CN1130401A

CN1130401A - 被调节的细胞程序死亡

Info

Publication number: CN1130401A
Application number: CN 94193251
Authority: CN
Inventors: G·R·克拉特里; S·L·施赖伯; D·M·施潘塞; T·J·万列斯; P·贝肖
Original assignee: Harvard College; Leland Stanford Junior University
Current assignee: Harvard College; Leland Stanford Junior University
Priority date: 1993-07-16
Filing date: 1994-07-18
Publication date: 1996-09-04
Also published as: EP0776359A1; CZ8496A3; EP0776359A4; PL312586A1

Abstract

我们开发了一种调节(可诱导的)细胞内蛋白质二聚或低聚合的通用方法，并公开了使用此方法以可调节地启动基因工程细胞中细胞特异性的细胞程序死亡(程序化的细胞死亡)的方法和材料。

Description

被调节的细胞程序死亡

技术领域

本发明涉及与嵌合蛋白质同二聚或多聚的，较好是非肽的有机分子的低聚合有关的材料、方法及应用。借助对宿主细胞的重组修饰及其在基因治疗中的应用或可诱导基因表达的其他应用，举例说明了本发明的若干方面。

引言

生物学特异性通常是由蛋白质间高度特异性的相互作用而导致的。信号转导即是这一原理的实际例证，借助这一过程细胞外分子影响到细胞内行为。许多途径都是随着细胞外配体与细胞表面受体结合而发生的。在许多情况下，受体二聚合导致蛋白质的转磷酸化及补充，所述蛋白质继续进行信号级联反应。认识到膜受体可经过同二聚作用而被激活是从受体可由交联了两个受体的抗体所激活这一观察结果而得出的。其后，发现许多受体都有这些性质。据信许多受体的细胞外和跨膜区域都通过配体依赖性二聚合或低聚合，将受体的胞浆区带向密切接近处而发挥功能的，而受体的胞浆区则将特定信号传递给细胞的内部对应部分。

其他一些人已研究了配体-受体在不同的***中的相互作用。例如Clark等人(Science(1992)258，123)描述了B细胞抗原受体复合物的胞浆效应物。Durand等人(Mol.Cell.Biol.(1988)8，1715)、Verweij等人(J.Biol.Chem.(1990)265，15788)和Shaw等人(Science(1988)241，202)报导NF-AT指导的转录是严格处于抗原受体控制下的。Emmel等人(Science(1989)246，1617)和Flanagan等人(Nature(1991)352，803)报导了环孢菌素A(cyclosporin A)和FK506对NF-AT-指导的转录的抑制作用。Durand等人(Mol.Cell.Biol.(1988)8，1715)和Mattila等人(EMBO J.(1990)9，4425)描述了NF-AT结合位点。描述ζ链的参考文献包括0rloff，等人Nature(1990)347，189-191；Kinet，等人，Cell(1989)57.351-354；Weissman，等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1988)85，9709-971 3和Lanier，Nature(1989)342，803-805。Byrn等人(Nature(1990)344，667-670)描述了CD4免疫粘附蛋白(immunoadhesin)。Irving等人(Cell(1992)64，891)，以及Letourner和Klausner(Science(1992)255，79)描述了CD8-ζ融合的蛋白质。

描述与启动子区域关联的转录因子和不同的活化作用和DNA结合的转录因子的文章包括：Keegan等人，Nature(1986)231，699；Fields和Song，ibid(1989)340，245：Jones，Cell(1990)61，9；Lewin，Cell(1990)61，1161；Ptashne and Gann，Nature(1990)346，329；Adams and Workman，Cell(1993)72，306。

描述孢囊击靶和融合的文章包括：Sollner等人，(1993)Nature 362，318-324；和Bennett and Scheller(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90，2559-2563。

描述调节的蛋白质降解的文章包括：Hochstrasser等人(1990)Cell 61，697；Scheffher，M.等人(1993)Cell 75，495；Rogers等人(1986)Science 234，364-368。

提供合成技术和FK506及相关化合物的修饰方面的其他信息的公开包括：GB 2 244 991 A；EP 0 455 427 A1；WO91/17754；EP0 465 426 A1；US 5,023,263和WO 92/00278。

涉及Fas抗原、p55 TNF受体(下文的“TNF受体”)和/或细胞程序死亡的描述性公开包括：Itoh等人(1991)Cell 66，233-243；Nagata等人，欧洲专利申请公开号510691(1992)；Suda等人，Cell(1993)，75(6)1169-78；Oehm等人，J.Biological Chem.(1992)267(15)，10709-10715；和Wong and Goeddel，JImmunol(1994)，152(4)，1751-5。

有关基因治疗的方法和材料的讨论见于Watson，Gilman，Witkowski和Zoller，RECOMBINANT DNA，2d edition(WHFreeman&Co，1992)的第28章以及该文文献目录中引用的参考文献，尤其是pp564-565中。

然而，如从本说明书中可以清楚地看出的，前述作者都没有描述或提示本发明。下文中详细公开的我们的发明包括利用蛋白质在活细胞内同二聚合、异二聚合和低聚合的普遍适用的方法及材料。(本文所用术语低聚体、低聚合化和低聚合作用包含二聚体、三聚体和更高级的低聚体及其形成)。嵌合应答蛋白质是作为有特异性受体区的融合蛋白质在细胞内表达的。用与受体区域结合的细胞可穿透性多价配体试剂处理细胞，导致嵌合体的二聚合或低聚合。与其他嵌合受体(如参见Weiss，Cell(1993)73，209)相似，设计嵌合蛋白质以使低聚合作用激发细胞死亡，在某些具体实施方案中，可激发任选的其他继后的变化过程，如细胞内信号通过继后的蛋白质-蛋白质相互作用传播，从而激活特异性亚群的转录因子。可使用受体基因检测法检测转录的开始。由合成配体在细胞内交联嵌合蛋白质对于各种细胞过程的基础研究、工程细胞中可调节地发动细胞死亡和在调节有治疗或农业重要性之蛋白质的合成中具有潜在作用。此外，配体介导的低聚合目前已使调节的基因治疗得以可能实现。在这种情况下，它提供了-种新方法以提高用基因治疗得到的安全性、表达水平及总体效果。

发明的概述

本发明提供了宿主细胞基因工程的材料和方法，以使所述细胞及其后代以可调节的方式对有程序的细胞死亡(细胞程序死亡)敏感。本发明可用作消除在培养基中或体内生长的工程细胞的群体的手段，因此它可为基因治疗中所用的基因工程细胞提供特别的具有自动防止故障特性的机理。

本发明涉及新的嵌合的(或“融合的”)蛋白质、编码它们的DNA构建体，以及能够使嵌合蛋白质低聚合的配体分子。该嵌合蛋白质至少含有一个与下文详述的能在细胞中启动程序死亡的作用区域融合的配体结合(或“受体”)区域。如下文也将述及的，嵌合蛋白质也可含有附加区域。就其各个区域是得自不同的来源，因而并非同时存在于自然界(即是异种的)这个意义上说，嵌合蛋白质是重组的。

本发明提供了编码新的嵌合蛋白质的DNA分子(“构建体”)，它可用于宿主细胞的基因工程。这些构建体就其组成部分，如编码特定区域或表达控制序列的各部分并非在自然界中被发现彼此直接相连这个意义上说，它们是重组体。本发明还提供了产生和使用所述经修饰细胞的方法和组合物。

为了产生经修饰细胞，有人将编码所需嵌合体的DNA引入选定的宿主细胞，这可以通过使用常规的载体(可以商购多种载体)和技术来完成。如有必要，还可通过常规方法从其他细胞中筛选、分离出经修饰细胞并培养之。

用于实施本发明的低聚合化配体能与两个(或多个)受体区域，即含有这种受体区域的两个或多个嵌合蛋白质结合。低聚合化配体可以任一顺序或同时与嵌合体结合，优选Kd值低于大约10^-6，更优选的低于约10^-7，甚至最好的是低于大约10^-8，并且在某些实施方案中Kd值低于约10^-9M。优选的配体不是蛋白质，并且具有小于大约5kDa的分子量。如此低聚合的嵌合蛋白质的受体区域可以是相同或不同的。嵌合蛋白质能够在暴露于配体之后，即嵌合体低聚合后启动其宿主细胞的程序死亡。因此，本发明基因工程细胞的程序死亡发生在细胞暴露于能使嵌合体低聚合化的配体之后。换句话说，本发基因工程细胞含有上述嵌合体蛋白质，并且对能使那些嵌合体低聚合化的配体的存在有反应。这种反应性可通过对细胞死亡的启动来证实。

被编码的嵌合蛋白质可进一步包含能够将嵌合蛋白质导向预期的细胞对应部分的细胞内靶向区域。靶向区域可能是分泌性前导序列、跨膜序列区、膜结合区或指导蛋白质例如与泡囊或与核联系的序列。

嵌合蛋白质的作用区域可选自通过交联激发细胞程序死亡的任何蛋白质或蛋白质区域(优选为人类来源或序列)，包括例如Fas抗原的胞质区域。

正如下文将更详细讨论的，举例来说，本发明多个实施方案中，嵌合蛋白质能够结合FK506型配体、环孢菌素A型配体、四环素或类固醇配体。这种结合导致嵌合蛋白质与其他可以相同或不同的嵌合蛋白质分子的低聚合。

除了编码上述嵌合体(“初级”嵌合体)的构建体以外，细胞还可任选地进一步含有另外的异源DNA构建体用以一个或多个所需基因的可调节性或组成性表达。例如，细胞另外还可含有一个或多个编码任选嵌合体的其他构建体，否则如上所述只含有作用区域，它通过配体诱导的低聚合作用可激发生物过程而不是细胞程序死亡。这种其他的作用区域可选自能够在该嵌合蛋白质低聚合后影响所需生物学结果的多种不同蛋白质的区域。例如，作用区可包含如CD 3 zeta(ζ)亚单位这样的蛋白质区域，该区域在接触配体并继而低聚后，能够发起可检测的细胞内信号；作用区还包含如Gal4这样的DNA结合蛋白质，或如VP16这样的转录激活区。本文提供了许多其他的例子。可检测之细胞内信号的一个例子是在可对低聚合作用反应的转录控制元件(如增强子和/或启动子元件等)的转录控制下，激活基因转录的信号。优选地，可使初级嵌合体低聚合化并导致细胞程序死亡的配体不会导致任选嵌合体蛋白质的低聚合。通常甚至更优选的是可使任选嵌合体低聚合化并影响任选的生物学过程，如经调节的基因转录的配体不会导致初级嵌合体的低聚合或激发细胞程序死亡。不同套的配体在某种意义上来说是正交的。

正如下文将更详细讨论的，在本发明各种实施方案中，嵌合蛋白质能够结合FK506型配体、环孢菌素A型配体、四环素或类固醇配体。这种结合可导致嵌合蛋白质分子与其他可以相同或不同的嵌合蛋白质分子的低聚合。

可任意选择的是，细胞还可以含有另一个重组构建体或这类构建体系列，该构建体包含处于转录控制元件(如启动子/增强子)的转录控制下的靶基因，所说的转录控制元件对由配体介导的任选嵌合蛋白质的低聚合，即细胞暴露于相关配体所激发的信号有反应。就靶基因并非天然处于反应性转录控制元件的转录控制之下而言，这些构建体是重组的。

这种任选的靶基因构建体可含有(a)对上述任选嵌合蛋白质的低聚合起反应的转录控制元件，和(b)来自靶基因的侧翼DNA序列，该序列允许转录控制元件同源重组到与靶基因相关联的宿主细胞中。在另外的实施方案中，构建体含有所需基因和允许靶基因同源重组到所需座位中之靶座位的侧翼DNA序列(参见例如Mansour等人，1988，Nature 336，348-352以及M.Capecchi等人后来的论文)。构建体还可含有反应性转录控制元件，或可由座位提供的反应性元件。靶基因可编码如表面膜蛋白质、分泌性蛋白质、胞质蛋白质或核酶(ribozyme)或反义序列。

本发明的构建体还可含有允许构建体转染到宿主细胞中并选择含有该构建体之转染体的可选择标志。本发明进一步包括DNA载体，它含有各种本文所述的构建体，可用于将此构建体引入进行组织培养的宿主细胞中，也可在活体内将此构建体施用给整个生物体以引进细胞中。在任一种情况下，此构建体可通过附加体引入或用于染色体整合。该载体可以是病毒载体，例如包括腺病毒载体、腺相关病毒载体或反转录病毒载体。

本发明还包括由我们的任何一个DNA构建体编码的嵌合蛋白质，以及含有和/或表达它们的细胞，包括原核和真核细胞，特别是各种类型和谱系的酵母、蠕虫、昆虫、小鼠或其他啮齿动物、以及包括人细胞在内的其他哺乳动物细胞，其可以是冷冻的或呈活体生长的，或培养中的或含有它们的整体生物。

概括地说，本发明提供了含有编码初级嵌合蛋白质的第一个DNA构建体的细胞，优选但并非一定是哺乳动物细胞，其中所说的嵌合蛋白质包含(i)至少一个能够与本发明选择的低聚合化配体结合的受体区域以及(ii)另一个蛋白质区域，它与有关的受体区域异源，但与一个或多个其他类似区域低聚合后能够激发细胞的程序死亡。将细胞暴露于选定的配体之后，即可发生程序化的细胞死亡。

在一些实施方案中，刚刚描述过的细胞也可含有编码一个或多个嵌合蛋白质的一个或多个任选的DNA构建体，其中所说的嵌合蛋白质包含(i)至少一个能够与本发明选择的低聚合化配体结合的受体区域以及(jj)另一个蛋白质区域，它与有关的受体区域异源，但与这些任选的嵌合体低聚合后能够激发(直接或间接)靶基因在对所说的低聚合起反应之转录控制元件的转录控制下的转录过程活化。这些细胞通常也可含有处在对所说的低聚合配体起反应的转录控制元件之表达控制下的靶基因。在暴露于选择的配体之后，靶基因得以表达。另外，能够使初级嵌合体低聚合化的配体和能够使任选的嵌合体低聚合化的配体应能正交。

在其他实施方案中，本发明的细胞也可含有编码第一任选嵌合蛋白质的DNA构建体，其中所说的嵌合蛋白质包含DNA结合区和至少一个能与第一个选择的配体部分结合的受体区域。所述细胞进一步包括含有转录激活区域及至少一个能与第二个选择的配体部分(其可以与第一个选择的配体部分相同或不同)结合的受体区域的第二任选嵌合蛋白质。所述细胞另外还含有编码处于异源转录控制序列的转录控制下的靶基因的DNA构建体，靶基因具有相关的结合位点以结合到DNA结合区域并对转录激活区发生反应，从而在细胞暴露于含有选择之配体部分的低聚合化配体之后即可表达靶基因。

用于实施本发明各方面的DNA组合物包括那些编码任选嵌合体的DNA组合物，那些组合物含有编码嵌合蛋白质之第一DNA构建体和编码靶基因之第二DNA构建体，其中所说的嵌合蛋白质包含至少一个能与选择的配体结合的受体区，该受体区则融合于能够在暴露于低聚配体后，即嵌合蛋白质低聚合后发起生物学过程的异源附加蛋白质区；且其中所说的靶基因处于对低聚配体起反应的转录控制元件的转录控制下。

用于实施本发明各方面的另一类型的DNA组合物包含编码第一和第二个嵌合蛋白质的第一系列DNA构建体，以及编码靶基因的第二DNA构建体，所说的靶基因处在对嵌合蛋白质分子低聚合起反应的转录控制元件的转录控制下。编码第一个嵌合蛋白质的DNA构建体包含(a)至少一个能与选择的第一配体部分结合的第一受体区域，以及与受体区域融合的(b)能够在接触低聚合配体，即第一嵌合蛋白质低聚成第二嵌合蛋白质分子后起动生物学过程的异源附加蛋白质区域。编码第二个嵌合蛋白质的DNA构建体包含(i)至少一个能够与选择的第二配体部分结合的受体区域，以及与该区域融合的(ii)能够在接触低聚配体后，即与第一个嵌合蛋白质低聚合后起动生物学过程的异源附加蛋白质区域。在这些情况下，第一和第二受体部分可以是相同或不同的，并且第一和第二选择配体部分也同样可以是相同或不同的。

我们的配体是能够与本发明的两个或多个嵌合蛋白质分子结合，以形成其低聚体的分子，并有下列通式：

接头-[rbm1，rbm2，…rbm n]其中n是2至大约5的整数，rbm(1)-rbm(n)是可以相同或不同的并能与嵌合蛋白质结合的受体结合部分。rbm部分共价连接到接头部分上，所说的接头部分是能够与两个或多个rbm部分共价结合(“-”)的双或多功能分子。优选的配体分子量小于大约5kDa，并且不是蛋白质。这样的配体的例子包括其中rbm部分相同或不同者，而且包含FK506-型部分，环孢菌素型部分、类固醇或四环素。环孢菌素型部分包括环孢菌素及能够与亲环素(cyclophilin)结合的，天然或经修饰的，较好有低于大约10^-6M之Kd值的其衍生物。在某些实施方案中，配体较好以大于约10^-6M，更好以大于约10^-5M的Kd值结合到天然存在的受体上。本发明的说明性配体是其中至少-个rbm包含FK506、FK520、雷帕霉素或其在C9、C10或两位置上经修饰之衍生物的分子者，这些配体以比其天然存在之受体蛋白质结合的Kd值小至少1个，较好2、更好3个，甚至最好4或5个或更大数量级的Kd值，与经过修饰的受体或含有经过修饰之受体区域的嵌合分子结合。接头部分也在下面详细描述，但作为说明其可包括如C2-C20亚烷基、C4-C18氮杂亚烷基、C6-C24N-亚烷基氮杂亚烷基，C6-C18亚芳基，C8-C24芳基二亚烷基或C8-C36双羧酰氨基亚烷基部分。

本发明的单体rbm，以及含有单一rbm拷贝的化合物是低聚合拮抗剂，其能够与我们的嵌合蛋白质结合但不影响其二聚合或更高级的聚合或低聚合(从个别rbm的单体性质来看)。

在本发明的一个重要的方面，本发明的基因工程细胞可以与其他细胞一起培养，通过加入有效量的相应于(即可结合于)初级嵌合蛋白质的低聚合配体可从细胞混合物中有选择地清除出此基因工程细胞。因此，将此细胞与低聚合配体接触可激发工程细胞的细胞死亡。例如，可允许这种细胞在需要的期间内产生内源或异源产物，然后通过加入配体使之缺失。在这种情况下，细胞被工程化以产生根据本发明的初级嵌合体。可按常规方法在培养物中培养将进一步被工程化以在配体诱导的调节下表达所需基因的细胞。在那种情况下，向培养基中加入任选嵌合体的配体可导致所需基因的表达和所需蛋白质的产生。如下文详细描述的，然后向培养基中加入低聚合拮抗剂即可关闭基因的表达和蛋白质的产生。在其他情况下，蛋白质的产生是组成型的。无论怎样，在这些工程细胞已完成其所要完成的使用目的(如产生所需蛋白质或其他产物)之后，可通过向培养基中加入有效量的适当低聚合化配体以导致初级嵌合体的低聚合并诱导工程细胞的程序死亡，从而从细胞培养物中清除这些工程细胞。本发明的工程化改造的细胞也可以在体内用于修饰整体生物，例如包括人在内的动物，以使含有这些细胞的动物体内由这些细胞产生所需蛋白质或其他效果。这类应用包括进行基因治疗。另外，可以在细胞外使用嵌合蛋白质和低聚分子，以将协同发挥启动生理学作用的蛋白质带到一起。

因此本发明提供了在对加入低聚合配体反应中，有选择地清除细胞的材料和方法。该方法包括提供按照本发明进行工程改造的细胞，并使细胞与配体接触。

因此，本发明提供了使用如本文所述的工程化细胞通过可调节地激活细胞中靶基因的转录从而产生异源蛋白质，并在需要时清除工程细胞的方法。该方法包括可提供本发明的细胞，它可表达初级嵌合蛋白质，此蛋白质在低聚合后可启动细胞程序死亡，该细胞进一步包含并能表达(a)至少一个可编码嵌合蛋白质的DNA构建体，此蛋白质在低聚合后可激活(b)靶基因的转录。嵌合蛋白质包含至少一个能够与选择的低聚合配体结合的受体区域。该受体区域融合到一个在暴露于低聚配体之后，即与一个或多个含有另一作用区域之拷贝的其他嵌合蛋白质低聚合后，能够启动细胞内信号的作用区域上。此信号能够激活基因的转录，例如在这种情况下可激活处于对此信号起反应之转录控制元件的转录控制下之靶基因的转录。因此该方法包括使细胞暴露子能够与导致靶基因表达的有效量嵌合蛋白质结合的低聚合配体。在细胞生长于培养基中的情况下，向培养基中加入配体即可使细胞暴露于配体。在细胞存在于宿主生物体内的情况下，则将配体投药于宿主生物体，即可实现细胞与配体的接触。例如，在宿主生物体是动物，特别是哺乳动物(包括人)的情况下，可将配体在其适当的载体中，经口服、口内(bucal)、舌下、经皮、皮下、肌肉内、静脉内、关节内或吸入等途径对宿主动物给药。为了清除工程细胞，可根据具体情况在培养基中加入或给宿主生物体、施用能够使初级嵌合体低聚合化的第二低聚合化配体。

本发明进一步包括药用组合物，用于从包括动物组织或含有这种工程细胞的个体在内的不同细胞混合物中清除本发明的基因工程细胞。这种药用组合物含有与可药用的载体及任选的一种或多种可药用的赋形剂相混合的本发明低聚合配体。如在本文其它部分所详述的，低聚合配体可以是同低聚合试剂或异低聚合试剂，只要它能与本发明的初级嵌合蛋白质结合或能激发本发明工程细胞的程序死亡。同样，本发明还包括一种药用组合物，它含有与可药用的载体并可选择地与一种或多种可药用的赋形剂相混合的本发明低聚合拮抗剂，用于完全或部分地防止或降低细胞培养物或个体内本发明工程细胞中嵌合蛋白质的低聚合水平，因此可防止或消除相关细胞中的细胞死亡。因此使用低聚合试剂和低聚合拮抗剂制备的药用组合物包括在本发明的范围内。

本发明还贡献一种提供对本发明的低聚合配体有反应的宿主生物体，优选是动物，在许多情况下是哺乳动物的方法。该方法包括引入已按本发明进行离体(ex vivo)工程化改造的，即含有编码前述之嵌合蛋白质之DNA构建体的生物体细胞。另外，亦可在允许体内转染一个或多个宿主哺乳动物细胞的条件下将本发明的DNA构建体导入宿主生物体，如哺乳动物体内。

我们进一步提供了产生对配体调节的细胞程序死亡敏感之细胞的试剂盒。一种试剂盒包含至少一个编码我们的初级嵌合蛋白质之一的DNA构建体，所说的嵌合蛋白质则含有至少一个受体区域和作用区域(例如Fas或TNF受体的胞质区，如前所述)。在一个实施方案中，DNA构建体含有常规的多接头以给实践者提供掺入细胞型特异性表达控制元件(启动子和/或增强子元件)的位点，从而提供一个或多个嵌合体的细胞型或组织特异性表达。该试剂盒可含有一定量能够使由试剂盒中的DNA构建体编码的嵌合蛋白质分子低聚合的本发明的配体，另外并可含有一定量的低聚合拮抗剂，如单体配体试剂。在由构建体编码单一嵌合蛋白质时，低聚配体是同低聚合配体。如编码一个以上这样的嵌合蛋白质，则可包括异低聚合配体。该试剂盒可进一步包含另外的DNA构建体，该构建体编码任选的嵌合体和/或靶基因构建体和/或对嵌合蛋白质分子的低聚合起反应的转录控制元件。DNA构建体较好是与一个或多个便于选择转染体的选择标志，以及用于在原核细胞中复制、在真核细胞中表达等的其他常规载体元件相联系的。对于每个不同的DNA构建体来说选择标志可以是相同或不同的，从而便于选择含有这种DNA构建体的多种联合的细胞。

