CN111705038A

CN111705038A - 一种稳定表达人源pdl1/cd73蛋白细胞株的构建方法及其应用

Info

Publication number: CN111705038A
Application number: CN202010853887.4A
Authority: CN
Inventors: 赵静; 琚存祥; 鞠超
Original assignee: Gempharmatech Co ltd
Current assignee: Jiangsu Jicui Yaokang Biotechnology Co., Ltd
Priority date: 2020-08-24
Filing date: 2020-08-24
Publication date: 2020-09-25
Anticipated expiration: 2040-08-24
Also published as: CN111705038B

Abstract

本发明提供了一种稳定表达双人源PDL1/CD73蛋白细胞株的构建方法，通过在鼠源肿瘤细胞上对CD73和PD‑L1靶基因进行人源化，在鼠源肿瘤细胞上用人的hCD73和hPD‑L1基因取代小鼠mCD73和mPD‑L1表达，从而构建了一种专门用于在免疫健全的小鼠体内评价抗体人源化药物药效评价细胞系，可作为直接评价人源化抗体药物的临床前药效实验的可靠方法。

Description

一种稳定表达人源PDL1/CD73蛋白细胞株的构建方法及其应用

技术领域

本发明属于动物基因工程和基因遗传修饰领域，具体地说，涉及一种稳定表达双人源PDL1/CD73蛋白细胞株的构建方法及其在生物医药的应用。

背景技术

使用靶向CTLA-4和PD-1/PD-L1的免疫检查点疗法已经彻底地变革了实体肿瘤的治疗方法和进程。然而，免疫检查点疗法的临床疗效依旧存在患者阳性相应率低，并且不同肿瘤之间肿瘤特异性靶向免疫检查点的机理仍不清楚等问题。为了进一步提升PD1/PDL1药物的阳性率和扩大肿瘤适应症，多种联合免疫检查点策略的临床试验正在大量进行中。

肿瘤细胞可以通过多种机制逃避抗肿瘤免疫反应，如诱导和招募各种抑制免疫细胞，分泌免疫抑制细胞因子，产生免疫抑制代谢产物。多种免疫抑制细胞如调节性T细胞(Treg)、骨髓源性抑制细胞(MDSCs)、肿瘤相关巨噬细胞(TAMs)和非自然杀伤T细胞(NKT)等在肿瘤微环境中积累，通过抑制抗肿瘤免疫反应，帮助肿瘤逃逸。在肿瘤微环境的各种免疫调节因子中，腺苷(adenosine)是一种ATP衍生的核苷，是帮助肿瘤逃逸的重要因子。腺苷代谢信号通路是促进肿瘤发生及恶化过程中的关键信号通路之一，该信号通路的激活与抑制主要由腺苷生成酶所调控肿瘤微环境的炎症和低氧状态增强了腺苷生成酶的表达，其中包括CD73。CD73通过自身酶活性水解磷酸腺苷（AMP）为腺苷。目前已有多项研究表明，CD73在多种实体瘤中高表达。同时，体外实验数据表明CD73高表达可促进多种肿瘤细胞增殖和侵袭。

有研究发现肿瘤Treg细胞发生凋亡，这种凋亡的Treg细胞废除PDL1抑制剂介导的抗肿瘤T细胞免疫。实验结果表明，腺苷，而不是典型的抑制因子如PD-L1、CTLA-4、TGF-TGF、IL-35和IL-10，是介导凋亡的Treg细胞免疫抑制的关键因子。凋亡的Treg细胞通过CD39和CD73释放并将大量ATP转化为腺苷，并通过腺苷和A2A途径介导免疫抑制。对于肿瘤患者，抗体药物靶向阻断CD73信号通路激活将有效抑制肿瘤生长。联合抗PDL1等免疫检查点抑制剂阻断CD73信号通路将是一种新的有前景的联合靶点治疗策略。

小鼠是目前应用最广泛也是最具有代表性的临床前实验动物，目前研究肿瘤靶向抗体类药物较广泛使用的是肿瘤异体移植小鼠模型，即人源肿瘤细胞系或肿瘤组织接种到免疫缺陷小鼠后形成人源肿瘤的模型。但该模型用于药效评价***的缺陷在于无法体现和研究药物的靶向性和特异性，尤其对于通过调节免疫***发挥药效功能的药物，该模型由于缺失B细胞、T细胞和NK细胞不能更真实的反映药物药效及药物发挥作用的机制。

由于小鼠的免疫***与人类高度相似，小鼠的同源肿瘤模型（Syngeneic Model）也被广泛应用于肿瘤药物筛选和药效评估中。同源肿瘤模型即将鼠源肿瘤细胞接种到同型小鼠体内，待肿瘤细胞形成瘤体后进而筛选和评价药效。但该模型存在的问题在于只能评价靶向鼠源抗原抗体或人鼠共识别抗体药物药效，对于特异性靶向人源肿瘤抗原的药物则无法很好地进行预测。为了在同源肿瘤模型中解决该问题，我们提出了对同源肿瘤模型中的肿瘤细胞进行基因人源化改造的方案，通过基因编辑技术，将鼠源肿瘤细胞的基因替换为人源基因，并将人源化鼠源细胞接种到同型小鼠上，能够满足在免疫功能健全的小鼠上验证和筛选靶向人源抗原的药物药效及探究机制的功能。

由于同源肿瘤模型的可靠性和稳定性，将会是评价抗体药物未来长期的发展趋势。而基因人源化肿瘤细胞作为同源肿瘤小鼠模型的必不可少的一部分，对于靶向肿瘤细胞人源抗原的基因改造则是十分必要且不可缺少的。

