CN113046260B - 一种促进大豆生长的微生物混合菌剂及其应用 - Google Patents

一种促进大豆生长的微生物混合菌剂及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及农业微生物技术领域，尤其是涉及一种促进大豆生长的微生物混合菌剂及其应用。所述微生物混合菌剂包括巴西固氮螺菌和帕氏嗜氢菌的发酵液，所述巴西固氮螺菌的浓度为1×106cfu/ml～1×1010cfu/ml；所述帕氏嗜氢菌的浓度为1×106cfu/ml～1×1010cfu/ml。本发明的微生物混合菌剂可刺激植物细胞分泌各种生长激素，强力促进增根、生根、壮根、毛细根，其长度或宽度有所增加，增强了作物吸水吸肥能力，使作物具有茎长粗，抗倒伏等效果，进而使得作物增产，还解决了农耕者滥用或长期使用的化肥的问题。

Description

一种促进大豆生长的微生物混合菌剂及其应用
技术领域
本发明涉及农业微生物技术领域，尤其是涉及一种促进大豆生长的微生物混合菌剂及其应用。
背景技术
大豆是我国最重要的粮食之一，我国大豆产量位居世界第四，2017/18年度大豆种植面积增加。从地域分区来看，我国大豆生产种植地域主要有四大区域，分别是黑龙江种植区、安徽种植区、内蒙占自治区种植区和吉林省种植区，分别占比全国种植面积36％、11％、8％、4％。我国大豆平均单产为120千克/亩，远低于国际水平200千克/亩，国产大豆单产有待提高。
目前大豆的栽培管理主要包括大豆品种选择、种子处理、整地、播种、田间管理等主要生产环节。现流行主的是化肥农耕技术，化肥主要投有五种，分别是硫酸钾(K2SO4)、氯化钾(KCl)、硝酸铵(NH4NO3)、氯化铵(NH4Cl)和碳酸氢铵(NH4HCO3)。其主要使用化肥来达到增产增益的效果，此化肥农耕技术能使作物根部发达，茎部生长粗壮，果实饱满，使作物大豆受益，也使农耕者受益良多。
虽然现有化肥农耕技术在我国农业方面取得巨大成果，但是在可持续发展方面也是步步难行。由于大量使用化肥，虽然前期达到增产的幅度，但是长久施用下去，必然导致大豆减产，导致大豆产量下降的表现如下：造成庄稼的倒伏或苗弱：长期施用化肥，就会导致浓度差，作物的根部进行渗透作用，根细胞不但没有吸收土壤的水分，反而将细胞质中的水分倒流入土壤，导致作物受害，简称“烧苗”。从而造成根茎柔弱，导致作物倒伏。作物因烧面而导致根系活力下降，不能正常发育，植物根部细胞呼吸减弱，而氮素等营养又多以离子态存在，吸收时要耗细胞代谢产生的能量，呼吸减弱，故能量供应不足，影响养分的吸收。
氮、磷、钾是农作物所需营养的“三大要素”。大气中的氮气是绝大多数作物不能利用的氮素形态，必须转化成能够被作物利用的其他形态作为肥料，而这个转化过程就要消耗大量能源把氮素形态它变成氨气态活性氮。过去生产氮肥主要能源是以石油为原料，现在主要靠天然气和煤，而这些能源又都是紧缺资源，因为紧缺也就导致了化肥的生产成本居高不下，从而导致农耕者施用化肥的成本越来越高，而生产出来的农产品质量越来越差。
发明内容
本发明的目的在于克服上述现有技术的不足之处而提供一种促进大豆生长的微生物混合菌剂，本发明的微生物混合菌剂可刺激植物细胞分泌各种生长激素，强力促进增根、生根、壮根、毛细根，其长度或宽度有所增加，增强了作物吸水吸肥能力，使作物具有茎长粗，抗倒伏等效果，进而使得作物增产，还解决了农耕者滥用或长期使用的化肥的问题。
为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：
本发明的第一目的提供了一种微生物混合菌剂，所述微生物混合菌剂包括巴西固氮螺菌和帕氏嗜氢菌的发酵液，所述巴西固氮螺菌的浓度为1×106cfu/ml～1×1010cfu/ml；所述帕氏嗜氢菌的浓度为1×106cfu/ml～1×1010cfu/ml。
巴西固氮螺菌(Azospirillum brasilense)是螺旋状革兰氏阴性细菌，兼性厌氧，有极性鞭毛可以运动，鞭毛帮助其附着在根系上面，能利用多种碳源和氮源进行代谢，在不良环境下形成概念胞素，同时分泌大量多糖，并在体内形成聚B-羟基丁酸作为能源以度过不良环境。生长温度和PH条件范围较广，在适合条件下有较高的固氮酶活性，同时具有产生H2、分泌植物激素和自主固氮刺激作物生长。