例如，本发明的一种试剂盒含有编码如本文其它部分所述的初级嵌合蛋白质的DNA构建体，编码嵌合蛋白质的第一任选的DNA构建体，其中嵌合蛋白质包含至少一个融合到转录激活物区域上的受体区域(能够与选择的配体结合)；编码嵌合蛋白质的第二任选的DNA构建体，其中嵌合蛋白质至少含有一个融合到DNA结合区域上的受体区域(能够与选择的配体结合)；以及编码靶基因的靶基因DNA构建体，其中靶基因处于含有一DNA序列的转录控制元件的控制下，所说的DNA序列上结合了DNA结合区并且它是在第一和第二个任选的嵌合蛋白质存在下经暴露于配体而被转录激活的。

另外，用于导入处于反应性转录控制元件控制下之靶基因的DNA构建体可含有一代替靶基因的克隆位点，以为工程化细胞提供可诱导地表达由实际工作者将提供的基因提供适用试剂盒。

本发明的其他试剂盒可包含一个或两个(或多个)表达嵌合蛋白质的DNA构建体，其中一个或多个构建体含有克隆位点代替作用区域(转录起始信号发生元件、转录激活因子、DNA结合蛋白质等)，以允许使用者***她/他所希望的某一个作用区域。这样的试剂盒亦可任选包含上述的其他元件，如表达处于反应性表达控制下之靶基因的DNA构建体、低聚合配体、拮抗剂等。

任何试剂盒还都可含有用本发明的构建体稳定地转化的阳性对照细胞，以使它们在对细胞与配体接触发生反应中表达报导基因(编码CAT、β-半乳糖苷酶或任何可方便地检测的基因产物)。还可提供检测和/或定量报导基因表达产物的试剂。

附图的简要描述

图1是质粒pSXNeo/IL2(IL2-SX)的示意图。NF-AT-SX中，来自含IL2增强子/启动子之IL2-SX的HindIII-ClaI DNA片段，被赋予基本转录的最小IL-2启动子和含有3个串联NFAT结合位点的可诱导元件所取代(详见下述)。

图2是制备细胞内信号传输嵌合体质粒p#MXFn和p#MFnZ的流程图，其中n是指示结合区域的数目。

图3A和3B是制备细胞外信号传输嵌合体质粒p#1FK3/pBJ5的流程图。

图4A、4B和4C是构建主题发明所用质粒中使用的引物的序列。

图5是具有不同增强子群的报导构建体对受体TAC/CD3ζ与配体反应的反应曲线。

图6是各种配体与实施例1中所述TAg Jurkat细胞的活性的曲线图。

图7是配体FK1012A(8，图9B)与细胞外受体1FK3(FKBPx3/CD3ζ)之活性的曲线图。

图8是通过肉豆蔻酰化的CD3ζ/FKBP12嵌合体经信号传递激活NFAT报导基因的曲线图。

图9A和9B分别是烯丙基连接的FK506变异体和环己基连接的FK506变异体的化学结构。

图10是合成FK520的衍生物的流程图。

图11A和B是合成FK520衍生物的流程图，和FK520的化学结构，其设计底部结构以接到突变体FKBP12上。

图12是图解说明在假定的沟中的有经修饰之FK520的突变体FKBP。

图13是合成FK520和环孢菌素之异二聚体的流程图。

图14是图解显示嵌合蛋白质的低聚合，举例的嵌合蛋白质含有亲免素部分作为受体区。

图15说明配体介导的嵌合蛋白质的低聚合，图解显示对转录起始信号的激发。

图16描绘基于FK-506型部分的MED和HOD试剂的合成流程。

图17描绘以CsA开始的(CsA)2的合成。

图18是融合cDNA构建体和蛋白质MZF 3E的概观。

图19显示FK1012诱导的，用肉豆蔻酰化Fas-FKBP 12融合蛋白质(MF3E)转染之Jurkat T细胞系的细胞死亡，根据降低的细胞的转录活性指示结果。

图20A是在瞬间转染试验中对亲环素-Fas(和Fas-亲环素)融合构建体的分析。在该系列中显示MC3FE是最有效的。

图20B描绘亲免素-Fas抗原嵌合体，和在用大的T抗原稳定转化的Jurkat T细胞中瞬间表达实验的结果。Myr：取自编码残基1-14之pp60^c-grc的肉豆蔻酰化序列(Wilson等人，Mol.εCellBiol.94(1989)：1536-44)：FKBP：人FKBP12；CypC：编码残基6-212的鼠亲环素C序列；(Freidman等人，Cell 664(1991)：799-806)；Fas：编码残基179-319之人Fas抗原的细胞内区域(Oehm等人，J.Biol.Chem.267.15(1992)：10709-15)。细胞用编码分泌的碱性磷酸酶报导基因(该报导基因处于3个串联AP1启动子控制下)的质粒连同6倍摩尔过量的亲免素融合构建体经电穿孔而转染。24小时后用PMA(50ng/ml)(借以刺激报导基因的合成)和(CsA)2刺激细胞。在第48小时，检测细胞的报导基因活性。在24小时用抗HA表位抗体进行Western印迹试验。

图21描绘经修饰的FK506型化合物的合成。

本发明的描述I.一般性讨论

本发明提供了嵌合蛋白质，用于低聚合嵌合蛋白质的有机分子及使用它们的***。融合的蛋白质(嵌合体)有一个用于与(较好是小的)有机低聚合分子结合的结合区域和一个作用区域，作为嵌合蛋白质低聚合的结果其可导致某生理学作用或细胞过程。

图14中图解说明了可诱导的蛋白质联系的基本概念。可发挥异二聚合(或异低聚合，“HED”)剂和同二聚合(或同低聚合，“HOD”)剂作用的配体是哑铃形结构给出的。

(同二聚和同低聚是指相似部分结合，例如它们借助本发明的配体相连接而形成二聚体或低聚体。异二聚和异低聚是指不相似的组分结合形成二聚体或低聚体。因此同低聚体包含特定成分的多个拷贝的结合，而异低聚体包含不同成分之拷贝的结合。本文所使用的术语“低聚合作用”、“低聚合化”和“低聚体”，如无明显的相矛盾的指示，不管有无字首，都意欲包括“二聚合作用”、“二聚合化”和“二聚体”。

图14中描绘的是含有有用靶蛋白质区域(“作用区域”)和一个或多个可与配体结合之受体区域的融合蛋白质分子。对于细胞内嵌合蛋白质，即定位于产生它们的细胞之内的蛋白质，较好还存在一细胞击靶序列(包括细胞器击靶氨基酸序列)。配体与受体区域的结合导致融合蛋白质的异或同二聚合。低聚作用使得作用区域彼此密切靠近，从而激发正常情况下与各个作用区域相关联的细胞过程-例如细胞程序死亡或TCR介导的信号转导。

可由低聚作用激发的细胞过程包括状态的改变，例如构象改变、结合对象改变、细胞死亡、起始转录、通道开放、离子(如Ca⁺²等)释放等物理状态的改变，或者例如酶解催化的化学反应，如酰化、甲基化、水解、磷酸化或去磷酸化、氧化还原状态改变、重排等化学状态的改变。因此，任何这类可由配体介导的低聚合作用激发的过程均包括在本发明范围内，尽管本文最初的焦点是细胞程序死亡。

在本发明的主要特征中，细胞经修饰以便能与配体分子反应，该配体分子能与本文公开的初级嵌合体结合。因此能使嵌合体低聚合化。例见以下实施例4(B)和4(C)。这种工程细胞通过进行细胞程序死亡而对配体的存在发生反应，因此在必需或需要清除经遗传修饰的细胞的基因治疗和其他场合的应用中可以清除这种工程细胞。例如，经修饰的细胞可以变成癌性或者要不然变成有害的或多余的细胞。

经修饰的细胞的特征在于其基因组含有基因构建体(或其系列)，此构建体编码可允许配体调节的细胞程序死亡的本发明初级嵌合蛋白质，此初级嵌合体含有例如Fas抗原或Apo-1抗原的胞质区域，当其交叉连接时可诱导大多数细胞类型的细胞程序死亡(Trauth等人，(1989)Science 245，301-305：Watanaba-Fukunaga等人，(1992)Nature 356，314)。通过这种方式可为工程细胞的群体提供配体诱导的细胞死亡。

可将细胞进一步工程化改造以产生能与选定的配体分子结合并反应的任选的其他嵌合蛋白质。这种进一步任选的工程改造给予细胞额外的配体调节的功能，此功能可用于包括体外细胞培养的应用及基因治疗的应用。优选地，能与任选的其他嵌合体结合并能调节任选的其他细胞过程(如基因转录)的配体分子不能与初级嵌合体分子交叉反应，因此它不能激发工程细胞的程序死亡。

这种进一步经修饰的细胞可用于需要调节如靶基因的转录或翻译(两者统称为表达)的细胞过程调节的应用中。这种细胞的特征在于其基因组至少含有第一或第一系列(该系列可能只包括一个构建体)基因构建体，此基因构建体编码任选的其他嵌合体，并可望包括第二或第二系列(该系列可以只包括一个构建体)靶基因构建体。

所述基因构建体的性质和数目将取决于嵌合蛋白质的性质及其在细胞中所起的作用。例如，在一些实施方案中任选的其他嵌合蛋白质是将与靶基因(其可含有指导嵌合蛋白质将与细胞表面膜或与核或泡囊等细胞器相联系的细胞内击靶序列或区域)的表达相联系的，这样正常情况下将至少有两个系列的这种其他构建体：编码嵌合蛋白质的第一系列，该蛋白质在配体介导低聚合后起动信号指导靶基因表达，以及更理想的是还有第二个包括靶基因和/或其表达控制元件(该元件对信号有应答)的系列。

在包括同低聚体通常是同二聚体时，第一系列中将只需要单一的构建体，而当包括异低聚体时，则可能涉及两个或多个且通常不多于三个构建体。由第一系列构建体编码的嵌合蛋白质将与基因转录的启动相关并且通常将被指引向表面膜或核，在那里低聚合的嵌合蛋白质能够直接或间接地启动一个或多个靶基因的转录。在导入外源基因，或者为表达内源基因而导入外源或重组表达控制序列时(例如通过同源重组)，将需要第二系列的附加构建体，每种情况下其转录均将因嵌合蛋白质的低聚合而激活。

在嵌合蛋白质是在细胞内的并且能直接起作用而没有引发另一个基因的转录的情况下，则利用不同的第一系列其他构建体。例如，能够可诱导地或构成上地表达与胞吐作用相关的蛋白质，此时蛋白质除非在低聚分子存在下，一般将不发生复合。通过利用具有任何或所有下列这些性质的蛋白质，即在宿主细胞中不复合；经与其他蛋白质复合而受到抑制，且其抑制作用可因与配体低聚而得到克服；需要通过一个宿主细胞中不可得到的过程来激活；或者通过修饰指导泡囊与胞浆膜融合的蛋白质以形成嵌合蛋白质，此时复合物形成和膜融合的程度因有低聚分子的存在而提高，胞吐作用具有将被低聚分子诱导的能力。

可以同样地修饰和使用其他细胞内蛋白质，如激酶、磷酸酶及细胞周期控制蛋白质。

对本发明实际可用的各类任选的其他基因构建体描述如下：

(1)编码包括结合区和作用区之嵌合蛋白质的构建体，其中结合区是细胞外或细胞内的，作用区是细胞内的，这样配体介导的嵌合蛋白质的低聚合作用，包括其自身的低聚合(形成同低聚体)或与包含不同作用区之不同融合蛋白质的低聚合(形成异低聚体)，即可诱导产生导致一系列过程的信号，进而激活一个或多个基因的转录；

(2)编码包括有结合区和作用区之嵌合蛋白质的构建体，其中结合区和作用区在同一核内，这样配体介导的蛋白质的低聚合，包括其自身的低聚合(形成同低聚物)或与包括不同作用区之不同的融合蛋白质的低聚合(形成异低聚物)，即可诱导直接通过低聚物与DNA转录起始区的复合而发动转录过程：

(3)编码包括结合区和作用区之嵌合蛋白质的构建体，其中结合区和作用区是胞质内的，这样配体介导的蛋白质低聚合作用，包括其自身的低聚合(形成同低聚体)或与包含有不同作用区之不同的融合蛋白质的低聚合(形成异低聚体)，即可导致胞吐作用；和

(4)编码包括结合区和作用区之嵌合蛋白质的构建体，其中结合区和作用区是细胞外的，而且作用区与发动生物学活性相关联(作为非限制性举例说明，作用区可以自身与一种物质，即受体或其他膜蛋白质结合，在经过配体介导的嵌合体低聚合之后，桥接一种或多种相似或不相似的分子或细胞)；以及

(5)编码去稳定化的、失活的或短寿命的具有结合区和作用区之嵌合蛋白质的构建体，这样一来配体介导的蛋白质与含有不同作用区之靶蛋白质的低聚合便导致所说低聚合的靶蛋白质的去稳定和/或降解或失活。

II.转录调节

上述(1)和(2)类构建体被看作是第一系列。(1)类构建体在其作用上不同于(2)类构建体。(1)类构建体是稍有多效性的，即能够激活许多野生型基因，以及靶基因。另外，(1)类基因的表达产物对配体的反应相对较慢。(2)类构建体可被导向特异性靶基因并能够限制将被转录之基因的数目。(2)类构建体的表达产物对配体的反应十分迅速。

(1)和(2)类的主题***将包括第一系列含有编码嵌合蛋白质的DNA序列的构建体，通常包括一至三个，一般是一至两个不同的构建体。该***通常还包括第二系列将便于一个或多个基因，常常是外源基因表达的构建体。“外源基因”是指不同于正常情况下的由细胞表达的基因，原因例如可以是由于细胞的性质、细胞的遗传缺陷、基因来源于不同的种或者是突变的或合成的基因等情况。这样的基因可能编码蛋白质、反义分子、核酶等，或者可以是包含一表达控制序列的DNA序列，所说的表达控制序列被连接或将要连接到一个正常情况下表达控制序列并不与之联系的外源基因上。因此，如上所述，该构建体可含适于配体诱导的外源基因表达的外源或重组表达控制序列。

常常优选的是，由(1)、(2)和(3)类构建体编码的嵌合蛋白质可以有一个细胞内击靶区，其包含将嵌合蛋白质指向所需之区如表面膜、核、泡囊膜或其他部位的序列，在这些部位由配体介导的嵌合蛋白质的低聚合作用，至少是二聚合发动所需的生理学活性。

嵌合蛋白质含有能够与至少一个配体分子结合的第二(“结合”或“受体”)区域。由于配体可含有一个以上的结合位点或表位，所以其可与本发明的嵌合蛋白质形成二聚体或更高级的同或异低聚体。嵌合蛋白质的结合区可具有一个或多个结合位点，从而可与二价配体形成同低聚体。因为有两个或多个能结合第二区域的表位，故配体可以以这种方式低聚嵌合蛋白质，从而为嵌合蛋白质的更高级低聚合作好准备。

嵌合蛋白质还含有能够在通过结合区实现配体介导的嵌合蛋白质分子的低聚合后发动生物学活性的第三(“作用”)区域。因此，作用区可以作为配体介质的低聚合的结果，与信号的转导相关联。所述信号，例如可依据于参与信号转导的特定中间成分，导致一个或多个基因转录的开始。图15描绘了一个有代表性的嵌合蛋白质，其中细胞内击靶区包含肉豆蔻酸酯部；受体区包含三个FKBP12部分；且作用区包含一个ζ亚单位。在其它嵌合蛋白质中，作用区可含有转录因子，其在低聚合后导致一个或多个靶基因(内源和/或外源的)的转录开始。作用区可包含与泡囊膜同表面或其他膜的融合相关的蛋白质或其部分，如SNAP和SNARE组群的蛋白质(参见Sollner等人，Nature(1993)362，318 and 353：Cell(1993)72，43)。

A.表面膜受体

本发明的一类其他任选的嵌合蛋白质是与表面膜相关的并且是能够转导引起一个或多个基因转录的信号。该过程涉及许多在最终实现转录因子与靶基因相关启动子区域结合的一系列相互作用中的辅助蛋白质。在转录因子结合到与其他基因相关的启动子区域上的情况下，此处也发起转录。编码本实施方案之嵌合蛋白质的构建体，可以编码能受到加工并因而可能不存在于成熟嵌合蛋白质中的信号。嵌合蛋白质在任何过程中都将包括(a)能够结合预定配体的结合区域，(b)任选的(但在许多实例中又是优选的)膜结合区，其包括为使融合的蛋白质向细胞表面/膜上转移，和维持结合到细胞表面膜上的蛋白质所需的跨膜区或结合脂质，以及(c)作为作用区的胞质信号起始区。胞质信号起始区能够发动导致基因转录的信号，所述基因在转录起始区中有识别起始之信号的序列。

本文中所说的其表达受来自嵌合蛋白质之信号调节的基因是指“靶”基因，包括处于内源或外源(或杂种)表达控制序列的表达控制下的外源基因或内源基因。促使与膜结合之嵌合蛋白质的分子部分也称为“保留区域”。适当的保留区包括直接与膜的脂质层结合的部分，如通过脂质参与膜中或通过膜延伸等。如图15中所示，在这些情况下蛋白质逐渐向膜特别是细胞膜转移并与之结合。

B.核转录因子

另一个任选的第一构建体编码含有细胞击靶序列的嵌合蛋白质，所说的序列适于使蛋白质向核转位的需要。该(“信号共有序列”)序列具有多个碱性氨基酸，称为由两部分组成的碱性重复序列(参见Garcia-Bustos et al.，Biochimica et Biophysica Acta(1991)1071，83-101)。该序列可以出现在分子内部或接近于N或C末端的侨何部分，并可致使嵌合蛋白质成为核内的。本发明一个实施方案的实践将涉及至少两种(“第一系列”)嵌合蛋白质：(1)一种具有与靶基因相关转录起始区的DNA结合的作用区域，以及(2)含有作为作用区的转录激活区域的另一种不同的嵌合蛋白质，其能够与第一个嵌合蛋白质的DNA结合区联合，发动靶基因的转录。两个作用区域或转录因子可衍生于相同或不同的蛋白质分子。

对于细胞宿主来说，转录因子可以是内源的或外源。如果转录因子是外源的，但在宿主内发挥功能并且可以与内源性RNA聚合酶(而不是需要可导入基因的外源性RNA聚合酶)协同作用，一起提供随融合的转录因子发挥功能的外源性启动子元件则配有用于调节靶基因转录的第二个构建体。借助这一手段，可使转录的起始限制到与外源启动子区域相联系的基因，即靶基因。

已知大多数转录因子为发挥活性需要有两个亚单位。另外，在单一转录因子可以分成两个独立的功能区域(如转录激活区和DNA结合区)的情况下，构个区域可各自失活，但是当使它们在一起密切接近时，则又恢复了转录活性。可以使用的转录因子包括由Fields和Song(文献同上)描述的可分成两个区域的酵母GAL4。作者使用了GAL4(1-147)-SNF1和SNF4-GAL4(768-881)的融合体，其中SNF1和-4可以被主题结合蛋白质(作为结合区)所取代。可利用GAL4和VP16或HNF-1的结合体。其他转录因子是Jun、Fos和ATF/CREB家族的成员，Oct1、Sp1、HNF-3、类固醇受体总家庭等的成员。

作为不同于的联合使用DNA结合区和天然存在之激活区或其修饰形式的可代用方式，可以用与转录激活区和RNA聚合酶(包括但不只限于RNA聚合酶II)间的桥接有关的结合蛋白质之一取代激活区。这些蛋白质包括称为TAF′s的蛋白质、TFII蛋白质，特别是B和D等。因此，可使用任何一种蛋白质或组合，例如融合蛋白质或其结合部分，用于桥接DNA结合蛋白质和RNA聚合酶并用于发动转录。在与DNA结合区接合以发动转录中，较好使用最接近RNA聚合酶的蛋白质。如果需要，主题构建体可为将三个或更多个，通常不超过约4个，蛋白质带到一起作好准备，以提供转录起始复合物。

可使用失活化区，如ssn-6/TUP-1或Krüppel家族阻遏区，而不是有作为作用区的转录激活区。以这种方式，调节导致构成型表达基因转录的关闭。例如，在基因治疗情况下，可以提供构成型表达的一种激素(如生长激素)、血液蛋白质、免疫球蛋白等。利用编码一种含有与配体结合区连接之DNA结合区的嵌合蛋白质，和另一种含有与配体结合区连接之失活化区的嵌合蛋白质的构建体，即可通过配体介导的低聚合作用抑制基因的表达。

设计编码特别含有与转录激活区或亚单位、转录失活化区或DNA结合区融合之配体结合区的嵌合蛋白质的构建体，并按照组装其他构建体的同样方式组装之。转录因子的N-末端将常常结合到配体结合区的C-末端上，尽管在某些情况下是反过来的，例如单一转录因子的两个不同的区域分在两个不同的嵌合体间。

III.胞吐作用

配体介导的低聚合机制的另一个应用是胞吐作用，其中蛋白质的输出面不是转录作用受到配体的控制。此可与一种或多种有用蛋白质的表达相配合，作为一种可替代方式促成通过分泌信号序列分泌有用蛋白质。该实施方案涉及两种不同的第一构建体。一种构建体编码将蛋白质引向泡囊以整合到泡囊膜中的嵌合蛋白质(Sollner et al.，文献出处同上)。可用作泡囊结合蛋白质的蛋白质包括单独或合用的VANP(synaptobrevin)、SNC2、rab3、SEC4、synaptotagmin等。细胞膜蛋白质可包括单独或组合的syntaxin、SSO1、SSO2、neurexin等。其他构建体则为向表面膜运输作准备，并利用上述的肉豆蔻酰信号序列、其他胞浆膜击靶序列(为用于异戊烯化)或跨膜保留区。上述参考文献中描述了所编码的蛋白质，作为作用区的全部或其功能性部分。可在与外源蛋白质表达的配合中使用这些构建体，其适当地进行编码以运输泡囊或内吞内源性蛋白质，以提高内源性蛋白质的输出。

有多种机制可用于胞吐作用。依据细胞类型以及何种蛋白质对该细胞内的胞吐作用是限制性的，可由一种或多种具有被配体激活之反应性元件的构建体编码一种或多种泡囊结合的蛋白质或细胞蛋白质。特别有用的是组合VAMP和syntaxin。另外，亦可提供控制胞吐作用的非限制性蛋白质的构成型表达，以及提供配体调节胞吐作用限制性蛋白质的表达。最后，可以提供与胞吐作用相关的嵌合蛋白质的构成型表达，从而由嵌合蛋白质与配体的低聚合控制胞吐作用。使用适当的结合区域，可以使不同的嵌合蛋白质将在泡囊表面上低聚合以形成活性复合物，和/或通过配体使泡囊蛋白质与细胞膜表面蛋白质连接。在没有配体的情况下，由于对配体的修饰如缺失、突变等，实质上降低了蛋白质控制的胞吐作用间的结合亲合性，嵌合蛋白质没有可能提供胞吐作用。可以使用各个蛋白质的交迭片段并确定那一个片段保留有活性便可很容易地确定这些修饰的存在。可以进一步使用丙氨酸取代修饰各片段，以确定实质上影响结合的各个氨基酸(Beohncke等人，J.Immunol.(1993)150，331-341，Evavold等人，出处同上(1992)148，347-253)。

