CN108101990B - 阻断人Tim-3功能的单克隆抗体及其编码基因和应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种能阻断人Tim‑3功能的单克隆抗体及其编码基因，该抗体能够与人Tim‑3胞外区结合，可以特异性阻断Tim‑3与其配体的结合，抑制信号转导，因此可将本发明的单克隆抗体作为Tim‑3信号通路的阻断剂，从而成为肿瘤免疫治疗、慢性病毒感染性疾病及自身免疫性疾病治疗的一种新型抗体药物。

Description

阻断人Tim-3功能的单克隆抗体及其编码基因和应用

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种阻断人Tim-3功能的单克隆抗体及其编码基因和应用。

背景技术

McIntire等在2001年发现了Tim基因家族，研究发现Tim基因编码含有免疫球蛋白和黏蛋白结构域的蛋白分子，在免疫细胞上广泛表达，参与调节多种T细胞包括调节性T细胞的分化，在免疫自稳与凋亡细胞的清除过程中发挥重要作用。Tim家族在人类中只有3个基因，定位于人类染色体的5q33.2，分别编码蛋白Tim-1、3、4。Tim-3是Tim家族的重要成员，由301个氨基酸组成，其结构包括胞外免疫球蛋白V区、粘蛋白区、跨膜区和胞浆区[FreemanGJ，Casasnovas JM，Umetsu DT，et a1.TIM genes：a family of cell surfacephosphatidylserine receptors that regulate innate and adaptive immunity[J].Immunol Rev，2010，235(1)：172-189；Umetsu SE，Lee WL，Mcintire JJ，et a1.TIM-1induces T cell activation and inhibits the development of peripheraltolerance[J].Nat Immunol，2005，6(5)：447454；Rodriguez-Manzanet R，Dekruyf R，Kuchroo VK，et a1.The costimulatory role of TIM molecules[J].Immunol Rev，2009，229(1)：259-270.]。

目前，已发现Tim-3表达在分化的Th1细胞表面、CD8⁺T细胞、NK细胞、巨噬细胞、DC细胞、Treg细胞、T17细胞及肥大细胞等免疫细胞及一些肿瘤细胞上[Anderson AC,Anderson DE,Bregoli L et a1.Promotion of tissue inflammation by the immunereceptor TIM-3expressed on innate immune cells.Science 2007；318(5853):1141-1143；Freeman GJ,Casasnovas JM,Umetsu DT,DeKruyff RH.TIM genes:a family of cellsurface phosphatidylserine receptors that regulate innate and adaptiveimmunity.Immunological reviews2010；235:172-89.]。

Tim-3与其配体Galectin-9结合后负向调控CD4⁺Th1细胞的功能，诱导CD4⁺Th1细胞凋亡。Tim-3/galectin-9通路异常参与多种免疫性疾病发生，如自身免疫性脑脊髓炎，I型糖尿病及急性移植物抗宿主病。有研究表明多发性硬化症动物模型体内抑制Tim-3/Gal-9的信号转导后，动物病情恶化。更多的研究表明Tim-3在自身免疫性疾病中起重要调节作用[Monney L,Sabatos CA,Gaglia JL,et a1.Th 1-specific cell surface protein Tim-3regulates macrophage activation and severity of an autoimmunedisease.Nature,2002；415:536-541；Zhu C,et a1.The Tim-3ligand galectin-9negatively regulates T helper type 1immunity.Nat Immunol.2005；6:1245-1252；Boenisch O,D’Addio F,Watanabe T,Elyaman W,et a1.TIM-3:a novel regulatormolecule ofalloimmune activation.J Immuno1.2010Nov 15；185(10):5806-19]。

