacaagt 1350

1351 tatttagctg ttagctttat cggaatagtg taaaactgtt aaaatgagct 1400

1401 gtacaaaaaa actgagagta aatttttttg taacgctttt gataaagttt 1450

1451 ttgtgattag taactgtcaa aattgtattg ttattaaaat ggttaccatt 1500

1501 caaatctatt aggtaaaata cagagccgtc cataagtaca agcgggtcaa 1550

1551 acacaagctt gtggcctcaa ttactataaa taaaattttg atttttttta 1600

1601 gtagaaaaat tagttgcttg cttctttgat gacaaaaaaa aaaaagcaag 1650

1651 cagtcagata aatcaatgat aatctaaaaa aaagaaaaat ctgacgaaaa 1700

1701 aaaaaaagaa aaaaaagaaa aatctgaagg ttgtacactt gtagaagata 1750

1751 ttttacacac acagcccaat aaaaacccaa atccaaaaac tggagtatcc 1800

1801 aaaaaaaaca cggctgtttc attcatctcc tcacacaaca acttaaccct 1850

1851 cactagccca cgtgtttact ttctcaacca ttcccttatc tcccaaaatt 1900

1901 gtatttactt caaaaataaa ccgaaccgta tcaaattaaa acaagaccac 1950

1951 acttttgtct gaacacaaaa aaaaaaaaaa cttttatttt ttcctcgaga 2000

2001 cgtctctctt cttcaatttc ttcacgattc tacttttgcg ttatccccaa 2050

2051 aattggcaac caaaaccaaa cctctctctc ttattgaaac caaca 2095

Claims

1.一种拟南芥DnaJ-like蛋白基因，其特征是来源于拟南芥(Arabidopsis thaliana)，名称为CRR1，核苷酸序列为：

1 atgagtccga tcgtcataac ccagttagct acaggaatca gcgttttagc 50

51 cggtgcggtc tttatcaaat cagtcatgga ccaaaagcct atggctggtc 100

101 aattccctcg ttgtccgact tgtaacggta ctggacgagt cacgtgtttc 150

151 tgttctcgat ggtccgatgg tgacgttgga tgtcgtaggt gttctggttc 200

201 aggtcgtgcg gcttgtagca attgtggtgg ttctggaact ggtagacctt 250

251 taccggctca gattacggtt cagccaccga atcgtcctta ttga 294 。

2.根据权利要求1所述拟南芥DnaJ-like蛋白，其特征是来源于拟南芥(Arabidopsis thaliana)，名称为CRR1，氨基酸序列为：

Met Ser Pro Ile Val Ile Thr Gln Leu Ala Thr Gly Ile Ser Val Leu

1 5 10 15

Ala Gly Ala Val Phe Ile Lys Ser Val Met Asp Gln Lys Pro Met Ala

20 25 30

Gly Gln Phe Pro Arg Cys Pro Thr Cys Asn Gly Thr Gly Arg Val Thr

35 40 45

Cys Phe Cys Ser Arg Trp Ser Asp Gly Asp Val Gly Cys Arg Arg Cys

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Arg Ala Ala Cys Ser Asn Cys Gly Gly Ser Gly Thr