然而，由于小鼠和人体在免疫***功能上依然存在着不少差异，如何在小鼠上更好的模拟人体的免疫***功能，构建出更加符合人类免疫***临床前药物动物研究模型，仍然是新药研发者和临床前CRO公司面临的大挑战。

为解决如上问题，本发明通过在鼠源肿瘤细胞上对CD73和PD-L1靶基因进行人源化，在鼠源肿瘤细胞上用人的hCD73和hPD-L1基因取代小鼠mCD73和mPD-L1表达，从而构建了一种专门用于在免疫健全的小鼠体内评价抗体人源化药物药效评价细胞系，可作为直接评价人源化抗体药物的临床前药效实验的可靠方法。

我们构建了优化的制备稳定表达双人源PDL1/CD73蛋白细胞株的具体操作方法，该方法中优化了表达人源化的载体上的元件构成、敲除鼠源基因的最佳sgRNA、以及鉴定筛选所使用的引物和酶切方案等，确保了制备目的细胞株的高效性。

发明内容

本发明提供了一种稳定表达双人源PDL1/CD73蛋白细胞株的构建方法，该方法无需慢病毒包装和感染，直接将目的片段转入细胞内，即可获得稳定高表达人源蛋白的细胞株，包括如下步骤：将人源化CD73基因全部CDS序列随机***至表达人源化PDL1的细胞系中，同时采用Cas9 KO技术将鼠源的CD73敲除，实现人源PDL1/CD73基因取代鼠源PDL1/CD73基因的在鼠源细胞中的稳定表达，人源CD73 CDS序列如SEQ ID NO：2所示，其所编码的氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示。

优选地，该方法具体包括如下步骤：（1）构建表达人源化CD73的表达载体用于人源化CD73基因的***，该载体包含如下组件CAG启动子-hCD73-PolyA-Loxp-Puromycin –Loxp；（2）构建sgRNA用于鼠源CD73的敲除；（3）将表达人源化CD73的表达载体和sgRNA连同Cas9蛋白同时电转入表达人源化PDL1的细胞，获得高表达hPDL1和hCD73且几乎不表达mPDL1和mCD73的细胞。

优选地，通过扩增和电泳对步骤（1）中构建的载体进行鉴定，扩增使用如下引物对CAG-tF1/ GPT000349-tR1和GPT000349-tF2/ GPT000349-tR2（SEQ ID NO：4-7）：

。

优选地，通过酶切和电泳对步骤（1）中构建的载体进行鉴定，酶切使用方案：

限制性内切酶	片段长度
		HindIII	5017\3506
SpeI	4362\2857\1304
		NotI	5823\2700

优选地，其中步骤（2）具体为：在exon2的5’端和exon3的3’端设计sgRNA，筛选发生移码突变的细胞克隆。根据CRISPR Cas9技术，分别在exon2的5’端和exon3的3’端分别设计了2条sgRNA，使用sgRNA进行细胞电转，并收集细胞提取遗传物质，通过PCR和TA克隆进行sgRNA切割效率判断，筛选出切割效率较高的sgRNA用于后续细胞电转。

优选地，其中筛选出的切割效率最高的sgRNA为CD73-E2S1和CD73-E3S2，序列如下所示：

SEQ ID NO：8: AGTTCTCTCTGTTGGCGGTG

SEQ ID NO：9：CGCTCAGAAAGTTCGAGGTG。

优选地，其中步骤（3）具体为：

（a）将MC38肿瘤细胞复苏传代；（b）第四天进行肿瘤细胞电转，将表达人源化CD73的表达载体和sgRNA连同Cas9蛋白同时电转入细胞中，电转培养；（c）48h后，加入Puromycin进行细胞筛选，每天更换含有相应药物浓度的培养液，同步药筛野生型细胞作对照，直至对照的野生型细胞全部死亡，继续培养细胞至一定密度，使用有限稀释法进行单克隆挑选，将挑选的单克隆细胞扩增至一定密度，一部分细胞冻存，一部分细胞进行人源和鼠源CD73表达检测；（d）通过PCR鉴定不同细胞克隆中鼠源CD73删除情况；（e）通过流式细胞仪检测分析不同细胞克隆中hCD73和hCD73蛋白表达水平。

优选地，步骤（d）中PCR鉴定使用的引物如下所示：

。

优选地，步骤（3）还包括：(f) 细胞体内成瘤性测试。

优选地，所述细胞为肿瘤细胞。

优选地，其中表达人源化PDL1的细胞系为hPDL1（Tg）-mPDL1（KO）细胞系，是将人源PDL1基因胞外区域CDS替换鼠源PDL1基因的胞外域序列，同时利用CRISPR Cas9的技术将鼠源Pdl1基因敲除获得。

优选地，人源化PDL1的细胞系的构建具体包括：

（1）构建表达人源化PDL1的表达载体用于人源化PDL1基因的***，所述人源化PDL1的氨基酸序列如下（SEQ ID NO：1）：

MRIFAVFIFMTYWHLLNAFTVTVPKDLYVVEYGSNMTIECKFPVEKQLDLAALIVYWEMEDKNIIQFVHGEEDLKVQHSSYRQRARLLKDQLSLGNAALQITDVKLQDAGVYRCMISYGGADYKRITVKVNAPYNKINQRILVVDPVTSEHELTCQAEGYPKAEVIWTSSDHQVLSGKTTTTNSKREEKLFNVTSTLRINTTTNEIFYCTFRRLDPEENHTAELVIPELPATHPPQNRTHWVLLGSILLFLIVVSTVLLFLRKQVRMLDVEKCGVEDTSSKNRNDTQFEET。