如上所述，可以在构成上或可诱导地表达组装在泡囊腔中的蛋白质，以及与胞吐作用相关的融合蛋白质。是涉及内源性或是外源性蛋白质，将被输出的蛋白质是构成型表达还是可诱导地表达，是否可使用同样配体发动与胞吐作用相关联之融合蛋白质以及将被输出之蛋白质的转录，或者是否不同的蛋白质要受制于不同的可诱导信号，均可依据胞吐作用的目的确定控制表达的方式。一个方面，胞吐作用机制应只是由配体控制的过程。在另一方面，至少一种蛋白质的表达以及胞吐作用均可受到配体控制。

通过引入使蛋白质向泡囊转位的细胞击靶序列，而不丢失所述蛋白质的生理学活性来修饰各种蛋白质。可使用胞吐作用作为释放机制，依据宿主的性质，在短时间内释放相对高的剂量蛋白质，在维管***中产生高度定位水平的或高浓度的蛋白质。令人感兴趣的有意义蛋白质包括胰岛素、组织血纤维蛋白溶酶原激活剂、细胞激活素、***、集落刺激因子、生长因子、炎性肽、细胞迁移因子。

可从与胞吐作用相关的泡囊结合蛋白质得到将蛋白质导向泡囊的编码序列(如参见Sollner，等人，文献出处同上)。

低聚合机制的另一个应用是控制蛋白质降解或失活。例如，可以借助与本发明不同的嵌合蛋白质(其具有相对短的半寿期或去稳化或以趋向于降解的低聚物)的配体介导的低聚合作用，使本发明的相对稳定的或有长寿期的嵌合蛋白去稳定化或趋向于降解。在这一实施方案中，配体介导的低聚合通过赋予蛋白质以缩短的半寿期而调节蛋白质的生物学功能。后来的嵌合蛋白质可含有使蛋白质对准溶酶体的区域或使蛋白质易在细胞溶质或核或非溶酶体细胞器中对蛋白水解裂解敏感的区域。

可根据许多因素确定细胞内蛋白质的半寿期，这些因素包括在所说的蛋白质内存在富含氨基酸残基脯氨酸、谷氨酸、丝氨酸和苏氨酸的短氨基酸序列(因此是“害虫(PEST)”)、有相似功能的其他序列、蛋白酶敏感性裂解位点及遍在蛋白化状态。遍在蛋白化是由针对蛋白质降解的一个或多个短肽链单位、遍在蛋白完成的对蛋白质的修筛。一般认为蛋白质遍在蛋白化的速率主要是由被加工蛋白质N-末端氨基酸的同一性以及靠近氨基末端的一个或多个特有赖氨酸残基决定的。

IV.其他调节***

可由与个别蛋白质有关的特定活性的低聚作用控制的其他生物学功能是蛋白质激酶或磷酸酶活性、还原酶活性、环氧合酶活性、蛋白酶活性或依赖于亚单位联系的酶促反应。另外，还可以提供与细胞周期有关的G蛋白质与受体蛋白质的联系，如细胞周期调节蛋白(cyclins)和cdc激酶、多单位解毒酶。

V.构建体的成分

与(1)和(2)类任选的其他嵌合蛋白质相关联的第二或其他任选的构建体(靶基因构建体)包括有指明的靶识别序列或反应性元件的转录起始区，以便对来自活化受体或活化转录因子的起始信号作出应答，导致至少一个有意义基因转录成有意义序列，通常是mRNA，其转录及适当情况下的翻译可导致蛋白质的表达，和/或对其他基因的调节，如反义链、转录因子的表达、膜融合蛋白质的表达等。

为不同的目的，可以使用不同的位点，不同的结合区域和不同的胞质区域。对于与表面膜相关联的嵌合蛋白质受体，如果配体结合区是细胞外的，可以设计嵌合蛋白质使之含有一个选自各种表面膜蛋白质的细胞外区域。同样，可以根据由胞质部分调节的那个内源性基因，而使用能够转导信号的表面膜蛋白质的不同的胞浆或细胞内区域。如嵌合蛋白质是内在的，在表面膜蛋白内或与例如核、泡囊等细胞器相联系的，则配体结合区部分将受制于能够与可穿过表面膜或其他膜(如果适宜的话)的分子结合的区域。因此，这些结合区域一般将同小的天然存在的或并不包括蛋白质或核酸的合成的配体分子结合。

A.胞质区域

(1)类似嵌合蛋白质受体可以含有胞质区域，后者来自各种细胞表面膜受体之一，包括其突变蛋白，其中参与与胞质区域相关联之起始转录的识别序列是已知的，或者对这些序列有反应的基因是已知的。有意义的突变受体将使靶基因的转录激活同可能与有害付作用(如失调的细胞生长或细胞激活素的不适当释放)相关之基因的活化脱离联系。特别令人感兴趣的受体相关的胞质区域将具有下列特征：对相对很少的(可望少于100)并且一般在细胞宿主中无害的基因，受体活化导致转录的起始；由受体活化发动的转录所必需的其他因子存在于细胞宿主中；靶基因以外的基因被激活将不影响期望使用这些细胞要达到的目的；胞质区域的低聚合作用或其他可利用的机制导致信号发动；胞质区域连接到所需的配体结合区上将不干扰信号发送。许多不同的胞质区是已知的。这些区域中许多是酪氨酸激酶或是与酪氨酸激酶复合的，如CD3ζ、IL-2R、IL-3R等(参见Cantley，etal.，Cell(1991)64，281中的综述)。经交联如二聚合(基于首先由Yarden和Ulrich[Annu.Rev.Biochem.(1988)57，443]提出的命名)而活化的酪氨酸激酶受体包括I亚类：EGF-R、ATR2/neu、HER2/neu、HER3/c-erbB-3、Xmrk；II亚类：胰岛素-R、JGF-1-R[***受体]、IRR；III亚类：PDGF-R-A、PDGF-R-B、CSF-1-R(M-CSF/c-Fms)、c-kit、STK-1/Flk-2；以及IV亚类：FGF-R、flg[酸性FGF]、bek[碱性FGF]：神经营养性酪氨酸激酶：Trk家族，包括NGF-R、Ror1，2。与交联后酪氨酸激酶相联系的受体包括CD3ζ家族：CD3ζ和CD3η(主要见于T细胞，与Fyn相联系)；FcεRI的β和γ链(主要见于肥大细胞和嗜碱性细胞中)；FcrRIII/CD16的γ链(主要见于巨噬细胞、嗜中性细胞和天然杀伤细胞中)；CD3γ、-δ和-ε(主要见于T细胞中)；Ig-α/MB-1和Ig-β/B29(主要见于B细胞中)。许多细胞激活因子和生长因子受体与共同的β亚单位相关联，β亚单位与酪氨酸激酶和/或其他信号发送分子相互作用，并且可在本发明的嵌合蛋白质中用作胞质区域。这些β亚单位包括(1)由GM-CSF、IL-3和IL-5受体分享的通用β亚单位；(2)与IL-6、白血病抑制因子(LIF)、睫状神经营养性因子(CNTF)、制瘤素M和IL-11受体相关的β链gp130；(3)也与IL-4、IL-7和IL-13(及可能的IL-9)的受体相关的IL-2受体γ亚单位；以及(4)与G-CSF受体之胞质区域同源的IL-2受体的β链。

可以使用包括干扰素α/β和γ(其可以激活酪氨酸激酶之JAK、TyK家族的一个或多个成员)在内的干扰素家庭的受体、以及生长激素、***和催乳素(可能也激活JAK2)受体作为胞质区域的来源。

胞质区域的其他来源包括细胞表面受体的TGF-β家族(Kingslkey，D.，Genes and Devel opment(1994)8，133)。该受体家族在其胞质区域包含丝氨酸/苏氨酸激酶活性，据信是经交联而被激活的。

与转录因子的活化和去活化相关的酪氨酸激酶在提供可受控制的、并可用以发动或抑制外源基因表达的特殊途径中是特别有用的。

下表中列出了一些受体和与受体相关的性质，以及其激活基因的核反应性元件。该表不是无遗漏的，所列出的只是可适用于主题本发明的举证性的***。

在许多状态下可以得到突变的胞质区，其中被转导的信号可能不同于野生型，从而产生与野生型相比受限制的或不同的途径。例如，对于EGF和FGF等生长激素，已报导了其突变情况，其中信号与细胞生长相脱离，但仍由c-fos保留(Peters et al.，Nature(1992)358，678)。

在全身的各种细胞上，都可以发现酪氨酸激酶受体。相反，CD3ζ家族、Ig家族和淋巴激活素β链受体家族则主要见于造血细胞、特别是T细胞、B细胞、肥大细胞、嗜碱细胞、巨噬细胞、嗜中性细胞及天然杀伤细胞上。NF-AT转录所需要的信号主要来自抗原受体的zeta(ζ)链，较少来自CD3γ、δ、ε。

由于天然存在的或被截短的、修饰的或突变的，胞质区域至少约10个，一般至少约30个，更通常至少约50个氨基酸，并且通常不超过约400个氨基酸，更好是不超过约200个氨基酸(参见Romeo，et al.，Cell(1992)68，889-892)。虽然任何种均可使用，但较好使用内源于宿主细胞的种。然而，在许多情况下，可以有效地使用来自不同种的胞质区。上文指出的任何胞质区，以及目前已知的或继后可能被发现的其他胞质均可使用。

表1

配体	DNA元件	结合因子	基因	参考文献
配体	DNA元件	结合因子	基因	参考文献	胰岛素及其他	cAMP反应性元件(cre)	LRFI	jun-B许多基因	Mol.Cell Biol.(1992)，12，4654PNAS，83，3439
PDGF，FGF，TGF及其他	SRE	SRF/SREBP	c-fos	Mol.Cell Biol.(1992)，12，4769	胰岛素及其他	cAMP反应性元件(cre)	LRFI	jun-B许多基因	Mol.Cell Biol.(1992)，12，4654PNAS，83，3439
PDGF，FGF，TGF及其他	SRE	SRF/SREBP	c-fos	Mol.Cell Biol.(1992)，12，4769	EGF	VL30RSRF		RVL-3病毒c-jun	Mol.Cell.Biol.(1992)，12，2793do.(1992)，12，4472
IFN-α	ISRE	ISGF-3		Gene Dev.(1989)3，1362	EGF	VL30RSRF		RVL-3病毒c-jun	Mol.Cell.Biol.(1992)，12，2793do.(1992)，12，4472
IFN-α	ISRE	ISGF-3		Gene Dev.(1989)3，1362	IFN-γ	GAS	GAF	GBP	Mol.Cell.Biol.(1991)11，182
PMA andTCR		AP-1	许多基因	Cell(1987)49.729-739	IFN-γ	GAS	GAF	GBP	Mol.Cell.Biol.(1991)11，182
PMA andTCR		AP-1	许多基因	Cell(1987)49.729-739	TNF		NFκ B	许多基因	Cell(1990)62.1019-1029
抗原	ARRE-1	OAP/Oct-1	许多基因	Mol.Cell.Biol.(1988)8，1715	TNF		NFκ B	许多基因	Cell(1990)62.1019-1029
抗原	ARRE-1	OAP/Oct-1	许多基因	Mol.Cell.Biol.(1988)8，1715	抗原	ARRE-2	NFAT	IL-2增强子	Science(1988)241，202

对于大部分与转录因子相关的其他嵌合蛋白质来说，主要不同在于具有将嵌合蛋白质导向核膜内侧的细胞击靶序列，并具有作为作用区域的转录因子或其部分。通常，转录因子作用区域可分为“DNA结合区”和“激活区”。可以提供有一个或多个配体结合区的DNA结合区，以及有一个或多个配体结合区的激活区。以这种方式，DNA结合区可以与多个结合区和/或激活区偶联。另外，对涉及信号转导的与表面膜有关之嵌合蛋白质的讨论也适用于指导与基因组DNA结合的嵌合蛋白质。同样，与胞吐作用相关的嵌合蛋白质，代替转导性胞质蛋白质，基本上不同于与泡囊膜同表面膜的融合相关的蛋白质。

B.细胞击靶区域

信号肽或序列使嵌合蛋白质运输到细胞表面膜，此时相同或其他的序列可以编码与细胞表面膜结合的嵌合蛋白质。虽然有一个通用的信号序列部分，在两个或三个N末端极性氨基酸之后是大约15-20个基本上疏水的氨基酸，但个别氨基酸可能有很大的变化。因此，实质上任何在宿主中有功能活性的，并且可能或可能不与嵌合蛋白质的其他区域之一相联系的信号肽均可利用。正常情况下，信号肽要经过加工并且将不保留在成熟的嵌合蛋白质中。编码信号肽的序列是在编码序列的5′端，并且将包括起始蛋氨酸密码子。

选择膜保留区域对于本发明来说不是很重要的，因为发现这些膜保留区域实质上是可替代的，并且结合或为激活而结合到其他膜区域上都不要求有严格的氨基酸。因此，不管是否是宿主内源的，从任何方便的表面膜或胞浆蛋白质中都可以分离膜保留区域。

至少有两个不同的膜保留区：跨膜保留区，其为横跨膜延伸的氨基酸序列；以及脂质膜保留区，其脂质与细胞表面膜的脂质相联。

为了易于构建，大部分都可使用胞质区域或受体区域的跨膜区，这样可趋向于简化融合蛋白质的构建。然而，对于脂质膜保留区，通常在与膜结合的N末端编码序列的5′端，和接近C末端结合区编码序列的3′端加上加工信号。脂质膜保留区具有约12到24个碳原子，特别是14个碳原子，更具体是有肉豆蔻酰基，与甘氨酸连接的脂质。脂质结合区的信号序列是一N末端序列并且可有很宽范围的变化，通常在2位残基上是甘氨酸且在7位残基上是赖氨酸或精氨酸(Kaplan，et al.，Mol.Cell.Biol.(1988)8，2435)。Carr等人(PNAS，USA(1988)79，6128)、Aitken等人(FEBS Lett.(1982)150，314)、Henderson等人(PNAS，USA(1983)80，319)、Schulz等人(Virology(1984)123，2131)、Dellman等人(Nature(1985)314，374)都已描述过，并在Ann.Rev.of Biochem.(1988)57，69中也已综述过参与翻译后加工以提供脂质膜结合的肽序列。有意义的氨基酸序列包括序列M-G-S-S-K-S-K-P-K-D-P-S-Q-R。多种DNA序列均可用于编码融合之受体蛋白质中的所述序列。

一般说来，跨膜区域有大约18-30个氨基酸，更常见是约20-30个氨基酸，其中心部分主要是中性、非极性氨基酸，并且该区域的末端是极性氨基酸，常常是带电荷的氨基酸，一般约带1-2个电荷，跨膜区域的末端主要是碱性氨基酸，其后是螺旋断裂残基，如pro-或gly-。

C.配体结合区域

本发明任何嵌合蛋白质的配体结合(“二聚合”或“受体”)区可以是任何允许使用或结合天然或非天然配体，较好是非天然合成配体进行诱导的适宜区域。根据构建体的性质和选择的配体不同，结合区域可以是细胞膜内部的或外部的。多种包括受体在内的结合蛋白质，包括与上文指出的胞质区相关的结合蛋白质都是已知的。其中特别有用的是已知其配体的(较好是小的有机配体)或可以容易产生的结合蛋白质。这些受体或配体结合区域包括FKBP和亲环素受体、类固醇受体、四环素受体、上文指出的其他受体等，以及可从抗体，特别是重或轻链亚单位、其突变序列得到的“非天然”受体、以随机程序、组合合成等方法得到的随机氨基酸序列。在大多数情况下，受体区作为天然区域或其截短的活性部分，至少有大约50个氨基酸、且少于约350个氨基酸，通常少于200个氨基酸。结合区较好是小的(＜25kDa，以允许在病毒载体中有效转染)、单体的(这就排除了抗生物素蛋白-生物素***)、非免疫原性的，并且应是易于合成上的、可透过细胞的、可二聚成形的无毒性配体。

依据编码嵌合蛋白质之构建体的设计和适当配体的可利用性，受体区可以是细胞内或细胞外的。对于疏水配体，结合区可以在膜的任一侧，但对于亲水配体，特别是蛋白质配体，除非有一个使配体以其得到结合的形式实现内在化的运输***，否则结合区通常都是细胞膜外的。对于细胞内受体，构建体可以编码信号肽和受体区序列的跨膜区5′或3′端，或可能有受体区序列的脂质连接信号序列5′或3′端。当受体区处于信号肽和跨膜区域之间时，受体区将是细胞外的。

构建体的编码受体的部分可因种种原因受到诱变。经诱变的蛋白质可提供更高的结合亲和性，允许由配体分辨天然出现的受体和经诱变受体，为设计受体-配体对等提供机会。受体改变可包括已知是在结合位点上的氨基酸的改变、使用组合技术进行随机诱变，其中可经改变特定氨基酸的密码子(有已知改变或随机改变)，在适当的原核宿主中表达所得到的蛋白质，然后筛选所得到的用于结合的蛋白质，而对与结合位点相关之氨基酸或与构型改变相关之其他氨基酸的密码子进行诱变。可举例的这种状态是将FKBP12的36位Phe改变成Ala，和/或将其37位Asp改变成Gly或Ala，以便在FK506或FK520的9或10位上容纳氨基酸取代。具体地说，作为在C9和/或C10上包含修饰的FK506型和FK-520型配体的受体区，代替一个或多个Tyr26、Phe36、Asp37、Tyr82和Phe99而含有Val、Ala、Gly、Met或其他小氨基酸的突变FKBP12部分是特别有意义。

作为结合区可以使用抗体亚单位，如重链或轻链，特别是其片段，更具体的是全部或部分可变区，或重链与轻链的融合体以产生高亲和性结合。可以制备抗生理上可接受之半抗原分子的抗体，并根据结合亲和性筛选个别抗体亚单位。可以分离编码亚单位的cDNA并经缺失恒定区、部分可变区、诱变可变区等对其进行修饰，以得到对配体有适当亲和性的结合蛋白质区域。以这种方式，几乎任何生理上可接受的半抗原化合物均可以用作配体，或提供配体的表位。如结合区是已知的并且有一个有用的结合配体时，可以利用天然受体来代替抗体单位。

基于体外利用诱变或对编码蛋白质之序列的组合修饰，得以能够生产可根据不同配体的结合亲和性进行筛选的蛋白质文库。例如，可在编码结合蛋白质的DNA序列中的一个或多个位点上，总体上随机设定一个有1至5个、10个或更多个密码子的序列，制成表达构建体并将此表达构建体导入单细胞微生物中，以建立文库。然后可以根据对一个或理想地多个配体的结合亲和性筛选该文库。然后即可使用与它们将导入其中的细胞相匹配的最好的亲和性序列作为结合区。应根据所使用的宿主细胞来筛选配体，以确定配体与内源性蛋白质结合的水平。可以权衡对经过诱变的结合区的结合亲和性与对内源性蛋白质的结合亲和性之结合区的比例，以确定结合特性。然后可使用有最好结合特性的那些配体作为配体。作为非限制性的例子，可在完成前述工作中使用噬菌体显示技术。

D.多聚合

正常情况下，转导的信号是由于配体介导的嵌合蛋白质分子的低聚合造成的，即由于配体结合后的低聚合的结果，尽管亦可利用其他结合过程，例如变构激活来产生信号。就各区域的次序和个别区域的重复数目来说，嵌合蛋白质的构建体间是有所不同的。对于在5′-3′方向上转录的细胞外受体区域来说，构建体将编码包含信号肽、受体区、跨膜区和信号起始区的蛋白质，其最后一个区域将是细胞内的(胞质的)。然而，如受体区是细胞内的，则可利用不同的次序，此时信号肽之后可跟着受体区或信号起始区，然后是其余区域，或者有多个受体区，信号起始区可夹在受体区之间。通常，信号起始区的活性位点是在序列内的，并且不需要有游离的羧基末端。每个区域都可以被多聚合，特别是受体区，通常具有不超过大约5次重复，及常见是不超过大约3次重复。

为了使受体多聚合，嵌合表面膜蛋白质的受体区配体通常是在其至少应有两个结合位点的意义上多聚的，同时每个结合位点均能够与受体区结合。可望主题配体是二聚体或更高级的低聚体，通常是不大于四聚的小的合成有机分子，单个分子一般至少约150D并且小于约5KD，通常是小于约3KD。可利用多种合成配体和受体对。例如，在涉及天然受体的实施方案中，可使用二聚FK506与FKBP受体，可使用二聚合的环孢菌素A与环孢菌素受体、二聚合的***与***受体、二聚合的糖皮质激素与糖皮质激素受体、二聚合的四环素与四环素受体、二聚合的维生素D与维生素D受体等。另外亦可使用更高级聚合如三聚合的配体。对于涉及非天然受体的实施方案，例如抗体亚单位、经修饰的抗体亚单位或经修饰的受体等，可以使用任何各种不同的化合物。这些配体单位的重要特征是它们以高亲和性(较好Kd≤10-8M)与受体结合，并且能够化学二聚合。

配体可以有带不同表位的不同的受体结合分子(也称为“ HED”试剂)，因为它们可以介导有相同或不同结合区域之嵌合蛋白质的异二聚合或异低聚合。配体可包括FK506或FK506型部分，以及CsA或环孢菌素型部分。两部分部共价连接到共同的接头部分上。这样的配体将适用于介导第一和第二嵌合蛋白质的低聚合，其中第一嵌合蛋白质含有能够与FK506型部分结合的受体区如FKBP12：第二嵌合蛋白质则含有能够与环孢菌素A型部分结合的受体区如亲环素。

VI.细胞

细胞可以是原核的，但最好是真核的，包括植物、酵母、蠕虫、昆虫以及哺乳动物。目前特别优选的细胞是哺乳动物细胞，特别是灵长类动物，更具体是人，但可以涉及其他任何有兴趣的动物特别是家养动物，如马、牛、鼠、羊、狗、猫等。这些种动物中，可包括各种类型的细胞，例如造血、神经、间质、皮、粘膜、基质、肌肉、脾、网状内皮、表皮、内皮、肝、肾、胃肠、肺等组织的细胞。其中特别有用的是造血细胞，其包括任何可能与淋巴样细胞或骨髓单核细胞谱系相关的有核细胞。其中特别有价值的是T和B细胞谱系的成员、巨噬细胞和单核细胞、成肌细胞和成纤维细胞。另外特别适用的是干细胞和祖细胞，如造血、神经、基质、肌肉、肝、肺、胃肠等细胞。

细胞可以是自体细胞、同源细胞、同种异型细胞、甚至有些情况下是异源细胞。可以改变主要组织相容性复合(“MHC”)特征以修饰细胞，包括失活β₂巨球蛋白以阻止生成功能性I类MHC分子、失活II类分子、为一种或多种MHC分子的表达准备条件、经提高或抑制与细胞毒活性相关之基因的表达提高或失活胞毒能力等。