在病毒慢性感染状态下，Tim-3高表达使CD4⁺T和CD8⁺T细胞功能缺陷丧失免疫效应。研究表明，在HIV、HBV及HCV病毒感染中，Tim-3⁺CD8⁺T的比率增加，且免疫效应功能降低，在使用阻断剂如Tim-3抗体等处理后，CD8⁺T细胞效能会恢复[Jones RB,Ndhlovu LC,Barbour JD,et a1.TIM-3expression defines a novel population of dysfunctionalT cells with highly elevated frequencies in progressive HIV-1infection.ExpMed 2008；205:2763-2779；Wei Wu,Yu Shi,Shuping Li,et al.Blockade of Tim-3signaling restore the virus-specific CD8+T-cell response in patients withchronic hepatitis B.Eur.J.Immunol.2012.42:1180-1191.]。

在肿瘤浸润的CD4⁺T和CD8⁺T细胞高表达Tim-3，且细胞效应功能受损，与肿瘤进展具有相关性。在急性髓性白血病中，大部分的白血病干细胞表达Tim-3，使用Tim-3抗体可有效抑制白血病干细胞的再生，补体依赖性和抗体依赖性的毒性反应也得到增强，且不影响正常的造血干细胞[Kikushige Y,Akashi K.TIM-3as a therapeutic target formalignant stem cells in acute myelogenous leukemia.Ann N Y Acad Sci,2012,1266:118-123.]。

上述研究表明，Tim-3通路具有重要的免疫调节功能，在凋亡细胞和病原菌的清除、***反应性疾病和自身免疫性疾病调节及肿瘤的发生和发展等方面起着重要的作用。因此，开发出与Tim-3具有高亲和力的中和抗体，功能性阻断Tim-3的信号通路，对于自身免疫性、感染性及肿瘤等方面疾病的机制研究、疾病诊断和治疗具有重要的意义。

目前现有的Tim-3抗体亲和力较低，尚缺少一种具有高亲和力的阻断性Tim-3抗体。

发明内容

为了克服现有技术中所存在的问题，本发明的目的在于提供一种阻断人Tim-3功能的单克隆抗体及其编码基因和应用。

本发明所述单克隆抗体或其片段与含有T细胞免疫球蛋白黏蛋白分子3(后面均简称Tim-3)的胞外区结合，并具有阻断Tim-3功能的作用。

为了实现上述目的以及其他相关目的，本发明采用如下技术方案：

本发明的第一方面，提供一种单克隆抗体，所述单克隆抗体包括轻链和重链，所述轻链包括氨基酸序列如SEQ ID NO.1～3所示的CDR区，所述重链包括氨基酸序列如SEQ IDNO.4～6所示的CDR区。

所述重链和轻链通过二硫键连接。

优选地，所述单克隆抗体，其轻链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO.7或其保守型变异序列，其重链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO.8或其保守型变异序列。

优选地，所述轻链可变区的编码核苷酸序列为SEQ ID NO.9或其保守型变异序列，所述重链可变区的编码核苷酸序列为SEQ ID NO.10或其保守型变异序列。

优选地，所述单克隆抗体是鼠源性的。

更优选的，所述单克隆抗体是IgG2a重链和Kappa型轻链亚型的免疫球蛋白。

本发明所提供的单克隆抗体是一种抗(结合或作用)分化的Th1细胞表面、CD8⁺T细胞、NK细胞、巨噬细胞、DC细胞、Treg细胞、T17细胞及肥大细胞等免疫细胞及一些肿瘤细胞上所表达的Tim-3抗原(或受体、或表位)、或者部分抗(结合或作用)Tim-3抗原、或者部分抗(结合或作用)Tim-3抗原的单克隆抗体。

所述单克隆抗体或其衍生物可以是单链抗体、双链抗体、嵌合抗体、人源化抗体，只要其能与人Tim-3蛋白结合，且具有能够阻断Tim-3通路的功能效应即可。

本发明进一步提供所述单克隆抗体的衍生物，所述衍生物可以为所述单克隆抗体片段、或包含所述单克隆抗体或单克隆抗体片段的融合蛋白，所述单克隆抗体的片段可以为Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv或scFv等。只要其能与人Tim-3蛋白结合，且具有能够阻断Tim-3通路的功能效应即可。