该载体包含如下组件：CAG启动子-hPDL1胞外区CDS- mPDL1胞内区CDS -PolyA-Loxp-Neo –Loxp；经PCR鉴定和酶切鉴定证实载体构建成功。

（2）构建sgRNA用于鼠源PDL1的敲除；筛选出的切割效率最高的sgRNA如下：

Gtatggcagcaacgtcacgatgg（SEQ ID NO：18）；agtgaccaccaacccgtgagtgg（SEQ ID NO：19）；

（3）将表达人源化PDL1的表达载体和sgRNA连同Cas9蛋白同时电转入细胞，获得高表达人源化PDL1且几乎不表达鼠源PDL1的细胞。

本发明还提供上述任一方法在评估靶向人源CD73的药物有效性、靶向人源CD73的药物筛选开发、靶向人源CD73的药物联合其他药物抗肿瘤药效评价、或靶向人源CD73的药物的毒理研究中的应用。

还提供了特异性靶向小鼠CD73基因的sgRNA，包括 CD73-E2S1和CD73-E3S2，CD73-E2S1、CD73-E3S2的引物序列如下所示：

SEQ ID NO：7：AGTTCTCTCTGTTGGCGGTG

SEQ ID NO：8：CGCTCAGAAAGTTCGAGGTG。

本发明具有以下积极效果：

1、本发明提供了一种人源化肿瘤细胞系的修饰方法，操作简单，无需慢病毒包装和感染，直接将目的片段转入细胞内，即可获得稳定高表达人源蛋白的细胞株。此种人源化肿瘤细胞系获取方法，不受慢病毒载体容量限制，可同时进行多基因载体的转入，获得多基因人源化细胞系。

2、本发明建立了一种人源化PDL1/CD73肿瘤细胞系配合人源化小鼠的体系，该体系可用于人源药物的体内药效评价。在人源化小鼠免疫***健全中接种表达人源化细胞系后再进行药物评价，更能真实的反映药物疗效。与使用免疫重建后的荷瘤鼠进行药效评价相比，人源化小鼠接种同种人源化肿瘤细胞系的模型，大大降低了药效评价成本，为同时进行大量候选药的药物筛选提供了平台。

3、本发明提供了优化的制备稳定表达双人源PDL1/CD73蛋白细胞株的具体操作方法，该方法中优化了表达人源化CD73的载体上的元件构成、敲除鼠源CD73的最佳sgRNA、以及鉴定筛选所使用的引物和酶切方案，确保了制备目的细胞株的高效性。

附图说明

图1 为CAG-hCD73PolyA-Loxp-Puro-Loxp载体构建策略。

图2为GPT000349-huCD73载体鉴定跑胶图。

图3为GPT000349-CAG-huCD73-polyA-Puro鉴定跑胶图。

图4为GPT000349-huCD73酶切鉴定跑胶图。

图5为鼠源CD73基因敲除策略。

图6为MC38-hCD73 (Tg)-mCD73 (KO)-hPDL1 (Tg)-mPDL1 (KO)鉴定跑胶图。

图7为不同细胞株表达人源和鼠源PDL1和CD73蛋白的流式检测图。

图8为MC38-hPDL1(Tg)-mPDL1(KO)细胞及MC38wt细胞在C57BL/6-hPD1/hPDL1/hCD137小鼠体内的成瘤测试。

具体实施方式

下面结合附图对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。

实施例1：MC38-hCD73 (Tg)-mCD73 (KO)-hPDL1 (Tg)-mPDL1 (KO)细胞系构建

1、CAG-hCD73PolyA Loxp-Puro-Loxp载体构建

CAG-hCD73PolyA-Loxp-Puro-Loxp载体的构建策略如图1所示，具体构建方法如下：

1.1确定人源片段替换区域及***的人源序列：

我们将人源化CD73基因全部CDS序列随机***至表达人源化PDL1的细胞系中，同时采用Cas9 KO技术将鼠源的CD73敲除，实现了人源PDL1/CD73基因取代鼠源PDL1/CD73基因的在鼠源细胞中的稳定表达。

其中，表达人源化PDL1的细胞系hPDL1（Tg）-mPDL1（KO）细胞系是将人源PDL1基因胞外区域CDS替换鼠源PDL1基因的胞外域序列，同时利用CRISPR Cas9的技术将鼠源PDL1基因敲除获得，具体包括：

MRIFAVFIFMTYWHLLNAFTVTVPKDLYVVEYGSNMTIECKFPVEKQLDLAALIVYWEMEDKNIIQFVHGEED LKVQHSSYRQRARLLKDQLSLGNAALQITDVKLQDAGVYRCMISYGGADYKRITVKVNAPYNKINQRILVVDPVTSE HELTCQAEGYPKAEVIWTSSDHQVLSGKTTTTNSKREEKLFNVTSTLRINTTTNEIFYCTFRRLDPEENHTAELVIPELPATHPPQNRTHWVLLGSILLFLIVVSTVLLFLRKQVRMLDVEKCGVEDTSSKNRNDTQFEET

