CN114796275B - 一种干细胞凝胶制剂及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及生物医学技术领域，具体公开一种干细胞凝胶制剂及其制备方法和应用。所述干细胞凝胶制剂包括经血源间充质干细胞、自体富血小板血浆和几丁糖。本发明提供的干细胞凝胶制剂可以通过免疫调节促进内膜组织修复，改善***的炎症反应，显著增加***严重的患者的内膜厚度，提升中重度***患者的生育可能性，对***具有良好的预防和治疗效果。
Description
技术领域
本发明涉及生物医学技术领域，尤其涉及一种干细胞凝胶制剂及其制备方法和应用。
背景技术
子宫内膜损伤主要体现为***(IUA)。目前***的发病率居高不下，***患者除了会出现***和盆腔疼痛外，还能阻止胚泡着床，损害子宫和胚胎血液供应，最终导致患者反复流产或者***。宫腔镜是女性生殖疾病领域的常用手术辅助治疗手段，主要目的是解除***，恢复正常宫腔解剖和生殖功能。但宫腔镜治疗***对后续妊娠以及子宫内膜损害人具有潜在的危险。反复的宫腔镜分离手术会对子宫内膜基底层产生严重创伤，进而损伤基底层干细胞，并可能会出现难以修复的子宫内膜损伤。后来出现了宫腔灌注药物技术来治疗额预防***，该技术操作简单、对患者侵入性小，一定程度上避免了治疗过程出现严重创伤的情况。但现有的临床治疗手段对反复粘连的子宫内膜修复并无明显预防和治疗效果。
发明内容
针对现有***的临床治疗手段存在的上述问题，本发明提供一种干细胞凝胶制剂及其制备方法和应用，该干细胞凝胶制剂可以通过免疫调节促进内膜组织修复，改善***的炎症反应，显著增加***严重的患者的内膜厚度，提升中重度***患者的生育可能性，对***具有良好的预防和治疗效果。
为达到上述发明目的，本发明实施例采用了如下的技术方案：
一种干细胞凝胶制剂，包括经血源间充质干细胞、自体富血小板血浆和几丁糖。
相对于现有技术，本发明提供的干细胞凝胶制剂将血源间充质干细胞、自体富血小板血浆和几丁糖结合，在用于治疗子宫内膜修复等疾病中，该凝胶制剂可以调节子宫内膜细胞的抑炎因子和促炎因子的表达量，提升抑炎细胞的量，改善***的炎症反应，促进子宫内膜损伤的修复，抑制宫腔组织粘连和疤痕的形成，利于维持正常妊娠，尤其对中重度***患者具有显著的治疗效果，可增加中重度***患者的子宫内膜厚度，提升中重度***患者生育的可能性。
优选的，所述干细胞凝胶制剂中所述经血源间充质干细胞的细胞浓度为(0.5-1)×107个/mL。
优选的，所述干细胞凝胶制剂中血小板的浓度为(600-1200)×109/L。
优选的，所述干细胞凝胶制剂中所述几丁糖的浓度为0.4wt％-0.6wt％。
优选的，所述自体经血源间充质干细胞的制备方法包括以下步骤：
a、取经血与保存液混合，然后加入Ficoll分离液中，离心分离，去上清得到经血单个核细胞，再用间充质干细胞培养基重悬，得到经血源间充质干细胞悬液；
b、向所述经血源间充质干细胞悬液中加入灭活后的患者外周血血浆和头孢哌酮钠舒巴坦钠，得到经血源间充质干细胞培养液，置于温度为35℃-37℃、CO2体积浓度为4％-6％的条件下培养，当细胞融合度达到50％-70％时，进行消化传代，得到P1代细胞；继续传代培养，当细胞融合度达到80％-90％时进行第二次消化传代，得到P2代细胞；继续传代培养至P3代细胞后，吸出除细胞外的培养液，得到贴壁生长的经血源间充质干细胞；
c、向贴壁生长的所述经血源间充质干细胞中加入胰酶进行消化，待所述经血源间充质干细胞变圆后终止消化，离心，去上清，得到所述经血源间充质干细胞。
上述优选的自体经血源间充质干细胞的制备方法制得的自体经血源间充质干细胞不含异种血清成分，可培养的细胞起始量低，细胞培养周期更短，得到的细胞纯度更高，其与上述凝胶制剂的他成分结合应用于子宫内膜修复具有更好的活性，进一步增加子宫内膜修复的速度。同时上述自体经血源间充质干细胞的应用无伦理学限制，可满足临床使用标准。
所用胰酶的品牌为gibco，商品名为CTSTMTrypLETMSelect，货号为A1285901-01。
优选的，步骤a中，所述保存液由生理盐水、头孢哌酮钠舒巴坦钠和两性霉素B组成；所述头孢哌酮钠舒巴坦钠在所述保存液中的浓度为3.8-4.2mg/mL；所述两性霉素B的体积含量为所述保存液体积的1.8％-2.2％。