帕氏嗜氢菌(Hydrogenophaga palleronii)是帕氏菌门，使分解有机物质变成小分子有机物或无机物，从而帮助作物吸收其养分，使作物生长旺盛。
巴西固氮螺菌可以将空气中的N2吸收，然后巴西固氮螺菌中的氮氧化酶形成铵根离子(NH4+)，并以盐离子相结合，形成铵根盐。此产物提供作物所需要的的氮元素，从而形成生物肥料，提供作物所需的无机物。使作物吸收生物肥料生长茂盛，促根茎叶生长，从而达到量产。发明人发现将巴西固氮螺菌和帕氏嗜氢菌进行联合对大豆有良好的促进根茎叶生长的作用，并增加大豆的产量和增强大豆的果粒质量，而且减少天然气、煤、石油等不可再生资源的损失，符合可持续发展的理念。
作为本发明所述微生物混合菌剂的优选实施方式，所述巴西固氮螺菌的浓度为1.9×108cfu/ml；所述帕氏嗜氢菌的浓度为6.8×107cfu/ml。
发明人通过实施发现当巴西固氮螺菌的浓度为1×106cfu/ml～1×1010cfu/ml；帕氏嗜氢菌的浓度为1×106cfu/ml～1×1010cfu/ml时，其促进大豆生长的效果较好，当巴西固氮螺菌的浓度为1.9×108cfu/ml；帕氏嗜氢菌的浓度为6.8×107cfu/ml时，效果最佳。
作为本发明所述微生物混合菌剂的优选实施方式，所述巴西固氮螺菌的发酵液和帕氏嗜氢菌的发酵液的体积比为(10～13):(7～10)。
作为本发明所述微生物混合菌剂的优选实施方式，所述巴西固氮螺菌的发酵液和帕氏嗜氢菌的发酵液的体积比为13:7。
作为本发明所述微生物混合菌剂的优选实施方式，所述巴西固氮螺菌来源于中国普通微生物菌种保藏中心，保藏编号为CGMCC 1.10379。
作为本发明所述微生物混合菌剂的优选实施方式，所述帕氏嗜氢菌来源于中国普通微生物菌种保藏中心，保藏编号为CGMCC 1.12500。
本发明的第二目的提供了一种大豆育种的方法，包括以下步骤：在幼苗时期将上述的微生物混合菌剂喷洒于大豆的根部。
本发明的第三目的提供了上述的微生物混合菌剂在制备促进作物生长的制剂中的应用。
作为本发明所述应用的优选实施方式，所述作物包括大豆。在本发明中作物不仅限于大豆，作物还可以为其他农作物，例如小麦、水稻等农作物。
本发明的第四目的提供了一种培养基，包括上述的微生物混合菌剂。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明的微生物混合菌剂可刺激植物细胞分泌各种生长激素，强力促进增根、生根、壮根、毛细根，其长度或宽度有所增加，增强了作物吸水吸肥能力，使作物具有茎长粗，抗倒伏等效果，进而使得作物增产。
附图说明
图1为巴西固氮螺菌(Azospirillum brasilense)的光学镜检图；
图2为巴西固氮螺菌(Azospirillum brasilense)的平板涂布图；
图3为帕氏嗜氢菌(Hydrogenophaga palleronii)的光学镜检图；
图4为帕氏嗜氢菌(Hydrogenophaga palleronii)的平板涂布图；
图5为本发明微生物混合菌剂的光学镜检图；
图6为本发明微生物混合菌剂的平板涂布图；
图7为空白对照组和本发明微生物混合菌剂实验组大豆幼苗期生长的对比图；
图8为空白对照组和本发明微生物混合菌剂实验组大豆结荚鼓粒期生长的对比图；
图9为空白对照组和本发明微生物混合菌剂实验组大豆成熟期结果对比图；
图10为空白对照组和本发明微生物混合菌剂实验组大豆茎部石蜡切片观察图；
图11为空白对照组和本发明微生物混合菌剂实验组大豆叶片石蜡切片观察图。
具体实施方式
为更好的说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明。本发明中的各种微生物均可市购或可从中国普通微生物菌种保藏管理中心获得，各种微生物培养液的制取方法均采用对应的标准培养基和培养液依据常规培养方法进行。