人源化CD73 CDS序列如下（SEQ ID NO：2）：

ATGTGTCCCCGAGCCGCGCGGGCGCCCGCGACGCTACTCCTCGCCCTGGGCGCGGTGCTGTGGCCTGCGGCTGGCGCCTGGGAGCTTACGATTTTGCACACCAACGACGTGCACAGCCGGCTGGAGCAGACCAGCGAGGACTCCAGCAAGTGCGTCAACGCCAGCCGCTGCATGGGTGGCGTGGCTCGGCTCTTCACCAAGGTTCAGCAGATCCGCCGCGCCGAACCCAACGTGCTGCTGCTGGACGCCGGCGACCAGTACCAGGGCACTATCTGGTTCACCGTGTACAAGGGCGCCGAGGTGGCGCACTTCATGAACGCCCTGCGCTACGATGCCATGGCACTGGGAAATCATGAATTTGATAATGGTGTGGAAGGACTGATCGAGCCACTCCTCAAAGAGGCCAAATTTCCAATTCTGAGTGCAAACATTAAAGCAAAGGGGCCACTAGCATCTCAAATATCAGGACTTTATTTGCCATATAAAGTTCTTCCTGTTGGTGATGAAGTTGTGGGAATCGTTGGATACACTTCCAAAGAAACCCCTTTTCTCTCAAATCCAGGGACAAATTTAGTGTTTGAAGATGAAATCACTGCATTACAACCTGAAGTAGATAAGTTAAAAACTCTAAATGTGAACAAAATTATTGCACTGGGACATTCGGGTTTTGAAATGGATAAACTCATCGCTCAGAAAGTGAGGGGTGTGGACGTCGTGGTGGGAGGACACTCCAACACATTTCTTTACACAGGCAATCCACCTTCCAAAGAGGTGCCTGCTGGGAAGTACCCATTCATAGTCACTTCTGATGATGGGCGGAAGGTTCCTGTAGTCCAGGCCTATGCTTTTGGCAAATACCTAGGCTATCTGAAGATCGAGTTTGATGAAAGAGGAAACGTCATCTCTTCCCATGGAAATCCCATTCTTCTAAACAGCAGCATTCCTGAAGATCCAAGCATAAAAGCAGACATTAACAAATGGAGGATAAAATTGGATAATTATTCTACCCAGGAATTAGGGAAAACAATTGTCTATCTGGATGGCTCCTCTCAATCATGCCGCTTTAGAGAATGCAACATGGGCAACCTGATTTGTGATGCAATGATTAACAACAACCTGAGACACACGGATGAAATGTTCTGGAACCACGTATCCATGTGCATTTTAAATGGAGGTGGTATCCGGTCGCCCATTGATGAACGCAACAATGGCACAATTACCTGGGAGAACCTGGCTGCTGTATTGCCCTTTGGAGGCACATTTGACCTAGTCCAGTTAAAAGGTTCCACCCTGAAGAAGGCCTTTGAGCATAGCGTGCACCGCTACGGCCAGTCCACTGGAGAGTTCCTGCAGGTGGGCGGAATCCATGTGGTGTATGATCTTTCCCGAAAACCTGGAGACAGAGTAGTCAAATTAGATGTTCTTTGCACCAAGTGTCGAGTGCCCAGTTATGACCCTCTCAAAATGGACGAGGTATATAAGGTGATCCTCCCAAACTTCCTGGCCAATGGTGGAGATGGGTTCCAGATGATAAAAGATGAATTATTAAGACATGACTCTGGTGACCAAGATATCAACGTGGTTTCTACATATATCTCCAAAATGAAAGTAATTTATCCAGCAGTTGAAGGTCGGATCAAGTTTTCCACAGGAAGTCACTGCCATGGAAGCTTTTCTTTAATATTTCTTTCACTTTGGGCAGTGATCTTTGTTTTATACCAATAG

人源CD73 CDS编码氨基酸序列如下（SEQ ID NO：3）：

MCPRAARAPATLLLALGAVLWPAAGAWELTILHTNDVHSRLEQTSEDSSKCVNASRCMGGVARLFTKVQQIRRAEPNVLLLDAGDQYQGTIWFTVYKGAEVAHFMNALRYDAMALGNHEFDNGVEGLIEPLLKEAKFPILSANIKAKGPLASQISGLYLPYKVLPVGDEVVGIVGYTSKETPFLSNPGTNLVFEDEITALQPEVDKLKTLNVNKIIALGHSGFEMDKLIAQKVRGVDVVVGGHSNTFLYTGNPPSKEVPAGKYPFIVTSDDGRKVPVVQAYAFGKYLGYLKIEFDERGNVISSHGNPILLNSSIPEDPSIKADINKWRIKLDNYSTQELGKTIVYLDGSSQSCRFRECNMGNLICDAMINNNLRHTDEMFWNHVSMCILNGGGIRSPIDERNNGTITWENLAAVLPFGGTFDLVQLKGSTLKKAFEHSVHRYGQSTGEFLQVGGIHVVYDLSRKPGDRVVKLDVLCTKCRVPSYDPLKMDEVYKVILPNFLANGGDGFQMIKDELLRHDSGDQDINVVSTYISKMKVIYPAVEGRIKFSTGSHCHGSFSLIFLSLWAVIFVLYQ

1.2构建载体CAG-hCD73-PolyA-Loxp-Puro-Loxp

1）用XhoI酶切V52#MouseH11-CAG-pMD18T（2713bp，1783bp），回收1783bp的片段，命名为GPT000349-huCD73。如图2所示。一个孔代表酶切的一个反应体系，为了保证回收片段浓度，我们进行了两管酶切反应体系。

2）高保真酶PCR扩增GPT000349-huCD73。

3）使用V52#.PMD18T-CAG-PURO，ASC1线性化酶切载体CIAP处理备用；

4）SLIC连接扩增huCD73到步骤3回收的线性化的载体上，涂AMP板，连接成功的载体命名为GPT000349-CAG-huCD73-polyA-Puro TG。使用表1所示引物对载体进行扩增，扩增产物的电泳图如图3所示，可见经过CAG-tF1/ GPT000349-tR1引物对扩增产生了预期的943bp产物，经GPT000349-tF2/ GPT000349-tR2引物对扩增产生了预期的1311bp产物。每个孔代表AMP板上挑取的单菌落提取的质粒鉴定结果。