优选的，步骤a中，所述经血与所述保存液的混合体积为1:0.8-1.2。
优选的，步骤a中，所述Ficoll分离液的密度为1.07-1.08g/mL，所述Ficoll分离液的体积为所述经血体积的1.8-2.2倍。
优选的，步骤a中，所述间充质干细胞培养基的制备方法为：采集健康足月新生儿脐带，剥离羊膜及动静脉血管，撕取脐带华通胶；采用组织块贴壁法对脐带华通胶进行原代细胞培养，当细胞融合度达到30％-50％时，进行消化传代，去除组织块，得到P1代细胞；继续传代培养，当细胞融合度达到80％-90％时，进行第二次消化传代，得到P2代细胞；继续传代培养，当细胞融合度达80％-90％时，收集培养上清液，将收集的上清液与北京京蒙高科干细胞技术有限公司生产的间充质干细胞无血清培养基按1：0.8-1.2的体积比混合，得到所述间充质干细胞培养基。
利用上述优选的间充质干细胞培养基制备所述经血源间充质干细胞，可以进一步提高制得的经血源间充质干细胞的纯度、增值量和细胞贴壁率。增加经血量极少情况下经血源间充质干细胞培养的成功率，满足临床反复中重度***经血量明显偏少(1-2mL)的患者提升自体移植的可能性。
优选的，步骤a中，所述经血源间充质干细胞悬液中的经血源间充质干细胞浓度为(1-3)×106个/mL。
优选的，步骤b中，所述患者外周血血浆的加入量为所述经血源间充质干细胞悬液体积的8％-12％。
优选的，步骤b中，所述头孢哌酮钠舒巴坦钠在所述经血源间充质干细胞培养液中的浓度为0.8mg/mL-1.2mg/mL。
上述浓度的头孢哌酮钠舒巴坦钠的添加在达到抑菌作用的同时对细胞增殖无影响，无统计学差异。
优选的，步骤c中，所述终止消化的方法为，向变圆后的所述经血源间充质干细胞中加入生理盐水。
优选的，所述自体富血小板血浆的制备方法为：
采集患者外周血进行抗凝处理后，离心，使外周血分为上层、中层和下层吸取上层和中层，进行二次离心，弃去上层分离液，向剩余部分加入凝血酶和8wt.％-10wt.％的氯化钙溶液激活后，得到所述自体富血小板血浆；所述自体富血小板血浆中所述氯化钙溶液的体积百分含量为8％-12％，凝血酶的含量为15-25U/mL。
本发明还提供了所述干细胞凝胶制剂的制备方法，包括：用所述自体富血小板血浆重悬所述经血源间充质干细胞，得到细胞混悬液，向所述细胞混悬液中加入几丁糖，混合均匀，制得所述干细胞凝胶制剂。
相对于现有技术，本发明提供的干细胞凝胶制剂的制备方法简单，原料成分易得，无伦理学限制，可短时间内满足临床使用需求。
本发明还提供了所述干细胞凝胶制剂在作为预防和治疗子宫内膜损伤药物中的应用。
本发明还提供了所述干细胞凝胶制剂在作为治疗重度***药物中的应用。
附图说明
图1是本发明实施例1中试验组和对照组中的P0代经血源间充质干细胞的显微图；
图2是本发明实施例1中试验组和对照组中的P3代经血源间充质干细胞的显微图；
图3是本发明实施例1中试验组和对照组HUVECs的增值曲线图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例1
制备干细胞凝胶制剂
1、环境要求
1)经血源间充质干细胞(MenSCs)种子细胞的分离、培养和制剂制备操作在B级洁净室中进行，开放式操作在A级环境内进行(生物安全柜)。
2)制备人员提前对细胞操作间和生物安全柜进行紫外线灭菌，紫外线照射时间为30min，开启B级洁净室中各生物安全柜相关操作单元紫外线灯照射30min，关闭各操作单元紫外线灯后通新风10min，保持各操作单元处于运行状态。
3)所有试剂、耗材、样本等进入实验室内必须进行紫外照射、酒精擦拭消毒等消毒灭菌操作后方能传递进入。
4)制备人员须按照人员更衣标准的SOP规范进行更衣后方能入内。
2、配制间充质干细胞培养基
采集健康足月新生儿脐带，剥离羊膜及动静脉血管，撕取脐带华通胶；采用组织块贴壁法对脐带华通胶进行原代细胞培养，当细胞融合度达到40％时，进行消化传代，去除组织块，得到P1代细胞；继续传代培养，当细胞融合度达到85％时，进行第二次消化传代，得到P2代细胞；继续传代培养，当细胞融合度达85％时，收集培养上清液，将收集的上清液与北京京蒙高科干细胞技术有限公司生产的间充质干细胞无血清培养基按1：0.8-1.2的体积比混合，得到所述间充质干细胞培养基。其中，原代细胞培养和传代培养所用的培养基的配方为：北京京蒙高科干细胞技术有限公司生产的间充质干细胞无血清培养基，其货号为(MSC1201B+MSC1201S)/套。
