CN113105418B - 一种具有细胞抗氧化活性的酚酸及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种具有细胞抗氧化活性的酚酸及其制备方法和应用。本发明的酚酸化合物9‑甲基‑(8‑5')‑环合脱氢二聚阿魏酸的结构式如式(Ⅰ)所示，其是从水稻的果实、茎或叶的干品或鲜品中分离获得。经体外药理实验证实，化合物9‑甲基‑(8‑5')‑环合脱氢二聚阿魏酸具有良好的超氧自由基清除能力，其CAA值为0.51±0.14μmol TE/μmol，说明其具有良好的抗氧化活性。所述的酚酸化合物9‑甲基‑(8‑5')‑环合脱氢二聚阿魏酸有望作为先导化合物开发出新型的抗氧化剂药物。
Figure DDA0002965823860000011

Description

一种具有细胞抗氧化活性的酚酸及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于天然药物技术领域，具体涉及一种新酚酸化合物9-甲基-(8-5′)-环合脱氢二聚阿魏酸及其制备方法和在制备抗氧化药物中的应用。
背景技术
自由基是指化学结构中的共价键发生均裂而形成的具有不成对电子的原子或基团，自由基化学性质非常活泼，能够与多种分子发生自由基反应。人体自身会产生活性氧自由基，体内活性氧自由基具有一定的功能，如参与免疫和信号传导过程。但是当体内的氧化还原平衡被打破时，过量的活性氧自由基会导致人体正常细胞和组织的损坏，从而引起多种疾病。如衰老、肿瘤、神经退化、自身免疫性疾病和心血管疾病，严重危害人类健康。抗氧化剂是一类具有减缓或抑制其他分子氧化作用的物质，适当补充抗氧化剂，能够有效预防和缓解氧化应激对身体造成的损伤。自然界中的次级代谢产物是抗氧化剂的重要来源，结构中具有酚羟基结构的酚类物质由于其良好的自由基清除活性越来越受到人们的关注，已成为重要的天然抗氧化剂来源。
水稻(Citrusgrandis L.Osbeck)是禾本科稻属植物，是全世界重要的粮食作物，前人研究表明水稻除富含淀粉、蛋白质等营养素外，还含有丰富的酚类物质。目前未见有水稻中具有抗氧化活性的9-甲基-(8-5′)-环合脱氢二聚阿魏酸成分的研究报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种新的酚酸成分9-甲基-(8-5')-环合脱氢二聚阿魏酸，并提供其制备方法，以及提供其在制备具有抗氧化作用的药物中的应用。
本发明所述的新酚酸成分9-甲基-(8-5′)-环合脱氢二聚阿魏酸，或其药用盐，或其酯化衍生物，其结构如式(Ⅰ)表示：
Figure BDA0002965823840000021
本发明所述的新酚酸成分9-甲基-(8-5')-环合脱氢二聚阿魏酸由本发明人首次从水稻(Oryza sativa L.)各个组织部位的干品或鲜品中分离获得，具体部位可以是糙米、糠层和精米层。
本发明提供的新酚酸成分9-甲基-(8-5')-环合脱氢二聚阿魏酸，经体外药理实验证实，具有良好的超氧自由基(CAA)清除能力，其CAA值为0.36±0.14μmol QE/μmol。所述的新酚酸成分9-甲基-(8-5')-环合脱氢二聚阿魏酸、或其药用盐、或其酯化衍生物可用于制备抗氧化药物。
本发明的新酚酸成分9-甲基-(8-5')-环合脱氢二聚阿魏酸、或其药用盐、或其酯化衍生物可与制剂或药物允许的赋形剂或载体结合，制备得到具有抗氧化活性的可用于缓解氧化应激的药物或药物组合物。该药物或药物组合物可以采用可湿性粉剂、片剂、颗粒剂、胶囊、口服液、滴丸、注射剂、气雾剂等剂型；还可采用现代制药界所公知的控释或缓释剂型或纳米制剂。
因此，本发明还提供了一种抗氧化药物，其包括上述新酚酸成分9-甲基-(8-5')-环合脱氢二聚阿魏酸、或其药用盐，或其酯化衍生物，作为活性成分。
所述的抗氧化药物还包括制剂或药物允许的赋形剂或载体，如可以采用可湿性粉剂、片剂、颗粒剂、胶囊、口服液、滴丸、注射剂、气雾剂等剂型；还可采用现代制药界所公知的控释或缓释剂型或纳米制剂。
本发明还提供了新酚酸成分9-甲基-(8-5')-环合脱氢二聚阿魏酸的制备方法，其是从水稻(Oryza sativa L.)植物中分离获得，包括水稻的果实、茎或叶的干品或鲜品。优选，是从水稻果实各个组织部位的干品或鲜品中分离获得，具体部位可以是糙米、糠层和/或精米。