表1 GPT000349-CAG-huCD73-polyA-Puro TG载体鉴定引物

。

鉴定时采用的限制性内切酶和酶切后的片段长度如表2所示。GPT000349-huCD73酶切鉴定跑胶图如图4所示。酶切鉴定结果表明GPT000349-CAG-huCD73-polyA-Puro TG载体构建成功。

表2 GPT000349-CAG-huCD73-polyA-Puro TG酶切鉴定方案

。

2、构建sgRNA用于鼠源CD73敲除

鼠源CD73基因敲除策略的示意图如图5所示。

2.1 通过分析CD73基因结果发现，每个外显子单独敲除后均不发生移码。为了提高敲除效率，同时避免切除人源CD73 CDS序列，在exon2的5’端和exon3的3’端设计sgRNA，筛选发生移码突变的细胞克隆。根据CRISPR Cas9技术，分别在exon2的5’端和exon3的3’端分别设计了2条sgRNA。

2.2 sgRNA转录制备方法：以PrimerStar或PrimerStarMax体系，sgRNA-F、sgRNA-R为引物，测序正确的puc57-sgRNA质粒为模板进行PCR，PCR产物进行纯化，制备sgRNA转录制备模板。使用T7-ShortScript体外转录试剂盒（AM1354）进行sgRNA的转录。

2.3使用表3的sgRNA进行细胞电转，并收集细胞提取遗传物质，通过PCR和TA克隆进行sgRNA切割效率判断。根据结果，筛选出切割效率较高的sgRNA：CD73-E2S1（序列为：SEQID NO：8 AGTTCTCTCTGTTGGCGGTG）和CD73-E3S2（序列为：SEQ ID NO：9：CGCTCAGAAAGTTCGAGGTG）用于后续MC38细胞电转。

表3敲除鼠源CD73所用sgRNA序列

。

3、细胞电转，获得MC38-hCD73 (Tg)-mCD73 (KO)-hPDL1 (Tg)-mPDL1 (KO)细胞系。

3.1将MC38肿瘤细胞复苏，铺板到10cm培养皿上，每天换液，隔天传代。

3.2第四天进行肿瘤细胞电转，将GPT000349-CAG-huCD73-polyA-Puro载体和sgRNA连同Cas9蛋白同时电转入细胞中。完成电转后，将细胞放入二氧化碳培养箱，37°C，5%CO2培养，每天换液。

3.3细胞培养48h后，加入Puromycin（200ul/ml）进行细胞筛选。每天更换含有相应药物浓度的培养液，同步药筛野生型细胞作对照，直至对照的野生型细胞全部死亡，继续培养细胞至一定密度，使用有限稀释法进行单克隆挑选。将挑选的单克隆细胞扩增至一定密度，一部分细胞冻存，一部分细胞进行人源和鼠源CD73表达检测。

3.4通过PCR鉴定不同细胞克隆中鼠源CD73删除情况。

将挑选的13个单克隆细胞株（G7、2G7、H7、D11、F7、E11、2G7、F11、F10、G11、C11、2C11、2F9）提取相应细胞遗传物质，进行PCR扩增、胶回收、测序，判断鼠源CD73删除和人源CD73转基因情况。结果如下：

1）克隆2G7、H7、E11、2G7、F11、C11、2C11、2F9基因型为转入hCD73基因型；

2）克隆H7、G11、C11基因型为敲除mCD73基因型；

根据以上PCR和跑胶鉴定结果，我们选择H7和C11细胞克隆株进行后续验证和研究。

鉴定MC38-hCD73 (Tg)-mCD73 (KO)-hPDL1 (Tg)-mPDL1 (KO)时使用的扩增引物如表4所示。扩增产物的电泳图如图6所示。P为阳性对照，WT为MC38野生型，N为negative空白对照，M为DNA Marker，数字代表单克隆细胞。扩增条带与阳性对照条带大小一致，则认为构建成功。

表4 MC38-hCD73 (Tg)-mCD73 (KO)-hPDL1 (Tg)-mPDL1 (KO)鉴定扩增引物

。

3.5通过流式细胞仪检测分析不同细胞克隆中hCD73和hCD73蛋白表达水平。结果显示：

（1）MC38 WT细胞只能检测到mPDL1和mCD73，其中mPDL1＞99%、mCD73＞9%；

（2）细胞株MC38-C11、MC38-H7的mPDL1和mCD73表达比例＜1%，而hPDL1和hCD73表达比例＞99%。

综合以上，细胞株MC38-C11、MC38-H7高表达hPDL1和hCD73且几乎不表达mPDL1和mCD73，可选用进行体外扩增及体内成瘤性测试。

表5不同细胞株表达人源和鼠源PDL1和CD73蛋白检测结果。

。

实施例2 细胞体内成瘤性测试

我们使用自主开发的C57BL/6/hPD1/hPDL1/hCD73人源化小鼠（6-8周龄雌鼠）进行人源化细胞株的体内成瘤性测试。

荷瘤与肿瘤检测方法：

1) 复苏细胞：将所需细胞从液氮罐中取出，于37℃水浴锅中迅速解冻，接种在15cm培养皿中培养。

2) 传代：MC38属于贴壁细胞，通常情况下，每2-3天需要进行一次传代。

3) 将小鼠随机分为4组，小鼠接种对数期的MC38 WT细胞或不同剂量的MC38-C11、MC38-H7细胞。

4) 观察与测量：每天观察小鼠的生长情况，每周称重2次。确认小鼠荷瘤后（肿瘤大小在80-100mm³进行分组），对肿瘤大小进行检测。

5) 接种后单只小鼠肿瘤体积达到3000mm3时执行安乐死结束实验。

结果显示：

1）接种相同数量的MC38-hPDL1(Tg)-mPDL1(KO)-hCD73(Tg)-mCD73 (KO) -C11、MC38-hPDL1(Tg)-mPDL1(KO)-hCD73(Tg)-mCD73 (KO) -H7细胞，体内成瘤速度接近；