本发明的第二方面提供一种分离的DNA分子，编码所述单克隆抗体的重链和/或轻链的可变区或全长氨基酸。

本发明的第三方面，提供一种包含所述分离的DNA分子的构建体。

优选的，所述DNA载体表达构建体由所述分离的抗体DNA分子***到表达载体的多克隆位点构建而成。

所述表达载体具体可以是本领域的技术人员所熟知的现有常用的表达载体，具体可采用的表达载体包括但不限于：pET系列表达载体、pGEX系列表达载体、pcDNA系列表达载体等。

本发明第四方面提供一种单克隆抗体的表达***，由所述构建体转染到宿主细胞构建而成。

任何适用于表达载体(构建体)进行表达本专利所述抗体的细胞都可以作为宿主细胞。例如，酵母、昆虫、植物等的细胞。优选的，所述宿主细胞为真核细胞，可采用不会产生抗体的哺乳动物宿主细胞系，具体可采用的细胞系包括但不限于：中国仓鼠的卵巢细胞(CHO)、幼仓鼠的肾脏细胞(BHK,ATCC CCL 10)、幼鼠的塞尔托利细胞(Sertoli cells)、猴的肾脏细胞(COS细胞)、通过SV40(COS-7,ATCC CRL 165 1)转化的猴的肾脏CVI细胞、人的胚肾细胞(HEK-293)、猴肾脏细胞(CVI，ATCC CCL-70)、非洲绿猴的肾脏细胞(VERO-76,ATCCCRL-1587)、人的子***细胞(HELA,ATCC CCL-2)等。

本发明第五方面提供所述单克隆抗体的制备方法，包括如下步骤：在适合表达所述抗体的条件下，培养所述的单克隆抗体的表达***，从而表达出所述的单克隆抗体，纯化分离出所述的单克隆抗体。

在获得编码本发明的抗体的核酸序列后，可按照以下方法制备生产目的抗体。例如将含有编码目标抗体的核酸的载体直接导入宿主细胞，细胞在适当的条件下进行培养，从而诱导出被编码抗体的表达。本发明中所用的表达载体和宿主细胞均为现有技术，可通过商业途径直接获取，培养中所用的10％FBS的1640培养基亦为各种常规的哺乳细胞培养基，本领域技术人员可根据经验选择适用的1640培养基，在适于宿主细胞生长的条件下进行培养。当宿主细胞生长到适当的细胞密度后，用合适的方法(如温度转换或化学诱导)诱导选择的启动子，将细胞再培养一段时间。在上面的方法中的重组多肽可在细胞内、或在细胞膜上表达，或分泌到细胞外。一旦获得本发明所说的单克隆抗体，就可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化所述单克隆抗体。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于：常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。

本发明的第六方面提供所述单克隆抗体在制备具有以下任一项或多项的功效的药物中的用途：

(1)免疫细胞功能的活化；(2)癌症治疗；(3)免疫性疾病治疗；(4)感染性疾病的治疗。

本发明的一些实施方式中，证明了本发明的单克隆抗体具有促进CD8⁺T细胞增殖的功效。因此，本发明还提供所述单克隆抗体在制备能够促进CD8⁺T细胞增殖的药物中的用途。

本领域技术人员根据本发明所提供的试验数据可知，本发明的单克隆抗体能够与人Tim-3胞外区结合，可以特异性阻断Tim-3与其配体的结合，抑制信号转导，因此可将本发明的单克隆抗体作为Tim-3信号通路的阻断剂，从而成为肿瘤免疫治疗、慢性病毒感染性疾病及自身免疫性疾病治疗的一种新型抗体药物。

