CN113045653A - 抑制疟原虫感染的单克隆抗体及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及动物细胞技术领域，具体公开了抑制疟原虫感染的单克隆抗体的制备方法，具体包括以下步骤：阳性克隆的获取、原核表达、纯化重组蛋白、重组蛋白免疫小鼠、融合细胞制备、收集免疫后小鼠脾细胞、融合培养、单克隆筛选和杂交瘤细胞培养。本发明获得的单克隆抗体PfRH5‑1和PfRH5‑2能够明显抑制疟原虫入侵红细胞，降低疟原虫的感染率。
Description
技术领域
本发明涉及动物细胞技术领域，具体涉及抑制疟原虫感染的单克隆抗体及其制备方法和应用。
背景技术
疟疾是通过雌性按蚊叮咬吸血传播的重要寄生虫病。WHO《2020年世界疟疾报告》指出：2019年在91个国家有2.29亿疟疾感染病例，全球疟疾死亡总数达40.9万人，数据表明近四年来全球的疟疾患者数量没有减缓的趋势。疟原虫是疟疾的病原体，感染人的疟原虫有5种：包括恶性疟原虫、间日疟原虫、三日疟原虫、卵形疟原虫和诺氏疟原虫，恶性疟原虫是非洲地区最流行的疟原虫，占2019年疟疾病例的99.7％。疟原虫生活史包括在人体内的发育和在雌性按蚊体内的发育两个部分。在人体内的发育有包括红外期和红内期两个时期。通过携带有疟原虫的雌性按蚊叮咬感染人体，疟原虫子孢子进入人体，在肝脏内发育增殖后释放入血，一部分被吞噬细胞吞噬，一部分侵入红细胞内裂体增殖，导致红细胞大量破坏后引起发热、贫血、脾肿大及肾脏损害等。在恶性疟疾高度流行地区，5岁以下儿童、孕妇、AIDS患者以及无疟疾免疫力人群易引发凶险型疟疾，若未及时治疗或处理不当，易造成患者死亡。虽经多年防治，疟疾仍然是一种世界范围内高发病率和高死亡率的严重公共卫生问题，其与结核病、艾滋病并称世界三大传染病。
抗疟药、蚊媒控制和疟疾疫苗是防治疟疾的重要手段，然而，全球范围内已经出现了耐药性疟原虫株和按蚊，致使疟疾防控受到严峻挑战。疟原虫裂殖子入侵红细胞是疟疾致病的关键机制，该过程是由裂殖子配体与宿主受体间的相互作用来介导的。疟原虫裂殖子是利用多个配体,如：红细胞结合蛋白(Erythrocyte Binding Like proteins，EBL)家族和网状红细胞结合蛋白(Reticulocyte binding like proteins，RBL)家族来入侵红细胞。PfRH5是恶性疟原虫RBL家族的新成员，位于裂殖子顶端的棒状体内，是近期研究发现的参与裂殖子入侵的重要蛋白。这一发现的重要意义更在于，很多种株的恶性疟原虫都存在PfRH5与其配体的结合，而此前所发现的能介导疟原虫入侵红细胞的途径都只对少数种株恶性疟原虫有效；还有研究显示，基于PfRH5的疫苗在灵长类动物夜猴能够产生针对不同种属疟原虫的抵抗力。所以PfRH5被誉为开启恶性疟原虫这一“阿喀琉斯之踵”的万能钥匙。
目前尚未有应用恶性疟原虫RH5的单克隆抗体抑制疟原虫裂殖子入侵。多克隆抗体由于抗体成分复杂，并不适合用于临床治疗的原因，所以开发有效的单克隆抗体是非常有必要的。
发明内容
为解决上述技术问题，本发明提供了抑制疟原虫感染的单克隆抗体及其制备方法和应用，制备得到的两株单克隆抗体均可以检测恶性疟原虫或者筛选相应的药物。
本发明第一个目的是提供了抑制疟原虫感染的单克隆抗体的其制备方法，具体包括如下步骤：
S1，阳性克隆的获取：选用PfRH5蛋白序列的201-324aa段氨基酸序列相应的编码基因合成克隆入原核表达载体PGEX4T-1，选择阳性克隆标记为PfRH5-1，选用PfRH5蛋白序列的302-396aa段氨基酸序列相应的编码基因合成克隆入原核表达载体PGEX4T-1，选择阳性克隆标记为PfRH5-2；
S2，原核表达：
将两个阳性克隆菌种分别接种于含抗生素的LB培养基中培养，加入诱导物IPTG继续培养过夜，破碎大肠杆菌，将破碎的菌液离心，分别收集上清和沉淀；
