CN113061177B - 一种cd73酶活性相关的抗原表位及针对该表位的特异性抗体的制备方法 - Google Patents

一种cd73酶活性相关的抗原表位及针对该表位的特异性抗体的制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及医药领域，公开了一种CD73酶活性相关的抗原表位及针对该表位的特异性抗体的制备方法。该CD73酶活性相关的抗原表位包括如SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列，或与两者同源性在90%以上的氨基酸序列。该抗原表位的氨基酸序列具有很强的不可替代性，且利用多肽合成方法即可获得足量多肽，不需要生产大量的重组蛋白，节约了实验材料，缩短了抗原制备时间；且利用该抗原表位制得的表位特异性抗体能有效抑制CD73酶活性和刺激淋巴细胞释放干扰素，发挥抗肿瘤作用，具有广泛的应用前景和实用价值。

Description

一种CD73酶活性相关的抗原表位及针对该表位的特异性抗体 的制备方法
技术领域
本发明涉及医药领域，尤其涉及一种CD73酶活性相关的抗原表位及针对该表位的特异性抗体的制备方法。
背景技术
目前大量研究强调了肿瘤微环境条件在肿瘤进展中的重要作用及其对肿瘤治疗结果的重要影响。在CD73和CD39的作用下，肿瘤组织中的ATP转化为腺苷，导致肿瘤微环境中免疫刺激因子ATP的耗竭和免疫抑制因子腺苷的过度表达，为肿瘤细胞增殖提供了最佳条件。已有研究表明腺苷的过度表达与癌细胞表面CD73的上调有关，且依赖于CD73的上调。此外，CD73不仅能增加腺苷的产生从而抑制抗肿瘤反应，还能促进血管生成、癌细胞侵袭和转移等多种恶性行为，这使该分子具有成为癌症治疗靶点的潜在价值。
CD73又称胞外-5’-核苷酸酶(5’-NT)，是一种细胞表面糖基化磷脂酰肌醇锚定糖蛋白，由548个氨基酸组成，分子量约为61kDa。其N端为两种催化二价金属离子提供结合位点，C端为AMP结合位点，能够将CD39催化ATP和ADP生成的AMP去磷酸化成腺苷。
鉴于CD73功能的重要性，已有多项研究探讨了不同方法阻断CD73的抗肿瘤作用。小分子化合物APCP能够特异性抑制CD73，易于获得和耐受性好使其成为一种有吸引力的抗癌药物。然而APCP的应用存在一些局限性，如体内可达水平的APCP对CD73酶活性的阻断效果较差，且其在体内的半衰期和生物分布还不是很清楚。因此，设计和开发不受上述限制的CD73抑制剂至关重要，抗CD73抗体可能是一种有效的替代治疗方法。
目前制备抗CD73抗体常以重组表达的CD73全长蛋白或胞外区作为靶抗原，然而这些重组蛋白除蛋白质构象可能与天然蛋白存在差异外，还有大量的非特异性或活性无关的优势抗原表位存在，因此筛选获得的抗体可能会与其他蛋白质存在交叉反应，多数抗体仅与CD73蛋白有结合能力，却缺乏阻断其酶活性的能力，使其减少了成药的可能性，且需要经过大量的功能学实验和表位鉴定才能筛选出具有治疗作用的抗CD73抗体。根据CD73酶活性中心的肽段制备表位特异性抗体可以显著提高功能性抗体的筛选效率，减少后期克隆鉴定成本，且制备的表位特异性抗体能有效抑制CD73酶活性和刺激淋巴细胞释放干扰素，发挥抗肿瘤作用，具有广泛的应用前景和实用价值。
发明内容
为了解决上述技术问题，本发明提供了一种CD73酶活性相关的抗原表位及针对该表位的特异性抗体的制备方法。利用该抗原表位制备特异性抗体，能大大提高功能性抗CD73单抗的筛选效率，减少后期克隆鉴定的成本，且制备的表位特异性抗体能有效抑制CD73酶活性和刺激淋巴细胞释放干扰素，发挥抗肿瘤作用，具有广泛的应用前景和实用价值。
本发明的具体技术方案为：
第一，本发明公开了一种CD73酶活性相关的抗原表位，包括如SEQ ID NO:1所示或与其同源性在90％以上的氨基酸序列。
第二，本发明公开了另一种CD73酶活性相关的抗原表位，包括如SEQ ID NO:2所示或与其同源性在90％以上的氨基酸序列。