2）接种相同数量的MC38-hPDL1(Tg)-mPDL1(KO)、MC38-hCD73(Tg)-mCD73 (KO)细胞，体内成瘤速度接近；

3）接种相同数量的MC38-hPDL1(Tg)-mPDL1(KO)、MC38-hCD73(Tg)-mCD73 (KO)、MC38-hPDL1(Tg)-mPDL1(KO)-hCD73(Tg)-mCD73 (KO) -C11、MC38-hPDL1(Tg)-mPDL1(KO)-hCD73(Tg)-mCD73 (KO) -H7，细胞小鼠体内成瘤中，PDL1和CD73双人源化MC38细胞成瘤速度明显高于PDL1和CD73单人源化细胞；

4）小鼠接种人源化的肿瘤细胞后，对体重变化无影响。

表6成瘤性测试方案及结果

。

尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用。它完全可以被适用于各种适合本发明的领域。对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改。因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节和这里示出与描述的图例。

序列表

<110> 江苏集萃药康生物科技有限公司

<120> 一种稳定表达人源PDL1/CD73蛋白细胞株的构建方法及其应用

<160> 18

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1725

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

atgtgtcccc gagccgcgcg ggcgcccgcg acgctactcc tcgccctggg cgcggtgctg 60

tggcctgcgg ctggcgcctg ggagcttacg attttgcaca ccaacgacgt gcacagccgg 120

ctggagcaga ccagcgagga ctccagcaag tgcgtcaacg ccagccgctg catgggtggc 180

gtggctcggc tcttcaccaa ggttcagcag atccgccgcg ccgaacccaa cgtgctgctg 240

ctggacgccg gcgaccagta ccagggcact atctggttca ccgtgtacaa gggcgccgag 300

gtggcgcact tcatgaacgc cctgcgctac gatgccatgg cactgggaaa tcatgaattt 360

gataatggtg tggaaggact gatcgagcca ctcctcaaag aggccaaatt tccaattctg 420

agtgcaaaca ttaaagcaaa ggggccacta gcatctcaaa tatcaggact ttatttgcca 480

tataaagttc ttcctgttgg tgatgaagtt gtgggaatcg ttggatacac ttccaaagaa 540

accccttttc tctcaaatcc agggacaaat ttagtgtttg aagatgaaat cactgcatta 600

caacctgaag tagataagtt aaaaactcta aatgtgaaca aaattattgc actgggacat 660

tcgggttttg aaatggataa actcatcgct cagaaagtga ggggtgtgga cgtcgtggtg 720

ggaggacact ccaacacatt tctttacaca ggcaatccac cttccaaaga ggtgcctgct 780

gggaagtacc cattcatagt cacttctgat gatgggcgga aggttcctgt agtccaggcc 840

tatgcttttg gcaaatacct aggctatctg aagatcgagt ttgatgaaag aggaaacgtc 900

atctcttccc atggaaatcc cattcttcta aacagcagca ttcctgaaga tccaagcata 960

aaagcagaca ttaacaaatg gaggataaaa ttggataatt attctaccca ggaattaggg 1020

aaaacaattg tctatctgga tggctcctct caatcatgcc gctttagaga atgcaacatg 1080

ggcaacctga tttgtgatgc aatgattaac aacaacctga gacacacgga tgaaatgttc 1140

tggaaccacg tatccatgtg cattttaaat ggaggtggta tccggtcgcc cattgatgaa 1200

cgcaacaatg gcacaattac ctgggagaac ctggctgctg tattgccctt tggaggcaca 1260

tttgacctag tccagttaaa aggttccacc ctgaagaagg cctttgagca tagcgtgcac 1320

cgctacggcc agtccactgg agagttcctg caggtgggcg gaatccatgt ggtgtatgat 1380

ctttcccgaa aacctggaga cagagtagtc aaattagatg ttctttgcac caagtgtcga 1440

gtgcccagtt atgaccctct caaaatggac gaggtatata aggtgatcct cccaaacttc 1500

ctggccaatg gtggagatgg gttccagatg ataaaagatg aattattaag acatgactct 1560

ggtgaccaag atatcaacgt ggtttctaca tatatctcca aaatgaaagt aatttatcca 1620

gcagttgaag gtcggatcaa gttttccaca ggaagtcact gccatggaag cttttcttta 1680

atatttcttt cactttgggc agtgatcttt gttttatacc aatag 1725

<210> 2

<211> 574

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 2

Met Cys Pro Arg Ala Ala Arg Ala Pro Ala Thr Leu Leu Leu Ala Leu

1 5 10 15

Gly Ala Val Leu Trp Pro Ala Ala Gly Ala Trp Glu Leu Thr Ile Leu

20 25 30

His Thr Asn Asp Val His Ser Arg Leu Glu Gln Thr Ser Glu Asp Ser

35 40 45

Ser Lys Cys Val Asn Ala Ser Arg Cys Met Gly Gly Val Ala Arg Leu

50 55 60

Phe Thr Lys Val Gln Gln Ile Arg Arg Ala Glu Pro Asn Val Leu Leu

65 70 75 80

Leu Asp Ala Gly Asp Gln Tyr Gln Gly Thr Ile Trp Phe Thr Val Tyr

85 90 95

Lys Gly Ala Glu Val Ala His Phe Met Asn Ala Leu Arg Tyr Asp Ala

100 105 110

Met Ala Leu Gly Asn His Glu Phe Asp Asn Gly Val Glu Gly Leu Ile

115 120 125

Glu Pro Leu Leu Lys Glu Ala Lys Phe Pro Ile Leu Ser Ala Asn Ile

130 135 140

Lys Ala Lys Gly Pro Leu Ala Ser Gln Ile Ser Gly Leu Tyr Leu Pro

145 150 155 160

Tyr Lys Val Leu Pro Val Gly Asp Glu Val Val Gly Ile Val Gly Tyr

165 170 175

Thr Ser Lys Glu Thr Pro Phe Leu Ser Asn Pro Gly Thr Asn Leu Val

180 185 190

Phe Glu Asp Glu Ile Thr Ala Leu Gln Pro Glu Val Asp Lys Leu Lys