本发明的第七方面，提供一种药物组合物，包括治疗有效量的所述单克隆抗体或其免疫偶联物。

所述免疫偶联物包括但不限于所述单克隆抗体或其片段与药物、毒素、细胞因子、放射性核素、酶或其他诊断试剂等结合而形成的偶联物。

所述药物组合物，以病灶所表达的Tim-3为抗原，结合或作用于所述抗原，特异性阻断Tim-3与其配体的结合，抑制信号转导，从而治疗疾病。

本发明的单克隆抗体可以通过本领域任何已知的方式配制药物组合物来使用。这种组合物以所述单克隆抗体为活性成分，加上一种或多种药物学上可接受的载体或赋形剂，所述载体或赋形剂应当于所述单克隆抗体相容。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

本发明新发现了一种能阻断人Tim-3功能的单克隆抗体及其编码基因，该抗体能够与人Tim-3胞外区结合，可以特异性阻断Tim-3与其配体的结合，抑制信号转导，因此可将本发明的单克隆抗体作为Tim-3信号通路的阻断剂，从而成为肿瘤免疫治疗、慢性病毒感染性疾病及自身免疫性疾病治疗的一种新型抗体药物。

附图说明

图1为RT-PCR方式扩增的抗人Tim-3单克隆抗体CDT1的轻重链可变区基因的琼脂糖凝胶电泳图。

图2为抗Tim-3抗体的阻断效应实验，图中CDT1抗体处理的CD8⁺T细胞流式可检测到多个峰，细胞有明显的增殖效应，而PBS和同型对照则为单一峰图，均无促进细胞增殖效应。

图3：CDT1抗体和某商品化的Tim-3功能抗体比较，A为CDT1抗体，B为同型对照，C为PBS，D为商品化的功能抗体。

图4：CDT1抗体和同时制备的无功能作用的抗体比较，A为CDT1抗体；B为同型对照；C为PBS，D和E为两个无功能作用的抗体，其名称为：CPT1CPT2。

具体实施方式

在进一步描述本发明具体实施方式之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围。下列实施例中未注明具体条件的试验方法，通常按照常规条件，或者按照各制造商所建议的条件。

当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。

除非另外说明，本发明中所公开的实验方法、检测方法、制备方法均采用本技术领域常规的分子生物学、生物化学、染色质结构和分析、分析化学、细胞培养、重组DNA技术及相关领域的常规技术。这些技术在现有文献中已有完善说明，具体可参见Sambrook等MOLECULAR CLONING：A LABORATORY MANUAL，Second edition，Cold Spring HarborLaboratory Press，1989and Third edition，2001；Ausubel等，CURRENT PROTOCOLS INMOLECULAR BIOLOGY，John Wiley&Sons，New York，1987and periodic updates；theseries METHODS IN ENZYMOLOGY，Academic Press，San Diego；Wolffe，CHROMATINSTRUCTURE AND FUNCTION，Third edition，Academic Press，San Diego，1998；METHODS INENZYMOLOGY，Vol.304，Chromatin(P.M.Wassarman and A.P.Wolffe，eds.)，AcademicPress，San Diego，1999；和METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY，Vol.119，ChromatinProtocols(P.B.Becker，ed.)Humana Press，Totowa，1999等。

实施例1抗人Tim-3单克隆抗体CDT1杂交瘤细胞株的构建

1.材料

DNA免疫佐剂购自Sigma公司；胎牛血清及PRMI1640培养基购自Gibco公司；SP2/0细胞购自ATCC；BALB/c小鼠由浙江大学实验动物中心提供。

2.方法：

(1)质粒构建

根据NCBI上查的Tim-3基因序列设计引物，以人的cDNA为模板，扩增出Tim-3基因DNA序列，利用分子生物学的方法构建到pcDNA3.1质粒上。

(2)小鼠免疫

选用4-6周龄的BALB/c小鼠，将构建的Tim-3基因重组质粒溶于PBS与佐剂等体积混合乳化，皮下和腹腔多点免疫。首次免疫后每隔2周，分别用同样剂量的质粒与佐剂混合乳化后注射进行加强免疫。第3次免疫7天后尾静脉采血，用ELISA方法梯度稀释检测抗体产生的情况。融合前3天，用同样剂量的质粒与佐剂混合加强免疫1次。