在某些情况下，特定克隆或寡克隆细胞可能是有意义的，这些细胞有特定的特异性，例如T细胞和B细胞即具有特定抗原特异性或保有靶位点特异性。

VII.配体

包括天然发生的和合成的物质在内的多种多样的配体均可用于本发明，以影响嵌合蛋白质分子的低聚合。选择配体的适用的和容易观察或度量的标准是：(A)配体是生理上可接受的(即对于它所用于的细胞或动物没有过多的毒性)，(B)有合理的治疗剂量范围，(C)可望(用于整体动物，包括基因治疗应用时)能够口服摄入(其在胃肠***中是稳定的，并且可被吸收到血管***中)，(D)必要时可以穿越细胞和其他膜，并且(E)以适合所期望之应用的亲和性结合到受体区域上。第一个合乎需要的标准是除了其激活受体的能力之外，所用化合物在生理上是相对惰性的。配体与天然受体结合越少并目与天然受体结合之总配体的比例越低，则反应越是正常。特具体地说，受体对天然蛋白质不应该有强的生物学效应。对大多数情况来说，受体将是非肽的和非核酸的。

对大多数主题化合物要有两个或多个单位，这些单位可以是通过中心连接基团连接在一起的相同或不同的单位。“单位”是能够结合受体区的各个部分(如FK506、FK520、环孢菌素A、类固醇等)。至少在二聚体或较高级同聚物中，各单位通常通过相同的反应性部分连接到连接基团上。

如上文指出的，对于小的非蛋白质有机分子有多种不同的天然存在的受体，这些小的有机分子都符合上述标准，并且可在不同的位点上二聚合以提供本发明的配体。只要保留有所需特异性的结合能力，即允许对这些化合物进行实质性修饰。许多化合物是大环的，例如大环内酯。适宜的结合亲和性将反映在Kd值低于10^-4，较好低于10^-6，更好低于约10^-7，但结合亲和性也可能低于10^-9或10^-10，并且在某些情况下是最合乎要求的。

普遍优选的配体包括低聚物，通常是能够与FKBP蛋白质和/或亲环素蛋白质结合之化合物的二聚体。这样的配体包括保留其与天然或诱变之结合区的结合能力的，环孢菌素A、FK506、FK520及雷帕霉素和其衍生物的同和异多聚体(通常是2-4个，更常见为2-3个单位)。这些化合物的许多衍生物部是已经知道的，包括可用于本发明实践中的合成的高亲和性FKBP配体(例如参见Holt et al，J.Am.Chem.Soc.1993，115，9925-9935)。连接FK506和其类似物的有意义位点包括卷入从17至24位的环状碳原子的位置，以及与这些环原子结合的取代基位置，如21(烯丙基)、22、37、38、39和40位或32位(环己基)，而除21位外同一位置对于FK520是有意义的。对于环孢菌素，有意义的位点包括MeBmt，位置3和位置8。

对配体修饰中特别有意义的是改变其结合特性，特别是就配体的天然存在的受体来说。同时，应改变结合蛋白质以适应配体的改变。例如，可以用具有更大空间需要的基团取代羟基，或者用有更大空间要求的基团取代羰基或使羰基功能化，例如形成N取代的西夫碱或亚胺来修饰10位上的羰基，以加大该位置的空间体积，而对FK506的9和10位上基团进行修饰(参见Van Duyne et al(1991)Science252，839)，以便增强它们的空间要求。可以在这些位点上方便地引入的各种功能性基团是形成醚的烷基基团、酰氨基团、N-烷化胺、2-羟乙基亚胺也可形成1，3-噁唑啉等。一般说来，取代基大约有1-6个，通常1-4个，更多是1-3个碳原子，且有1-3个，通常1-2个杂原子，这些杂原子一般是氧、硫、氮等。可使用具有基本结构的不同衍生物，产生对结合有不同构型要求的不同配体。经诱变受体，可以得到实质上有相同序列的不同受体，所述受体对结构上没有明显不同的经修饰的配体有不同亲和性。

可以使用的其他配体是类固醇。类固醇可以是低聚的，以致在没有丢失其与含有一个或多个类固醇受体区之嵌合蛋白质的结合能力的情况下，显著地降低了它们的天然生物学活性。作为非限制性实施例，可以使用糖皮质激素和***。也可以使用多种药物，已知这些药物能够以高亲和力结合特定受体。在受体的结合区是已知的时尤其是这样，因此允许在本发明的嵌合蛋白质中只使用结合区，而不是整个天然受体蛋白质。为此目的，可使用酶和酶抑制剂。

A.接头

连接中可包括多种不同的官能团，例如酰胺基团，包括碳酸衍生物、醚、酯、有机和无机酯、氨基等。为了提供连接，可经氧化、羟化、取代、还原等修饰特定单体，以提供偶联位点。可以根据不同单体、选择不同的位点作为偶联位点。

可用任何常规方法合成多聚配体，其中连接基团是在并不干扰配体与受体在结合位点上的结合的位点。在生理学活性的活性位点和配体与受体区的结合位点不同的情况下，一般可望在活性位点连接以失活配体。可以利用多种连接基团，通常在两分子之间的链中有1-30个、更好有大约1-20个原子(除氢以外)，其中连接基团主要由碳、氢、氮、氧、硫和磷组成。连接基因可以包括各种官能团，如酰胺和酯(有机和无机的)、胺、醚、硫醚、二硫化物、季铵盐、肼等。链可包括脂族、无环、芳族或杂环基团。可根据合成容易的和多聚配体的稳定性来选择链。因此，如果希望保留长期活性，可使用相对惰性的链，以使多聚配体键合不被裂解。另外，亦可只希望在血流中有短的半寿期，那么即可利用易于被裂解的各种基团，例如酯和酰胺，特别是肽，其中循环的和/或细胞内的蛋白酶能够裂解连接基团。

可利用各种基团作为配体间的连接基团，例如通常有2至20个碳原子的亚烷基，通常有4至18个碳原子的氮杂亚烷基(其中氮通常是在两个碳原子之间)、通常有6至2 4个碳原子的N-亚烷基氮杂亚烷基(见上文)、通常有6至18个碳原子的亚芳基、通常有8至24个碳原子的芳二亚烷基(ardialkylene)、通常有8至36个碳原子的双-羧酰氨基亚烷基等。说明性的这类基团包括亚癸基、亚十八烷基、3-氮杂亚戊基、5-氮杂亚癸基、N-亚丁基、5-氮杂亚壬基、亚苯基、亚二甲苯基、对二亚丙基苯、双-苯甲酰基1，8-二氨基辛烷等。可使用下文实施例中描述的材料和方法，用携带相应受体区的本发明嵌合蛋白质估计上述含接头部分的多价或其他(详见下述)配体分子。

B.配体特征

对于细胞内结合区，应选择能够以生物活性形式跨膜转移的配体，即该配体是可透过膜的。多种配体都是疏水的或者是可以经用亲脂基团进行适当修饰而制成的。具体地说，可经提供约有12至24个碳原子脂族侧链来利用连接桥提高配体的亲脂性。另外，亦可提供一个或多个将提高跨膜运输能力的，而又希望没有核内体形成的基团。

在某些例子中，不必使用多聚配体。例如，在两个不同的结合位点供受体二聚时，可以使用分子。在其他例子中，配体的结合可导致受体区的构型改变，例如使受体低聚合而导致活化。诱导信号的其他一些机制也是可以发挥效力的，例如结合具有构象改变而导致胞质区域激活的单一受体。

如本文别处所讨论的，能够发动如靶基因转录的任何任选的其他细胞过程的配体应优选被选择为不能与工程细胞中的初级嵌合蛋白质交叉反应以启动细胞程序死亡。

C.配体拮抗物

可以使用单体配体逆转多聚配体的作用，即防止、抑制或破坏低聚体的形成或维持。因此，如果希望迅速终止细胞激活的效应，可以使用单体配体。可以使用同样方法，在如多聚体的相同位点方便地修饰母配体部分，不同的是用单功能化合物取代多功能化合物。可使用有2到20个(它们可以更长)，通常有2至12碳原子的单胺，如乙胺、己胺、苄胺等代替多胺。另外，在母体化合物没有过多不期望的生理学活性(如免疫抑制、有丝***、毒性等)的情况(或剂量水平)下，可以使用单价母体化合物。

D.举例说明性的同可与含补偿性突变之突变受体结合的“***块”异低聚(HED)和同低聚(HOD)的试剂

如上文讨论的，由于在经修饰的HED/HOD试剂上存在与受体之结合“袋”中的侧链残基进行空间碰撞的取代基(“***块”)，所以可以制备这种不能与其野生型受体(如FKBP12)发生可估计的结合的经修筛的HED/HOD试剂。也可以制得在干扰残基上包含突变(“补偿性突变”)的相应受体，并因此而获得与带“***块”之配体结合的能力。使用“形成***块的”配体部分和携带补偿性突变的受体区域，会提高我们的试剂的特异性并进而提高其效力。形成***块的试剂不会与内源性、野生型受体结合，其另外可以对基于天然配体部分的二聚体起到“缓冲剂”作用。另外，新的受体-配体对的产生同时将会产生将在需要异二聚化时使用的HED试剂。例如，可以使HED试剂诱导syntaxin(一种浆膜融合蛋白质)与synaptobrevin(一种泡囊膜融合蛋白质)的异二聚，而实现受调节的泡囊融合。这不仅提供了一种研究工具，而且也可作为使用经适当修饰的分泌细胞对糖尿病进行基因治疗的基础。

作为“形成***块的FK1012s”的一个实例，我们制备了FK506的C10乙酰胺和甲酰胺衍生物。有关FK1012s A-C和FK506M的合成的其他详细内容可参见图16A和我们的报导，Spencer et al，“Controlling Signal Transduction with Synthetic Ligands”，Science262，(1993)：1019-1024。我们选择制备两类形成***块的FK1012s：一类在C10上有***，一类在C9上有***。已按照图16B中所示的反应顺序合成了FK506之C10乙酰胺和甲酰胺的R和S异构体。这些带***的衍生物在它们对FKBP12的结合亲和性失去了至少3个数量级(图16B)。检测衍生物抑制FKBP12旋转异构酶(rotamase)的活性来确定亲和性。

第二类C9带***块之衍生物的一个实例是已按已知方法(参见例如Fisher et al.J.Org.Chem.56，8(1991)：2900-7和Edmunds et al.Tet.Lett.32，48(1 991)：819-820)制得的螺-环氧化物(如图16C中所示)。令人特别感兴趣的C9衍生物系列的特征在于它们的sp3杂化和在C9上的还原的氧化状态。已按照图16C中所示的反应合成了几种这样的化合物。

应理解到的是，异二聚体(或其他异低聚体)须按不同于同二聚体的方法构成，否则至少在应用中同二聚体污染时可能会对其成功地应用造成不利影响。图16D中图解显示了为克服这一问题而发展的一个说明性的合成战略。在含过量三乙胺的二氯甲烷中，使单alloc-保护的1，6-己二胺(Stahl et al，J.Org.Chem.43，11(1978)：2285-6)与衍法形式的FK506偶联，以44％产率得到alloc-胺-取代的FK506。现在即可将该中间产物用于与任何活化的FK506(或带***块的FK506)分子偶联。在室温THF中双甲酮存在下，用催化性四联-三苯基膦钯去保护，除去胺保护基团。立即用活化的FK506衍生物处理，然后脱甲硅基而产生二聚产物。已使用该技术合成了说明性的HOD和HED试剂。

E.说明性的环孢菌素试剂

环孢菌素A(CsA)是以高亲和力(6nM)与其细胞内受体亲环素——一种13kDa单体蛋白质-结合的环十一肽。所得到的复合物如FKBP12-FK506复合物，与蛋白质磷酸酶calcineurin结合并使之失活，进而导致药物的免疫抑制性质。作为本发明的另一个说明性实例，我们以6个步骤通过其MeBmtl测链二聚合了CsA，并以35％的总产率得到(CsA)2(图17，按Eberle et al，J.Org.Chem.57，9(1992)：2689-91中报导的方法进行步骤1-4)。同FK1012s一样，选择二聚位点以使所得的二聚体与两个亲环素分子结合而又不能在结合亲环素后与calcineurin结合。我们已证明(CsA)2以1∶2的化学计算量用亲环素A结合。因此，(CsA)2同FK1012s一样，并不抑制信号传输途径并因而没有免疫抑制作用和毒性。

VIII.靶基因

A.转录起始区域

靶基因构建体在5′区域具有反应性元件，如上文所讨论的，其可能是通过产生和转导转录起始信号，对配体介导的嵌合受体蛋白质的低聚合作用发生反应。因此，必须选择至少一个由胞质区域直接或间接激活的或者可通过两个区域的联系而激活的转录起始***，例如转录因子。还必须选择至少一个对所得到的转录起始***起反应的启动子区域。需要选择启动子区域或在其转录控制下的基因。换句话说，可以基于作用区域通过给定的启动子或反应性元件在起始转录中所起的作用，来选择嵌合蛋白质的作用区(由“第一”系列构建体编码)(如参见上文V(A)部分“胞质区域”)。

在知道反应性元件的情况下，即可使其包括在靶基因构建体中，以便为整合到基因组中(以游离基因形式或经染色体掺入)提供表达盒。只要知道在天然配体结合到含有胞质区的蛋白质上之后由胞质区转录激活的基因，便不必去分离反应性元件的特定序列。然后可以使用同源重组将有意基因***启动子区的下游以使之处于内源性启动子区的转录调节之下。如特异的反应性元件序列是已知的，可以将其与不同的、可以在转录速度上有高或低的活性以及结合特定的转录因子等其他表现的转录起始区相连接。

因此，表达构建体将在其转录方向的5′端有允许诱导有用靶基因，通常是治疗性基因转录起始的反应性元件和启动子序列。转录终止区不是那么重要，其可通过***用于降低mRNA稳定性的AU序列，用以提高短半寿期mRNA的半寿期或制得短半寿期的mRNA，并因此而限制蛋白质作用的时间。可以利用任何提供必要的转录终止，以及在需要时提供翻译终止的任何区域。

反应性元件可以是单一序列或者可以是低聚合的，通常具有不超过约5次重复，更多是有大约3次重复。

也可以使用同源重组除去或失活内源性转录控制序列(包括对低聚合过程有反应的启动子和/或反应性元件)，和/或在所需内源性基因上游***这样的反应性转录控制序列。

B.产物

可以利用多种基因作为靶基因，包括编码有意义蛋白质的基因或有意义的反义序列或有意义的核酶(ribozyme)。靶基因可以是提供所需表型的任何有用序列。靶基因可以表达表面膜蛋白质、分泌的蛋白质、胞质蛋白质，或者是可表达不同类型产物的多个靶基因。靶基因可以是反义序列，该序列可通过抑制转录调节蛋白质而调节特定途径，或者通过抑制某途径中抑制物的翻译而开通该特定途径。靶基因可编码核酶，该核酶可以通过在RNA水平上干扰相关转录调节物的表达，或干扰特定途径之抑制物的表达来调节特定途径。被单一地或联合地表达的蛋白质可以牵涉到寻靶(homing)、细胞毒性、增殖、免疫反应、炎性反应、凝血或血凝块溶解、体液调节等过程。所表达的蛋白质可以是天然存在的蛋白质，天然蛋白质的突变体、独特序列或其组合形式。

基因可以是由细胞分泌的任何基因，从而可随意制得期望得到的或宿主必需的被编码的产物。多种被分泌的产物包括激素，如胰岛素、人生长激素、胰高血糖素、垂体释放因子、ACTH、促黑激素、松弛素等；生长因子，如EGF、IGF-l、TGF-α、-β、PDGF、G-CSF、M-CSF、GM-CSF、FGF、***、巨核细胞刺激和生长因子等；白细胞介素，如JL-1至-13；TNF-α和-β等；以及酶，如组织血纤维蛋白溶酶原激活物、补体级联反应成员、perforins、超氧化物歧化酶、凝血因子、抗凝血酶-III、因子VIIIc、因子VIIIvW、α-抗胰蛋白酶、蛋白质C、蛋白质S、内啡呔、dynorphin、骨形态形成蛋白质、CFTR等。

基因可以是任何天然的或经导入适当信号肽及跨膜序列而制得之表面膜蛋白质的基因。各种各样的蛋白质可以包括寻靶受体，如L-选择素(Mel-14)、血液相关蛋白质，特别是有kringle结构的蛋白质，如因子VIIIc、因子VIIIvW，造血细胞标志物，如CD3、CD4、CD8、B细胞受体、TCR亚单位α、β、γ、6、CD10、CD19、CD28、CD33、CD38、CD41等；受体，如白细胞介素受体IL-2R、IL-4R等；离子如H⁺、Ca⁺²、K⁺、Na⁺、Cl^-等流入或流出的通道蛋白质；CFTR、酪氨酸激活基序、ζ激活蛋白质等。

为了向泡囊运输蛋白质以便发生胞吐，可以对蛋白质进行修饰。加进来自某蛋白质的被引向泡囊的序列，在这里修饰该序列使之接近一个或另一个末端，或位于与蛋白质来源相似的位置，以将被修饰的蛋白被导向泡囊中高尔基氏器进行包装。这一过程与存在胞吐作用的嵌合蛋白质相结合，即可将蛋白质迅速地输向细胞外介质，并达到相对高的定位浓度。

另外，具体根据宿主细胞的性质，一些细胞内蛋白质可能是有意义的，例如代谢途径中的蛋白质、调节蛋白质、类固醇受体、转录因子等。上文指出的某些蛋白质也可以作为细胞内蛋白质存在。

下面是不同基因的少数实例。在T细胞中，可能希望导入编码一条或两条T细胞受体链的基因。对于B细胞，可以提供用于分泌作用的免疫球蛋白的重链和轻链。对于皮肤细胞，例如角质形成细胞，特别是干细胞角质形成细胞，可以通过分泌α-、β或γ-干扰素、抗趋药性因子、对细菌细胞壁蛋白质特异的蛋白酶等而提供防止感染保护作用。

除了提供有治疗价值之基因的表达外，有许多情况下可希望将细胞导向特定部位。这些部位可包括解剖部位，如***、粘膜组织、皮肤、滑囊、肺或其他内部器官等，或者是例如凝血、损伤部位、外科处理部位、炎症、感染等功能性部位。经提供在宿主靶部位对天然存在之表位的结合，以提供可将宿主细胞引向特定部位之表面膜蛋白质的表达，从而可使分泌的产物达到局部化的浓度。有用蛋白质包括寻靶受体，如L-选择素(Selectin)，GMP140、CLAM-1等；或地址素，如ELAM-1、PNAd、LNAd等；血块结合蛋白质，或对趋药因子的局部化梯度反应的细胞表面蛋白质。在许多情况下可希望将细胞导向特定部位，并在该部位释放出治疗产物，这将是有很大价值的。

在许多情况下可能希望能够杀死经修饰的细胞，例如希望终止对细胞的处理，细胞已变得不合乎需要，例如变为致瘤性细胞，或者细胞应完成的使命已经完成，它们的继续存在已无必要。本发明的经修饰细胞能够表达初级嵌合蛋白质，此蛋白质含有如Fas抗原或TNF受体的胞质区的区域(Watanable-Fukunaga et al.，Nature(1992)356，314-317)。将细胞暴露于能使初级嵌合体低聚合化的配体之后，通过细胞程序死亡可容易地消除本发明经修饰的细胞。使用常规材料和方法将编码初级嵌合体的构建体设计成可组成型表达，从而使经修饰的细胞在其表面上有或在其胞质中存在这样的蛋白质。此外，也可以提供受控制的表达，此时相同或不同的低聚合配体均可发动表达初级嵌合体和开始自然死亡过程。通过在胞质中提供Fas抗原或TNF受体的胞质部分-其中所说的胞质部分连接到与有意靶基因表达相关之结合区域不同的结合区域上，即可在受控制的条件下杀死被修饰的细胞。

C.阐述性举例

作为举例说明，可按下述方法处理心脏病人或易患中风的病人。将按本文所述方法修饰的细胞施予病人并保留相当长的时间。举例的细胞包括浆细胞、B细胞、T细胞或其他造血细胞。应修饰细胞使之表达与血凝块结合的蛋白质，例如有kringle区域结构的蛋白质，或粘附性相互作用的蛋白质如CD41，并表达凝块溶解蛋白质，如组织血纤维蛋白溶酶原激活物、链激酶等。以这种方式，在配体介导的低聚合后，细胞在血块部位积聚并提供高定位浓度的血栓溶解蛋白质。

另一个例子是再灌注损伤。可以利用有限半寿期的细胞，例如巨噬细胞或多形核白细胞(“嗜中性细胞”)。细胞具有嗜中性细胞寻靶受体以将细胞引向再灌注损伤的部位。细胞也可表达超氧化物歧化酶，以破坏单氧并抑制自由基对组织的侵害。

第三个例子是自体免疫性疾病。可利用长半寿期的细胞，例如T细胞。构建体将提供寻找自身免疫损伤部位的寻靶受体、并对引起损伤的细胞进行胞毒性攻击。然后治疗即针对引起损伤的细胞发挥作用。另外，可以提供分泌可溶性受体或其他肽或蛋白质的条件，其中分泌产物将抑制对引起损伤之细胞的活化或诱导无反应性。另一种可替代的手段是分泌可用于减小退化作用的抗炎产物。

第四个例子包括通过包裹用内啡肽治疗慢性疼痛。用其中以嵌合转录调节蛋白质控制人内啡肽转录的构建体转染人成纤维细胞的原株。DNA构建体由TATAAA位点和转录起始位点上游的HNF-1^*转录因子GTTAAGTTAAC的3个结合位点拷贝组成。内啡肽cDNA将被***到起始位点的下游，多腺苷酸和终止序列的上游。任选地，内啡肽cDNA装备有“PEST”序列以使蛋白质不稳定，或者在mRNA的3′非翻译区中有AUUA序列以使其被快速降低。

也用有两个转录单位的构建体转染成纤维细胞，其中之一将编码截短的HNF-1^*cDNA，以正好编码从氨基酸1到250的DNA结合序列，后者偶联到处于在成纤维细胞中有功能的调节起始和终止区之转录和翻译控制下的三聚FKBP结合区域上。构建体应包括一个附加的转录单位，后者是由偶联到三聚FKBP′结合区上的指导衍生于HNF-4之转录激活区产生的同一调节区域驱动的(该最好部分意欲改变FKBP以nM浓度结合到经修饰的FK506上。此修饰抑制了与内源性FKBP的结合)。

可包裹这些总体上修饰的细胞以抑制免疫识别，并放在病人的皮下或其他方便的体内部位。当病人需要疼痛药物治疗时，给病人使用二聚配体FK506-FK506′，给予大约1μg至1mg应是足够的。以这种方式可以在无须注射或没有成瘾危险的情况下提供止痛效果。

第五个例子是治疗骨质疏松。可以克隆扩增淋巴细胞或培养生长来自待治疗病人的皮肤成纤维细胞。按上述方法转染细胞，其中用骨形态形成因子cDNA基因取代内啡肽基因。对于淋巴细胞，可以使用抗原特异性克隆，以允许用抗sIg之独特型抗体破坏之。另外，给予sIg的抗原将会扩充细胞群体，以增加可被释放之蛋白质的量。可注入淋巴细胞克隆并给予产生骨形态形成因子所需的配体。监测对配体的反应，并可根据监测的结果调整所产生的骨形态形成因子的量，以便将剂量调到所需要的水平。