3、经血源间充质干细胞的制备
1)经血样本处理
取出经血保存液置于室温平衡1h，打开生物安全柜紫外线照射30min，同时将本次实验所需耗材也紫外照射消毒，完成后打开风机和照明***，等待气流平稳，将经血样本传入生物安全柜中，按1：1比例加入配制好的保存液，充分混匀，4℃保存，得到处理样本(48h内处理)。其中，保存液由生理盐水、头孢哌酮钠舒巴坦钠和两性霉素B组成；头孢哌酮钠舒巴坦钠在保存液中的浓度为4mg/mL；两性霉素B的体积含量为保存液体积的2％。
2)患者外周血血浆的制备
对患者本人外周血3500rpm离心处理10min，离心机设置参数为：升9降9，20℃，将分离的血浆转入新的离心管中，封口灭活，56℃灭活30min。灭活后对血浆继续2000rpm离心处理10min，离心机设置参数为：升9降9，20℃，取上清(患者外周血血浆)备用。
3)MenSCs分离
①提前取出实验所需试剂置于室温平衡1h，打开生物安全柜紫外线照射30min，同时将本次实验所需耗材均进行紫外照射消毒，完成后打开风机和照明***，等待气流平稳，将处理过的经血处理样本传入生物安全柜中，转移到新的离心管内。
②按1：2比例将经血处理样本加到密度为1.077的Ficoll分离液上。2000rpm离心处理25min，离心机设置参数为：升9降2，20℃。离心结束后，用吸管吸取中间PBMC层，将吸取的细胞转移到新的离心管中，此时的悬液即为经血单个核细胞。对细胞悬液室温下1500rpm离心处理5min，离心机设置参数为：升9降9，20℃。离心结束后，弃去上清，清洗细胞沉淀，并重复三次。
③清洗完成后，用制得的间充质干细胞培养基重悬细胞沉淀，按体积比添加10％灭活后的患者血浆和头孢哌酮钠舒巴坦钠(1:1)，得到细胞悬液，其中头孢哌酮钠舒巴坦钠的终浓度为1mg/mL。
4、MenSCs培养
①将混匀的细胞悬液加入细胞培养瓶中，在培养瓶上标记相关信息。镜下观察细胞接种密度，然后将培养瓶置于温度为37℃、CO2体积浓度为5％的培养箱中培养。48h后第一次全量换液，更换新的间充质干细胞培养基(此时的细胞为P0代)，并添加头孢哌酮钠舒巴坦钠(1:1)，头孢哌酮钠舒巴坦钠的终浓度为1mg/mL,之后每3d换液一次。在显微镜下观察细胞融合度，当细胞融合度达到60％时，进行消化传代，得到P1代细胞；继续传代培养，当细胞融合度达到85％时进行第二次消化传代，得到P2代细胞；继续传代培养至P3代细胞后，吸出除细胞外的培养液，得到贴壁生长的经血源间充质干细胞。
显微镜记录P0代细胞和P3代细胞的生长情况，并用胎牛血清+DMEM培养基代替其中的间充质干细胞培养基作为对照。P0代细胞的显微图如图1。P3代细胞的显微图如图2所示。通过图1和图2中的细胞生长状态，可以看出试验组得到的接种相同密度后试验组细胞增殖数量明显较高。
对P3代经血源间充质干细胞进行流式鉴定，鉴定结果如表1所示：
表1经血源间充质干细胞流式鉴定结果
注：*P﹤0.05，**P﹤0.01
由表1可以看出，试验组得到的P3代经血源间充质干细胞的表面标记指标显示与对照组相比纯度明显增高，具有非常显著性差异(P﹤0.01)。
对试验组和对照组中得到P3代的经血源间充质干细胞的培养周期进行统计，统计结果如表2所示：
表2培养周期统计结果
注：*P﹤0.05，**P﹤0.01；
由表2可以看出，试验组经血源间充质干细胞在各初始采集血量组下的培养周期均较短，且具有非常显著性差异(P﹤0.01)，在经血采集量极少(1-2mL)的情况下，差异最大。
对试验组和对照组中得到P3代的经血源间充质干细胞的生长增值情况进行统计，统计结果如表3所示：
表3细胞生长增值统计结果
注：*P﹤0.05，**P﹤0.01；
由表3可以看出，在经血量越少的情况下，经血源间充质干细胞增殖数量与对照组相差倍数越大，具有非常显著性差异(P﹤0.01)，在经血量极少(1-2mL)的情况下，当细胞代次达到3代时即可满足临床移植的细胞数量级，经血量采集量在单次中等偏上(＞4ml)的情况下，细胞扩增的数量与对照组相比也具有非常显著性差异(P﹤0.01)。