(3)细胞融合

将免疫的小鼠处死后，无菌摘取小鼠脾脏，碾磨制备单个细胞悬液，用RPMI1640培养液洗涤两次后计数细胞数目；将小鼠脾淋巴细胞与骨髓瘤细胞SP2/0以1:5-1:10的比例混合，短时间内缓慢滴加50％的PEG溶液1ml，置37℃水浴1min，加入RPMI1640培养液后800r/min离心5min后，弃去上清后加入含20％FBS的1640培养基重悬细胞，将细胞悬液与等体积的饲养细胞(小鼠腹腔巨噬细胞)混合后，分装至96孔细胞培养板中，置37℃，5％CO₂培养箱中培养。培养3d后，加入含20％FBS的HAT 1640筛选培养基培养。

(4)杂交瘤细胞的筛选

在96孔板细胞集落长到合适大小时，吸取细胞培养上清用间接ELISA方法进行检测，筛选阳性的杂交瘤细胞。

(5)杂交瘤细胞克隆化

将鉴定为阳性的杂交瘤细胞培养至状态良好时，用有限稀释的方法将细胞计数后稀释并接种到96孔板中，使得每个孔中只有一个细胞，置37℃，5％CO₂培养箱中培养。5d-10d中观察细胞生长情况，取形成单个细胞克隆的孔内上清用间接ELISA方法进行检测，筛选和鉴定阳性克隆；重复亚克隆3-5次，直至杂交瘤细胞的阳性孔率达到100％，确定细胞的稳定性。

实施例2：抗人Tim-3单克隆抗体CDT1抗体亚类鉴定及稳定性试验

参照抗体亚类鉴定试剂盒说明书对抗体进行亚类鉴定，结果重链类别为IgG2a型，轻链为Kappa型。

将杂交瘤细胞株在体外连续传代培养3个月，测定上清中抗体的效价；将冻存的杂交瘤细胞株4个月后复苏，检测上清中的抗体效价，均未发生明显变化，表明所得的产生抗体的杂交瘤细胞株性能稳定。

实施例3：抗人Tim-3单克隆抗体CDT1的重链和轻链克隆

1.材料

根据文献资料设计单克隆抗体重链和轻链基因扩增引物于上海生工生物工程有限公司合成；DNA片段纯化试剂盒和质粒抽提试剂盒购自QIAGEN公司；pMD-18T kit和逆转录酶购自TAKARA公司；感受态细胞购自promega公司；KOD plus保真PCR酶购自TOYOBO公司，Trizol试剂购自Invitrogen公司。

2.方法和结果

(1)取5×10⁶-10⁷个单克隆抗体杂交瘤细胞离心去除上清，加入1mlTrizol试剂反复吹打至细胞充***解。室温静置5min后加入0.2ml的氯仿，上下颠倒混匀，室温静置2-3min。4℃12000*g离心15min。小心吸取上层液体与另一离心管中，加入500μl异丙醇颠倒混匀后室温放置10min，4℃12000*g离心10min。加入1ml预冷的75％乙醇洗涤沉淀，7500*g离心5min后弃上清，室温干燥5min后加入无RNase的去离子水溶解沉淀。

(2)取1μg RNA加入1μL的随机引物，用无RNase的水补充至6μL，70℃温育10min后迅速置冰上放置2min，加入5*M-MLV Buffer 2μL、dNTP mixture 0.5μL、RNaseinhibitor0.25μL、M-MLV酶1μL、无RNase水补充至10μL，42℃温育1h，70℃温育15min后冰上冷却，产物为cDNA第一链。