另一种情况是修饰抗原特异性T细胞，此时可以为激活细胞而激活蛋白质的表达。其中T细胞受体可能是直接针对肿瘤细胞、病原体、细胞介导的自身免疫等的。通过提供细胞的激活，例如象IL-2这样的白介素即可在对配体反应中用于扩充被修饰的T细胞。被修饰之T细胞的其他应用可包括表达将T细胞导向特定部位的寻靶受体，由此可望实现细胞毒性、靶细胞例如上皮细胞表面膜蛋白质的向上调节，或其他所需的生物学过程。

另外可能要求向靶部位释放高剂量的胞毒性因子。例如，在通过寻靶受体识别肿瘤抗原后，可以激发肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)释放出毒性浓度的TNF或其他相似产物。

另一种可替代的应用是输出被胞吐的激素或因子。在提高了胞吐作用的情况下，将会输出更大量的激素或因子；此外，如果有一个基于胞质中激素或因子的量的反馈机制，则将增加激素或因子的产生。或者，可以提供诱导的激素或因子的表达，以致能够相伴随地诱导表达和输出。

也可以供给在保留的体液如血管***、淋巴***、脑脊液等中的蛋白质。经修饰可以具有延长了在宿主中之半寿期的细胞，例如造血细胞、角质形成细胞、肌细胞等，特别是干细胞，蛋白质即可更长时间地保留在体液中。可以用提供分泌或胞吐作用的构建体来修饰细胞。适于实现分泌的构建体应具有作为转位区的信号肽，并且在使用其他嵌合蛋白质的情况下则具有结合区和作用区。作用区可得自于相同或不同的蛋白质。例如，就组织血纤维蛋白溶酶原激活物来说，其可以有凝块结合区为一个作用区，并有血纤维蛋白溶酶原活性位点为另一个不同的作用区。另外，也可以利用结合蛋白质，例如LFA-1作为一个作用区并用选择素作为第二个作用区，从而提高了对自动寻标的阻断。通过修饰蛋白质例如整联蛋白、T细胞受体、sIg等的亚单位，可以提供能够聚集并与某分子结合的可溶形式的表面膜蛋白质。其他机会是补体蛋白质、参与凝血的血小板膜蛋白质、细胞表面上的自体抗原，以及感染剂表面上的病原体分子。

IX.构建体导入细胞内

本文所述的构建体可以作为一个或多个DNA分子或其构建体导入细胞中，这些构建体中通常至少有一个标志物并可能有两个或多个标志物，借以选择含有构建体的宿主细胞。可以用常规方法制备构建体，包括分离基因和调节区，适当情况下经连接后克隆到适当的克隆宿主中，并经限制性酶切或序列测定分析或其他常规手段分析之。具体地说，可以利用PCR，分离包含全部或部分功能性单位的个别片段，其中可以使用“引物修补”、并在必要时利用连接、体外诱变等手段引入一个或多个突变。在完成构建并证明所得构建体具有适当的序列后，即可用任何常规方法将其导入宿主细胞中。可以将构建体整合并包装到非复制的、有缺陷的病毒如腺病毒、腺相关病毒(AAV)或单纯性疱疹病毒(HSV)或其他病毒，包括反转录病毒的基因组中，以感染或转导到细胞内。如果需要的话，构建体可以包括转染的病毒序列。或者，也可以借助融合、电穿孔、biolistics、转染、脂染等技术导入构建体。在导入构建体之前，通常要培养宿主细胞并在培养物中扩充之，然后经适当处理以导入构建体并整合该构建体。扩展细胞并借助存在于构建体中的标志物筛选之。可被成功地使用的各种标志包括hprt、新霉素抗性、胸苷激酶、潮霉素抗性等。

在某些情况下，可以有同源重组的靶位点，其中可望在特定位点整合构建体。例如，可以使用本领域已知的同源重组的材料和方法，“击倒”(knock-out)内源基因并用构建体编码基因取代之(在同一位点或其他位点)。另外，可以修饰对信号起始区起反应之内源基因的转录起始区，而不是提供基因。在这样的实施方案中，可经给予配体来控制如EPO、tPA、SOD等内源基因的转录。对于同源重组，可以使用Ω或O-载体(例如参见Thomas and Capecchi，Cell(1987)51，503-512；Mansour，et al.，Nature(1988)336，348-352；Joyner，et al.，Nature(1989)338，153-156)。

构建体可以作为编码所有基因的单一DNA分子，或有一个或多个基因的不同DNA分子被导入。可以同时或相继地导入各有相同或不同标志物的构建体。在一实例中，一个构建体含有处于特异性反应元件控制下的治疗基因(如NFAT)，另一个则编码含有融合到配体受体区(如在MZF3E中的)上之信号发生区的受体融合蛋白质。也可以导入编码寻靶受体或增加治疗产物之释放效率的其他产物的第三个DNA分子。

可用于制备构建体DNA贮备物并完成转染的含有细菌或酵母复制原点、可选择和/或可扩增标志、在原核或真核细胞中表达所需之启动子/增强子元件等有用元件的载体是本领域中已知的，并且可以市场上购得。

X.细胞和配体的施用

使已用DNA构建体修饰的细胞在选择条件下在培养基中生长，然后可扩充根据其含有构建体而选择的细胞，并使用例如聚合酶链反应检测宿主细胞中构建体的存在而进一步分析之。一旦鉴定了被修饰的宿主细胞之后，即可按计划使用之，如培养这些细胞或导入宿主生物体中。

然后可根据细胞的性质，以多种不同的方法将细胞导入宿主生物体，如哺乳动物体中。通常以至少约10⁴个细胞，一般不超过约10¹⁰个，较好不超过约10⁸个细胞的细胞数将造血细胞注射到血管***内。所使用的细胞数目将取决于多种环境条件、导入的目的、细胞的半寿期、待使用的程序例如给予的次数、细胞增殖的能力、治疗剂的稳定性、对治疗剂的生理需要等因素。另外，皮肤细胞可以作为移植物使用，其细胞数目取决于待施用于烧伤或其他损伤上的细胞层的大小。一般说来，成肌细胞或成纤维细胞的细胞数目至少约10⁴个且不超过大约10⁸个，并且可作为分散体施用，一般是注射到感兴趣的部位或其附近。细胞一般都是存在于生理上可接受的培养基中。

在许多情况下可希望在体内修饰细胞而不是在体外修饰细胞。为此目的，已开发了多种不同的体内修饰靶组织和细胞的技术。已开发了许多病毒载体，如可以将病毒转染和随机整合到宿主中的腺病毒和反转录病毒(例如参见Dubensky et al.(1 984)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81，7529-7533；Kaneda et al.，(1989)Science 243，375-378；Hiebertet al.，(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA86，3594-3598；Hatzoglu et al.(1990)J.Biol.Chem.265，17285-17293和Ferry et al.(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88，8377-8381)。载体可经血管内或肌肉内注射、吸入或其他胃肠道外方式使用。

按照体内遗传修饰，修饰的方法取决于组织的性质、所需的细胞修饰的效力、修饰特定细胞的机会、组织对被导入这DNA组合物的可接近性等。应用携带靶转录起始区的被减毒或修饰的反转录病毒后，必要时可使用本发明转录因子构建体之一来活化病毒，从而可以产生病毒并转染相邻的细胞。

DNA导入不一定在每种情况下部导致整合。在某些情况下短暂保留被导入的DNA即可满足需要。以这种方式可使被导入的DNA具有短期效应，这种情况下可将细胞导入宿主体内并经过预定时间后，例如当细胞已能够定位到特定部位后开通其活性机制。

然后可根据需要使用激活胞质区的配体。可根据配体的结合亲和性、所需的反应、施用方式、细胞半寿期、所存在的细胞数目的不同，使用多种不同的方法。配体可以以胃肠道外或口服途径使用。可根据上述因素确定给药次数。配体可以作为药丸、粉末、或分散体给口服摄入，或口颊内、舌下含服；血管内、腹膜内、皮下注射；吸入等途径使用。可使用本领域熟知的常规方法和材料来配制适于各种途径给药的配体(及单体化合物)。给药的精确剂量和特定方法将取决于上述因素，并可由临床医生或人或动物保健提供者来确定。在大多数情况下，给药方式将根据经验确定。

在欲逆转由配体激活的过程时，可以给予单体化合物或其它能与配体竞争的信号结合位点化合物。因此，在有不利反应或期望终止治疗效果的情况下，可以以任何方便的方式，特别是经血管内(如果希望快速逆转的话)途径使用单体结合化合物。此外，也可以在存在失活区(或转录沉默子)的情况下提供DNA结合区。在另一种方法中，通过本文别处所述的Fas或TNF受体发出信号使细胞程序死亡即可消除细胞。

可以按照治疗剂量监测程序来确定用于各种应用之配体的特定剂量，其中可望在延长的时间里，例如大约两周以上维持特定的表达水平；或者在重复治疗的情况下，以长的间隔期例如两周或更长时间的间隔期，在短时间里给予单个或重复剂量的配体。可以在预定范围内给出配体的剂量并监测反应，以便得出时间-表达水平关系曲线，同时观察治疗反应。可根据在此期间观察到的表达水平和治疗反应，按照反应大小在下次提供更大或更小的剂量。可以反复重复这一过程直到得到一个治疗范围内的有效剂量。当缓慢投用配体时，一旦确定了配体的维持剂量，即可以以延长的间隔期进行检测，从而确保该细胞***是可以提供适当的反应和表达产物水平的。

值得注意的是，该***受制于许多可变因素，如细胞对配体的反应、表达效率以及必要时的分泌水平、表达产物的活性，病人的随时间和环境而改变的特殊需要，以及因细胞丢失而丢失细胞活性的速度或个别细胞的表达活性等。因此，既使有可以对大的群体使用的一般性细胞，也期望对每个个别病人监测其适当的个体剂量。

本方法学和组合物可用于治疗多种病理状况或病征。例如可用B和T细胞***、感染性疾病、代谢缺陷、心血管病、遗传性凝血缺陷、自身免疫性疾病、关节退化性疾病，例如关节炎、肺部疾病、肾病、内分泌异常等。可使用牵连结构的各种细胞例如成纤维细胞和成肌细胞治疗遗传缺陷，如***缺陷、关节炎、肝病等。在必须制得大量蛋白质以补充缺陷或向肝炎或门脉循环中释放治疗产物的情况下，则可以使用肝细胞。

给出下列实施例旨在举例说明而不是限制本发明。

实施例

细胞的转化和评估

实施例1：经交联T细胞受体的CD3链诱导已分离的IL-2增强子结

合转录因子

将(1)用SspI和HindIII切割的pPL/SEAP(Berger，et al.，Gene(1988)66，1)；(2)用Nde I切割，用Klenow修成平头，然后用PvuI切割的pSV2/Neo(Southern and Berg，J.Mol.Appl.Genet.(1982)1，232)和(3)用PvuI与HindIII切割的各种含启动子质粒(即NFAT-CD8、B-CD8、cx121acZ-Oct-1、AP1-LUCIF3H，或cx15IL2)(如下所述)的三片段连接，制成含有处在人IL-2启动子(-325至+47；MCB(86)6，3042)控制下之胎盘分泌的碱性磷酸酶基因的质粒pSXNeo/IL2(IL2-SX)(图1)，及相关质粒变异体(即NFAT-SX，NF B-SX、OAP/Oct1-SX和AP-1-SX)-其中报导基因处于与含有各种启动子元件(即分别是NFAT、NKB、OAP/Oct-1和AP1)的合成寡聚体结合的最小IL-2启动子(-325至-294和-72至+47)的转录控制之下。NFAT-CD8含有NFAT结合位点(-286至-257；Gene and Dev.(1990)4，1823)的3个拷贝，且cx121acZ-Oct含有来自人IL-2增强子的OAP/Oct-1/(ARRE-1)结合位点(MCB，(1988)3，1715)的4个拷贝；B-CD8含有来自小鼠轻链之NF B结合位点(EMBO，(1990)9，4425)的3个拷贝，且AP1-LUCIF 3H含有来自金属硫蛋白启动子之AP-1位点(5′-TGACTCAGCGC-3′)的5个拷贝。

在各次转染中，将5μg编码嵌合受体TAC/TAC/Z(TTZ)(PNAS88，8905-8909)的表达载体pCDL-SR(MCB8，466-72)(Tac-IL2受体链)连同各种以分泌碱性磷酸酶为基础的报导质粒(见图1中pSXNzo/IL2的基因图)共转染到TAg Jurkat细胞(用SV40大T抗原稳定转染的人T细胞白血病Jurkat细胞系的衍生物[Northrup，et al.，J.Bi ol.Chem.，1993])中。各报导质粒均含有用于最小IL-2启动子内不同IL-2增强子结合转录因子之结合位点的多聚合寡核苷酸，或者是报导基因的完整IL-2增强子/启动子上游。24小时后，将细胞的等分样品(约10⁵个)放在含有对数稀释度之结合的抗TAC(CD25)mAb(33B3.1；AMAC，Westbrook，ME)的微量滴定板小井中。作为阳性对照并控制转染效率，向各次转染的等分样品中加入肌霉素(ionomycin)(1μm)和PMA(25ng/ml)。继续保温14小时后，检测上清液中的碱性磷酸酶活性，以及相对于阳性对照组样品所表达的这些活性。加入1ng/ml FK506，所有活性均由于NFAT而降到本底水平，证明失活作用是以用FK506阻断的同样途径发生的。所得到的各数据点都是两份样品的平均值，并且几次实验均得到相似的结果(见图5)。数据表明，用已知的细胞外受体，得到报导基因和不同增强子的适当反应。当使用抗TcR复合物(即OKT3)MAb时得到了相似的结果。

实施例2：免疫抑制剂药物FK506和环孢菌素A(CsA)或二聚衍生化

合物FK1012A(8)、FK1012B(5)、CsA二聚体(PB-

1-218)的抑制活性

向10⁵个TAg-Jurkat细胞中加入肌霉素(1μm)和PMA(25ng/ml)。另外，加入各种滴定度的不同药物。5小时后在温和去污剂(即Triton X-100)中溶解细胞并使提取物与β-半乳糖苷酶底物，MUG(甲基半乳糖苷基繖形酮)一起保温1小时。加入甘氨酸/EDTA停止缓冲液并检测提取物的荧光值。所得到的每个数据点都是两份样品的平均值，并且几次实验都得到相似的结果。令人惊奇的是，FK1012B在最高浓度(即5μg/ml)似乎可稍微放大促细胞***素活性；但对照实验则显示单独FK1012B没有刺激作用(见图6)。

实施例3：二聚FK506衍生物FK1012A对嵌合FKBP12/CD3

(1FK3)受体的活性

5μg含有嵌合受体(1FK3)的真核表达载体pBJ5(基于在16S拼接位点和poly A位点间***了多接头的pCDL-SR)与4μgNFAT可诱导地分泌碱性磷酸酶的报导质粒NFAT-SX进行共转染。在平行的转染中，使用5μg pBJ5代替1FK3/pBJ5作为对照。24小时后，将含有约10⁵个细胞的各转染实验的等分样品与如上指出的对数稀释度的药物FK1012A一起保温。作为阳性对照并为了控制转染效率，向各转染的等分样品中加入肌霉素(1μm)和PMA(25ng/ml)。继续保温14小时后，检测上清液的碱性磷酸酶活性和相对于阳性对照样品的被表达的这些活性。加入2ng/ml FK506使所有刺激作用降至本底水平，证明活化是以与用FK506阻断一样的途径进行的。因此，FK506或环孢菌素将作为使用这些化合物的有效解毒剂。所得到的各数据点均为两份样品的平均值，并且几次实验都得到了相似的结果(见图7)。

实施例4A：二聚FK506衍生物FK1012B对肉豆蔻酰化嵌合CD3/

FKBP12(MZF3E)受体的活性

我们成功地证明了许多进行配体设计与合成的办法，包括用称为“FK1012”的基于FK506的HOD试剂得到的阳性结果。我们已发现FK1012达到2∶1结合化学计算值的高亲和性(Kd(1)＝0.1nM；Kd(2)＝0.8nM)，并且不抑制神经钙蛋白(calcineurin)介导的TCR信号发生。此配体既非“免疫抑制性”的也无毒性(在细胞培养物中高达0.1mM)。同样，我们已制备了基于环孢菌素A的同二聚试剂“(CsA)2”，其可以1∶2的化学计算量与CsA受体亲环素结合，但不与神经钙蛋白结合。因此，象FK1012一样，(CsA)2并不抑制信号传输途径，并且既不是免疫抑制性的同样也无毒性。

我们的配体介导的蛋白质联系的这样及其他实例均导致了对信号转导途径的控制。在一个实例中，这一目的是通过产生由足以进行翻译后肉豆蔻酰化的Src的小片段(M)、ζ的胞质尾部(Z；也使用B细胞受体的成分)、三个连续的FKBP12(F3)和flu表位tag(E)组成的细胞内受体而实现的。在人(Jurkat)T细胞中表达构建体MZF3E(图18)后，我们进一步证实所编码的嵌合蛋白质经受了FK1012介导的低聚合。根据在对FK1012反应中(EC₃₀＝50nM)碱性磷酸酶分泌作用(SEAP)所证实的，伴随的ζ链的聚集导致通过内源性TCR信号传输途径发生信号(图15)。构建SEAP报导基因的启动子以由被激活之T细胞的核因子(NFAT)转录激活，使其在TCR信号发生后组装在核中。可通过称为FK506-M的配体的无毒性单位译本诱导的去聚集过程来终止FK1012诱导的信号传输。

具体地说，5μg真核表达载体，即含有肉豆蔻酰化嵌合受体的pBJ5与4μg NFAT-SX共转染。MZE、MZF1E、MZF2E和MZF3E分别含有处在肉豆蔻酰化CD3胞质区下游的0、1、2、或3个FKBP12的拷贝。(见图2)。作为对照，在平行的转染实验中使用5μgpBJ5。24小时后，将约含10⁵个细胞的各转染样品的等分部分与如所指出的药物，FK1012B的对数稀释液一起保温。作为阳性对照并为了控制转染效率，向各转染的等分样品中加入肌霉素(1μm)和PMA(25ng/ml)。继续保温12小时后，检测上清液的碱性磷酸酶活性和相对于阳性对照样品被表达的这些活性。加入1ng/mlFK506使所有刺激作用降到接近本底水平，证明激活是以如用FK506阻断同样的途径进行的。这一结果进一步证实本发明细胞激活作用的可逆性。所得到的各数据点均为两份样品的平均值并且所进行的几次实验都得到了相似的结果(见图8)。肉豆蔻酰化的衍生物以大约放大一个数量级对较低浓度的配体起反应，并且激活NFAT依赖性转录达到可比较的水平，但应注意到的是配体是不同的(比较图7和8)。

体内FK1012诱导的蛋白质二聚合。我们接下来要进一步证实MZF3E受体的细胞内聚集确定是由FK1012诱导的。因此使MZF3E构建体的流感血细胞凝集素表位-tag(flu)与不同的表位-tag(flag-M2)交换。在Jurkat T细胞中共表达密切相关的嵌合体MZF3Eflu和MZF3Eflag。用FK1012A处理细胞后使用偶联在琼脂糖小球上的抗F lag抗体进行免疫沉淀实验。在FK1012A(1μM)存在下，蛋白质嵌合体MZF3Eflag与MZF3Eflu相互作用，并与MZF3Eflag共免疫沉淀。不存在FK1012A时则观察不到MZF3Eflu的共免疫沉淀。用FKBP单体构建体MZF 1 Eflu和MZF 1 Eflag进行的相关实验并没有出现信号，表明它们也在FK1012A作用下发生了二聚合。这一结果反映了用内源性T细胞受体和我们的人工受体MZF3E观察到的聚集要求。

FK1012诱导的蛋白质-酪氨酸磷酸化作用在抗原刺激后TCR、CD3和ζ链的细胞内区域与胞质蛋白质酪氨酸激酶相互作用。Src家庭的特殊成员(lck和/或fyn)使这些细胞内区域内活化基序(酪氨酸活化基序，TAM)的一个或多个酪氨酸残基磷酸化。酪氨酸激酶ZAP-70被补充(通过其两个SH2区域)到酪氨酸磷酸化的T细胞受体上，被活化，并很可能参与磷酸化酶C的进一步的下游激活作用。如在E分别免疫沉淀内源性T细胞受体ζ链和MZF3E构建体后经体外激酶检测法所测得的，向用MZF3E稳定转染的Jurkat细胞中加入抗CD 3 MAb或FK1012A，导致了对ζ链之激酶活性的恢复。用抗CD3MAb或FK1012处理细胞后，使用单克隆α-磷酸酪氨酸抗体检测酪氨酸磷酸化作用。在刺激后的不同时间分析整个细胞溶胞产物。用抗CD3MAb或FK1012刺激后观察酪氨酸磷酸化之蛋白质的类似图形。该图形由可能是ZAP-70的70 kDa之主带和120kDa、62kDa、55kDa及42kDa的小带组成。

实施例4(B)：用亲免素-Fas抗原嵌合体调节程序化的细胞死亡

Fas抗原是细胞表面受体中神经生长因子(NGF)/肿瘤坏死因子(TNF)受体超家族的成员。Fas抗原与抗其细胞外区的抗体交联可激活一个知之很少的信号发生途径，由此导致程序化的细胞死亡或细胞自然死亡。Fas抗原和其相关自然死亡信号发生途径存在于包括可能所有肿瘤细胞在内的大多数细胞中。该途径导致迅速而独特的细胞死亡(2小时)，特征在于胞质浓缩、没有炎性反应及核小体DNA断裂，而这些特征部是坏死性细胞死亡中见不到的。

我们还发展了一个次等的、导致细胞自然死亡的可诱导的信号发生***。同MZF3E途径一样，该途径是通过激活一个人工受体而产生的，所说的人工受体则是构成上表达之“应答者”基因的产物。但此新的途径不同于第一个途径之处在于我们的HOD试剂诱导内源途径的产物而不是被转染的、可诱导的(如报导)基因的产物的合成。

增加对Fas途径的控制为生物学研究和医学进步提供了重要的机会。用处于细胞特异性启动子控制下的“死亡”应答基因设计转基因动物。然后可以给动物施用HOD试剂，以化学消除成年动物体内的靶细胞。以这种方法，可以评价特定脑细胞在记忆或认识中的作用，或免疫细胞在诱发或维持自体免疫性疾病中的作用。也可以使用由M.Blaese及其同事建立的人基因治疗技术(Culver，et al.，Science256，5063(1992)：1550-2)将死亡应答基因导入肿瘤中，然后经用HOD试剂处理病人而相继激活这些基因(类似于最近报导的治疗脑肿瘤的“gancyclovir”基因治疗临床试验)。最后，我们设想在基因治疗的实践中合用死亡应答基因和治疗基因。这将为基因治疗提供一种“失效保护”组分。如果什么东西要跑掉(一个共同讨论的问题是导致肿瘤的整合诱导的肿瘤抑制基因的丢失)，基因治疗病人就可服用将杀死所有被转染细胞的“失效保护”药片。因此我们为此目的设计了低聚合化试剂的正交***。因此，我们提供了一套配体和嵌合应答蛋白以用于调节宿主细胞的程序化死亡，另一套用于调节治疗基因的转录。用于调节治疗或所需基因转录的配体被设计为(或选择为)不能交叉反应和启动细胞程序死亡。