本发明的新酚酸成分9-甲基-(8-5')-环合脱氢二聚阿魏酸的制备方法，具体步骤优选为：将水稻粉碎后用乙醇水溶液浸提，分离提取液收集残渣，提取残渣加入NaOH溶液后氮气环境下提取，随后调节pH至1，用乙酸乙酯萃取，收集乙酸乙酯相减压浓缩去除有机溶剂后得到提取物，提取物经正相硅胶柱层析，用氯仿/甲醇从体积比100:0至60:40梯度洗脱，收集氯仿/甲醇体积比85:15洗脱的组分F5，组分F5采用ODS-A中压柱层析，用甲醇/水醇从体积比30:70至80:20梯度洗脱，收集甲醇/水体积比50:50洗脱的组分F5-4，流份F5-4经高效液相分离纯化得到9-甲基-(8-5')-环合脱氢二聚阿魏酸。
优选，所述的乙醇水溶液是体积分数95％的乙醇水溶液。
本发明采用水稻果实组织中提取分离高效抗氧化剂剂(药物)-9-甲基-(8-5')-环合脱氢二聚阿魏酸，其制备过程条件可控，提取方便，对环境友好并有潜在好的经济效益，且得到的新酚酸化合物9-甲基-(8-5')-环合脱氢二聚阿魏酸性质稳定、易存放。其抗氧化活性良好，有望作为先导化合物开发出新型的抗氧化药物。
附图说明
图1是化合物9-甲基-(8-5')-环合脱氢二聚阿魏酸的1HNMR图谱；
图2是化合物9-甲基-(8-5')-环合脱氢二聚阿魏酸的13C NMR图谱；
图3是化合物9-甲基-(8-5')-环合脱氢二聚阿魏酸的1H-1HCOSY图谱；
图4是化合物9-甲基-(8-5')-环合脱氢二聚阿魏酸的HSQC图谱；
图5是化合物9-甲基-(8-5')-环合脱氢二聚阿魏酸的HMBC图谱；
图6是化合物9-甲基-(8-5')-环合脱氢二聚阿魏酸的HR-EI-MS图谱。
具体实施方式
以下实施例是对本发明的进一步说明，不是对本发明的限制，根据本发明的实质对本发明进行的简单改进都属于本发明要求保护的范围。
实施例1：酚酸化合物9-甲基-(8-5')-环合脱氢二聚阿魏酸的制备
1.1植物来源与鉴定
供提取用植物材料水稻(Oryza sativa L.)的果实样品购自黑龙江省哈尔滨市。
1.2提取与分离
将水稻果实(稻谷)粉碎后用体积分数95％的乙醇水溶液浸提48小时，分离提取液收集残渣，提取残渣加入2M的NaOH溶液(1:20,w/v g/ml)后氮气环境下提取4小时，随后用6M HCl调节pH至1，用乙酸乙酯萃取(1:1,v/v)5次，收集乙酸乙酯相减压浓缩去除有机溶剂后得到提取物。提取物经正相硅胶柱层析，用氯仿/甲醇从体积比100:0至60:40梯度洗脱，收集氯仿/甲醇体积比85:15洗脱的组分F5，组分F5采用ODS-A中压柱层析，用甲醇/水醇从体积比30:70至80:20梯度洗脱，收集甲醇/水体积比50:50洗脱的组分F5-4，亚组分F5-4以35％甲醇水溶液(v/v)为流动相，以6mL/min为流速，通过制备HPLC采用Shim-pack PRC-ODSC-18柱(5μm，20×250mm)进一步层析分离纯化得化合物9-甲基-(8-5')-环合脱氢二聚阿魏酸(3mg，tR 43min)。
1.3新酚酸化合物的结构鉴定
图1是化合物9-甲基-(8-5')-环合脱氢二聚阿魏酸的1H NMR图谱；图2是化合物9-甲基-(8-5')-环合脱氢二聚阿魏酸的13C NMR图谱；图3是化合物9-甲基-(8-5')-环合脱氢二聚阿魏酸的1H-1H COSY图谱；图4是化合物9-甲基-(8-5')-环合脱氢二聚阿魏酸的HSQC图谱；图5是化合物9-甲基-(8-5')-环合脱氢二聚阿魏酸的HMBC图谱；图6是化合物9-甲基-(8-5')-环合脱氢二聚阿魏酸的HR-EI-MS图谱；9-甲基-(8-5')-环合脱氢二聚阿魏酸，淡黄色油状物；UV(MeOH)λmax nm(logε)208(4.40),224(4.31),289(4.18),317(3.74)；HRESIMSm/z 401.1228[M+H]+(calcd for C21H21O8 +,401.1231,error 0.3mDa)and 423.1050[M+Na]+(calcd for C21H20NaO8 +423.1050,error-0.0mDa)；1H(500MHz)and 13C(125MHz)核磁数据陈列如下表1所示。
表1.化合物9-甲基-(8-5')-环合脱氢二聚阿魏酸的NMR数据(in CD3OD)
Figure BDA0002965823840000051