在体外培养细胞中，细胞接种数与培养基的成分对细胞生长有着重要影响，细胞贴壁数过少可抑制细胞生长，此时细胞内生长物质弥散到细胞外过多，细胞不可再增殖造成培养失败，若培养基pH持续变碱，细胞将变圆不能贴壁直至细胞死亡。不同的培养体系对原代细胞贴壁密度及细胞增殖情况差异显著，对经血源间充质干细胞培养成功率进行统计，统计结果如表4所示：
表4经血源间充质干细胞培养成功率
由表4中的结果显示，经血量越多各组培养成功率越高。在经血量极少(1-2mL)的情况下，试验组成功率与对照组相比具有非常显著性差异(P﹤
0.01)。
可见，本申请中通过添加特定的间充质干细胞培养基既能降低经血源间充质干细胞的起始细胞数量、缩短培养周期，又能获得更多的细胞数量，增加经血量极少情况的培养成功率，为满足临床反复中重度***经血量明显偏少(1-2mL)的患者提升自体移植的可能性。
②在倒置显微镜下观察贴壁生长的经血源间充质干细胞的生长状况，于培养瓶的非细胞培养面加入新的培养基，然后将培养瓶置于温度为37℃、CO2体积浓度为5％的培养箱中培养，依据原代细胞贴壁数量及融合度，以及细胞克隆情况待融合度约60％-80％进行传代培养。
③用移液管吸出培养液，尽量吸取至全部吸完为止，于非细胞培养面加入生理盐水，轻轻震荡洗涤细胞贴壁面，弃去，重复2次。加入胰酶(胰酶的品牌为gibco，商品名为CTSTMTrypLETMSelect，货号为A1285901-01)，并使胰酶均匀浸润细胞贴壁面，37℃孵育2min，待细胞变圆后加入生理盐水终止消化过程，用移液管吹打细胞贴壁面，吸出细胞悬液转至离心管。对细胞悬液室温下1500rpm离心处理5min，离心机设置参数为：升9降9，20℃。离心结束后，弃去上清，得到所述经血源间充质干细胞。
5、自体富血小板血浆的制备
采集患者外周血，抗凝处理后，2500rpm离心处理10min，离心机设置参数为：升9降9，20℃。离心结束后，血液分为3层：上层为贫血小板血浆(poorplateletplasma，PPP)，中层为黄衣层，即为浓缩的血小板，下层为红细胞。用吸管吸取上层、中层以及邻近中层的部分红细胞(此处红细胞占全部红细胞比例不高于25％)转移到新的离心管中，进行第二次离心处理。第二次离心处理的转速为4100rpm、时间为20min，离心机设置参数为：升9降9，20℃。离心结束后离心管中液体分为3层，用吸管弃去上层部分的PPP，保留中下层，去除红细胞沉淀，充分混匀，加入凝血酶和10wt.％的氯化钙溶液激活后，得到自体富血小板血浆；氯化钙溶液在自体富血小板血浆的体积百分含量为10％，凝血酶的含量为20U/mL。
6、干细胞凝胶制剂的配制
将制得的经血源间充质干细胞与自体富血小板血浆和医用几丁糖混合，充分混匀，制成干细胞凝胶制剂，其中经血源间充质干细胞的浓度为1×107个/mL，血小板的浓度为1000×109/L，几丁糖的浓度为0.5wt％。将制得的干细胞凝胶制剂密封封装于医用一次性注射器内。
7、干细胞凝胶制剂对内皮细胞的促生能力检测
宫颈粘连患者的子宫内膜组织呈现血管闭塞，即受损的子宫内膜中血管重建利于子宫内膜的修复。本实验通过检测干细胞凝胶制剂对人脐静脉内皮细胞(HUVECs)的增值影响，来判断其对子宫内膜的修复能力。
①HUVECs的分离和培养：取部分新生儿脐带后及时放入无菌生理盐水，止血钳钳夹一端断端，寻找其中最粗且壁薄的静脉血管，用生理盐水冲洗至无色，注入胰酶消化，收集消化液于完全培养基的离心管，离心，弃上清，用完全培养基重悬沉淀，接种于培养瓶内置于温度为37℃、CO2体积浓度为5％的培养箱中培养，细胞融合度达80％-90％时进行传代用于后续实验。所述完全培养基为DMEM/F12+10％胎牛血清。
②CCK8法检测不同组对HUVECs增殖的影响：将HUVECs细胞悬液计数按每孔5×103个细胞接种于96孔板，用完全培养基进行培养至细胞融合度达90％以上更换为不含血清的DMEM/F12饥饿处理12h，依照实验组别每孔添加200uL干预液体(实验组为干细胞凝胶制剂，对照组1为0.5wt％的几丁糖、对照组2为0.5wt％的几丁糖+经血源间充质干细胞)继续培养24h，更换完全培养基并加入10uL的CCK8孵育2h，用酶标仪在波长490nm下检测各孔吸光度值，每24h测定一次，连续检测6天，分析其增殖能力。