(3)25μL的扩增体系中，各自分别加入两对重链和轻链PCR扩增引物各0.5μL，逆转录产物2μL，kod plus扩增酶0.5μL，dNTP 2μL，5*Buffer 5μL，用水补足至25μL。PCR扩增参数为：预变性94℃2min，循环步骤：98℃10s 55℃30s 68℃30s共35个循环。

(4)PCR扩增产物跑琼脂糖凝胶，如图1所示，将所要的目的产物割胶回收，用DNA片段回收试剂盒回收后，根据pMD-18T试剂盒说明书，将DNA片段和载体按照10:1的摩尔比进行混合后，加入连接酶和连接Buffer，总体积为10μL，16℃过夜连接。

(5)取连接液10μL加入200μl的TOP10F’感受态细菌中，冰浴30min后42℃热击90s，迅速放置冰上2min，加入800μL的LB培养液，37℃摇床180rpm/min振荡培养45min,5000rpm离心2min，弃去约800μl左右的上清，余下液体将沉淀吹打均匀后涂布含有氨苄青霉素的LB固体培养基平板，平板于37℃培养箱倒置培养12-16h。从平板上挑取单个细菌克隆，接种于含氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃摇床220rpm/min振荡培养过夜，去部分菌液裂解后用轻链和重链引物做PCR扩增验证，扩增出有需要大小片段的菌液送去测序。测序正确的菌液转接后用DNA质粒抽提试剂盒抽提质粒，该质粒上携带有抗体的可变区重链和轻链的基因。

经鉴定，结果表明，人Tim-3单克隆抗体CDT1轻链可变区互补决定区1(CDR1)氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，具体为：

GlnSerValLeuTyrSerSerAsnGlnLysAsnPhe。

轻链可变区互补决定区2(CDR2)氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，具体为：

TrpAlaSer。

轻链可变区互补决定区3(CDR3)氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，具体为：

HisGlnTyrLeuSerLeu ArgThr。

重链可变区互补决定区1(CDR1)氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示，具体为：

GlyPheThrPheThrAspTyrTyr。

重链可变区互补决定区2(CDR2)氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示，具体为：

IleArgAsnLysAlaAsnGlyTyrThrThr。

重链可变区互补决定区2(CDR2)氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示，具体为：

AlaArgAsp LeuAspTyr。

人Tim-3单克隆抗体CDT1的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示，具体为：

所述人Tim-3单克隆抗体CDT1的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示，具体为：

所述人Tim-3单克隆抗体CDT1的轻链可变区的编码核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示，具体为：

所述人Tim-3单克隆抗体CDT1的重链可变区的编码核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示，具体为：

实施例4：抗人Tim-3单克隆抗体CDT1促进CD8⁺T细胞增殖实验

1.人全血单个核细胞(PBMC)的分离

(1)用抗凝管收集血液，摇匀，加入的Hank’s液或PBS等体积(1:1)稀释血液。取淋巴细胞分离液2ml，放入15ml的离心管。

(2)将离心管倾斜45°角，用吸管吸取稀释血液，在离分层液面上1cm处，沿试管壁徐徐加入，使稀释血液量叠于分层液上，保持两者界面清晰(稀释血液与分层液体积比例约为2:1)。

(3)水平离心机室温以300^*g/min离心20min，离心后其中的内容物分为四层，上层为血浆(内含血小板)，中间层为分层液，底层为红细胞和粒细胞，在上、中层液体界面处可见到乳白色混浊的单个核细胞层。