发明人在试验过程中发现，SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2的氨基酸序列具有很强的不可替代性，其N端或C端缺少任意一个氨基酸，都会导致其与两株特异性抗体(由SEQ IDNO:1和SEQ ID NO:2免疫小鼠后获得的5A4抗体和8-5抗体)结合的阻断程度明显降低，说明两株特异性抗体的氨基酸序列均分别与SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2同源性在90％以上(91.7％和92.9％)。
第三，本发明公开了一种针对所述抗原表位的特异性抗体的制备方法，包括以下步骤：(1)合成包含所述抗原表位的抗原肽；
(2)利用步骤(1)合成的抗原肽免疫动物，获得杂交瘤细胞，收集培养上清液；
(3)对步骤(2)收集的上清液进行筛选、鉴定与纯化，得到针对CD73酶活性相关抗原表位的特异性抗体。
作为优选，步骤(1)的具体过程如下：采用多肽合成技术合成所述抗原表位的多肽，使用双功能偶联剂碳二亚胺(EDC)将多肽与载体蛋白-牛血清白蛋白(BSA)进行偶联，在去除游离的多肽后用高效液相色谱(HPLC)进行偶联效率鉴定，即得到抗原肽。
作为优选，步骤(2)中，所述免疫动物的具体过程如下：经皮肤较薄、松弛的部位皮下多点注射，免疫包括弗氏完全佐剂与抗原1:1混匀首次注射、3-4次弗氏不完全佐剂与抗原1:1混匀加强注射和最后一次抗原直接激发注射。
作为优选，所述免疫动物为小鼠、大鼠、兔、山羊、绵羊和羊驼。
作为优选，步骤(3)中，所述筛选的具体过程如下：使用双功能偶联剂EDC将步骤(1)中所述的合成多肽与载体蛋白-血蓝蛋白(KLH)进行偶联，利用得到的多肽-KLH偶联物进行ELISA筛选。
第四，本发明公开了一种通过所述制备方法获得的针对CD73酶活性相关抗原表位的特异性抗体。
通过本发明的方法，获得了分别针对抗原表位SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2的两种特异性抗体。其中，针对SEQ ID NO:1的特异性抗体能够高效抑制CD73酶水解AMP产生腺苷的活性(抑制率大于或等于90％)，有效降低肿瘤微环境中的腺苷浓度，进而重塑由腺苷介导的免疫抑制微环境；针对SEQ ID NO:2的特异性抗体能够刺激淋巴细胞释放干扰素，发挥免疫调节和抗肿瘤作用，在治疗高表达CD73或高浓度腺苷的肿瘤及自身免疫性疾病中具有广泛的应用前景和实用价值。
作为优选，所述特异性抗体为动物来源的单克隆抗体、嵌合抗体、人源化抗体、纳米抗体或抗体片段。
第六，本发明公开了一种药物组合物，其包含所述特异性抗体和药学上可接受的运载体。
作为优选，所述药物组合物还包含奥沙利铂。
第七，本发明公开了所述特异性抗体在制备诊断试剂或试剂盒中的应用，所述诊断试剂或试剂盒用于诊断高表达CD73或高浓度腺苷的肿瘤，或者高表达CD73或高浓度腺苷的自身免疫性疾病。
作为优选，所述肿瘤为CD73表达阳性的乳腺癌、结直肠癌、胃癌、***癌或肺腺癌。
第八，本发明公开了所述特异性抗体或所述药物组合物在制备药物制剂中的应用，其特征在于，所述药物制剂用于治疗高表达CD73或高浓度腺苷的肿瘤，或者高表达CD73或高浓度腺苷的自身免疫性疾病的。
作为优选，所述肿瘤为CD73表达阳性的乳腺癌、结直肠癌、胃癌、***癌或肺腺癌。
作为优选，所述药物制剂包含所述特异性抗体和药学上可接受的运载体。
作为优选，所述药物制剂包含针对第一个抗原表位的特异性抗体和奥沙利铂。
针对第一个抗原表位的5A4抗体和化疗药物奥沙利铂联合使用后，具有协同增强抗肿瘤效应，5A4抗体可有效抑制奥沙利铂导致的局部微环境腺苷聚集。
与现有技术相比，本发明具有以下优点：
(1)本发明提供的CD73酶活性相关的抗原表位为线性表位，其氨基酸序列具有很强的不可替代性，且利用多肽合成方法即可获得足量多肽，不需要生产大量的重组蛋白，节约了实验材料，缩短了抗原制备时间；
(2)本发明提供的利用CD73酶活性相关表位多肽免疫动物所制备的抗体与CD73全长重组蛋白免疫动物所制备的抗体在亲和力上具有等效性，但因本发明不含CD73蛋白的其他非活性相关的优势抗原表位，其特异性更强，筛选效率更高；