通过上述试验统计的试验组与对照组1和对照组2对HUVECs增殖的影响如表5所示，HUVECs的增殖曲线如图3所示。
表5各组制剂对HUVECs增殖的影响
注：*P﹤0.05，**P﹤0.01。
由表5与附图3中的结果可以看出，几丁糖结合自体PRP和经血源间充质干细胞对HUVECs的增殖具有显著的促进作用。
8、干细胞凝胶制剂通过免疫调节促进子宫内膜组织修复
损伤后的子宫内膜高表达促炎因子INF-γ与IL-2，呈现以Th1细胞为主的炎症反应，而Th2细胞主要呈现抑炎反应，当以Th2细胞为主时，有利于子宫内膜修复，并且有利于维持正常妊娠。
在研究干细胞凝胶制剂临床应用可能的效果与作用时，考虑中重度***患者内膜损伤程度多数较为严重，内膜厚度极薄，为了避免对患者进一步损伤又能得到客观的指标，除了观察内膜厚度外，开创性的选取患者月经血检测免疫细胞因子(流式细胞术法)代替内膜病理活检来反应子宫内膜修复的情况。检测结果如表6所示。
表6子宫内膜细胞增殖和相关因子表达情况
注：*P﹤0.05，**P﹤0.01。
结果显示凝胶制剂在宫腔内停留约4-7天，子宫内膜厚度有不同程度的增加；同时对比治疗前治疗后的月经血免疫细胞Th2/Th1检测结果发现其中6例治疗后有具有显著性差异(P﹤0.05)。
实施例2
制备干细胞凝胶制剂
1、环境要求
1)经血源间充质干细胞(MenSCs)种子细胞的分离、培养和制剂制备操作在B级洁净室中进行，开放式操作在A级环境内进行(生物安全柜)。
2)制备人员提前对细胞操作间和生物安全柜进行紫外线灭菌，紫外线照射时间为30min，开启B级洁净室中各生物安全柜相关操作单元紫外线灯照射30min，关闭各操作单元紫外线灯后通新风10min，保持各操作单元处于运行状态。
3)所有试剂、耗材、样本等进入实验室内必须进行紫外照射、酒精擦拭消毒等消毒灭菌操作后方能传递进入。
4)制备人员须按照人员更衣标准的SOP规范进行更衣后方能入内。
2、配置间充质干细胞培养基
采集健康足月新生儿脐带，剥离羊膜及动静脉血管，撕取脐带华通胶；采用组织块贴壁法对脐带华通胶进行原代细胞培养，当细胞融合度达到50％时，进行消化传代，去除组织块，得到P1代细胞；继续传代培养，当细胞融合度达到90％时，进行第二次消化传代，得到P2代细胞；继续传代培养，当细胞融合度达90％时，收集培养上清液，将收集的上清液与间充质干细胞无血清培养基按1：0.8-1.2的体积比混合，得到所述间充质干细胞培养基。其中，原代细胞培养和传代培养所用的培养基的配方为：北京京蒙高科干细胞技术有限公司生产的间充质干细胞无血清培养基。
3、经血源间充质干细胞的制备
1)经血样本处理
取出经血保存液置于室温平衡1h，打开生物安全柜紫外线照射30min，同时将本次实验所需耗材也紫外照射消毒，完成后打开风机和照明***，等待气流平稳，将经血样本传入生物安全柜中，按1：1.2比例加入配制好的保存液，充分混匀，4℃保存，得到处理样本(48h内处理)。其中，保存液由生理盐水、头孢哌酮钠舒巴坦钠和两性霉素B组成；头孢哌酮钠舒巴坦钠在保存液中的浓度为4.2mg/mL；两性霉素B的体积含量为保存液体积的2.2％。
2)患者外周血血浆的制备
对患者本人外周血3500rpm离心处理10min，离心机设置参数为：升9降9，20℃，将分离的血浆转入新的离心管中，封口灭活，56℃灭活30min。灭活后对血浆继续2000rpm离心处理10min，离心机设置参数为：升9降9，20℃，取上清(患者外周血血浆)备用。
3)MenSCs分离
①提前取出实验所需试剂置于室温平衡1h，打开生物安全柜紫外线照射30min，同时将本次实验所需耗材均进行紫外照射消毒，完成后打开风机和照明***，等待气流平稳，将处理过的经血处理样本传入生物安全柜中，转移到新的离心管内。
②按1：1比例将经血处理样本加到密度为1.077的Ficoll分离液上。2000rpm离心处理25min，离心机设置参数为：升9降2，20℃。离心结束后，用吸管吸取中间PBMC层，将吸取的细胞转移到新的离心管中，此时的悬液即为经血单个核细胞。对细胞悬液室温下1500rpm离心处理5min，离心机设置参数为：升9降9，20℃。离心结束后，弃去上清，清洗细胞沉淀，并重复三次。