在以下实施例中，巴西固氮螺菌(Azospirillum brasilense)来源于中国普通微生物菌种保藏中心，保藏编号为CGMCC 1.10379。帕氏嗜氢菌(Hydrogenophagapalleronii)来源于中国普通微生物菌种保藏中心，保藏编号为CGMCC 1.12500。
中国微生物菌种保藏中心编号(0002)营养肉汁培养基的配方如表1所示。
表1
蛋白胨 10.0g 牛肉浸取物 3.0g
NaCl 5.0g 蒸馏水 1L
实施例1、巴西固氮螺菌(Azospirillum brasilense)、帕氏嗜氢菌 (Hydrogenophaga palleronii)的单克隆培养
将获得的巴西固氮螺菌(Azospirillum brasilense)通过革兰氏染色法染色，通过光学镜检巴西固氮螺菌(Azospirillum brasilense)为革兰氏阴性，螺旋杆状结构。肉眼观察菌落特征为形态圆形，低凸起，圆形完整边缘，颜色为浅红色(见图1和图2)。
取中国微生物菌种保藏中心编号(0002)营养肉汁培养基，取规格为1L的烧杯溶解培养基定容至1L，培养基高温灭菌前调pH6.8～7.2之间，将配置好的200ml培养基倒入容量为500ml三角瓶，封上耐高温封口膜于三角瓶瓶口，放置高温灭菌过121℃灭菌30分钟，待冷却到常温后即可加入巴西固氮螺菌(Azospirillum brasilense)，培养温度设置在25℃～30℃之间，放置在恒温震荡培养24h即可，获得含有巴西固氮螺菌的发酵液。
将获得的帕氏嗜氢菌(Hydrogenophaga palleronii)通过革兰氏染色法染色，通过光学镜检帕氏嗜氢菌(Hydrogenophaga palleronii)为革兰氏阴性，螺旋结构。肉眼观察菌落特征为形态圆形，低凸起，圆形完整边缘，颜色为白色(见图3和图4)。
取中国微生物菌种保藏中心编号(0002)的营养肉汁培养基，取规格为1L的烧杯溶解培养基定容至1L，培养基高温灭菌前调pH6.8～7.2之间，将配置好的200ml培养基倒入容量为500ml三角瓶，封上耐高温封口膜于三角瓶瓶口，放置高温灭菌过121℃灭菌30分钟，待冷却到常温后即可加入帕氏嗜氢菌(Hydrogenophaga palleronii)，培养温度设置在25℃～30℃之间，放置在恒温震荡培养24h即可，获得含有帕氏嗜氢菌的发酵液。
实施例2、本发明微生物混合菌剂的制备
将实施例1中培养的含有巴西固氮螺菌的发酵液和含有帕氏嗜氢菌的发酵液按体积比13:7混合形成微生物混合菌剂(1L)(见图5)，选用巴西固氮螺菌的最佳浓度为1.9×108cfu/ml；选用帕氏嗜氢菌的最佳浓度为6.8×107cfu/ml，总菌体浓度不低于1×108cfu/mL。
将200ml的改良AGAR培养基(配方如表2所示)或BPY培养基(配方如表3所示)倒入容量为500ml三角瓶，封上耐高温封口膜于三角瓶瓶口，放置高温灭菌过121℃灭菌30分钟，待冷却到常温后即可加入上述的微生物混合菌剂，培养温度设置在25℃～30℃之间，放置在恒温震荡培养24h即可。
表2改良AGAR培养基的配方
酵母提取物 15g <![CDATA[KH<sub>2</sub>PO<sub>4</sub>]]> 0.1g
朊蛋白 0.25g <![CDATA[MgSO<sub>4</sub>·7H<sub>2</sub>O]]> 0.1g
酪蛋白氨基酸 0.25g <![CDATA[FeCl<sub>3</sub>]]> 0.05g
葡萄糖 15g <![CDATA[NaMoO<sub>4</sub>·2H<sub>2</sub>]]> 0.05g
蛋白胨 5g 可溶性淀粉 0.25g
<![CDATA[K<sub>2</sub>HPO<sub>4</sub>]]> 0.6g 丙酮酸钠 0.15g
<![CDATA[CaCl<sub>2</sub>]]> 0.05g 蒸馏水 1L
表3 BPY培养基的配方
牛肉膏 5g 酵母提取物 5g
蛋白胨 5g 葡萄糖 5g
NaCl 5g 蒸馏水 1L
实施例3、平板计算本发明微生物混合菌剂中巴西固氮螺菌、帕氏嗜氢菌的菌落数 量