Figure BDA0002965823840000061
根据以上紫外、质谱和一维和二维核磁等波谱相关数据的综合分析，解析推导出化合物的结构式如式(Ⅰ)所示，命名为9-甲基-(8-5')-环合脱氢二聚阿魏酸：
Figure BDA0002965823840000062
实施例2：酚酸化合物9-甲基-(8-5')-环合脱氢二聚阿魏酸的细胞抗氧化活性检测
1.仪器与材料
二甲基亚砜为美国剑桥公司生产；Trolox试剂、荧光素，2,2'-偶氮(2-甲基丙脒)盐酸盐(AAPH)，2',7'-二乙酸二氯荧光素(DCFH-DA)购自于美国Sigma公司；酶标仪为Genois microplate reader(Tecan GENios,Swizerland)。
2.CAA活性评价
将处于对数生长期的HepG2细胞悬液种到黑壁透明底96孔细胞培养板中，每孔100μL，细胞密度约为5×104/孔。培养板最外周各孔加入100μLPBS代替细胞悬液，以减少边缘效应造成的误差。细胞生长24h后，吸除培养基，用PBS 100μL/孔清洗各孔一次。然后将100μL含25μM DCFH-DA的不同浓度的槲皮素溶液或待测样品溶液(用MEM培养基溶解稀释)加入到相应孔中，空白对照孔和阳性对照孔中加入只含有25μM DCFH-DA的荧光素检测液，每种处理设三个复孔，放入培养箱中继续培养1h。然后去除各孔中的处理溶液，用多通道移液器迅速向各孔中加入100μLABAP溶液(514μM，临用前用PBS配制)，空白对照孔用PBS代替。迅速将细胞培养板放入荧光酶标仪中开始检测，测定条件为：激发波长485nm，发射波长520nm，12个循环，每个循环5min。绘制工作曲线计算槲皮素和样品的EC50值，以槲皮素EC50与样品EC50的比值为样品的CAA值，单位为μmol QE/g DW。
3.实验数据参见表2：
表2.化合物9-甲基-(8-5')-环合脱氢二聚阿魏酸的抗氧化活性
Figure BDA0002965823840000071
4.实验结论：
本实验表明，酚酸化合物9-甲基-(8-5')-环合脱氢二聚阿魏酸具有良好的细胞抗氧化活性，将可望能被开发用于制备抗氧化药物，应用潜质广泛，前景看好。
以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出的是，上述优选实施方式不应视为对本发明的限制，本发明的保护范围应当以权利要求所限定的范围为准。对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明的精神和范围内，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (4)

1.一种酚酸化合物9-甲基-(8-5')-环合脱氢二聚阿魏酸的制备方法，其特征在于，步骤为：
a.制备总提取物：将水稻粉碎后用乙醇水溶液浸提，分离提取液收集残渣，提取残渣加入NaOH溶液后氮气环境下提取，随后调节pH至1，用乙酸乙酯萃取，收集乙酸乙酯相减压浓缩去除有机溶剂后得到提取物。
b.分离纯化：提取物经正相硅胶柱层析，用氯仿/甲醇从体积比100:0至60:40梯度洗脱，收集氯仿/甲醇体积比85:15洗脱的组分F5，组分F5采用ODS-A中压柱层析，用甲醇/水醇从体积比30:70至80:20梯度洗脱，收集甲醇/水体积比50:50洗脱的组分F5-4，流份F5-4经高效液相分离纯化得到9-甲基-(8-5')-环合脱氢二聚阿魏酸；
所述的酚酸类化合物9-甲基-(8-5')-环合脱氢二聚阿魏酸，其结构如式(Ⅰ)所示：
Figure FDA0003681854000000011
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述的乙醇水溶液是体积分数95％的乙醇水溶液。
3.根据权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于，所述的水稻包括水稻的果实、茎或叶的干品或鲜品。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述的水稻是水稻果实，包括糠层和/或精米。
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