(3)本发明提供的针对CD73酶活性相关抗原表位SEQ ID NO:1的特异性抗体能够高效抑制CD73酶水解AMP产生腺苷的活性(抑制率大于或等于90％)，有效降低肿瘤微环境中的腺苷浓度，进而重塑由腺苷介导的免疫抑制微环境；
(4)本发明提供的针对CD73酶活性相关抗原表位SEQ ID NO:2的特异性抗体能够刺激淋巴细胞释放干扰素，发挥免疫调节和抗肿瘤作用，在治疗高表达CD73或高浓度腺苷的肿瘤及自身免疫性疾病中具有广泛的应用前景和实用价值；
(5)本发明提供的针对CD73酶活性相关抗原表位SEQ ID NO:1的特异性抗体与化疗药物如奥沙利铂等联合应用具有协同增强抗肿瘤效应，是潜在的临床新选择。
附图说明
图1为抗体与CD73蛋白抗原表位结合的Docking Model；其中，图(A)为抗体Fab段与CD73识别表位SEQ ID NO:1的结合模式；图(B)为抗体Fab段与CD73识别表位SEQ ID NO:2的结合模式；
图2为不同序列多肽竞争性阻断表位与5A4抗体和8-5抗体结合的ELISA吸光值统计图；其中，图(A)为不同序列多肽竞争性阻断表位与5A4抗体结合的ELISA吸光值统计图；图(B)为不同序列多肽竞争性阻断表位与8-5抗体结合的ELISA吸光值统计图；
图3为三株高表达CD73的人肿瘤细胞系与5A4抗体的流式结合率峰图；
图4为5A4抗体和8-5抗体经真核CD73蛋白阻断后的流式检测结果；其中，图(A)为5A4抗体经真核CD73蛋白阻断后的流式检测结果；图(B)为8-5抗体经真核CD73蛋白阻断后的流式检测结果；
图5为5A4抗体在荷瘤小鼠体内与肿瘤组织的结合情况；
图6为5A4抗体及8-5抗体对CD73酶活性的体外抑制能力评价；其中，图(A)为经25μg/mL5A4抗体处理后的MDA-MB-231细胞培养上清HPLC检测结果图，方框所示区域为腺苷出峰时间点，自上至下依次为APCP、8-5抗体和5A4抗体；图(B)为5A4抗体、8-5抗体和APCP对腺苷分泌抑制随浓度梯度变化统计图；
图7为5A4抗体对CD73酶活性的体内抑制能力评价；其中，图(A)为HPLC检测不同给药方案治疗后肿瘤组织中腺苷含量峰值图(上：5A4抗体；中：APCP；下：同型抗体)；图(B)为不同治疗组肿瘤组织单位腺苷含量比较统计图；
图8为ELISA检测不同处理条件下体外淋巴细胞干扰素的分泌情况统计图；
图9为CCK8连续检测7天经5A4抗体和8-5抗体孵育后的MDA-MB-231细胞体外增殖情况；
图10为5A4抗体对小鼠移植瘤生长的抑制作用；其中，图(A)同型抗体、APCP、5A4抗体治疗后，各组荷瘤小鼠；图(B)为同型抗体、APCP、5A4抗体治疗后，皮下移植瘤剥离拍照；图(C)为肿瘤体积随时间变化的生长曲线统计图；图(D)为肿瘤重量统计图；
图11为5A4抗体与奥沙利铂产生联合抑瘤效应；其中，图(A)为同型抗体、5A4抗体单药、奥沙利铂单药及5A4抗体联合奥沙利铂治疗后，皮下移植瘤剥离拍照；图(B)为肿瘤重量统计图；图(C)为肿瘤体积随时间变化的生长曲线统计图；图(D)为四个治疗组小鼠生存曲线图；
图12为5A4抗体对奥沙利铂治疗后肿瘤组织内腺苷产生的抑制作用；其中，图(A)为不同治疗组小鼠肿瘤组织腺苷HPLC峰值图(自上至下依次为同型抗体、奥沙利铂、5A4抗体和奥沙利铂+5A4抗体)；图(B)为不同治疗组小鼠单位重量肿瘤组织腺苷含量统计图。
图6(A)、图7(A)、图12(A)中字迹模糊不影响本领域技术人员对技术方案的理解。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的描述。
本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围。在不背离发明构思的精神和范围下，本领域技术人员能够想到的变化和优点都被包括在本发明中，并且以所附的权利要求及其任何等同物为本发明的保护范围。下述实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述试剂和生物材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。
实施例1：针对CD73酶活性相关抗原表位鉴定