已构建了由三个与Fas抗原的胞质信号传输区相融合之FKBP12区组成的嵌合cDNA范例(图19)。当在人Jurkat和小鼠D10T细胞中表达时，可由FK1012试剂诱导该构建体二聚合，并发起将导致FK1012依赖性自然死亡过程的信号级联。如根据报导基因活性丢失所确定的，FK1012A介导的被MFF3E短暂转染之细胞死亡的LD50值为15nM(见图19；有关检测法的讨论参见图20)。这些数据与在稳定转染的细胞系中进行的细胞死亡检测结果相符。因为稳定的转染体代表了一个细胞的同源群体，所以它们已被用于确定死亡是由于自然死亡而不是坏死(膜起泡、核小体DNA断裂)。然而，短暂转染程序更加方便，并因此被用作如下描述的初始试验***。

实施例4(C)：用亲环素-Fas抗原嵌合体调节程序化的细胞死亡

我们还制备了一系列亲环素C-Fas抗原构建体并在短暂表达试验中检验了它们的诱导(CsA)2依赖性自然死亡的能力(图20A)。

此外，已经用被该系列中最活跃的构建体MC3FE(M＝Src的肉豆蔻酰化区域，C＝亲环素区域，F＝Fas的胞质尾部，E＝flu表位tag)稳定转染的人Jurkat T细胞证明了(CsA)2依赖性自然死亡。在1、2、3或4个连续的亲环素区域之前或之后融合了Fas的胞质尾部。也制备了两个缺少Fas区的对照构建体。在这种情况下，我们观察到只有当放在二聚区之后时信号发生区才有功能活性(当放在二聚区之前或之后时ζ链构成信号)。如由Western印迹分析所证实的，3个信号发生构建体的表达水平和其活性有着量上的不同(图20B)。已如此明确证明的最佳***是MC3FE。MC3FE进行的(CsA)2介导之细胞死亡的LD₅₀约为200nM。这些数据证明了亲环素-环孢菌素相互作用对于调节细胞内蛋白质联系的实用性，并举例说明了不与FKBP12-FK1012***发生交叉反应的正交试剂***。此外，在此情况下，数据还显示由Fas胞质尾部发起信号传送只需要二聚合而不需要聚集。

肉豆蔻酰化作用信号的N末端甘氨酸突变为丙氨酸将阻止肉豆蔻酰化，并因此而阻止膜定位。我们也已观察到突变的构建体(△MFF3E)具有如FK1012依赖性自然死亡的诱导物的等同能力，此表明膜定位对于Fas介导的细胞死亡并不是必须的。

实施例5：鼠信号传送嵌合蛋白质的构建

使用图4中所述的引物制得各个不同的片段。有关引物编号应参见图4。

使用含鼠II类MHC受体(Cell，32，745)之I-E链的约1.2kbcDNA片段作为信号肽的来源，用供应商(Promega)描述的PCR方法由P#6048和P#6049制得70bp SacII-XhoI片段。使用含有连接到CD3之跨膜和胞质区(PNAS，88，8905)上的Tac(IL2受体链)的质粒制得第二个片段。使用P#6050和P#6051，以PCR方法制得CD3之跨膜区和胞质区的32Dbp XhoI-EcoRI片段。连接这两个片段并***SacII-EcoRI消化的pBluescript(Stratagene)中以得到质粒SPZ/KS。

为了得到FK506的结合区，使用质粒rhFKBP(由S.Schreiber提供，Neture(1990)346，674)与P#6052和P#6053制得含有人FKBP12的340bp XhoT-SalI片段。将该片段***用XhoI和SalI消化的pBluescript中以提供质粒FK1 2/KS，并以其作为FKBP12结合区的来源。用XhoI消化SPZ/KS，磷酸化(细胞小肠碱性磷酸酶：CIP)以防止自身退火，并与10倍摩尔过量的来自FK12/KS的含XhoI-SalI FKBP 12片段结合。分离在正确方向上含有单体、二聚和三聚FKBP12的克隆。克隆1FK1/KS、1FK2/KS和1FK3/KS在转录方向上由来自鼠MHCII类基因I-E的信号肽、分别是人FKBP12的单体、二聚体或三聚体的部分，以及CD3的跨膜和胞质部分组成。最后，使用限制性酶从pBluescript切下SacII-EcoRI片段并连接到已用SacII和EcoRI消化的p3J5的多接头中，以分别得到质粒1FK1/pBJ5、1FK2/pBJ5和1FK3/pBJ5(见图3和4)。

实施例6：

A.细胞内信号传送嵌合体的构建

从Pellman等人(Nature 314，374)处得到来自c-src的肉豆蔻酰化序列并连接到CD3的互补序列上，以提供互补于跨膜区之序列3′的引物，即P#8908 。该引物具有与肉豆蔻酰化序列的5′末端相邻的SacII位点，以及与其3′末端相邻的XhoI序列。另一引物P#8462具有与CD3之3′末端序列互补的序列SalI识别位点3′，终止密码子及EcoRI识别位点。使用PCR制得由肉豆蔻酰化序列和在5′-3′方向融合的CD3序列组成的450bp SaclI-EcoRI片段。将该片段连接到SacII/EcoRI消化的pBJ5(XhoI)(SalI)中并克隆之，得到质粒MZ/pBJ5。最后，用SalI消化MZ/pBJ5，磷酸化，并与10倍摩尔过量的来自FK1 2/KS的含XhoI-SalI FKBP12片段合并并连接之。克隆后，分离含有在5′-3′方向上由肉豆蔻酰化序列、CD3和FKBP12多聚体组成之所需构建体的质粒，并验证其具有正确结构(参见图2和4)。

B.细胞内信号传送嵌合体表达盒的构建

用限制性酶XhoI和SalI消化构建体MZ/pBJ5(MZE/pBJ5)，除去TCRζ片段并将所得载体与10倍过量的FKBP12的单体、二聚体、三聚体或更高级聚合体连接，以制得MF1E、MF2E、MF3E或MFnE/pBJ5。然后可将经过消化以含有相容性侧翼限制性位点(即XhoI和SalI)的活性区克隆到MFnE/pBJ5的唯一XhoI或SalI限制位点中。

实施例7：核嵌合体的构建

A.GAL4 DNA结合区-FKBP区域一表位tag。使用含有Kozak序列之SacII位点上游和翻译起始位点的5′引物(#37)，和含有SalI位点的3′引物(#38)，以PCR方法扩增GAL 4 DNA结合区(氨基酸1-147)。分离P(CR产物，用SacII和SalI消化，在SacII和SalI位点处连接到pBluescrjpt II KS (+)中，得到构建体pBS-GAL4 。经序列分析证实该构建体。分离pBS-GAL 4中的SacII/SalI片段并在SacII和XhoI位点处连接到IFK1/pBJ5和IFK3/pBJ5构建体(合有肉豆蔻酰化序列，见实施例6)中，得到构建体GF1E、GF2E和GF3E。

PCR扩增产物的5′端：

SacII |----Gal4(1-147)--->>

—— M K L L S S I

5′ CGACACCGCGGCCACCATGAAGCTACTGTCTTCTATCG

——

Kozak

PCR扩增产物的3′端：

<<----Gal4(1-147----)|

R Q L T V S5′ GACAGTTGACTGTATCGGTCGACTGTCG

3′ CTGTCAACTGACATAGCCAGCTGACAGC

——

SalIB.HNF1二聚合/DNA结合区-FKBP区域-tag。

使用含有Kozak序列之SacII位点上游和翻译起始位点的5′引物(#39)，和含有SalI位点的3′引物(#40)，以PCR方法扩增HNFla二聚/DNA结合区(氨基酸1-282)。分离PCR产物，用SaclI和SalI消化并在SacII和SalI位点处连接到pBluescriptIIKS(+)中，产生构建体pBS-HNF。经序列分析证实该构建体。分离pBS-HNF中的SacII/SalI片段并在SacIl和XhoI位点处连接到IFK1/pBJ5和IFK3/pBJ5构建体中，产生构建体HF1E、HF2E和HF3E。

PCR扩增产物的5′端：

SacII |--FNF1(1-281)-->>

—— M V S K L S

5′ CGACACCGCGGCCACCATGGTTTCTAAGCTGAGC

——

Kozak

PCR扩增产物的3′端：

<<——HNF1(1-282)——|

A F R H K L

5′CCTTCCGGCACAAGTTGGTCGACTGTCG

3′GGAAGGCCGTGTTCAACCAGCTGACAGC

——

SalI

C.FKBP区-VP16转录激活区-表位tag。以下述三个步骤制得这些构建体：(i)由IFK3/pBJ5产生其中的肉豆蔻酰化序列被直接接在XhoI位点上游之起始位点所取代的构建体，得到构建体SF3E；(ii)将核定位序列***XhoI位点，产生构建体NF3E；(iii)将VP16激活区克隆到NF3E的SalI位点中，产生构建体NF3EV1E。

(i)将编码Kozak序列和侧接有SacII和XhoI位点之起始位点的互补寡核苷酸(#45和#46)一起退火，经磷酸化处理后连接到MF3E的SacII和XhoI位点中，产生构建体SF3E。种属起始位点的***

Kozak

_____M L E

5′ GGCCACCAIGC

3′ CGCCGGTGGTACGAGCT

—— ——

SacII XhoI

突出部分突出部分

(ii)将编码侧接有5′SalI位点和3′XhoI位点之SV40T抗原核定位序列的互补寡核苷酸(#47和#48)一起退火，经磷酸化处理后连接到SF1E的XhoI位点中，产生构建体NF1E。经DNA序列分析证实该构建体。分离一个含有突变或缺陷形式之核定位序列的，其中128位苏氨酸取代赖氨酸的构建体。该构建体被定名为NF1E-M。从pBS-FKBP12中分离作为XhoI/SalI片段的FKBP12序列，并将该片段连接到用XhoI切成线形的NF1E中，得到FKBP12区的多聚体。如此产生了构建体NF2F和NF3E。

将NLS***种属起始位点：

T(ACN)

126 132

L D P K K K R K V L E

5′ TCGACCCTAAGAAGAAGAGAAAGGTAC

3′ GGGATTCTTCTTCTCTTTCCATGAGCT

—— ——

SalI XhoI

因128位上的苏氨酸而产生有缺陷的NLS。

(iii)使用含有SalI位点的5′引物(#43)和含有XhoI位点的3′引物(#44)以PCR法扩增VP16转录激活区(氨基酸413-490)。分离PCR产物，用SalI和XhoI消化并在XhoI和SalI位点上连接到MF3E中，得到构建体MV1E。经DNA序列测定证实该构建体。作为XhoI/SalI片段从MV1E中分离单一VP16序列，并将该片段连接到用XhoI切成线形的MV1E中而产生多聚的VP16区。以同样方法产生构建体MV2E、MV3E和MV4E。从MV1E或MV2E中分离作为XhoI/SalI片段的编码一种或多个多VP16区域的DNA片段并连接到用SalI切成线形的NF1E中，产生构建体NF1V1E和NF1V3E。从pBS-FKBP12中分离作为XhoI/SalI片段的FKBP12序列，并将此片段连接到用XhoI切成线性的NF1V1E中，得到FKBP12区的多聚体。从而导致构建体NF2V1E和NF3V1E的产物。

PCR扩增产物的5′端：

SalI |--VP16(413-490)--->>

_______ A P P T D V

5′ CGACAGTCGACGCCCCCCCGACCGATGTC

PCR扩增产物的3′端：

<<--VP16(413-490)----|

D E Y G G

5′GACGAGTACGGTGGGCTCGAGTGTCG

3′CTGCTCATGCCACCCGAGCTCACAGC

——

Xhol

寡核苷酸：

#3738mer/0.2um/OFF 5′CGACACCGCGGCCACCATGAAGCTACTGTCTT

CTATCG

#3828mer/0.2um/OFF 5′CGACAGTCGACCGATACAGTCAACTGTC

#39

34mer/0.2um/OFF5′CGACACCGCGGCCACCATGGTTTCTAAGCTGAGC

#40 28mer/0.2um/OFF 5′CGACAGTCGACCAACTTGTGCCGGAAGG

#43 29mer/0.2um/OFF 5′CGACAGTCGACGCCCCCCCGACCGATGTC

#44 26mer/0.2um/OFF 5′CGACACTCGAGCCCACCGTACTCGTC

#45 26mer/0.2um/OFF 5′GGCCACCATGC

#46 18mer/0.2um/OFF5TCGAGCATGGTGGCCGC

#47 27mer/0.2um/OFF 5TCGACCCTAAGA-(C/A)-GAAGAGAAAGGTAC

#48 27mer/0.2um/OFF 5TCGAGTACCTTTCTCTTC-(G/T)-TCTTAGGG

实施例8：转录诱导的证明

使用所指出的构建体(各5μg构建体)以电穿孔法(960μF，250v)转染Jurkat TAg细胞。24小时后，将细胞重新悬浮在新鲜培养基中并分成若干等份。取每份转染物的一半与二聚FK506衍生物(实施例14)，以1μM的终浓度保温。12小时后，洗细胞并经反复冻融制备细胞提取物。用标准方法(Molecular Cloning：ALaboratory Manual.Sambrook at al.eds.(1989)CSH Laboratory，pp.16-59 ff.)检测氯霉素乙酰转移酶(CAT)活性。所得数据证明37℃保温18小时后在70μl提取物(总提取物体积为120μl)中如所希望的(样品2中有或没有配体；样品5和6中存在配体)存在CAT活性。该项检测中所使用的样品是：

1. G5E4TCAT(GAL4-CAT报导质粒)

2. G5E4TCAT，GAL4-VP16

3. GSE4TCAT，NFSV1E

4. G5E4TCAT，GF2E

5. G5E4TCAT，GFF2E，NF3V1E

6. G5E4TCAT，GF3E，NF3V1E

化学合成实施例

如本文中所指出的，目前作为低聚剂的特别适用的化合物具有下列结构：

接头-[rbm1，rbm2，…rbmn]。

其中“接头”是如本文所述的与“n”(从2到约5的整数，通常是2或3)可以相同或不同的受体结合部分(“rbm”)共价连接的接头部分。如本文其他段落中所指出的，受体结合部分是已知受体的配体(或其类似物)，如在V(C)部中所列举的配体，并包括能够与FKBP结合的FK506、FK520、雷帕霉素和其类似物；以及能够与各自的受体结合的环孢菌素、四环素、其他抗生素和大环内酯及类固醇。

接头是能够共价结合(“-”)到两个或多个受体结合部分上的双或多功能分子。典型地，接头可含有最高达约40个原子，除了碳和氢外还包括氮、氧和硫。VI(A)部分和各实施例中公开了一些举例说明的接头部分，并且其中包括C1-C30烷基、亚烷基或芳烷基基团，它们可以被取代或不被取代，可以是直链、支链或环状，例如烷基取代基是饱和直链、环状或支链烃部分，优选为1至约12个碳原子，包括甲基、乙基、正丙基、异丙基、环丙基、正丁基、异丁基、叔丁基、环丁基、环丙基亚甲基、戊基、己基、庚基、辛基等等，并任选地可被一个或多个取代基所取代，所述取代基为例如低级烷氧基、羧薹、氨基(取代或亲取代的)、苯基、芳基、巯基、卤素(氟、氯、溴或碘)、叠氮基或氰基。

可以使用市场上可购得的材料和/或本领域已知的方法制备这些化合物。可按下文所述方法制得这些化合物的工程化受体。特别有用的化合物是以小于10^-6，较好小于约10^-7并且甚至更好小于10^-8M的Kd值与受体结合的化合物。

令人感兴趣的低聚合剂中的一个亚类是其中一个或多个受体结合部分为FK506、FK-506型化合物或其衍生物的低聚合剂，其中受体结合部分通过C21(使用FK506编号)上的烯丙基基团(如图9A中所示的化合物5或13)，或通过环己基环(C29-C34)，如通过C32羟基(如图9B中所示的化合物8、16、17)共价连接到接头部分上。可按本文中(包括下述实施例中)所述的方法制备该类化合物。

另一亚类有用的低聚合试剂是其中至少一个受体结合部分是FK520或其衍生物的低聚合试剂，其中FK520或其衍生物的分子共价连接到如图10所示FK1040A或FK1040B中的接头部分上。可按图10所示的方案1、图11A和11B所示的方案2或图12与图13所示的方案3制备这类化合物。

再一个有用低聚合试剂的亚类是其中至少一个受体结合部分为环孢菌素A或其衍生物的低聚合试剂。

应理解到的是，本发明的这些或其他低聚合试剂可以是同低聚合试剂(其中的rbm都是相同的)或导低聚合试剂(其中的rbm是不同的)。可按本文给出的相以方法，包括图13所示的方案3及本文中所讨论过的方法制备异低聚合试剂。

下列合成实施例只是举例说明性的。

A.通用方法。所有反应均在正氮或氩气压力下在烘箱干燥的玻、璃器皿中进行。对空气和湿气敏感的化合物通过注射器或经过橡胶隔片套管导入。

B.物理数据。在Bruker AM-500(500MHz)和AM-400(400MHz)分光仪上记录质子磁共振谱(¹H NMR)。使用溶剂共振作为内部标准(氯仿，7.27ppm)报告来自四甲基硅烷的化学位移(ppm)。数据报告如下：化学位移，多重性(s＝单峰，d＝双重峰；t＝三重峰，q＝四重峰，br＝加宽峰，m＝多重峰)，偶联常数(Hz)，积分，得到低和高分辨率质谱。

C.层析。使用E.Merck硅胶60F玻璃板(0.25mm)经薄层层析(TLC)监测反应。用长波紫外光光照，暴露于碘蒸气，和/或浸没于钼酸铈铵水溶液中然后加热以显现各组分。层析的溶剂为HPLC级。在E.Merck硅胶160(230-400目)上使用所指出的溶剂***的加压流(快速层析)进行液相层析。

D.溶剂和试剂。所有试剂和溶剂都是分析级的，并除了下述特殊要求者外均直接使用。从二苯甲酮羰游基钠中蒸馏四氢呋喃(THF)、苯、甲苯和二***。从氢化钙中蒸馏三乙胺和乙腈。从五氧化二磷中蒸馏二氯甲烷。在减压下从氢化钙中蒸馏二甲基甲酰胺(DMF)并过4_分子筛储存。FK506衍生物的制备

实施例9：FK506-TBS₂(1至2)的硼氢化作用/氧化作用

按照Evans(Evans，et al.，JACS(1992)114，6679；引文同上(1992)6679-6685)所述方法进行硼氢化反应(编号参见Harding，et al.，Nature(1989)341，758)。10ml烧瓶内装入24，32-双[(叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基]-FK506(33.8mg，0.033mmol)和[Rh(nbd)(diphos-4)]BF4(3.1mg，0.004mmol，13mol％)。将此有机混合物溶解在甲苯(2.0ml)中，减压下经4小时除去溶剂。用氮气小心清洗烧瓶，将桔黄色油溶于THF(3.0ml，10mM终浓度)并用冰水浴冷却到0℃。通过注射器加入儿茶酚硼烷(98μl，0.098mmol，在THF中的1.0M溶液，3.0当量)并将所得溶液于0℃搅拌45分钟。反应物于0℃与0.2ml THF/EtOH(1∶1)，然后是0.2ml pH7.0缓冲液(Fisher；0.05M磷酸盐)，再后用0.2ml 30％ H₂O₂骤冷。将溶液于室温下搅拌至少12小时。减压下除去溶剂，将剩余的油溶于甲苯(10ml)中并用饱和碳酸氢钠水溶液(10ml)洗，分离各相并用苯(2×10ml)反萃取水相。

合并有机相并用饱和碳酸氢钠水溶液(10ml)洗一次。用MgSO₄干燥苯相，浓缩，并经快速层析(2∶1己烷∶乙酸乙酯)后得到澄清的无色油状初级醇(12.8mg，0.012mmol，37％)。

制备混合的碳酸酯(2至3)。用Ghosh的方法制备混合的碳酸酯(Ghosh，et al.，Tetrahedron Lett.(1992)33，2781-2784)。在10ml烧瓶内装入初级醇(29.2mg，0.0278mmol)和苯(4ml)。在减压下经60分钟除去溶剂。将油溶解在乙腈(2.0ml，14mM终浓度)中并于20℃搅拌下加入三乙胺(77μl，0.56mmol)。以一份加入N，N′-二琥珀酰亚氨基碳酸酯(36mg，0.14mmol)并于20℃将溶液搅拌46小时。用二氯甲烷稀释反应混合物并用饱和碳酸氢钠水溶液(10ml)洗。分离各相并用二氯甲烷(2×10ml)反萃取水层。合并有机相并干燥(MgSO₄)之，浓缩并进行快速层析(3∶1至2∶1至1∶1己烷∶乙酸乙酯)。分离得到澄清无色的油状所需的混合碳酸酯(16.8mg，0.014mmol，51％)。

FK506的二聚合(3至4)。在一干的1ml锥形玻璃瓶(Kontes Scientific Glassware)内装入混合的碳酸酯(7.3mg，0.0061mmol)和乙腈(250μl，25mM终浓度)。加入三乙胺(10μl，0.075mmol)，再加入对位亚二甲苯二胺(8.3μl，0.0027mmol，加在DMF中的0.32M溶液)。反应物于20℃搅拌22小时并加入二氯甲烷(10ml)稀释使之聚冷。用饱和碳酸氢钠水溶液(10ml)洗该溶液。分离各相并用二氯甲烷(2×10ml)反萃取水层。合并有机相并干燥(MgSO₄)之、浓缩并进行快速层析(3∶1至2∶1至1∶1己烷∶乙酸乙酯)，得到所需的被保护的二聚体，其为澄清的无包油状物(4.3mg，1.9μmol，70％)。

FK506二聚体的去保护(4至5)。将被保护二聚体(3.3mg，1.4μmol)放在配有旋转叶轮的1.5ml聚丙烯管中。加入乙腈(0.5ml，3mM终浓度)并在搅拌下在20℃向溶液中加入HF(55μl，48％水溶液；Fisher)。将此溶液室温搅拌18小时。然后在15ml试管中在二氯甲烷和饱和碳酸氢钠水溶液之间分配去保护的FK506衍生物。旋转试管去充分混合各相，分离后用吸管除去有机相。用二氯甲烷(4×2ml)反萃取水相，并干燥(MgSO₄)合并的有机相，浓缩并进行快速层析(1∶1∶1己烷∶THF∶***至1∶1THF∶***)得到所需的澄清的无色油状二聚体产物(1.7mg，0.93μmol，65％)。

依照上述步骤，可以使用其他单胺和二胺，如苄胺(14)、辛二胺、癸二胺等。

实施例10：用L-Selectride还原FK506(FK506至6)

Danishefsky及其同事已证明用L-Selectride处理FK506可得到有硼酸酯接合C24和C22羟基基团的22-二氢-FK506(Colemanand Danishefsky，Heterocycles(1989)28，157-161；Fisher，et al.，J.Org.Chem.(1991)56，2900-2907)。

混合碳酸酯的制备(6至7)。10ml烧瓶装入22-二氢-FK506-硼酸仲丁酯(125.3mg，0.144mmol)和乙腈(3.0ml，50mM终浓度)，并在室温搅拌下加入三乙胺(200μl，1.44mmol，10当量)至澄清溶液。一次加入N，N′-二琥珀酰亚氨基碳酸酯(184.0mg，0.719mmol)，并将此澄清溶液在室温搅拌44小时。用乙酸乙酯(20ml)稀释溶液，再用饱和碳酸氢钠溶液(10ml)洗涤并分离各相。然后用乙酸乙酯(2×0ml)反萃取水相，合并有机相，干燥(MgSO₄)，并对所得到油进行快速层析(1∶1至1∶2己烷∶乙酸乙酯)，得到作为澄清的无色油的所需混合碳酸酯(89.0mg，0.088mmol，61％)。