取1ml实施例2制备的微生物混合菌剂进行梯度稀释到105，再取用稀释完成的菌液25ul进行涂布(NA)营养琼脂平板，倒置于生化恒温培养48h，得到结果如下(见图6)：
白色标点为巴西固氮螺菌(Azospirillum brasilense)，黑色标点为帕氏嗜氢菌(Hydrogenophaga palleronii)；
计数得到图6中黑色标点为14个，图6续中黑色标点为20个，经过算术平均数为17；
计数得到图6中白色标点为50个，图6续中白色标点为45个，经过算术平均数为47.5；
图6总标记数为64个，图6续总标记数为65个，经过算术平均数为64.5；根据公式(cfu/ml)＝统一稀释下平均菌落数×稀释倍数×(1000/滴加涂布数)通过平板计数法计算得出(见表4):
表4
单菌种名称 浓度(cfu/ml)
巴西固氮螺菌(Azospirillum brasilense)cfu： <![CDATA[1.9×10<sup>8</sup>cfu/ml]]>
帕氏嗜氢菌(Hydrogenophaga palleronii)cfu： <![CDATA[6.8×10<sup>7</sup>cfu/ml]]>
总菌浓(cfu/ml)： <![CDATA[2.6×10<sup>8</sup>cfu/ml]]>
通过以上试验，其实验数据均达到标准。
实施例4、乙炔还原法测定本发明微生物混合菌剂的固氮活性
固氮活性的测定方法参考Williams等(1987)和Wilson等(2012)。将乙炔还原器进行密封，先抽出5％的空气，然后注射等体积的乙炔，使反应器中的乙炔浓度为5％。乙炔气体由自制的乙炔反应器经过电石与纯水反应生成储气袋中。反应器在25℃静置反应8h后，采集反应器中的气体注入采气瓶中，利用气相色谱仪分析乙烯产量。
采用气相色谱仪(上海仪电分析)测定乙炔的生成量。色谱柱为GDX-50260/80mesh3mm直径填充柱。乙炔标准气体浓度100mg L-1。将28℃培养48h的恒温振荡器里的微生物混合菌剂样品、单菌株培养的巴西固氮螺菌(Azospirillum brasilense)、帕氏嗜氢菌(Hydrogenophaga palleronii)、空白对照(蒸馏水)分别取样1ml来测定乙炔还原活性，将新鲜的根瘤样品洗净，出去多余的水分，放入带塞的血清瓶，注射一定量的乙炔气体，于28℃震荡半小时以上测定产生的乙烯量。测定后将根瘤放入80摄氏度烘箱，烘16h称取干瘤重。
根据公式固氮酶活性(nmol/mg·h)＝C2H4nmol/[菌体蛋白量(mg)X反应时间(h)]，其中(C2H4nmol＝1000X C2H4体积(μL)X 273X P/[22.4X(273+t℃)X760]，其中P为气压(mm汞柱)，t为反应温度。
根据乙烯浓度与色谱峰面积对应关系标准曲线以及乙炔还原法色谱图计算公式计算得出(见表5)：
表5
微生物组 <![CDATA[(nmol C<sub>2</sub>H<sub>4</sub>*g<sup>-1</sup>*h<sup>-1</sup>)]]>
微生物混合菌剂 38.953
巴西固氮螺菌(Azospirillum brasilense) 37.471
帕氏嗜氢菌(Hydrogenophaga palleronii) 1.482
空白对照蒸馏水 0
根据以上实验，数据表格得出巴西固氮螺菌(Azospirillum brasilense)和帕氏嗜氢菌(Hydrogenophaga palleronii)都具有固氮作用能力，但是主要为巴西固氮螺菌(Azospirillum brasilense)固氮能力值为主。
实施例5、气相色谱仪测定本发明微生物混合菌剂利用氢气的能力
帕氏嗜氢菌(Hydrogenophaga palleronii)能够利用H2，在氢化酶的参与下，同化CO2和H2合成物质，进行化能自养。本发明中利用气相色谱法测定菌株吸收H2能力。用两支试管中加入5mL的NA琼脂制成斜面培养基，分别蘸取单株细菌帕氏嗜氢菌(Hydrogenophagapalleronii)、空白对照蒸馏水以软橡胶塞封口培养，28℃静至48h待帕氏嗜氢菌(Hydrogenophaga palleronii)长出菌斑后，两支试管同时抽取10％气体，加入等体积的H2，培养48h后抽取100μL试管内气体，用气相色谱仪测量氢气消耗量，中途不停止任何操作，等待峰值，确保定量分析的精密度。