我们通过生物建模Docking Model的方法模拟了3D环境下的CD73酶活性相关抗原表位与抗体结合的空间构象。(1)从Program Database数据库中获取NT5E(CD73)的晶体结构，蛋白ID分别是4H2F和1CLY。(2)借助Schrodingger 2015软件，对两个蛋白结构进行以下处理：添加氨基酸残基的侧链；添加晶体结构中缺失的loop部分；分配氨基酸残基的质子化状态以及在施加OPLS2005力场的情况下对整个蛋白结构优化。(3)使用ZDOCK在线计算(网址为http://zdock.umassmed.edu/)IgG Fab和NT5E的对接，在对接过程中，将NT5E选择为受体，1CLY设置为配体。结果如图1所示，通过构象变化发现NT5E中如SEQ ID NO:1(即IEFDERGNVISS)和SEQ ID NO:1(即PEDPSIKADINKWR)所示的两段氨基酸序列为酶活性相关抗原表位结合位点。
实施例2：制备针对CD73酶活性相关抗原表位的单克隆抗体
1合成多肽-载体蛋白偶联物
采用多肽合成技术分别合成如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示的两段多肽，HPLC检测纯度在95％以上。使用双功能偶联剂EDC分别将上述合成多肽上的-COOH直接与牛血清白蛋白(BSA)和血蓝蛋白(KLH)上的-NH2按100:1(摩尔比)进行偶联，在去除游离的多肽后HPLC鉴定偶联效率，即得到多肽-BSA与多肽-KLH偶联物。
2多肽-BSA偶联物免疫小鼠
挑选5只体重在18-22g、4周龄的Balb/c小鼠。以多肽-BSA偶联物为抗原，首次免疫浓度为1mg/mL，小鼠免疫剂量为0.1mL/只，与弗氏完全佐剂1:1混匀后抽入注射器内；二免至四免抗原浓度为0.5mg/mL，免疫剂量为0.1mL/只，与弗氏不完全佐剂1:1混匀后抽入注射器内。在小鼠颈背部皮下多点注射完全乳化的抗原-佐剂混合物，首免后第21天进行二免，以后免疫间隔时间为14天。
3小鼠血清效价检测
对免疫完成的小鼠进行眼眶采血，10000rpm离心5min，取上清进行ELISA检测抗体效价。用包被缓冲液将多肽-BSA偶联物稀释至20μg/mL，向96孔板(美国Nunc公司)中每孔加入100μL，4℃过夜，次日弃去孔内液体，1×TBST缓冲液洗涤4次，拍干。然后每孔加满1％BSA进行封闭，37℃孵育1h后拍干。将血清进行倍比稀释后每孔加入100μL，设置阴性对照孔(加1％BSA)，37℃孵育1h后洗涤4次并拍干。随后每孔加入100μL稀释(1:3000)的羊抗鼠二抗-HRP，37℃孵育30min后洗涤4次并拍干。于各反应孔中加入50μL TMB溶液A和50μL TMB溶液B，室温反应10min左右，加入100μL 2mol/L终止液终止反应。使用酶标仪(美国MolecularDevice公司)读取450nm处吸光值，保存数据进行分析。如表1所示，5只小鼠的血清抗体效价均可达1:240000，我们选择效价最高的5号小鼠进行下一步融合。
表1免疫小鼠后血清效价检测
Figure BDA0002880877340000061
Figure BDA0002880877340000071
4杂交瘤细胞融合
脱颈法处死小鼠后，在无菌条件下暴露脾脏，用镊子将脾细胞挤压出来，吹散后收集至50mL离心管中。随后利用电融合装置(BTX ECM2001)将分离得到的脾细胞与骨髓瘤细胞SP2/0以1:1的比例融合，加入2×HAT培养液培养杂交瘤细胞并接种于96孔细胞培养板中，每孔约5×105个细胞。
5ELISA克隆筛选
将96孔板(美国Nunc公司)在4℃下以20μg/mL的多肽-KLH偶联物包被过夜，洗涤与封闭后，加入杂交瘤细胞培养上清并在37℃下孵育1h，洗涤并拍干。随后加入羊抗鼠二抗-HRP并在37℃下孵育30min，洗涤并拍干。最后加入TMB显色液，肉眼观察结果，挑选阳性克隆。通过3次有限稀释法与ELISA筛选得到了产生高亲和力单克隆抗体的杂交瘤细胞，建株后扩大培养。将收集的细胞上清液上样至Protein G柱(MabSelect SuRe，GE)，用甘氨酸洗脱抗体，再立即用1M Tris中和，即得到纯化的抗合成多肽的单抗。经过上述筛选流程，我们最终获得两株CD73酶活性相关的表位特异性单克隆抗体：5A4及8-5。对这两株单抗进行测序，发现其序列与申请号为2020112089878的专利中利用全长重组抗原免疫小鼠并人源化设计后获得的抗体相同。