65 70 75 80

Gly Arg Pro Leu Pro Ala Gln Ile Thr Val Gln Pro Pro Asn Arg Pro

85 90 95

Tyr

97。

3.根据权利要求1所述拟南芥DnaJ-like蛋白基因的启动子，其特征是核苷酸序列为：

1 ccaactctct cctacaactt gacacatcag cacatgagag cttcccacct 50

51 aaacttcata aaataaataa tacataaata gtaattaatt caacataata 100

101 actaaaatag gaggatataa ttaatcagaa cttgaaccat cactctttct 150

151 acatttttta attcaatata tcctttttaa ttttgagatc caaacatgtt 200

201 acacatattc cttgcctaaa aattacacga ttattatgaa agaaactaaa 250

251 tgaatatgca gattaaatat atctaagctt ttcaagattt atgctaagaa 300

301 aacaagtaat ttgaaagatg tttgaggagt tatccttaaa actaatacgt 350

351 aagatagaag attatgacaa gaacttaact aaactttcca agaacatcaa 400

401 gttgaatatg attagattgg ttatgcagag acatggttaa taaaaacatg 450

451 ttatatttta aatgtaagaa agaaattttc taaaatttca ccgtttcaca 500

501 aactaaatat ataaccaaaa gaacaaggat atataaatta aaaaaaaaaa 550

551 ctgagaatct agaacaacaa taaaaaataa ctcaagcatt ttcgttttca 600

601 gatgaactaa tatagttgga ctttttgaaa acaattacaa atcatattta 650

651 tgtttcaaaa ccgatgcatt taactttact ttatatgaac agacattata 700

701 taaaacaatt tgtaaatagt aatacataaa cccgcacgta gtgcgggtac 750

751 tcatctagta tacaataata aaaacttcaa aatgatgcaa caatagctca 800

801 gaatcttcat atatgggcca ctcggcccac gccgaatttg aaaagcccga 850

851 tattggaagt aagcacgtgc ggttgtgaga attgcttctt cgtccaccat 900

901 tggacatgtt tatggctgcg ttcgacgcgt gatttgtttg tggagaagag 950

951 tgcatcgcct gataattcaa gcaacctagt tatagtacaa acgtgaaaga 1000

1001 aacaaaatta acccaaaaaa tgaaatggaa ggttacaatt gcaacccttg 1050

1051 caagatagta caacaatata atagtaacaa tagaacaata aaccctaacc 1100

1101 aaacaaagta agaattacat tcctctaatt ttagtgcatg taagttcggt 1150

1151 tatcactgca aacttaatca tttccctatt gactaattcg taacatagtt 1200

1201 tatactttcg attaatcaat taattaattt acagtgaatt tgtgaaaaac 1250

1251 ttctaacgag aaacttatta tgttataaaa gtcaacaaaa gaactgtatc 1300

1301 acacagaaca tatatattgg gtctgattgg taaccaaaaa ctatacaagt 1350

1351 tatttagctg ttagctttat cggaatagtg taaaactgtt aaaatgagct 1400

1401 gtacaaaaaa actgagagta aatttttttg taacgctttt gataaagttt 1450

1451 ttgtgattag taactgtcaa aattgtattg ttattaaaat ggttaccatt 1500

1501 caaatctatt aggtaaaata cagagccgtc cataagtaca agcgggtcaa 1550

1551 acacaagctt gtggcctcaa ttactataaa taaaattttg atttttttta 1600

1601 gtagaaaaat tagttgcttg cttctttgat gacaaaaaaa aaaaagcaag 1650

1651 cagtcagata aatcaatgat aatctaaaaa aaagaaaaat ctgacgaaaa 1700

1701 aaaaaaagaa aaaaaagaaa aatctgaagg ttgtacactt gtagaagata 1750

1751 ttttacacac acagcccaat aaaaacccaa atccaaaaac tggagtatcc 1800

1801 aaaaaaaaca cggctgtttc attcatctcc tcacacaaca acttaaccct 1850

1851 cactagccca cgtgtttact ttctcaacca ttcccttatc tcccaaaatt 1900

1901 gtatttactt caaaaataaa ccgaaccgta tcaaattaaa acaagaccac 1950

1951 acttttgtct gaacacaaaa aaaaaaaaaa cttttatttt ttcctcgaga 2000

2001 cgtctctctt cttcaatttc ttcacgattc tacttttgcg ttatccccaa 2050

2051 aattggcaac caaaaccaaa cctctctctc ttattgaaac caaca 2095。

4.根据权利要求1所述拟南芥DnaJ-like蛋白基因，其特征是与权利要求1所述基因的多核苷酸序列具有80％以上同源性且编码相同功能蛋白质的多核苷酸序列。

5.根据权利要求2所述拟南芥DnaJ-like蛋白，其特征是编码权利要求2所述蛋白质序列的多核苷酸序列。

6.根据权利要求3所述拟南芥DnaJ-like蛋白基因的启动子，其特征是与权利要求3所述启动子的多核苷酸序列有90％以上同源性且具有启动所述拟南芥的与耐逆性相关的DnaJ-like蛋白编码基因的转录功能的核苷酸序列。

7.根据权利要求2所述拟南芥DnaJ-like蛋白，其特征是将权利要求2所述蛋白的氨基酸序列经过一个或者几个氨基酸残基的取代、缺失或者添加且具有与权利要求2所述的氨基酸残基序列相同活性的衍生蛋白。

8.权利要求1所述拟南芥DnaJ-like蛋白基因在培育耐旱、耐脱落酸和耐低温植物品种中的应用。