195 200 205

Thr Leu Asn Val Asn Lys Ile Ile Ala Leu Gly His Ser Gly Phe Glu

210 215 220

Met Asp Lys Leu Ile Ala Gln Lys Val Arg Gly Val Asp Val Val Val

225 230 235 240

Gly Gly His Ser Asn Thr Phe Leu Tyr Thr Gly Asn Pro Pro Ser Lys

245 250 255

Glu Val Pro Ala Gly Lys Tyr Pro Phe Ile Val Thr Ser Asp Asp Gly

260 265 270

Arg Lys Val Pro Val Val Gln Ala Tyr Ala Phe Gly Lys Tyr Leu Gly

275 280 285

Tyr Leu Lys Ile Glu Phe Asp Glu Arg Gly Asn Val Ile Ser Ser His

290 295 300

Gly Asn Pro Ile Leu Leu Asn Ser Ser Ile Pro Glu Asp Pro Ser Ile

305 310 315 320

Lys Ala Asp Ile Asn Lys Trp Arg Ile Lys Leu Asp Asn Tyr Ser Thr

325 330 335

Gln Glu Leu Gly Lys Thr Ile Val Tyr Leu Asp Gly Ser Ser Gln Ser

340 345 350

Cys Arg Phe Arg Glu Cys Asn Met Gly Asn Leu Ile Cys Asp Ala Met

355 360 365

Ile Asn Asn Asn Leu Arg His Thr Asp Glu Met Phe Trp Asn His Val

370 375 380

Ser Met Cys Ile Leu Asn Gly Gly Gly Ile Arg Ser Pro Ile Asp Glu

385 390 395 400

Arg Asn Asn Gly Thr Ile Thr Trp Glu Asn Leu Ala Ala Val Leu Pro

405 410 415

Phe Gly Gly Thr Phe Asp Leu Val Gln Leu Lys Gly Ser Thr Leu Lys

420 425 430

Lys Ala Phe Glu His Ser Val His Arg Tyr Gly Gln Ser Thr Gly Glu

435 440 445

Phe Leu Gln Val Gly Gly Ile His Val Val Tyr Asp Leu Ser Arg Lys

450 455 460

Pro Gly Asp Arg Val Val Lys Leu Asp Val Leu Cys Thr Lys Cys Arg

465 470 475 480

Val Pro Ser Tyr Asp Pro Leu Lys Met Asp Glu Val Tyr Lys Val Ile

485 490 495

Leu Pro Asn Phe Leu Ala Asn Gly Gly Asp Gly Phe Gln Met Ile Lys

500 505 510

Asp Glu Leu Leu Arg His Asp Ser Gly Asp Gln Asp Ile Asn Val Val

515 520 525

Ser Thr Tyr Ile Ser Lys Met Lys Val Ile Tyr Pro Ala Val Glu Gly

530 535 540

Arg Ile Lys Phe Ser Thr Gly Ser His Cys His Gly Ser Phe Ser Leu

545 550 555 560

Ile Phe Leu Ser Leu Trp Ala Val Ile Phe Val Leu Tyr Gln

565 570

<210> 3

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

ctagagcctc tgctaaccat gttc 24

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

actacaggaa ccttccgccc 20

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

ctgttggtga tgaagttgtg 20

<210> 6

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

gatctcagtg gtatttgtga g 21

<210> 7

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

atagagttct ctctgttggc ggtg 24

<210> 8

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

aaaccaccgc caacagagag aact 24

<210> 9

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

atagcgctca gaaagttcga ggtg 24

<210> 10

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

aaaccacctc gaactttctg agcg 24

<210> 11

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

ctagagcctc tgctaaccat gttc 24

<210> 12

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

ttgacgcact tgctggagtc 20

<210> 13

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

aatggtggag atgggttcca g 21

<210> 14

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

ccaacctttg ttcatggcag 20

<210> 15

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

atgtggtcag gtgtcataga ggc 23

<210> 16

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

attcttggaa cgtctcccag c 21

<210> 17

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

tctgctttct aaccgtggat gtc 23

<210> 18

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 18

agacacagcc atcgaccatt c 21

Claims

1.一种稳定表达双人源PDL1/CD73蛋白细胞株的构建方法，该方法无需慢病毒包装和感染，直接将目的片段转入细胞内，即可获得稳定高表达人源蛋白的细胞株，包括如下步骤：将人源化CD73基因全部CDS序列随机***至表达人源化PDL1的细胞系中，同时采用Cas9KO技术将鼠源的CD73敲除，实现人源PDL1/CD73基因取代鼠源PDL1/CD73基因的在鼠源细胞中的稳定表达，人源CD73 CDS序列如SEQ ID NO：2所示，其所编码的氨基酸序列如SEQ IDNO：3所示。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于：具体包括如下步骤：（1）构建表达人源化CD73的表达载体用于人源化CD73基因的***，该载体包含如下组件CAG启动子-hCD73-PolyA-Loxp-Puromycin –Loxp；（2）构建sgRNA用于鼠源CD73的敲除；（3）将表达人源化CD73的表达载体和sgRNA连同Cas9蛋白同时电转入细胞，获得高表达hPDL1和hCD73且几乎不表达mPDL1和mCD73的细胞。