③清洗完成后，用制得的间充质干细胞培养基重悬细胞沉淀，按体积比添加10％灭活后的患者血浆和头孢哌酮钠舒巴坦钠(1:1)，得到细胞悬液，其中头孢哌酮钠舒巴坦钠的终浓度为1.2mg/mL。
4、MenSCs培养
①将混匀的细胞悬液加入细胞培养瓶中，在培养瓶上标记相关信息。镜下观察细胞接种密度，然后将培养瓶置于温度为37℃、CO2体积浓度为6％的培养箱中培养。48h后第一次全量换液，更换新的间充质干细胞培养基(此时的细胞为P0代)，并添加头孢哌酮钠舒巴坦钠(1:1)，头孢哌酮钠舒巴坦钠的终浓度为1.2mg/mL,之后每3d换液一次。在显微镜下观察细胞融合度，当细胞融合度达到70％时，进行消化传代，得到P1代细胞；继续传代培养，当细胞融合度达到90％时进行第二次消化传代，得到P2代细胞；继续传代培养至P3代细胞后，吸出除细胞外的培养液，得到贴壁生长的经血源间充质干细胞。
②在倒置显微镜下观察贴壁生长的经血源间充质干细胞的生长状况，于培养瓶的非细胞培养面加入新的培养基，然后将培养瓶置于温度为37℃、CO2体积浓度为6％的培养箱中培养，依据原代细胞贴壁数量及融合度，以及细胞克隆情况待融合度约60％-80％进行传代培养。
③用移液管吸出培养液，尽量吸取至全部吸完为止，于非细胞培养面加入生理盐水，轻轻震荡洗涤细胞贴壁面，弃去，重复2次。加入胰酶，并使胰酶均匀浸润细胞贴壁面，37℃孵育2min，待细胞变圆后加入生理盐水终止消化过程，用移液管吹打细胞贴壁面，吸出细胞悬液转至离心管。对细胞悬液室温下1500rpm离心处理5min，离心机设置参数为：升9降9，20℃。离心结束后，弃去上清，得到所述经血源间充质干细胞。
5、自体富血小板血浆的制备
采集患者外周血，抗凝处理后，2500rpm离心处理10min，离心机设置参数为：升9降9，20℃。离心结束后，血液分为3层：上层为贫血小板血浆(poorplateletplasma，PPP)，中层为黄衣层，即为浓缩的血小板，下层为红细胞。用吸管吸取上层、中层以及邻近中层的部分红细胞(此处红细胞占全部红细胞比例不高于25％)转移到新的离心管中，进行第二次离心处理。第二次离心处理的转速为4100rpm、时间为20min，离心机设置参数为：升9降9，20℃。离心结束后离心管中液体分为3层，用吸管弃去上层部分的PPP，保留中下层，去除红细胞沉淀，充分混匀，加用凝血酶和氯化钙(10:1)激活后，即得到所述自体富血小板血浆。
6、干细胞凝胶制剂的配制
将制得的经血源间充质干细胞与自体富血小板血浆和医用几丁糖混合，充分混匀，制成干细胞凝胶制剂，其中经血源间充质干细胞的浓度为0.8×107个/mL，血小板的浓度为1200×109/L，几丁糖的浓度为0.6wt％。将制得的干细胞凝胶制剂密封封装于医用一次性注射器内。
实施例3
制备干细胞凝胶制剂
1、环境要求
1)经血源间充质干细胞(MenSCs)种子细胞的分离、培养和制剂制备操作在B级洁净室中进行，开放式操作在A级环境内进行(生物安全柜)。
2)制备人员提前对细胞操作间和生物安全柜进行紫外线灭菌，紫外线照射时间为30min，开启B级洁净室中各生物安全柜相关操作单元紫外线灯照射30min，关闭各操作单元紫外线灯后通新风10min，保持各操作单元处于运行状态。
3)所有试剂、耗材、样本等进入实验室内必须进行紫外照射、酒精擦拭消毒等消毒灭菌操作后方能传递进入。
4)制备人员须按照人员更衣标准的SOP规范进行更衣后方能入内。
2、配置间充质干细胞培养基
采集健康足月新生儿脐带，剥离羊膜及动静脉血管，撕取脐带华通胶；采用组织块贴壁法对脐带华通胶进行原代细胞培养，当细胞融合度达到30％时，进行消化传代，去除组织块，得到P1代细胞；继续传代培养，当细胞融合度达到80％时，进行第二次消化传代，得到P2代细胞；继续传代培养，当细胞融合度达80％时，收集培养上清液，将收集的上清液与北京京蒙高科干细胞技术有限公司生产的间充质干细胞无血清培养基按1：0.8-1.2的体积比混合，得到所述间充质干细胞培养基。其中，原代细胞培养和传代培养所用的培养基的配方为：北京京蒙高科干细胞技术有限公司生产的间充质干细胞无血清培养基。
3、经血源间充质干细胞的制备