根据曲线运行，出峰时间，分析结果得出如下(见表6)：
表6
Figure BDA0002932781620000081
经过测定，帕氏嗜氢菌(Hydrogenophaga palleronii)的吸收H2能力作为本发明微生物混合菌剂的主导作用，可以作为氢氧化功能菌使用。
实施例6、应用本发明微生物混合菌剂促进大豆生长的方法
2020年3月15日长春九台进行大田种植，从幼苗期开始施用微生物混合菌剂，兑水稀释1:30，进行根部浇灌，每隔2个星期浇微生物混合菌剂1次，期间不间断浇灌，到2020年07月30日，获取大豆数据，期间未施任何化肥，只施用本发明微生物混合菌剂。结果参照图7-图9(图中左侧代表的是空白对照组；右侧代表实验组)。
参照图7，施用本发明微生物混合菌剂的大豆幼苗生长状态好于空白对照组的大豆幼苗，实验组的大豆幼苗的生长高度高于空白对照组的大豆幼苗。
参照图8，实验数据表明大豆根部根瘤数增加4倍，其大豆结荚鼓粒期实验组的大豆结荚鼓粒多于空白对照组的大豆结荚鼓粒。
参照图9，空白对照组大豆百粒重8.646g，实验组大豆百粒重19.196g，产量提高45％以上，此数据来自长春九台大田种植。
实施例7、大豆的茎部与叶片石蜡切片观察
经过大豆的茎部石蜡切片观察(参照图10，图中左侧代表的是空白对照组；右侧代表实验组)，应用本发明微生物混合菌剂实验组的茎秆比较有韧性和粗壮，可以看到，与空白对照组相比，实验组的茎秆组织饱满，强度高，能够抗倒伏。实验组的维管束数目多，细胞层数多，细胞排列紧密，贮藏物质较多。微生物混合微生物菌剂能够使大豆的茎部强度和韧性增加，抵抗倒伏能力增加。
经过大豆的叶片石蜡切片观察(参照图11，图中左侧代表的是空白对照组；右侧代表实验组)，实验组的大豆主叶脉和叶片比较和粗壮，大豆的维管束鞘细胞中，相应的叶脉(含维管束鞘细胞)、叶肉组织(含叶肉细胞)比对照组要多和结实，细胞排列多而紧密，储藏物质也多。
上述实验数据，说明本发明的微生物混合菌剂可以强力促进增根、生根、壮根、毛细根，其长度或宽度有所增加，增强了作物吸水吸肥能力，使得大豆具有茎长粗，抗倒伏等性能，进而使农作物增产。
最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。

Claims (7)

1.一种微生物混合菌剂，其特征在于，所述微生物混合菌剂包括巴西固氮螺菌(Azospirillum brasilense)和帕氏嗜氢菌(Hydrogenophaga palleronii)的发酵液，所述巴西固氮螺菌的浓度为1×106cfu/ml～1×1010cfu/ml；所述帕氏嗜氢菌的浓度为1×106cfu/ml～1×1010cfu/ml；所述巴西固氮螺菌来源于中国普通微生物菌种保藏中心，保藏编号为CGMCC 1.10379；所述帕氏嗜氢菌来源于中国普通微生物菌种保藏中心，保藏编号为CGMCC 1.12500。
2.如权利要求1所述的微生物混合菌剂，其特征在于，所述巴西固氮螺菌的浓度为1.9×108cfu/ml；所述帕氏嗜氢菌的浓度为6.8×107cfu/ml。
3.如权利要求1所述的微生物混合菌剂，其特征在于，所述巴西固氮螺菌的发酵液和帕氏嗜氢菌的发酵液的体积比为(10～13):(7～10)。
4.如权利要求3所述的微生物混合菌剂，其特征在于，所述巴西固氮螺菌的发酵液和帕氏嗜氢菌的发酵液的体积比为13:7。
5.一种大豆育种的方法，其特征在于，包括以下步骤：在幼苗时期将权利要求1～4任一项所述的微生物混合菌剂喷洒于大豆的根部。
6.如权利要求1～4任一项所述的微生物混合菌剂在制备促进大豆生长的制剂中的应用。
7.一种培养基，其特征在于，包括如权利要求1～4任一项所述的微生物混合菌剂。
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