S3，纯化重组蛋白：
收集的上清用0.22μm滤膜过滤后过柱，收集目的蛋白PfRH5-1-GST和PfRH5-2-GST，洗脱后透析，然后浓缩至1mg/mL，即为抗原；
S4，免疫小鼠：连续进行三次免疫，每次间隔22天，第三次免疫后10天，检测免疫小鼠抗体效小鼠尾尖采血，选取抗体效价较高的小鼠进行加强免疫，加强免疫抗原用量为48-50μg/只，尾静脉注射，180-200μl；
S5，制备融合细胞：取正常小鼠，制备脾细胞悬液进行培养；
S6，收集免疫后小鼠脾细胞：获取免疫后的小鼠脾细胞，向细胞沉淀中加入红细胞裂解液重悬混匀，裂解红细胞后计数；
S7，融合培养和单克隆筛选；
S8，杂交瘤细胞培养，获得单克隆抗体PfRH5-1和PfRH5-2。
进一步地，S2中，所述的两个阳性克隆菌种培养条件均为37℃，250rpm，所述的LB培养基中抗生素的终浓度为100g/mL。
进一步地，S3中，透析液为PBS，透析时间为12h。
进一步地，S4中，三次免疫具体为：首次免疫抗原量为100μg/只，皮下多点注射，共200μl；第2-3次免疫，抗原量为100μg/只，皮下多点注射，共200μl。
进一步地，S5中，脾细胞悬液培养时，调整细胞密度为1×105个/ml，加入96孔板，100μl/孔，于37℃、5％CO2培养箱培养。
进一步地，S7中，融合培养和单克隆筛选的具体过程为：取108细胞备用做融合，按SP2/0细胞：脾细胞以1:10的比例混合离心获得细胞沉淀，预热，吸取1ml预热至37℃的PEG加入细胞沉淀中，混合均匀，37℃水浴静止60s，加HAT培养基终止反应，将含融合细胞的HAT培养基接种于含饲养层细胞的96孔培养板中，100μl/孔，37℃、5％CO2培养箱培养，密度占孔1/3时进行单克隆筛选，选高效价融合阳性孔。
进一步地，S8中，杂交瘤细胞培养的具体过程为：选用10周龄小鼠，腹腔接种不完全佐剂，每只小鼠0.5ml，腹腔注射用无血清培养基稀释的杂交瘤细胞，注射细胞数量为2-3x106个/只，间隔7-10天后，采集腹水，离心、收集上清、纯化后获得单克隆抗体PfRH5-1和PfRH5-2。
本发明还提供了上述制备方法制备获得的单克隆抗体，所述单克隆抗体包括抗体PfRH5-1和抗体PfRH5-2。
本发明还提供了上述的单克隆抗体在制备抑制或检测恶性疟原虫感染的药物中的应用。
进一步地，所述感染的对象为红细胞。
与现有技术相比，本发明的有益效果在于：
1、本发明制备获得了两株高特异性的单克隆抗体，分别为PfRH5-1，PfRH5-2，两株单克隆抗体PfRH5-1和PfRH5-2均能够明显抑制疟原虫入侵红细胞，降低疟原虫的感染率；
2、利用本发明制备的单克隆抗体PfRH5-1或PfRH5-2，可以检测恶性疟原虫或者筛选相应的药物，是临床上预防或治疗恶性疟相关疾病的基础。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明实施例1获得的两株单克隆抗体Westermblot鉴定图；
图2为本发明实施例1中获得的两株单克隆抗体抑制疟原虫入侵红细胞检测结果图；
具体实施方式
下面对本发明的具体实施方式进行详细描述，但应当理解本发明的保护范围并不受具体实施方式的限制。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。本发明各实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
实施例1
本实施例提供了抑制疟原虫感染的单克隆抗体的其制备方法，包括如下步骤：