1)经血样本处理
取出经血保存液置于室温平衡1h，打开生物安全柜紫外线照射30min，同时将本次实验所需耗材也紫外照射消毒，完成后打开风机和照明***，等待气流平稳，将经血样本传入生物安全柜中，按1：0.8比例加入配制好的保存液，充分混匀，4℃保存，得到处理样本(48h内处理)。其中，保存液由生理盐水、头孢哌酮钠舒巴坦钠和两性霉素B组成；头孢哌酮钠舒巴坦钠在保存液中的浓度为3.8mg/mL；两性霉素B的体积含量为保存液体积的1.8％。
2)患者外周血血浆的制备
对患者本人外周血3500rpm离心处理10min，离心机设置参数为：升9降9，20℃，将分离的血浆转入新的离心管中，封口灭活，56℃灭活30min。灭活后对血浆继续2000rpm离心处理10min，离心机设置参数为：升9降9，20℃，取上清(患者外周血血浆)备用。
3)MenSCs分离
①提前取出实验所需试剂置于室温平衡1h，打开生物安全柜紫外线照射30min，同时将本次实验所需耗材均进行紫外照射消毒，完成后打开风机和照明***，等待气流平稳，将处理过的经血处理样本传入生物安全柜中，转移到新的离心管内。
②按1：1.8比例将经血处理样本加到密度为1.077的Ficoll分离液上。2000rpm离心处理25min，离心机设置参数为：升9降2，20℃。离心结束后，用吸管吸取中间PBMC层，将吸取的细胞转移到新的离心管中，此时的悬液即为经血单个核细胞。对细胞悬液室温下1500rpm离心处理5min，离心机设置参数为：升9降9，20℃。离心结束后，弃去上清，清洗细胞沉淀，并重复三次。
③清洗完成后，用制得的间充质干细胞培养基重悬细胞沉淀，按体积比添加8％灭活后的患者外周血血浆和头孢哌酮钠舒巴坦钠(1:1)，得到细胞悬液，其中头孢哌酮钠舒巴坦钠的终浓度为0.8mg/mL。
4、MenSCs培养
①将混匀的细胞悬液加入细胞培养瓶中，在培养瓶上标记相关信息。镜下观察细胞接种密度，然后将培养瓶置于温度为35℃、CO2体积浓度为4％的培养箱中培养。48h后第一次全量换液，更换新的间充质干细胞培养基(此时的细胞为P0代)，并添加头孢哌酮钠舒巴坦钠(1:1)，头孢哌酮钠舒巴坦钠的终浓度为0.8mg/mL,之后每3d换液一次。在显微镜下观察细胞融合度，当细胞融合度达到50％时，进行消化传代，得到P1代细胞；继续传代培养，当细胞融合度达到80％时进行第二次消化传代，得到P2代细胞；继续传代培养至P3代细胞后，吸出除细胞外的培养液，得到贴壁生长的经血源间充质干细胞。
②在倒置显微镜下观察贴壁生长的经血源间充质干细胞的生长状况，于培养瓶的非细胞培养面加入新的培养基，然后将培养瓶置于温度为35℃、CO2体积浓度为4％的培养箱中培养，依据原代细胞贴壁数量及融合度，以及细胞克隆情况待融合度约60％-80％可进行传代培养。
③用移液管吸出培养液，尽量吸取至全部吸完为止，于非细胞培养面加入生理盐水，轻轻震荡洗涤细胞贴壁面，弃去，重复2次。加入胰酶，并使胰酶均匀浸润细胞贴壁面，37℃孵育2min，待细胞变圆后加入生理盐水终止消化过程，用移液管吹打细胞贴壁面，吸出细胞悬液转至离心管。对细胞悬液室温下1500rpm离心处理5min，离心机设置参数为：升9降9，20℃。离心结束后，弃去上清，得到所述经血源间充质干细胞。
5、自体富血小板血浆的制备
采集患者外周血，抗凝处理后，2500rpm离心处理10min，离心机设置参数为：升9降9，20℃。离心结束后，血液分为3层：上层为贫血小板血浆(poorplateletplasma，PPP)，中层为黄衣层，即为浓缩的血小板，下层为红细胞。用吸管吸取上层、中层以及邻近中层的部分红细胞(此处红细胞占全部红细胞比例不高于25％)转移到新的离心管中，进行第二次离心处理。第二次离心处理的转速为4100rpm、时间为20min，离心机设置参数为：升9降9，20℃。离心结束后离心管中液体分为3层，用吸管弃去上层部分的PPP，保留中下层，去除红细胞沉淀，充分混匀，加用凝血酶和氯化钙(10:1)激活后，即得到所述自体富血小板血浆。
6、干细胞凝胶制剂的配制
将制得的经血源间充质干细胞与自体富血小板血浆和医用几丁糖混合，充分混匀，制成干细胞凝胶制剂，其中经血源间充质干细胞的浓度为0.5×107个/mL，血小板的浓度为600×109/L，几丁糖的浓度为0.4wt％。将制得的干细胞凝胶制剂密封封装于医用一次性注射器内。