FK506混合碳酸酯的二聚合(7至8)。在一干燥的1ml锥形玻璃瓶(Kontes Scientific Glassware)中装入混合的碳酸酯(15.0mg，0.0148mmol)和二氯甲烷(500μl，30mM终浓度)。室温搅拌溶液同时加入三乙胺(9μl，0.067mmol，10当量)再加入对亚二甲苯二胺(0.8mg，0.0059mmol)。反应在20℃下搅拌进行16小时并经用二氯甲烷(5ml)稀释进行骤冷。用饱和碳酸氢钠水溶液(5ml)洗该溶液。分离各相并用二氯甲烷(2×5ml)反萃取水相。合并有机相并干燥(MgSO₄)，浓缩并进行快速层析(1∶1至1∶2己烷∶乙酸乙酯)，得到作为澄清无色油的所需二聚体(7.4mg，3.8μmol，65％)。

按照上述步骤，可以用其他单胺、二胺或三胺代替亚二甲苯二胺，例如可使用苄胺(15)、辛二胺、癸二胺(16)、双-对位二苄胺、N-甲基二亚乙基胺、三-氨基乙胺(17)、三-氨基丙胺、1，3，5-三氨基甲基环己烷等。

实施例11：FK506的氧化裂解和还原(1至9)

按照Kelly(VanRheenen，et al.，Tetrahedron Lett.(1976)17，1973-1976)的方法进行锇酸化。按照Danishefsky(Zell，etal.，J.Org.Chem.(1986)51，5032-5036)的方法裂解。按照Krishnamurthy(J.Org.Chem.，(1981)46，4628-4691)的方法进行醛还原。10ml烧瓶内装入24，32-双[(叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基]-FK506(84.4mg，0.082mmol)、4-甲基吗啉N-氧化物(48mg，0.41mmol，5当量)和THF(2.0ml，41mM终浓度)。通过注射器加入四氧化锇(45μl，0.008mmol，0.1当量)。将澄清的无色溶液室温搅拌5小时。用50％甲醇水溶液(1.0ml)稀释反应混合物并一次加过碘酸钠(175mg，0.82mmol，10当量)。将所得混浊混合物室混搅拌40分钟，用***(10ml)稀释，并用饱和碳酸氢钠水溶液(5ml)洗涤。分离各相并用***(2×5ml)反萃取水层。干燥(MgSO₄)合并的有机层并用固体亚硫酸钠(50mg)处理。然后过滤有机层，浓缩并对油状物进行快速层析(3∶1至2∶1己烷∶乙酸乙酯)处理，得到澄清的无色油，即为不稳定的醛中间体(53.6mg)。将此醛直接溶解在THF(4.0ml)中并在氮环境下冷却到-78℃，并用三[(3-乙基-3-戊基)氧基]氢化铝锂(0.60ml，0.082mmol，0.14M的THF溶液，1.0当量)处理之。将澄清的溶液于-78℃搅拌10分钟，再用***(4ml)稀释并加入饱和氯化铵水溶液(0.3ml)使之骤冷。将混合物温热至室温并加入固体硫酸钠以于燥之。然后过滤混合物并浓缩。对所得到的油进行快速层析(2∶1己烷∶乙酸乙酯)，得到作为澄清的无色油的所需要的醇(39.5mg，0.038mmol，47％)。

混合碳酸酯的制备(9至10)。按Ghosh等人(TetrahedronLett.(1992)33，2781-2784)所述方法制备混合的碳酸酯。10ml烧瓶内装入伯醇(38.2mg，0.0369mmol)和乙腈(2.0ml，10mM终浓度)，并在室温搅拌下加入2，6-二甲基吡啶(43μl.0.37mmol，10当量)。以一份量加入N，N′-二琥珀酰亚氨基碳酸酯(48mg，0.18mmol)并将所得溶液室温搅拌24小时。用***(10ml)稀释反应混合物并用饱和碳酸氢钠水溶液(10ml)洗。分离各相并用***(2×10ml)反应萃取水层。合并有机相并干燥(MgSO₄)、浓缩之，对其进行快速层析(2∶1至1∶1己烷∶乙酸乙酯)。分离得到作为澄清的无色油的混合碳酸酯(32.6mg，0.028mmol，75％)。

氨基甲酸苄酯的制备(10至11)。在一干燥的、1ml锥形玻璃瓶(Kontes Scientific Glassware)内装入混合的碳酸酯10(8.7mg，0.0074mmol)和乙腈(500μl，15mM终浓度)。于室温下搅拌的同时加入三乙胺(10μl，0.074mmol，10当量)，然后再加入苄胺(1.6μl，0.015mmol，2当量)。室温下将反应混合物搅拌4小时。用干燥氮气流除去溶剂并直接对所得到的油进行快速层析，(3∶1至2∶1己烷∶乙酸乙酯)，得到澄清的无色油状的所需被保护的单体(6.2mg，5.3μmol，72％)。

将被保护的单体(6.2mg，5.3μmol)放在配有旋转叶轮的1.5ml聚丙烯管中。加入乙腈(0.5ml，11mM终浓度)并在室温搅拌下加入HF(55μl，48％水溶液；Fisher；终浓度3.0N)。室温下将溶液搅拌18小时。然后使去保护的FK506衍生物在15ml试管中分配于二氯甲烷和饱和碳酸氢钠水溶液之间。旋转试管彻底混合各相，分离后用吸管吸去有机相。用二氯甲烷(4×2ml)反萃取水相并干燥(MgSO₄)合并的有机相，然后浓缩并进行快速层析(己烷∶乙酸乙酯1∶1至0∶1)，得到所需的澄清的无色油状去保护的氨基甲酸苄酯(3.9mg，4.1μmol，78％)。

用二胺如亚二甲苯基二胺(12)、六亚甲基二胺、亚辛基二胺癸二胺(13)或其他二胺代替苄胺，制备本发明的二聚化合物。

实施例12：混合的FK506(12)碳酸酯的制备。在10ml烧瓶中装入24，32-双[(叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基]-FK506(339.5mg，0.329mmol)、4-甲基吗啉N-氧化物(193mg，1.64mmol，5当量)、水(0.20ml)和THF(8.0ml，终浓度41mN)。通过注射器加入四氧化锇(0.183ml，0.032mmol，0.1当量，在水中制成的0.18M溶液)。室温下将澄清的无色溶液搅拌4.5小时。用50％含水甲醇(4.0ml)稀释该反应物并一次加入高碘酸钠(700mg，3.29mmol，10当量)。室温下将混浊的混合物搅拌25分钟，用***(20ml)稀释，并用饱和碳酸氢钠水溶液(10ml)洗。分离各相并用***(2×10ml)反萃取水层。用MgSO₄和固体亚硫酸钠(50mg)干燥合并的有机相。然后过滤和浓缩有机相，将所得到的醛直接溶解在THF(8.0ml)中并在氮气环境下冷却到-78℃，再用三[(3-乙基-3-戊基)氧基]氢化铝锂(2.35ml，0.329mmol，在THF中的0.14M溶液，1.0当量)处理。-78℃下将澄清的溶液搅拌60分钟(以TLC法密切监测)后经用***(5ml)在-78℃稀释进行骤冷并加入饱和氯化铵水溶液(0.3ml)。使混合物温热至室温并加入硫酸钠以干燥该溶液。将混合物搅拌20分钟，过滤、浓缩，并将所得到的油直接溶解于乙腈(10ml)中。向所得到的在CH₃CN中的伯醇溶液中加入2，6-二甲基吡啶(0.380ml，3.3mmol，10当量)和N，N′-二琥珀酰亚氨基碳酸酯(420mg，1.65mmol，5当量)。室温下将异质混合物搅拌19小时，同时用***(30ml)稀释并用饱和碳酸氢钠水溶液(20ml)洗。用***(2×10ml)反萃取水相。合并有机相并干燥(MgSO₄)、浓缩，并进行快速层析(己烷/乙酸乙酯3∶1至2∶1至1∶1)。分离得到呈澄清、无色油状的所需的混合的碳酸酯12(217mg，0.184mmol，4步骤总产率56％)。

实施例13：24，24′，32，32′-四[(叔丁基二甲基甲硅烷基)

氧基]-FK1012-A的制备。(对位亚二甲苯基二胺桥接)于燥的、1ml锥形玻璃瓶内装入混合的碳酸酯(23.9mg，0.0203mmol)和乙腈(500μl，41mM终浓度)。加入三乙胺(28μl，0.20mmol，10当量)后再加入对位亚二甲苯基二胺(46μl，0.0101mmol，在DMF中的0.22M溶液)。反应混合物在室温下搅拌18小时，用干燥氮气除去溶剂，并对所得的油直接进行快速层析(己烷/乙酸乙酯，3∶1至2∶1至1∶1)，分离后得到呈澄清的、无色油状的所需被保护的二聚体(11.9mg，5.3μmol，52％)。

实施例14：FK1012-A(对位亚二甲苯基二胺桥接)(13)的制备

将被保护的二聚体(11.0mg，4.9μmol)放在1.5ml配有旋转叶轮的聚丙烯管中。加入乙腈(0.50ml，10mM终浓度)，于20℃搅拌下加入HF(55μl，48％水溶液；Fisher：终浓度3.0N)。于室温下将溶液搅拌16小时。然后在15ml试管内使去保护的FK506衍生物分配在二氯甲烷和饱和碳酸氢钠水溶液之间。旋转试管使各相充分混合，并在分离后用吸管吸除有机相。用二氯甲烷(4×2ml)反萃取水相，干燥(MgSO₄)合并的有机相，浓缩并对其进行快速层析(己烷/THF/***1∶1∶1至THF/***1∶1)制得作为澄清的无色油的FK1012-A(5.5mg，3.0μmol，63％)。

实施例15：24，24′，32，32′-四[(叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基]-FK1012-B(癸二胺桥接)的制备

在一干燥的1ml锥形玻璃瓶中装入混合的碳酸酯(53.3mg，0.0453mmol)和乙腈(2.0ml，11mM终浓度)。加入三乙胺(16μl，0.11mmol，5当量)，再加入癸二胺(61μl，0.0226mmol，在DMF中的0.37M溶液)。在室温下将反应混合物搅拌12小时，用氮气流除去溶剂，并对所得到的油直接进行快速层析(己烷/乙酸乙酯3∶1至2∶1至1∶1)，分离后得到所需的作为澄清的无色油的被保护的二聚体(18.0mg，7.8μmol，35％)。

实施例16：FK1012-B(癸二胺-1，10桥接)(14)的制备。

将被保护的二聚体(18.0mg，7.8μmol)放在配有搅拌flea的1.5ml聚丙烯管中。加入乙腈(0.45ml，16mM终浓度)，并在室温下搅拌同时向溶液中加入HF(55μl，48％水溶液；Fisher，终浓度3.6N)。将溶液于23℃搅拌17小时。然后使产物FK1012-B分配于15ml试管中的二氯甲烷和饱和碳酸氢钠水溶液之间。充分旋转试管以混合各相。分离后用吸管吸掉有机相。用二氯甲烷(4×2ml)反萃取水相，干燥(MgSO₄)合并的有机相，浓缩并进行快速层析(100％乙酸乙酯至乙酸乙酯/甲醇20∶1)，得到作为澄清的无色油的FK1012-B(5.3mg，2.9μmol，37％)。

实施例17：24，24′，32，32′-四[(叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基]-FK1012-C(双-对位氨基甲基苯甲酰基癸二胺桥接)的制备。

在一干燥的25ml滴形烧瓶内装入二胺连接物(15.1mg，0.0344mmol)和1.0ml DMF。在一分立的烧瓶中，将混合的碳酸酯和三乙胺(0.100ml，0.700mmol，20当量)溶解于2.0ml二氯甲烷，然后缓慢(4×0.50ml)加到搅拌的双-对位氨基甲基苯甲酰基癸二胺-1，10的溶液中。用二氯甲烷(2×0.50ml)洗含有混合的碳酸酯12的烧瓶内，以确保混合之碳酸酯12的完全转移。于23℃将反应混合物搅拌16小时，用于燥氮气流除去溶剂，并对余留的油直接进行快速层析(己烷/乙酸乙酯1∶1至1∶2)，以得到作为澄清的无色油的，所需被保护的二聚体(29.6mg，11.5μmol，34％)。

实施例18：FK1012-C(15)的制备

将被保护的二聚体(29.6mg，11.5μmol)(17)放在配有搅拌flea的1.5ml聚丙烯管中。加入乙腈(0.45ml，23mM终浓度)，并于室温下搅拌溶液同时加入HF(55μl，48％水溶液；Fisher，3.6N终浓度)。于室温下搅拌溶液17小时。然后在15ml试管中使所需的对称二聚体分配于二氯甲烷和饱和碳酸氢钠水溶液之间。大幅度旋转试管以混合各相，分离后用吸管吸去有机相。用二氯甲烷(4×2ml)反萃取水相，并干燥(MgSO₄)合并的水相，浓缩并进行快速层析(100％乙酸乙酯至15∶1乙酸乙酯/甲醇)，得到为澄清的无色油的FK1012-C(11.5mg，5.5μmol，47％)。CsA衍生物的制备

实施例19：MeBmt(OAc)--OH¹CsA(2)。

将MeBmt(OAc)--OAc¹-CsA(1)(161mg，124mmol)(参见Eberle and Nuninger，J.Org.Chem.(1992)57，2689)溶解在甲醇(10ml)中。将KOH(196mg)溶于水(8ml)。将297μlKOH溶液(.130mmol，1.05当量)加到(1)在甲醇的溶液内。在惰性气体环境和室温下将此新的溶液搅拌4小时，同时用乙酸(2ml)使反应骤冷。使用5cm×25cm，12μ，100A，C18柱以反相HPLC法纯化反应混合物，其中于70℃用含有0.1％(v/v)三氟乙酸的70％乙腈/水洗脱得到112mg(72％)所需的单乙酸酯(2)。

MeBmt(OAc)--OCOIm¹CsA(3)。MeBmt(OAc)--OH¹-CsA(2)(57mg，45.5μmol)和羰基二咪唑(15mg，2当量，91μmol)移入50ml园底烧瓶中，并溶解在无水THF(6ml)中。加入二异丙基乙胺(32μl，4当量，182μmol)后于室温下在旋转蒸发器上除去溶剂。使用乙酸乙酯作为洗脱剂，在硅胶上经快速层析纯化残留物，得到45mg(73％)所需的氨基甲酸酯(3)。

三-(2-氨基乙基)胺CsA三聚体三乙酸酯(6)。将MeBmt(OAc)--OCOIm¹-CsA(3)(7.5mg，5.54μmol，3.1当量)溶解于THF(100μl)。加入二异丙基乙胺(62μl，5当量，8.93μmol含有100μl胺在4ml THF中的溶液)，然后再加入三(2-氨基乙基)胺(26μl，1.79μmol，1当量含有101mg三胺在10mlTHF中的溶液)。在N₂环境下将该溶液搅拌5天。蒸发反应混合物，然后使用在氯仿中的0-5％甲醇，在硅胶上经快速层析纯化之，得到4.1mg所需的产物(6)。

实施例20：癸二胺CsA二聚体(8)。使固体钠金属(200mg，过量)与无水甲醇(10ml)于0℃下反应。将癸二胺CsA二聚体二乙酸酯(5)(4.0mg)溶解在MeOH(5ml)中。向(5)的溶液中加入2.5ml NaOMe溶液。于惰性环境下室温搅拌2.5小时后，用乙酸(2ml)快速冷却溶液，并使用5mm×25mm，12μ，100A，C18柱在70℃用反相HPLC法纯化产物，层析中用含有0.1％(v/v)三氟乙酸的70-95％乙腈/H₂O经20分钟洗脱得到2.5mg(60％)所需的二醇。

用0.45当量的1，10-二癸胺代替三(2-氨基乙基)胺制备癸二胺CsA二聚体二乙酸酯(5)。

实施例21：对位亚二甲苯基二胺CsA二聚体(4)。

用0.45当量的对位亚二甲苯基二胺代替三(2-氨基乙基)胺制备对位亚二甲苯基二胺CsA二聚体(4)。

按照文献中描述的下列方法，经在1(MeBmt1)位点以外的位点上连接而制备亲环素的其他衍生物。

使生产菌摄入D-氨基类似物制得在特定位点上掺入的8位D-异构体类似物[参见Patchett，et al.，J.Antibiotics(1992)45，43(β-MeSO)D-Ala8-CsA)；Traber，et al.，文献同上(1989)42，591]。经在Sac3的特定碳上使CsA多聚-锂氧化/烷基化，以制备3位类似物，参见Wenger，Transplant Proceeding(1986)18，213，supp.5(涉及亲环素桥接和活性特征，特别是D-MePhe3-CsA)；Seebach，美国专利No.4,703,033，1987年10月27日公布(涉及衍生物的制备)。

按照上述方法，可使CsA的其他天然存在的变异体多聚化，以代替环孢菌素A用于本发明。实施例21A. CsA二聚体的选择合成MeBmt(OH)-η-OCOIm¹-CsA

将MeBmt(OH)-η-OH¹-CsA(38mg，31μmol，1218.6g/mol)和羰基二咪唑(20mg，4当量，124μmol，162.15g/mol)移入10ml圆底烧瓶中，并溶解在无水THF(2ml)中。加入二异丙基乙胺(22μl，4当量，125μmol，129.25g/mol)后于室温下在旋转蒸发器上除去溶剂。使用于乙酸乙酯中的0-20％丙酮作为洗脱剂，在硅胶上经快速层析纯化残留物，得到32mg(产量为78％)白色固体。

(CsA)2亚二甲苯基二胺CsA二聚体

将MeBmt(OH)-η-OCOIm¹-CsA(12.5mg，9.52μmol，1312.7g/mol)溶于DCM(200μl)中，在此溶液中加入22μl(0.5当量，4.75μmol)于DMSO(0.5ml)中的亚二甲苯基二胺(14.7mg，136.2g/mol)溶液，在缓慢浓缩的氮气环境下室温搅拌反应混合物72小时。反应物经乙腈(2ml)稀释，玻璃纤维过滤，反相HPLC(Beckman C18，10μ，100A，1cm×25cm，5ml/min，50至90％ACN/H₂O(+0.1％TFA)，30分钟，70℃)纯化可得到6.1mg(产率为49％)白色固体。

实施例21B. FK506-CsA二聚体的合成MeBmt(OAc)-η-CH₂COOEt-CsA

将MeBmt(OAc)-η-Br¹-CsA(26mg，～80％纯度，15.7μmol，1323.57g/mol)溶于THF(500μl)中，用注射器将此溶液在15小时内加入乙基氢丙二酸(过量的)的镁enolate之THF溶液，后者是通过将jPrMgCl(2.15ml，2.34M，***中)加入于THF(4.7ml)中的乙基氢丙二酸(Lancaster，2.5mmol，332mg，132.12g/mol)的0℃溶液后再加温至室温而制备的。用1N HCl(50ml)使反应混合物骤冷并用乙酸乙酯(2×50ml)抽提之，用Na₂SO₄于燥有机层，过滤并蒸发之。

将粗产物溶于DMF(1ml)中，加入Et4NOAc·4H₂O(150mg，过量)，在90℃下加热此混合物2小时。将反应混合物冷至室温，用H₂O(50ml)稀释并用醚(2×50ml)抽提。用Na₂SO₄干燥合并的有机相，过滤并蒸发之。经用75-100％乙酸乙酯/己烷洗脱，在硅胶上通过快速层析纯化残留物，可得到11.4mg(55％)白色固体。

MeBmt(OH)-η-CH₂COOH¹-CsA

将MeBmt(OAc)-η-CH₂COOEt¹-CsA(11.0mg，8.27μmol，1330.76g/mol)溶于MeOH(2ml)中，并加入NaOMe(于MeOH中，1.30M，10ml)溶液中。在氮气环境下室温搅拌反应混合物5小时，搅拌过程中加入H₂O(2ml)，再将混合物搅拌2小时。反应物经用冰醋酸(1ml)骤冷，玻璃纤维过滤，反相HPLC(Rainin C18 dynamax，5u，300A，21.4mm×250mm，20ml/min，50至90％ACN/H₂O(+0.1％TFA)，30分钟，70℃)纯化，可得到5.5mg(产率为53％)白色固体。双-TBS-N-(6-(Boc-氨基)己基)FK506氨基甲酸酯

将双-TBS-FK506琥珀酰亚氨基碳酸酯(也是(tbs)4-FK1012的前体)(5.8mg，1177.62g/mol，4.93μmol)溶于DCM中，在此溶液中加入N-Boc-1，6-二氨基己烷(7.25mg，过量)。在室温下搅拌10分钟后蒸发反应混合物，经用10至40％乙酸乙酯/己烷洗脱，通过快速层析纯化可得到5.9mg(产率为94％)产物。

N-(6-氨基己基)FK506氨基甲酸酯

将双-TBS-N-(6-(Boc-氨基)己基)FK506氨基甲酸酯(5.9mg，1278.88g/mol，4.61μmol)转移到盛有ACN(700μl)的聚丙烯管中，再加入HF水溶液(49％，100μl)。室温下6小时后反应完全，缓慢加入饱和的NaHCO₃溶液使反应物骤冷，用饱和NaHCO₃(4ml)，H₂O(4ml)稀释混合物，并用DCM(3×10ml)抽提之。用MgSO₄干燥合并的有机相，过滤并蒸发之可得到3.6mg(产率为82％)粗产物。

将MeBmt(OH)-η-CH₂COOH¹-CsA(2.86mg，2.27μmol，1260.66g/mol)和N-(6-氨基己基)FK506氨基甲酸酯(粗品，2.16mg，2.28μmol，949.21g/mol)溶于DCM(900μl)中，在此溶液中加入127μl(3.0当量，6.8μmol)于DCM(500μl)中的BOP(11.9mg，442.5g/mol)溶液，再加入45μl(2.25当量，5.1μmol)于DCM(1.0ml)中的二异丙基乙胺溶液(20μl，d＝0.742129.25g/mol)，最后加入DMF(40μl)，在氮气流下，室温缓慢蒸发反应混合物达12小时，用乙腈(1ml)稀释反应混合物，并经玻璃纤维过滤，反相HPLC(Beckman C18，1cm×25cm，5ml/min，50至90％ACN/H₂O，25分钟，50℃)纯化，可得到2.4mg(产率为48％)白色固体。

实施例22：(A)基于结构所作的设计和FK1012“***块”化合物及其有补偿性突变的FKBP12的合成

可以是或者已通过合成得到的FK506的C9和C10位上的取代基，与不同组的FKBP12侧链残基相抵触。因此，这些配体的一类突变受体应包含不同的修饰，其中一个造成C10取代基的补偿性空穴，一个则造成C9取代基的补偿性空穴。对碳10进行选择性修饰使之具有从碳上突出的N-乙酰基或N-甲酰基基团(与FK506中的羟基基团相对)。这些衍生物的桥接性质清楚地表明，C10***块有效消除与固有FKBP12的结合。图21图解显示了含有附加之C9***块之FK506型部分的合成。使这样的配体与本发明的接头部分相组合即可构成制备嵌合蛋白质的HED和HOD(及拮抗剂)试剂，其中所说的嵌合蛋白质含有携带补偿突变的相应结合区。图21中图解说明了包含C9和C10′位上的修饰基团的HED试剂。