S1，阳性克隆的获取：首先联合应用Kyte-Doolittle法，Emini法以及Jameson-Wolf法辅以Gamier-Robson法、Chou-Fasman法和Karplus-Schulz法预测PfRH5 B细胞表位，初步确定B细胞表位富集区位于PfRH5蛋白序列的200-400aa区段内，选用201-324aa和302-396aa两段氨基酸序列相应的编码基因合成克隆入T载体后测序分析正确后，分别克隆入原核表达载体PGEX4T-1，选取阳性克隆，分别标记为PfRH5-1，PfRH5-2；
S2，原核表达：
将测序结果正确两个阳性克隆的菌种接种于含抗生素(终浓度为100g/mL)的5mL液体LB培养基中37℃，250rpm培养过夜，将过夜培养菌液以1:1000转接于含上述抗生素的150mL液体LB中，37℃250rpm，大量培养至OD600＝0.6左右，培养液加入诱导物IPTG至终浓度为1mmol/L，继续振荡培养过夜，离心获取菌体沉淀，菌体重悬于PBS(pH7.0)缓冲液，将重悬的菌体溶液离心(4℃，12000g，5min)，弃上清，重复两次，冰浴条件下，超声波破碎大肠杆菌，将超声波破碎的菌液离心(4℃，12000g，15min)，分别收集上清和沉淀，SDS-PAGE检测，检测出PfRH5-1-GST和PfRH5-2-GST蛋白在上清中；
S3，纯化重组蛋白：
进行PfRH5-1-GST和PfRH5-2-GST的纯化：过滤后的PBS洗柱4次，将超声波破碎的菌液离心(4℃，12000g，15min)，收集上清后用0.22μm滤膜过滤后过柱，重复过柱3次，取过滤后的PBS洗涤柱子两次，洗下未挂柱的蛋白、杂质和结合的不牢靠的带标签的非目的蛋白，洗脱Buffer(L-还原型谷胱甘肽溶液)洗脱蛋白，1mL/管，收集目的蛋白PfRH5-1-GST和PfRH5-2-GST，将洗脱后的蛋白经行透析，透析液为PBS，隔两小时换一次PBS直到过夜，将透析好的目的蛋白(抗原)用超滤管浓缩到1mg/mL；
S4，重组蛋白免疫小鼠：连续进行三次免疫，每次间隔22天，首次免疫抗原量为100μg/只，免疫方式为加福氏完全佐剂皮下多点注射，共200μl，第二，三次免疫，100μg/只，加福氏不完全佐剂皮下多点注射，共200μl，第三次免疫后10天，检测免疫小鼠抗体效小鼠尾尖采血，选取抗体效价较高的小鼠进行加强免疫，加强免疫抗原用量为50μg/只，尾静脉注射，200μl；
S5，制备融合细胞：取正常BALB/C小鼠，摘除眼球采血，颈椎脱臼处死后，浸泡于75％的酒精溶液，消毒5分钟。于解剖台上固定，用无菌剪刀在剪开腹部皮肤，暴露腹膜，并用75％的酒精棉球擦拭腹膜，用5ml注射器换用大号针头，先抽5ml预冷的RPMI-1640基础培养基，用镊子提起腹壁，从腹部一侧向腹腔注射，按摩腹部1min，形成细胞悬液，用镊子牵拉侧腹，形成一个腹囊，使细胞悬液聚集在此，注射器抽出悬液。反复此过程2次，将全部立即移入预冷的15ml离心管，230g离心5min，弃上清,用HAT培养基重悬后细胞计数后，调整细胞1×105/ml，加入96孔板，100μl/孔，37℃、5％CO2培养箱培养；
S6，收集免疫后小鼠脾细胞：免疫后的小鼠，眼球取血，血液凝集后收血清备用。小鼠颈椎脱臼处死后，放入75％酒精中消毒5min；剪开腹部皮肤，取出脾脏，用镊子剥去脾脏外的***，PBS冲洗干净。将脾脏放在200目不锈刚细胞筛网上，用20ml注射器的针芯挤压脾脏，使分散的脾细胞通过筛网落入下面含不完全培养基的的培养皿中。用少量不完全培养基冲洗筛网，吹匀脾细胞，收集，230g离心5min。弃上清，向细胞沉淀中加入红细胞裂解液重悬混匀，按细胞沉淀/裂解液(V/V)＝1/2裂解红细胞，静置3min，150g离心10min。去上清，用10ml的RPMI-1640不完全培养基重悬，150g离心10min，弃上清，再用10ml的RPMI-1640不完全培养基重悬，取少量悬液计数。