(4)用毛细管(或1ml注射器)轻轻***白膜层，沿试管壁周缘吸取界面层单个核细胞，移入另一离心管中，尽量全部吸出PBMC，避免吸到过多的分层液和血浆。

(5)加入5ml的Hank's液或RPMI1640洗涤2次，混匀，依次以300*g/min离心10min，吸弃上清。

(6)最后一次离心后，弃上清，用含有10％胎牛血清的RPMI1640培养液2ml，重悬细胞，备用。

2.CFSE标记PBMC

(1)将分离的PBMC调整到细胞数在0.5×10⁶-10×10⁷个/ml之间，置于15ml离心管中。

(2)离心管平置，管口加入110μL的PBS，取1.1μL的5mM的CFSE贮存液与PBS混合，迅速盖上盖子后反复颠倒混匀。

(3)细胞避光室温孵育5min。

(4)加入10倍体积的PBS(含5％灭活的胎牛血清)，300*g离心5min，小心弃去上清，重复洗涤细胞二次。

(5)加入培养液将细胞悬起，取100μL种96孔板，1×10⁵个细胞/孔。

3.抗体促进T细胞增殖检测

(1)CFSE处理的PBMC细胞种96孔板后，加入包被有CD3CD28抗体的磁珠和IL-2细胞因子激活T细胞，置细胞培养箱中，37℃，5％CO₂条件下培养3天，流式检测细胞表面的Tim-3表达，结果表明Tim-3表达明显上调。

(2)激活的细胞分为三组：空白对照组加入PBS，同型对照组加入与CDT1具有相同亚型的同型对照(名称：Purified Mouse IgG2a,κIsotype Ctrl Antibody品牌：Biolegend货号：401501)，抗体组加入CDT1抗体，终浓度为10ug/ml，置细胞培养箱中，37℃，5％CO₂条件下培养3天。

(3)细胞转入1.5ml ep管中，2000rpm离心5min，加入1mlPBS洗涤，重悬于100μL的PBS中。

(4)加入CD3-APC和CD8-PE荧光标记的流式抗体，4℃孵育30min，用PBS洗涤后，上流式机检测CD8⁺T细胞增殖情况，如图2所示，结果表明CDT1抗体对CD8⁺T细胞具有明显的促进增殖的效应。如图3所示，CDT1抗体和某商品化的Tim-3功能抗体比较，结果表明CDT1抗体对CD8⁺T细胞具有的促增殖效应，强于商品化的功能抗体。

对比例

本发明在研发过程中，采用上述实验方法，构建抗人Tim-3单克隆抗体CDT1杂交瘤细胞株的时候，同时构建筛选了其他两株能够与Tim-3胞外区结合的抗体：抗人Tim-3单克隆抗体CPT1杂交瘤细胞株、抗人Tim-3单克隆抗体CPT2杂交瘤细胞株。对其各自分泌的单克隆抗体CPT1和CPT2进行CD8⁺T细胞增殖实验研究。结果如图4所示，CPT1和CPT2不具备促进CD8⁺T细胞增殖的功能。

以上所述，仅为本发明的较佳实施例，并非对本发明任何形式上和实质上的限制，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还将可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。凡熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，当可利用以上所揭示的技术内容而做出的些许更动、修饰与演变的等同变化，均为本发明的等效实施例；同时，凡依据本发明的实质技术对上述实施例所作的任何等同变化的更动、修饰与演变，均仍属于本发明的技术方案的范围内。

序列表

<110> 浙江大学

<120> 阻断人Tim-3功能的单克隆抗体及其编码基因和应用

<130> 175402

<160> 10

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Gln Ser Val Leu Tyr Ser Ser Asn Gln Lys Asn Phe

1 5 10

<210> 2

<211> 3

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Trp Ala Ser

1

<210> 3

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

His Gln Tyr Leu Ser Leu Arg Thr

1 5

<210> 4

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

Gly Phe Thr Phe Thr Asp Tyr Tyr

1 5

<210> 5

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

Ile Arg Asn Lys Ala Asn Gly Tyr Thr Thr

1 5 10

<210> 6

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

Ala Arg Asp Leu Asp Tyr

1 5

<210> 7

<211> 111

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

Asn Ile Met Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ala Val Ser Ala Gly