因此本发明包括一类含有FK-506型部分的FK-506型化合物，所说的部分在C9和C10之一或两者上含有选自-OR、-R、-(CO)OR、-NH(CO)H或-NH(CO)R，其中R是被取代或未被取代的，可以是直链、支链或环状的烷基或芳基烷基的功能性基团，包括被取代或未被取代的过氧化物，以及碳酸酯。“FK506型部分”包括FK506、FK520和至少保留FK506环结构的(被取代或未被取代的)C2至C15部分，并能够较好以低于约10^-6M的Kd值与天然或被修饰的FKBP结合的其合成的或天然产生的变异体、类似物及衍生物(包括雷帕霉素)。

本发明进一步包括含有一个或多个共价结合到本发明之接头部分上的这类FK-506型化合物的同或异二聚体及更高级低聚合体。这些FK-506型化合物的单体也是有用的，而不管是否共价结合到接头部分上，也不管是否经过修饰进而没有消除它们对相应FKBP的结合亲和力。可以使用这些单体化合物作为低聚合拮抗剂，即作为基于象FK-506型化合物之低聚合试剂的拮抗剂。根据本发明包含它们的化合物和低聚体较好以至少0.1％，更好至少以大约1％，最好以至少大约10％的亲和力，如大到FK506对FKBP12的亲和力(参见Holt et al.，下文)，与天然的或优选突变的FKBP结合。

可用基于结构的，位点特异性的或随机的诱变方法制得本发明的这些和其他配体的受体区域。我们研究了一个FKBP12部分的家族，其含有Val、Ala、Gly、Met或其他小氨基酸代替Tyr26、Phe36、Asp37、Tyr82和Phe99中的一个或多个氨基酸，以作为包括C9和/或C10位修饰的FK506型和FK-520型配体的受体区域。我们尤其期望使用与FK506型和FK520型配体结合的FKBP，FKBP中具有小的置换，如Gly或Ala置换Asp37，而配体在C10位有取代基(如-NHCOR，其中R是烷基，优选为低级烷基如甲基：或-NHCHO)，还期望使用在C9位含有置换(如Oxazalines或亚胺类)的FK506型和FK520型配体结合的FKBP，FKBP中含有小的置换，如Gly或Ala置换Phe36，Phe99和Tyr26 。

可使用大引物诱变法(参见Sakar and Sommer，Bio Techniques84(1990)：404-407)进行位点特异性诱变。用序列酶(Sequenase)试剂盒进行cDNA序列测定。可在包含在大肠杆菌菌株XKA90中的质粒pHN1⁺中进行突变体FKBP12的表达，因为许多FKBP12突变体均已在该***中获得了有效地表达。可按已描述过的方法(例如参见Aldape et al.，J.Biol.Chem.267，23(1992)：16029-32和Park et al.，J.Biol.Chem.267，5(1992)：3316-3324)，通过DE52阴离子交换树对脂进行分级分离，然后在Sepharose柱上进行分子筛分离以方便地纯化突变体蛋白质。可按两种方法之一很容易地确定结合常数。如果突变的FKP保留有足够的异构酶(rotamase)活性，可利用标准异构酶检测法(如参见Galat et al.，Biochemistry 31(1992)：2427-2434)。否则可使用我们以前用于检测FKBP和亲环素的LH20树脂和放射标记的³H₂-二氢FK506及³H₂-二氢CsA，对突变的FKBP12进行结合试验(Bierer et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，87，4(1993)：555-60)。

(B)使用酵母二杂种***选择***块-FK506的FKBP12中的补偿突变

得到包括FKBP12的受体蛋白质或区域之变异体的一种方法是酵母“二杂种”或“相互作用陷阱”***。已使用二杂种***确定彼此相互作用的蛋白质。由融合到转录激活区上靶蛋白质组成的“铒”融合蛋白质与融合到DNA结合区上的潜在的“钩”的cDNA库共表达。根据受体基因产物(其合成需要连接DNA结合和激活区)的出现来确定蛋白质-蛋白质(铒-钩)相互作用。本文提到的酵母二杂种***最初是由Elledge和其同事共同建立的(Durfee et al.，Genes&Development 74(1993)：555-69和Harper et al.，Cell 75，4(1993)：805-816)。

因为二杂种***不能提供对涉及小分子有机配体的受体-配体相互作用的深入了解，所以我们已发展了一种新的、FK1012可诱导的转录激活***(见下文所述)。使用该***可以扩展二杂种***，从而能够深入研究小分子(例如本发明的FK506或FK1012或FK506型分子)。首先产生具有区域定位于FK506的C9和C10周围位点处之突变的FKBP(“钩”)的cDNA库。对于“铒”来说可采取两种不同的策略。第一个是利用FK506与FKBP12结合的能力并造成一个与calcineurin结合的复合表面。因此序列特异性转录激活物由下列部分组成：DNA结合区-突变FKBP12-***块FK506-calcineurinA-激活区(其中“-”是指非共价结合相互作用)。第二个策略利用FK1012同时与二种FKBP结合的能力。可使用FK1012的HED变体筛选下列集合体：DNA结合区-突变FKBP12-***块FK506-正常FK506-野生型FKBP12-激活区。

1.作为“铒”的calcineurin-Gal4激活区融合体：已构建了含有Gal4激活区和calcineurin A亚单位融合构建体的pSE1107的衍生物。已使用二杂种***制出calcineurin的FKBP-FK506结合位点图谱，研究证实了其以所提出的方式作为“铒”的能力。

2.作为“铒”的hFKBP12-Gal4激活区融合体：作为包括完整开放读码的EcoRI-HindIII片段，切下hFKBP12cDNA，修成平头并与已修成平头的pSE1107的XhoI位点连接，以产生全长度hFKBP-Ga14激活区蛋白质融合体。

3.突变体hFKBP12cDNA库：可用EcoRI和HindIII消化hFKBP12，修成平头并克隆到已用NcoI切割并修成平头的pAS1(Durfeeet al，文献同上)中。进一步用NdeI消化该质粒以除去pAS1之多聚接头序列中NdeI位点和hFKBP12之5′末端间的NdeI片段，并再连接之，从而产生hFKBP12-Gal4DNA结合区蛋白质融合体。用引物#11206和#11210再次扩增hFKBP。引物表：

11206 NdeI

5NdFK： 5′-GGAATTC CAT ATG GGC GTG CAG G-3′

H M G V Q

D11207 SmoI

35mFK37：5′-CTGTC CCG GGA NNN NNN NNN TTT CTT TCC ATC TTC AAG C-

R S X X X K K G D E L

11208 SmaI

35mFK27：5′-CTGTC CCG GGA GGA ATC AAA TTT CTT TCC ATC TTC AAG CA

R S S D F K K G D E L M

NNN NNN NNN GTG CAC CAC GCA GG-3′

X X X H V V C

11209 BomHI

3BmFK98：5′-CGC GGA TCC TCA TTC CAG TTT TAG AAG CTC CAC ATC NNN

END E L K L L E V D X

NNN NNN AGT GGC ATG TGG-3′

X X T A H P

11210 BamHI

3BmFK： 5′-CGC GGA TCC TCA TTC CAG TTT TAG AAG C-3′

5ND E L K L L

引物表：用于构建区域定位的hFKBP 12cDNA文库的引物，用以筛选补偿性突变。

然后使用下面列出的在限定的位置上含有hFKBP之随机化突变序列的引物，以聚合酶链反应法制备突变体hFKBP 12cDNA片段，并将其***Ga l4DNA结合区-hFKBP(NdeI/BamHI)构建体中。

4.酵母菌株酿酒酵母Y153携带两个被整合到基因组中并由Gal4启动子(Durfea，文献同上)驱动的可选择标志基因(his3/β-半乳糖苷酶)。

使用Calcineurin-Gal4激活区域作为“铒”。FKBP12-FK506复合物以高亲和力与calcineurin-一种2B型磷酸酶蛋白质相结合。因为我们使用C9或C10有***的配体作为二杂种***中的桥，所以只有含补偿突变的cDNA库中的FKBP才产生转录激活剂。为方便起见，可以制备各含有8,000个突变FKBP12的至少三个不同的文库(使用引物表中的引物11207-11209)。经检查FKBP12-FK506结构来选择随机化的位点，此提示突变的残基群可允许令人讨厌的C9或C10取代基结合于有***基团的FK506上。然后使用C9和C10带***基团的FK506分别筛选各文库。可根据宿主酵母在his滴落(drop-out)培养基上生长的能力及β-半乳糖苷酶基因的表达确定带***基因之FK506与补偿性hFKBP12突变体的相互作用。因为这一选择取决于带***基因之FK506的存在，可使用添加或未添加带***之基团FK506配体的复制板，经扣除筛选(substractive screening)排除假阳性。

使用hFKBP12-Gal4激活区作为“铒”。使用calcineurin A-Gal4激活区筛选hFKBP12突变cDNA库是-种鉴定FKBP12上补偿突变的简单方法。但是，使带***基团的FK506与hFKBP12结合的突变可破坏突变FKBP12-带***FK506复合物与calcineurin间的相互关系。如果用calcineurin作为铒的初始筛选有错误，则可以使用野生型hFKBP12-Gal4激活区代替之。可以合成包括固有FK506-带***部分的FK506(图16)组成的FK1012HED试剂并用作“钩”。FK1012的FK506部分可以结合FKBP12-Gal4激活区。FKBP12的带***FK506部分与FKBP12补偿的补偿突变体间的相互作用，可使宿主酵母生长在his滴落培养基上生长并表达β-半乳糖苷酶。以这种方式，单独基于hFKBP12突变体与带***基团的FK506反应的能力进行选择。可使用同样的扣除筛选策略排除假阳性。

除了较早讨论的体外结合试验外，还可以使用体内试验确定带***之FK506与补偿性hFKBP12突变体的结合亲和力。在酵母二杂种***中，可根据“铒”和“捕获物”间相互作用的程度来确定β-gal活性。因此，可根据在不同的HED(天然FK506-带***的FK506)浓度下由宿主酵母产生的相应β-半乳糖苷酶活性来估计带***之FK506和补偿性FKBP12突变体间的亲和力。

使用同样的策略，可以以低亲和力补偿性FKBP12突变体作为模板产生涉及其他***块接触残基的附加随机化突变体FKBP12cDNA文库，并进行相似的筛选。

对高亲和力补偿性FKBP突变的噬菌体展开筛选法(displayscreening)。有些***块FK506的高亲和力hFKBP12突变体可在蛋白质的不连续区域含有几个结合的点突变。含有适当结合之突变的文库，对于酵母二杂种***的能力来说可能是太大了(例如＞10⁸个突变)。使用噬菌体作为显露整个功能性蛋白质的载体，将会大大提高筛选大数目突变的能力(如参见Bass et al，Proteins：Structure，Function&Genetics 84(1990)：309-14；McCafferty et al.Nature 348，6301(1990)：552-4：和Hoogenboom，Nuci.Acids Res.19，15(1991)：4133-7)。如果不能用酵母二杂种***鉴定所需的高亲和力补偿性突变体，则可以用噬菌体载体在hFKBP12上造成大数目的组合突变。可以用带***之FK506-Sepharose作为亲和性基质(其可按我们按原来合成基于FK506的亲和基质的相似方法合成，参见Fretz et al，J.Am.Chem.Soc.113，4(1991)1409-1411)，筛选突变的hFKBP12融合噬菌体。重复进行结合和噬菌体扩增循环即可鉴定高亲和力补偿性突变体。

(C)“带***的(CsA)2s”的合成：MeVal(11)CsA的修饰

如上文详述的，我们已证明在细胞死亡信号发生途径相关的解决方案中，使用亲环素作为二聚合区和(CsA)2作为HOD试剂的可行性。然而，为了使(CsA)2试剂的细胞活性最佳化，应依据如就FK1012所描述的相似策略。因此，在应用中应优选经过修饰的(产生***基团的)基于CsA的低聚合试剂，此时特别希望该试剂将能够从内源性亲环素中区别出它的靶，即人工蛋白质构建体。

本发明的一类被修饰的CsA衍生物是CsA类似物，其中(a)NMeVal 11被NMePhe(其可以是被取代或未被取代的)或NMeThr(其可以是未被取代或在苏氨酸β羟基基团上被取代的)取代，或(b)NMeVal 11的前S甲基基团被至少有2个碳原子，较好有3个或更多个碳原子的大基团取代，所说的取代基可以是直链、分支链的和/或含有环部分的，并可以是烷基(乙基，或更好是丙基、丁基包括叔丁基等)、芳基或芳基烷基。这些化合物包括在MeVal 11的位置上包含NMeLeu、NMeIle、NMePhe或特别是非天然的NMe[βMePhe]的CsA类似物。“(b)”CsA化合物是有结构式2的化合物，其中R代表如上所述的功能性基团。

本发明包括其中含有一个或多个这样的CsA类似物的同和异二聚体及更高级低聚体。优选本发明的包含它们的化合物和寡聚体以至少0.1％，较好至少约1％，更好至少约10％的亲和力，如大至CsA对亲环素的亲和力与天然的，或较好是突变的亲环素蛋白质的结合。

可以使用两步骤策略从CsA开始制备经修饰的[MeVal11]CsA衍生物。第一步中，从大环上去掉残基MeVal11。第二步中，在(在先的)MeVal11位点上引入选择的氨基酸并使线性肽环化。与总体合成相比较，该策略的优点是易于通向几种经修饰的[MeVal11]CsA衍生物。合成流程如下：

为了区分酰胺键，已在MeBmt1的氨基和羟基基团间实现了N，O移换，从而得到TsoCsA(Ruegger et al，Helv.Chim.Acta 59，4(1976)：1075-92)(参见上列流程)。反应在甲磺酸存在下于THF中进行(Oliyai et al，Pharm.Res.95(1992)：617-22)。以一罐法在吡啶和乙酐存在下用乙酰基团保护游离胺。N-乙酰基保护的lsoCsA的总产率为90％。然后于N-甲基酰胺键存在下，例如使用DIBAL-H选择性地还原酯MeBmt1-MeVal11键。将所得到的二醇转化成有另一个酸诱导的N，O移换的相应的二酯。如此将制得通过用含水碱水解新形成的酯除去的N-乙酰基团和MeVal11残基。

在保护游离氨基基团之后，例如用PyBrop偶联剂引入新的氨基酸残基。在DMAP存在下用BOP使线性肽去保护并环化(A1berg andSchreiber，Science262，5131(1993)：248-250)以完成2的合成。用估测FK506和FK1012的同样方法估测带***的CsA与亲环素的结合亲和力。一旦鉴定了有补偿性突变的亲环素，即可按照以前描述过的方法合成带***基因的(CsA)2HED和HOD试剂。其中特别有用的是可形成二聚体的带***的CsA化合物，其本身可按1∶2化学计算量与亲环素蛋白质结合。可以设计至少含有一个这样的CsA或被修饰的CsA部分的同二聚体和更高级同低聚体、异二聚体和更高级异低聚体，并使用为FK1012A和(CsA)2而建立的方法估计之，同时按研究FK1012的相以方法使接头元件最佳化。

现在有可能通过在配体上容纳额外的大基团制备结合我们的11位CsA变异体(2)突变的亲环素。可以通过在FK1012研究中所述的基于结构的位点特异性和随机诱变/筛选方法鉴定带有这些补偿性突变的亲环素。

上述结果表明，本方法和组合物在生产野生型变种细胞中的广泛通用性。利用本发明的构建体，可将细胞用于治疗目的，其中细胞可在使用前保持无活性状态，并在给予一种安全的药物后使之被激活。因为细胞在宿主体内有野生品种的生活史，所以有机会处理慢性和急性病症以提供短期或长期保护作用。另外，可以提供将被导向特定部位，如解剖部位或功能部位的细胞，并借以在该部位提供治疗效果。

可提供将导致分泌各种品种蛋白质的细胞，其可用于纠正缺陷或抑制不希望的后果，如激活溶胞性细胞、失活有害因子、杀死受限制的细胞群体等。由于细胞在限定的期间内存在于宿主中，所以给予足可导致细胞在宿主中的迅速反应之剂量的药物即很容易将细胞激活。可以提供使其中被表达的嵌合受体存在于细胞内的细胞，故可避免由于细胞表面上的外来蛋白质引起的免疫反应。此外，细胞内嵌合受体蛋白质在为配体结合后的有效信号转导提供了条件，这显然比在细胞外受体区上的受体结合更为有效。

使用与嵌合膜结合受体结合的相对简单的分子，导致有用产物的表达或抑制该产物的表达，从而可提供细胞治疗效果。可以以多种途径使用可安全给药的化合物，并可保证出现很特异的反应，以致不会搅乱体内平衡。

本说明书中列出的所有出版物和专利申请都掺入本文作参考文献，如同个别出版物或专利申请特别地和各自地指出其列为本文参考文献一样。

虽然为了清楚了解本发明的目的在一定程度上详细举例描述了本发明，但对本发明技术教导的某些没有超出待批权利要求书之精神实质或范围的改变和改动，对于本领域普通技术人员来说将是显而易见的。

Claims

1.编码嵌合蛋白质的DNA构建体，所说的嵌合蛋白质包括

(a)至少一个能够与所选配体结合的受体区域；和

(b)异源蛋白质区域，在细胞暴露于配体之后，它能启动含有所说嵌合蛋白质的细胞的程序化死亡；

所说配体能够结合两个或更多个嵌合蛋白质分子。

2.根据权利要求1的DNA构建体，其中嵌合蛋白质进一步包括能够将嵌合蛋白质导向预期之细胞对应部分的细胞内靶向区域。

3.根据权利要求2的DNA构建体，其中细胞内靶向区域包括分泌性前导序列、跨膜序列区域、膜结合区域或者指导蛋白质与泡囊或与核联系的序列。

4.根据权利要求1的DNA构建体，其中嵌合蛋白质与所选配体结合的Kd值小于或等于大约10^-6M。

5.根据权利要求1的DNA构建体，其中所选配体的分子量小于约5kDa。

6.根据权利要求1的DNA构建体，其中异源蛋白质区域含有人Fas或人TNFα受体的胞质区域。

7.根据权利要求1-6中任一项的DNA构建体，其中嵌合蛋白质能结合于FK506型配体，环孢菌素A型配体，四环素或类固醇配体。

8.DNA载体，其包含根据权利要求1-7中任何一项的DNA构建体和允许将DNA构建体转染到宿主细胞中并选择含有该构建体之转染体的可选择标志。

9.根据权利要求8的DNA载体，其中载体是病毒载体。

10.根据权利要求9的病毒载体，其为腺病毒载体、腺相关病毒载体或反转录病毒载体。

11.由根据权利要求1-7中任何一项的DNA构建体编码的嵌合蛋白质。

12.含有并能够表达至少一种根据权利要求1-7中任何一项之DNA构建体的细胞。

13.根据权利要求12的细胞，将之与所选配体接触后可变为程序化死亡。

14.根据权利要求12的细胞，其为哺乳动物细胞。

15.根据权利要求13的细胞，其进一步含有：

(a)编码嵌合蛋白质的DNA构建体，其中嵌合蛋白质包括

(i)至少一个能够与第二个所选配体结合的受体区域和

(ii)另一个蛋白区域，它对于所述受体区域来说是异源的，但当在与一个或多个其他相似区域低聚合后能够激发处于对所说的低聚合起反应的转录控制元件之转录控制下的靶基因转录的活化；和

(b)处于对所说的低聚合有反应的转录控制元件之表达控制下的靶基因；

将此细胞暴露于所说第二个所选配体后可表达靶基因。

16.根据权利要求13的细胞，其含有编码下列蛋白质的系列DNA构建体；

(a)含有DNA结合区和至少一个能够与第一个所选配体部分结合的受体区的第一种另外的嵌合蛋白质；和

(b)含有转录激活区和至少一个能够与第二种选择的配体(其可以相同或不同于第一种选择的配体部分)结合之

受体区域的第二种另外的嵌合蛋白质；和以及编码靶基因的第二个DNA构建体，所说的靶基因处于异源转录控制序列的转录控制之下，而所说的转录控制序列与DNA结合区结合并对转录激活区有反应；

所说的细胞在接触到含有选择之配体部分的物质后即表达靶基因。

17.使用能启动根据权利要求13的基因工程细胞程序化死亡的配体以制备消除所说细胞群体的药用组合物的用途，所说的配体具有下列结构式：

接头-{rbm1，rbm2，…rbmn}其中n是2至大约5的整数，rbm₍₁₎-rbm_(n)是可以相同或不同的并能够与嵌合蛋白质结合的受体结合部分，所说的rbm部分被共价结合到接头部分上，后者则是能够与两个或多个rbm部分共价连接(“-”)的双或多功能分子。

18.根据权利要求17的用途，即使用配体以制备可消除基因工程细胞群体的药用组合物，其中配体具有小于约5kDa的分子量。

19.根据权利要求17的用途，即使用配体以制备可消除基因工程细胞群体的药用组合物，其中配体含有FK506型部分、环孢菌素型部分、类固醇或四环素。

20.根据权利要求17的用途，即使用配体以制备可消除基因工程细胞群体的药用组合物，其中配体以大于约10^-5M的Kd值结合于天然存在的受体上。

21.根据权利要求17的用途，即使用配体以制备可消除基因工程细胞群体的药用组合物，其中配体包含FK506、FK520、雷帕霉素或其在C9、C10或两者上被修饰之衍生物的分子。

22.根据权利要求20的用途，即使用配体以制备可消除基因工程细胞群体的药用组合物，其中配体含有接头部分，该部分包括C2-C20亚烷基、C4-C18氮杂亚烷基、C6-C24N-亚烷基氮杂亚烷基、C6-C18亚芳基、C8-C24芳二亚烷基(ardialkylene)或C8-C36双-羧酰氨基亚烷基部分。

23.消除根据权利要求13的基因工程细胞群体的方法，包括将细胞暴露于有效量的能与嵌合蛋白质结合的配体中以导致发动细胞死亡。

24.根据权利要求23的方法，其中细胞生长于培养基中，并经向培养基中加入配体而使细胞与配体接触。

25.根据权利要求23的方法，其中细胞存在于宿主生物体内，并经给宿主生物体施用配体而使细胞与配体接触。

26.根据权利要求25的方法，其中宿主生物体是哺乳动物，并且配体经口服、口内、舌下、透皮、皮下、肌肉内、静脉内、关节内及吸入途径，在其适当载体中给药。

27.产生能被有选择地杀死之细胞的方法，包括将根据权利要求1-7中任一项的DNA构建体引入宿主细胞。

28.根据权利要求2 7的方法，进一步包括选择含有引入DNA构建体的那些细胞。

29.包含至少一种根据权利要求1-7中任何一项的DNA构建体的试剂盒。

30.根据权利要求29的试剂盒，其还包含由DNA构建体编码的一种或多种嵌合蛋白质与之结合的配体。

31.根据权利要求29的试剂盒，其还包含作为配体-嵌合蛋白质结合之拮抗剂的单体配体试剂。

32.含有根据权利要求12-16中任一项的细胞的宿主生物体。

33.根据权利要求32的宿主生物体，其是植物或动物生物体。

34.根据权利要求33的动物，其为蠕虫、昆虫或哺乳动物。

35.根据权利要求34的哺乳动物，其为小鼠或其他啮齿动物或人。