3.如权利要求2所述的方法，通过扩增和电泳对步骤（1）中构建的载体进行鉴定，扩增使用如下引物对CAG-tF1/ GPT000349-tR1和GPT000349-tF2/ GPT000349-tR2：

CAG-tF1：CTAGAGCCTCTGCTAACCATGTTC

GPT000349-tR1：ACTACAGGAACCTTCCGCCC

GPT000349-tF2：CTGTTGGTGATGAAGTTGTG

GPT000349-tR2：GATCTCAGTGGTATTTGTGAG。

4.如权利要求2所述的方法，通过酶切和电泳对步骤（1）中构建的载体进行鉴定，酶切使用方案：HindIII酶切后片段长度为5017\3506bp，SpeI酶切后片段长度为4362\2857\1304bp，NotI酶切后片段长度为5823\2700bp。

5.如权利要求2所述的方法，其中步骤（2）具体为：在exon2的5’端和exon3的3’端设计sgRNA，筛选发生移码突变的细胞克隆，根据CRISPR Cas9技术，分别在exon2的5’端和exon3的3’端分别设计了2条sgRNA，使用sgRNA进行细胞电转，并收集细胞提取遗传物质，通过PCR和TA克隆进行sgRNA切割效率判断，筛选出切割效率高的sgRNA用于后续细胞电转。

6.如权利要求5所述的方法，其中筛选出的切割效率最高的sgRNA为CD73-E2S1和CD73-E3S2，序列如下SEQ ID NO：8-9所示：

SEQ ID NO：8: AGTTCTCTCTGTTGGCGGTG

SEQ ID NO：9：CGCTCAGAAAGTTCGAGGTG。

7.如权利要求2所述的方法，其中步骤（3）具体为：

（a）将MC38肿瘤细胞复苏传代；（b）第四天进行肿瘤细胞电转，将表达人源化CD73的表达载体和sgRNA连同Cas9蛋白同时电转入细胞中，电转培养；（c）48h后，加入Puromycin进行细胞筛选，每天更换含有相应药物浓度的培养液，同步药筛野生型细胞作对照，直至对照的野生型细胞全部死亡，继续培养细胞，使用有限稀释法进行单克隆挑选，将挑选的单克隆细胞扩增，一半的细胞冻存，另一半细胞进行人源和鼠源CD73表达检测；（d）通过PCR鉴定不同细胞克隆中鼠源CD73删除情况；（e）通过流式细胞仪检测分析不同细胞克隆中hCD73和hCD73蛋白表达水平。

8.如权利要求7所述的方法，其特征在于：步骤（d）中PCR鉴定使用的引物如下所示：引物对1：CAG-tF1和GPT000349-hCD73-5tR1；引物对2：GPT000349-hCD73-3tF1和Rabbit-PolyA-tR5，引物组3：GPT000349-mCD73-KO-tF1和GPT000241-mCD73-KO-tR1，引物组4：GPT000241-mCD73-wt-tF1和GPT000241-mCD73-wt-tR1，其中

CAG-tF1：CTAGAGCCTCTGCTAACCATGTTC（SEQ ID NO：10）

GPT000349-hCD73-5tR1：TTGACGCACTTGCTGGAGTC（SEQ ID NO：11）

GPT000349-hCD73-3tF1：AATGGTGGAGATGGGTTCCAG（SEQ ID NO：12）

Rabbit-PolyA-tR5：CCAACCTTTGTTCATGGCAG（SEQ ID NO：13）

GPT000349-mCD73-KO-tF1：ATGTGGTCAGGTGTCATAGAGGC（SEQ ID NO：14）

GPT000241-mCD73-KO-tR1：ATTCTTGGAACGTCTCCCAGC（SEQ ID NO：15）

GPT000241-mCD73-wt-tF1：TCTGCTTTCTAACCGTGGATGTC（SEQ ID NO：16）

GPT000241-mCD73-wt-tR1：AGACACAGCCATCGACCATTC（SEQ ID NO：17）。

9.如权利要求7所述的方法，其特征在于步骤（3）还包括：(f) 细胞体内成瘤性测试。

10.如权利要求1-9任一项所述的方法，其中所述细胞为肿瘤细胞。

11.权利要求1-10任一所述的方法在评估靶向人源CD73的药物有效性、靶向人源CD73的药物筛选开发、靶向人源CD73的药物联合其他药物抗肿瘤药效评价、或靶向人源CD73的药物的毒理研究中的应用。

12.特异性靶向小鼠CD73基因的sgRNA，包括 CD73-E2S1和CD73-E3S2，CD73-E2S1、CD73-E3S2的引物序列如下所示：

SEQ ID NO：8：AGTTCTCTCTGTTGGCGGTG

SEQ ID NO：9：CGCTCAGAAAGTTCGAGGTG。