实施例3：抗CD73酶活性相关表位特异性单克隆抗体识别氨基酸序列鉴定
(1)包板：将SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2两段多肽-KLH偶联物用包被缓冲液稀释至2.5μg/mL，向ELISA 96孔板(美国Nunc公司)中加100μL/孔，4℃过夜，次日，弃去孔内溶液，用1×TBST洗涤缓冲液洗涤3次，拍干；
(2)封闭：每孔加100μL的1％BSA进行封闭，置37℃孵育1h，弃封闭液；
(3)加样：加50μL/孔的上述5A4或8-5杂交瘤培养上清液+50μL/孔1％BSA或50μL/孔的上述5A4或8-5杂交瘤培养上清液+50μL/孔的1mg/mL裸肽(表2为不同裸肽的氨基酸序列)，各设3个复孔，置37℃孵育120min，拍干，用1×TBST洗涤缓冲液洗涤3次，拍干；
(4)加酶标抗体：将羊抗鼠二抗-HRP按1:3000稀释(用1％BSA进行稀释)，以100μL/孔加入酶标板孔中，置37℃孵育60min，之后弃液，用1×TBST洗涤缓冲液洗涤3次，拍干；
(5)加底物液显色：于各反应孔中加入配制的TMB底物溶液100μL(A液与B液以1:1配制，现配现用)，置37℃反应5min；
(6)终止反应：于各反应孔中加入2mol/L硫酸100μL，终止反应；
(7)读板：将酶标板置于酶标仪(美国Molecular Device公司)中进行读数，保存数据，进行分析。
结果如图2所示，PEP1-7与PEP9-11均可不同程度阻断多肽IEFDERGNVISS-KLH偶联物与5A4单抗的结合，且随裸肽N端和C端氨基酸数目的逐个减少，阻断程度逐步降低，证实5A4单抗的抗原识别表位为SEQ ID NO:1；同理，N端逐个减少氨基酸的PEP12-18和C端逐个减少氨基酸的PEP19-23均逐渐降低对多肽PEDPSIKADINKWR-KLH偶联物与8-5单抗结合的抑制，证实8-5单抗的抗原识别表位为SEQ ID NO:2。同时我们发现，在PEP1与PEP12的N端或C端缺少任意一个氨基酸的情况下，其对5A4单抗及8-5单抗与相应多肽-KLH偶联物结合的阻断程度较完整裸肽明显降低，说明两株单抗识别的氨基酸序列均分别与SEQ ID NO:1和SEQID NO:2同源性在90％以上(91.7％和92.9％)。
表2不同裸肽的氨基酸序列
PEP1 IEFDERGNVISS PEP12 PEDPSIKADINKWR
PEP2 EFDERGNVISS PEP13 EDPSIKADINKWR
PEP3 FDERGNVISS PEP14 DPSIKADINKWR
PEP4 DERGNVISS PEP15 PSIKADINKWR
PEP5 ERGNVISS PEP16 SIKADINKWR
PEP6 RGNVISS PEP17 IKADINKWR
PEP7 GNVISS PEP18 KADINKWR
PEP8 NVISS PEP19 PEDPSIKADINKW
PEP9 IEFDERGNVIS PEP20 PEDPSIKADINK
PEP10 IEFDERGNVI PEP21 PEDPSIKADIN
PEP11 IEFDERGNV PEP22 PEDPSIKADI
PEP23 PEDPSIKA
实施例4：体外检测抗CD73酶活性相关表位特异性单克隆抗体与靶蛋白的结合情况选取处于对数生长期的高表达CD73的乳腺癌MAD-MB-231细胞系、肺腺癌H385细胞系和结肠癌HCT116细胞系，加入1mL胰酶消化计数，按5×105个/管分装至EP管中，3500rpm离心5min后小心吸掉上清。向实验组中按100μL/管加入10μg/mL的制备抗体5A4，重悬细胞沉淀，室温避光孵育30min，同时设置阴性对照组与同型对照组。孵育完成后，每管加1mL PBS洗涤细胞2次。随后按100μL/管加入1:1000稀释(PBS+2％FBS的溶液稀释)的二抗，重悬细胞沉淀，室温避光孵育30min。孵育完成后，PBS洗涤2次，小心吸掉上清，加入200μL Stainingbuffer重悬后，使用多色细胞流式检测仪(美国贝克曼库尔特公司)检测免疫荧光。结果如图3所示，5A4抗体可与细胞表面立体结构下的CD73高度结合且具有普遍性。