经检测，实施例2和实施例3制得的干细胞凝胶制剂在促进子宫内膜修复中的作用和效果与实施例1中制得的干细胞凝胶制剂基本相当。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换或改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (6)
1.一种干细胞凝胶制剂的制备方法，其特征在于：包括：用自体富血小板血浆重悬经血源间充质干细胞，得到细胞混悬液；向所述细胞混悬液中加入几丁糖，混合均匀，制得干细胞凝胶制剂；
所述干细胞凝胶制剂包括经血源间充质干细胞、自体富血小板血浆和几丁糖；所述干细胞凝胶制剂中所述几丁糖的浓度为0.4wt%-0.6wt%；
所述经血源间充质干细胞的制备方法包括以下步骤：
a、取经血与保存液混合，然后加入Ficoll分离液中，离心分离，去上清得到经血单个核细胞，再用间充质干细胞培养基重悬，得到细胞悬液；所述保存液由生理盐水、头孢哌酮钠舒巴坦钠和两性霉素B组成；
所述间充质干细胞培养基的制备方法为：采集健康足月新生儿脐带，剥离羊膜及动静脉血管，撕取脐带华通胶；采用组织块贴壁法对脐带华通胶进行原代细胞培养，当细胞融合度达到30%-50%时，进行消化传代，去除组织块，得到P1代细胞；继续传代培养，当细胞融合度达到80%-90%时，进行第二次消化传代，得到P2代细胞；继续传代培养，当细胞融合度达80%-90%时，收集培养上清液，将收集的上清液与间充质干细胞无血清培养基按1：0.8-1.2的体积比混合，得到所述间充质干细胞培养基；
b、向所述细胞悬液中加入灭活后的患者外周血血浆和头孢哌酮钠舒巴坦钠，得到经血源间充质干细胞培养液，置于温度为35℃-37℃、CO2体积浓度为4%-6%的条件下培养，当细胞融合度达到50%-70%时，进行消化传代，得到P1代细胞；继续传代培养，当细胞融合度达到80%-90%时进行第二次消化传代，得到P2代细胞；继续传代培养至P3代细胞后，吸出除细胞外的培养液，得到贴壁生长的经血源间充质干细胞；
c、向贴壁生长的所述经血源间充质干细胞中加入胰酶进行消化，待所述经血源间充质干细胞变圆后终止消化，离心，去上清，得到所述经血源间充质干细胞。
2.如权利要求1所述的干细胞凝胶制剂的制备方法，其特征在于：所述干细胞凝胶制剂中所述经血源间充质干细胞的细胞浓度为（0.5-1）×107个/mL；
和/或所述干细胞凝胶制剂中血小板的浓度为（600-1200）×109/L。
3.如权利要求1所述的干细胞凝胶制剂的制备方法，其特征在于：步骤a中，所述头孢哌酮钠舒巴坦钠在所述保存液中的浓度为3.8-4.2mg/mL；所述两性霉素B的体积含量为所述保存液体积的1.8%-2.2%；
和/或步骤a中，所述经血与所述保存液的混合体积为1:0.8-1.2；
和/或步骤a中，所述Ficoll分离液的密度为1.07-1.08g/mL，所述Ficoll分离液的体积为所述经血体积的1.8-2.2倍；
和/或步骤a中，所述经血源间充质干细胞悬液中的经血源间充质干细胞浓度为（1-3）×106个/mL。
4.如权利要求1所述的干细胞凝胶制剂的制备方法，其特征在于：步骤b中，所述患者外周血血浆的加入量为所述经血源间充质干细胞悬液体积的8%-12%；
和/或步骤b中，所述头孢哌酮钠舒巴坦钠在所述经血源间充质干细胞培养液中的浓度为0.8mg/mL-1.2mg/mL。
5.如权利要求1所述的干细胞凝胶制剂的制备方法，其特征在于：步骤c中，所述终止消化的方法为，向变圆后的所述经血源间充质干细胞中加入生理盐水。
6.如权利要求1所述的干细胞凝胶制剂的制备方法，其特征在于：所述自体富血小板血浆的制备方法为：
采集患者外周血进行抗凝处理后，离心，使外周血分为上层、中层和下层吸取上层和中层，进行二次离心，弃去上层分离液，向剩余部分加入凝血酶和8wt.%-10wt.%的氯化钙溶液激活后，得到所述自体富血小板血浆；所述自体富血小板血浆中所述氯化钙溶液的体积百分含量为8%-12%，凝血酶的含量为15-25U/mL。
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