S7，融合培养和单克隆筛选：取108细胞备用做融合。取SP2/0细胞，用10ml的RPMI-1640不完全培养基重悬，离心，弃上清，再用RPMI-1640不完全培养基重悬，计数。按SP2/0：脾细胞以1:5或者1:10的比例取适量的SP2/0悬液，将准备好的脾细胞悬液和SP2/0悬液混合离心，90g离心5min。尽量吸净上清，轻轻弹击离心管底使细胞沉淀略为松动，于37℃水浴中预热待用。吸取1ml预热至37℃的PEG，在60s-90s内(先慢后快)逐滴加入细胞沉淀中，边加边轻轻搅拌，混合均匀，50ml离心管倾斜，使PEG与细胞充分接触混匀，37℃水浴静止60s。加HAT培养基终止反应，将含融合细胞的HAT培养基接种于含饲养层细胞的96孔培养板中，100μl/孔，37℃、5％CO2培养箱培养。期间视细胞状态进行换液，待状态好，密度占孔1/4-1/3时即可进行单克隆筛选。选高效价融合阳性孔，一部分转24孔板，剩余部分计数，稀释至每孔1.5、1个细胞，铺板，每孔100μl，每个密度各铺半块96孔板。7日后，镜检鉴定单克隆和多克隆，作出标记。用ELISA法测定单克隆抗体效价，计算阳性孔率，若为100％，则每板挑效价高的孔5-10个(每孔均为单克隆)进行转孔，转至24孔板中，扩大培养至24孔板中，传代扩增至3个孔，每孔密度80％时，即可进行首次细胞冻存。轻轻从孔板吹起细胞，吹打均匀，吸取少量细胞悬液用于细胞计数。计算细胞密度和活力，冻存要求：活力﹥90％，密度1×106-1×107/ml。吸取细胞悬液至15ml离心管中，90g离心3min，离心后，倒掉细胞上清，加入对应体积的预冷的冻存液，轻轻吹打均匀，分装于冻存管中，1ml/管。冻存管上做好标记：细胞名称、代次、密度、日期、操作人姓名。
S8，杂交瘤细胞培养：选用10周龄左右BALB/C小鼠，腹腔接种不完全佐剂，每只小鼠0.5ml。腹腔注射用无血清培养基稀释的杂交瘤细胞，注射细胞数量约为2x106/只。间隔7天后，每天观察小鼠腹水产生情况，如腹部明显膨大且触摸时皮肤有紧绷感，即可采集腹水，将腹水离心，收集上清。将腹水进行纯化。
以疟原虫虫体裂解物作为抗原，westernblot检测表明，获得的单克隆抗体具有较好的特异性(如图1所示)，获得的两株单克隆抗体PfRH5-1和PfRH5-2的效价均为：1:2000以上。
单克隆抗体抑制疟原虫增殖情况：恶性疟原虫(3D7株)经山梨醇同步化处理至裂殖体期。96孔板中每孔加入90μL培养基和10μL经灭活并过滤除菌的免疫血清，每个样品均做8个孔，取裂殖体期原虫，调整其感染率为2％，RBC压积至4％，混匀后每孔加入100μL，培养24h后收集RBC，涂片染色，计数环状体感染率。
入侵抑制率＝(正常培养孔感染率一实验孔感染率/正常培养孔感染率)×100％。
如图2所示，两株单克隆抗体都能明显抑制疟原虫入侵红细胞，入侵抑制率在70％左右。
综上所述，本发明获得的单克隆抗体PfRH5-1和PfRH5-2均能能够明显抑制疟原虫入侵红细胞，降低疟原虫的感染率，可以检测恶性疟原虫或者筛选相应的药物，是临床上预防或治疗恶性疟相关疾病的基础。
尽管已描述了本发明的优选实施例，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例作出另外的变更和修改。所以，所附权利要求意欲解释为包括优选实施例以及落入本发明范围的所有变更和修改。
显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。
Claims (10)
1.抑制疟原虫感染的单克隆抗体的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1，阳性克隆的获取：选用PfRH5蛋白序列的201-324aa段氨基酸序列相应的编码基因合成克隆入原核表达载体PGEX4T-1，选择阳性克隆标记为PfRH5-1，选用PfRH5蛋白序列的302-396aa段氨基酸序列相应的编码基因合成克隆入原核表达载体PGEX4T-1，选择阳性克隆标记为PfRH5-2；