进一步地，我们进行了结合阻断实验，将5A4抗体及8-5抗体分别与10μg/mL真核CD73蛋白孵育30min，设置5A4、8-5、5A4(孵育后)和8-5(孵育后)4个实验组进行上述流式检测。结果如图4所示，阻断后两株抗体的结合率均下降90％左右，证明这两株抗体与CD73的结合具有特异性。
实施例5：体内检测抗CD73酶活性相关表位特异性单克隆抗体与靶蛋白的结合情况选择5只4周龄的Balb/c雌性裸鼠屏障中饲养1周，将对数生长期的MDA-MB-231细胞消化并洗涤2次后，按1×107/只的细胞接种量计数留取所需细胞。用PBS重悬细胞沉淀，加入等体积基质胶混匀，按200μL/只的剂量将混悬液接种至小鼠左侧腋下脂肪垫，建立小鼠乳腺癌原位接种模型，即MDA-MB-231荷瘤Balb/c裸鼠。
使用Alexa Fluor 647抗体标记试剂盒(美国赛默飞世尔科技有限公司)将5A4抗体进行荧光素标记，按150μL/只的剂量尾静脉注射上述荷瘤小鼠。24h后给予小鼠异氟烷吸入麻醉，将麻醉后的小鼠肿瘤面朝上置入暗室中，使用活体荧光成像***(美国赛默飞世尔科技有限公司)进行拍照(激发波长684nm，发射波长707nm)，每隔24h重复麻醉拍照，直至其中有小鼠荧光完全消失为止。
结果如图5所示，小鼠移植瘤区域明显呈高信号，而其他组织未见明显信号，提示偶联了荧光素的5A4抗体特异性结合在肿瘤区域，即CD73酶活性相关表位特异性抗体可在体内与人肿瘤组织中高表达的CD73分子高度结合。同时，根据药物代谢检测情况，24h后可见5只小鼠明显结合，直至第5天有小鼠出现药物完全代谢。
实施例6：抗CD73酶活性相关表位特异性单克隆抗体的生物学功能验证
1体外实验
对于CD73蛋白来说，其最重要的生物学功能是酶解AMP生成腺苷，即酶活性。因此我们借助高效液相色谱(HPLC)检测经5A4抗体及8-5抗体处理后高表达CD73的肿瘤细胞系培养上清中腺苷的分泌情况。取对数生长期的MDA-MB-231细胞消化计数，以2×104个/孔铺24孔板。待6h细胞贴壁后吸掉上清，加入L-15培养基配制的5A4、8-5、APCP和同型IgG对照，分别设置25μg/mL、12.5μg/mL、6.25μg/mL、3.13μg/mL、1.56μg/mL、0.78μg/mL和0.39μg/mL的浓度梯度。37℃孵育2h后，吸掉上清，PBS清洗1遍，加入无血清L-15配制的500μmol/LAMP，每孔200μL，37℃孵育30min。收集培养上清，2000rpm离心3min，将100μL上清与甲醇按1:1震荡混匀，混匀后15000g离心10min，吸取200μL上清加入内衬管中，使用高效液相色谱(日本岛津公司)检测腺苷水平。
如图6所示，在25μg/mL浓度下，5A4抗体和8-5抗体均可明显抑制腺苷的分泌，抑制率分别为100％和85％，显著高于商品化CD73小分子抑制剂APCP。同时两株抗体对MDA-MB-231细胞腺苷分泌的抑制呈浓度依赖性，提示它们不仅能结合CD73，且具备酶活性抑制功能。
2体内实验
我们对实施例5中获得的MDA-MB-231荷瘤Balb/c裸鼠进行分组，接种后10天(皮下瘤可触及)开始腹腔注射给药。5A4抗体及同型抗体共给药8次，第1次注射400mg/只，其余7次均为200mg/只，分别于第4、7、10、13、16、19、22、25天给药；APCP每天给药1次，400μg/只。治疗结束后取瘤进行称重、拍照，加入1mL高氯酸反复研磨至肿瘤组织呈匀浆状态。15000g水平离心10min后吸取上清，40μm滤网过滤，滤液作为样本借助上述HPLC方法检测其中腺苷含量(μmol)，并计算出单位重量中腺苷的含量(μmol/g)。
比较结果如图7所示，相比于同型抗体，小分子抑制剂APCP可减少肿瘤组织腺苷的产生，而5A4抗体可进一步显著减少腺苷的分泌，这证明CD73酶活性相关表位特异性抗体可在体内组织水平抑制腺苷分泌。