1 5 10 15

Glu Lys Val Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Val Leu Tyr Ser

20 25 30

Ser Asn Gln Lys Asn Phe Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln

35 40 45

Ser Pro Glu Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Val Ser Gly Val

50 55 60

Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr

65 70 75 80

Ile Ser Asn Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys His Gln

85 90 95

Tyr Leu Ser Leu Arg Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile

100 105 110

<210> 8

<211> 114

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

Val Lys Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser

1 5 10 15

Leu Arg Leu Ser Cys Ala Thr Ser Gly Phe Thr Phe Thr Asp Tyr Tyr

20 25 30

Met Ser Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Ala Leu Glu Trp Leu Gly

35 40 45

Phe Ile Arg Asn Lys Ala Asn Gly Tyr Thr Thr Glu Tyr Ser Ala Ser

50 55 60

Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Tyr Ser Gln Ser Ile Leu

65 70 75 80

Tyr Leu Gln Met Asn Thr Leu Thr Ala Glu Asp Ser Ala Thr Tyr Phe

85 90 95

Cys Ala Arg Asp Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val

100 105 110

Ser Ser

<210> 9

<211> 333

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

aacattatga tgacacagtc gccatcatct ctggctgtgt ctgcaggaga aaaggtcact 60

atgagctgta agtccagtca aagtgttttg tacagttcaa atcagaagaa cttcttggcc 120

tggtaccagc agaaaccagg gcagtctcct gaactgctga tctactgggc atccactagg 180

gtatctggtg tccctgatcg cttcacaggc agtggatctg ggacagattt tactcttacc 240

atcagcaatg tacaagctga agacctggca gtttattact gtcatcaata cctctccttg 300

cgcacgttcg gaggggggac caagctggag atc 333

<210> 10

<211> 342

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

gtgaaactgc aggagtctgg aggaggcttg gtacagcctg ggggttctct gagactctcc 60

tgtgcaactt ctgggttcac cttcactgat tactacatga gctgggtccg ccagcctcca 120

ggaaaggcac ttgagtggct gggttttatt agaaacaaag ctaatggtta cacaacagaa 180

tacagtgctt ctgtgaaggg tcggttcacc atctccagag attattccca aagcatcctc 240

tatcttcaaa tgaacaccct gacagctgag gacagtgcca cttatttctg tgcaagagat 300

ctggactact ggggccaagg gaccacggtc accgtctcct ca 342

Claims (11)

1.一种针对T细胞免疫球蛋白黏蛋白分子3的单克隆抗体，所述单克隆抗体包括轻链和重链，所述轻链包括CDR1、CDR2和CDR3，所述CDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述CDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示；所述重链包括CDR1、CDR2和CDR3，所述CDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示，所述CDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示，所述CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示。

2.根据权利要求1所述的单克隆抗体，其特征在于，其轻链可变区的氨基酸序列为SEQID NO.7，其重链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO.8。

3.根据权利要求1所述的单克隆抗体，其特征在于，所述轻链可变区的编码核苷酸序列为SEQ ID NO.9，所述重链可变区的编码核苷酸序列为SEQ ID NO.10。

4.根据权利要求1所述的单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体是鼠源性的。

5.根据权利要求1所述的单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体是IgG2a重链和Kappa型轻链亚型的免疫球蛋白。

6.一种分离的DNA分子，编码如权利要求1-5任一项权利要求所述单克隆抗体的重链和/或轻链的可变区或全长氨基酸。

7.一种构建体，包含所述权利要求6所述的分离的DNA分子。

8.一种单克隆抗体的表达***，由权利要求7所述的构建体转染到宿主细胞构建而成。

9.如权利要求1-5任一项权利要求所述单克隆抗体的制备方法，包括如下步骤：在适合表达所述抗体的条件下，培养所述的单克隆抗体的表达***，从而表达出所述的单克隆抗体，纯化分离出所述的单克隆抗体。

10.如权利要求1-5任一项权利要求所述单克隆抗体在制备具有促进CD8⁺T细胞增殖功效的药物中的用途。

11.一种药物组合物，包括治疗有效量的如权利要求1-5任一项权利要求所述单克隆抗体或其免疫偶联物。

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