S2，原核表达：
将两个阳性克隆菌种分别接种于含抗生素的LB培养基中培养，加入诱导物IPTG继续培养过夜，破碎大肠杆菌，将破碎的菌液离心，分别收集上清和沉淀；
S3，纯化重组蛋白：
收集的上清用0.22μm滤膜过滤后过柱，收集目的蛋白PfRH5-1-GST和PfRH5-2-GST，洗脱后透析，然后浓缩至1mg/mL，即为抗原；
S4，免疫小鼠：连续进行三次免疫，每次间隔22天，第三次免疫后10天，检测免疫小鼠抗体效小鼠尾尖采血，选取抗体效价较高的小鼠进行加强免疫，加强免疫抗原用量为48-50μg/只，尾静脉注射，180-200μl；
S5，制备融合细胞：取正常小鼠，制备脾细胞悬液进行培养；
S6，收集免疫后小鼠脾细胞：获取免疫后的小鼠脾细胞，向细胞沉淀中加入红细胞裂解液重悬混匀，裂解红细胞后计数；
S7，融合培养和单克隆筛选；
S8，杂交瘤细胞培养，获得单克隆抗体PfRH5-1和PfRH5-2。
2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，S2中，所述的两个阳性克隆菌种培养条件均为37℃，250rpm，所述的LB培养基中抗生素的终浓度为100g/mL。
3.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，S3中，透析液为PBS，透析时间为12h。
4.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，S4中，三次免疫具体为：首次免疫抗原量为100μg/只，皮下多点注射，共200μl；第2-3次免疫，抗原量为100μg/只，皮下多点注射，共200μl。
5.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，S5中，脾细胞悬液培养时，调整细胞密度为1×105个/ml，加入96孔板，100μl/孔，于37℃、5％CO2培养箱培养。
6.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，S7中，融合培养和单克隆筛选的具体过程为：取108细胞备用做融合，按SP2/0细胞：脾细胞以1:10的比例混合离心获得细胞沉淀，预热，吸取1ml预热至37℃的PEG加入细胞沉淀中，混合均匀，37℃水浴静止60s，加HAT培养基终止反应，将含融合细胞的HAT培养基接种于含饲养层细胞的96孔培养板中，100μl/孔，37℃、5％CO2培养箱培养，密度占孔1/3时进行单克隆筛选，选高效价融合阳性孔。
7.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，S8中，杂交瘤细胞培养的具体过程为：选用10周龄小鼠，腹腔接种不完全佐剂，每只小鼠0.5ml，腹腔注射用无血清培养基稀释的杂交瘤细胞，注射细胞数量为2-3x106个/只，间隔7-10天后，采集腹水，离心、收集上清、纯化后获得单克隆抗体PfRH5-1和PfRH5-2。
8.根据权利要求1所述的制备方法制备获得的单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体包括抗体PfRH5-1和抗体PfRH5-2。
9.如权利要求8所述的单克隆抗体在制备抑制或检测恶性疟原虫感染的药物中的应用。
10.如权利要求8所述的单克隆抗体在制备抑制恶性疟原虫感染的药物中的应用，其特征在于，所述感染的对象为红细胞。
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