实施例7：体外验证抗CD73酶活性相关表位特异性单克隆抗体的淋巴细胞刺激能力我们借助混合淋巴细胞反应检测8-5抗体刺激淋巴细胞产生γ-干扰素的能力。准备好两份健康人外周血分离得到的PBMC，计数后取等量细胞混合后铺于U形底96孔板(20万/100μL/孔)。待6h细胞聚团后加药，设置同型IgG、5A4、8-5和5A4+8-5四组，浓度梯度分别为50μg/mL、25μg/mL、12.5μg/mL和6.25μg/mL，每组设置3个复孔。37℃孵育48h后，2000rpm离心3min，小心吸取上清作为待测样本，按照人IFN-γELISA检测试剂盒(美国Biolegend公司)说明书进行操作，结果如图8所示，相比于同型抗体，8-5抗体可明显刺激淋巴细胞分泌γ-干扰素。
实施例8：检测抗CD73酶活性相关表位特异性单克隆抗体对肿瘤细胞增殖的影响事先设置7个时间梯度组，将对数生长期MDA-MB-231细胞按104个/100μL/孔的浓度消化计数铺板于96孔板中。待细胞贴壁后分别加入等体积10μg/mL的同型抗体、5A4抗体和8-5抗体，37℃CO2培养箱中孵育。每隔24h对相应组别进行如下操作：使用移液器将10μL CCK-8溶液小心添加到每个孔中，培养箱中孵育2h，结束后取出96孔板在振荡器上震荡混合1min，使用多功能检测酶标仪(美国Thermo Fisher公司)测量450nm处的吸光度。
结果如图9所示，相较于同型抗体，5A4抗体可明显抑制MDA-MB-231细胞的增殖，8-5抗体的抑制程度稍低一些，提示CD73酶活性相关表位特异性抗体在体外具有抑制肿瘤细胞增殖的作用。
实施例9：检测抗CD73酶活性相关表位特异性单克隆抗体对体内肿瘤生长的影响我们对实施例6体内实验中经不同药物治疗的MDA-MB-231荷瘤Balb/c裸鼠进行每周3次的肿瘤生长监测，测量肿瘤的长径及短径，计算体积(公式为体积＝长径×长径×短径/2)并记录，使用GraphPad Prism软件绘制肿瘤体积生长曲线图。同时剥离其皮下移植瘤，拍照并称重记录。结果如图10所示，从肿瘤体积上看，相较于同型抗体，APCP及5A4抗体均可在一定程度上抑制肿瘤生长，且5A4抗体比APCP的抑制效果更明显；从肿瘤重量上看，5A4抗体呈现比APCP更好的抑制效果，但差异无统计学意义。这些提示CD73酶活性相关表位特异性抗体具有体内抑制肿瘤生长的作用。
实施例10：检测抗CD73酶活性相关表位特异性单克隆抗体与化疗药物的联合效应为评估5A4抗体与化疗药物奥沙利铂(免疫原性较高，可产生胞外ATP)联用的治疗效果，我们对实施例5中获得的MDA-MB-231荷瘤Balb/c裸鼠进行分组，分别设置同型抗体、5A4抗体、奥沙利铂和5A4抗体+奥沙利铂四组，接种后10天(皮下瘤可触及)开始腹腔注射给药。5A4抗体及同型抗体共给药8次，第1次注射400mg/只，其余7次均为200mg/只，分别于第4、7、10、13、16、19、22、25天给药；奥沙利铂共给药2次，分别在第5天和第14天给予10mg/kg。治疗过程中，每周检测肿瘤生长3次，测量肿瘤长径及短径，计算体积(公式为体积＝长径×长径×短径/2)并记录。当肿瘤体积达到2000mm3或肿瘤坏死时处死小鼠，计算存活率，取瘤进行称重、拍照，使用GraphPad Prism软件绘制肿瘤体积生长曲线图及生存曲线图。
结果如图11所示，与同型抗体治疗组相比，5A4抗体单独治疗可抑制肿瘤生长，但肿瘤消退不如奥沙利铂治疗组，而5A4抗体和奥沙利铂联合治疗可进一步抑制肿瘤。生存期方面呈现同样的趋势，5A4抗体联合奥沙利铂可明显延长小鼠的生存时间。
进一步地，化疗药物在大量杀伤局部肿瘤细胞时，细胞损伤及坏死后会释放大量ATP，随后水解产生腺苷，腺苷在局部的大量聚集可导致化疗药物耐药及免疫细胞功能抑制。我们将上述不同组治疗后剥离的肿瘤反复研磨至组织呈匀浆状态，15000g水平离心10min后吸取上清，40μm滤网过滤，滤液作为样本借助前述HPLC方法检测其中腺苷含量(μmol)，并计算出单位重量中腺苷的含量(μmol/g)。
结果如图12所示，相比于对照组(同型抗体)，奥沙利铂治疗后的小鼠肿瘤组织腺苷含量明显升高，与5A4抗体联用后，组织水平腺苷含量较前明显降低，这提示5A4抗体可有效抑制化疗药物导致的局部微环境腺苷聚集。
综上所述，本发明提供了一种CD73酶活性相关的抗原表位，其氨基酸序列包括SEQID NO:1或SEQ ID NO:2或与两者同源性在90％以上的氨基酸序列。制备针对该表位特异性抗体的方法包括以下步骤：(1)合成包含上述氨基酸序列的抗原合成肽；(2)利用步骤(1)合成的抗原合成肽免疫动物，获得杂交瘤细胞，收集培养上清；(3)将步骤(2)收集的上清进行筛选、鉴定与纯化。上述抗体制备方法可以大大提高功能性抗CD73单抗的筛选效率，减少后期克隆鉴定的成本，且制备的表位特异性抗体能有效抑制CD73酶活性和刺激淋巴细胞释放干扰素，发挥抗肿瘤作用，具有广泛的应用前景和实用价值。
在本发明中，除非另有说明，否则本文中使用的科学和技术名词具有本领域技术人员所通常理解的含义。并且，本文中所用的细胞培养、分子遗传学、核酸化学、免疫学实验室操作步骤均为相应领域内广泛使用的常规步骤。
本发明中所用原料、设备，若无特别说明，均为本领域的常用原料、设备；本发明中所用方法，若无特别说明，均为本领域的常规方法。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例，并非对本发明作任何限制，凡是根据本发明技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、变更以及等效变换，均仍属于本发明技术方案的保护范围。
序列表
<110> 浙江大学
杭州昂可纽生物科技有限公司
<120> 一种CD73酶活性相关的抗原表位及针对该表位的特异性抗体的制备方法
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 12
<212> PRT
<213> 胞外-5’-核苷酸酶(Ecto-5′-Nucleotidase)
<400> 1
Ile Glu Phe Asp Glu Arg Gly Asn Val Ile Ser Ser
1 5 10
<210> 2
<211> 14
<212> PRT
<213> 胞外-5’-核苷酸酶(Ecto-5′-Nucleotidase)
<400> 2
Pro Glu Asp Pro Ser Ile Lys Ala Asp Ile Asn Lys Trp Arg
1 5 10

Claims (7)

1.一种CD73酶活性相关的抗原表位肽，其特征在于，所述抗原表位肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。
2.一种CD73酶活性相关的抗原表位肽，其特征在于，所述抗原表位肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。
3.如权利要求1或2所述抗原表位肽在制备针对CD73酶活性相关抗原表位的特异性抗体中的应用。
4.一种针对CD73酶活性相关抗原表位的特异性抗体的制备方法，其特征在于，所述CD73酶活性相关抗原表位的氨基酸序列如SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2所示；所述制备方法包括以下步骤：
（1）合成包含如权利要求1或2所述抗原表位的抗原肽，与牛血清白蛋白偶联后，获得多肽-BSA偶联物；
（2）利用步骤（1）合成的多肽-BSA偶联物免疫动物，获得杂交瘤细胞，收集培养上清液；
（3）对步骤（2）收集的上清液进行筛选、鉴定与纯化，得到针对CD73酶活性相关抗原表位的特异性抗体。
5.如权利要求1或2所述抗原表位肽在制备药物制剂中的应用，其特征在于，所述药物制剂用于治疗高表达CD73的肿瘤。
6.如权利要求5所述应用，其特征在于，所述药物制剂包含利用所述抗原表位肽制得的特异性抗体和药学上可接受的运载体。
7.如权利要求5所述应用，其特征在于，所述药物制剂包含利用所述抗原表位肽制得的特异性抗体和奥沙利铂。
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