CN101035803A - Nogo－a多肽片段、变异nogo受体－1多肽、及其应用 - Google Patents

Abstract

Nogo、MAG、以及OMgp是髓磷脂衍生的蛋白质，其结合神经元Nogo－66受体(NgR)以限制在CNS损伤后的轴突再生。Nogo－A蛋白可能在体内发挥最重要的作用，这可能是因为其作用既由NgR又由其它受体介导。这里，我们扩展了我们之前对Nogo－A和NgR功能结构域的分析。除了NgR－依赖性Nogo－66抑制性结构域和非NgR－依赖性Amino－Nogo－A特异性结构域外，我们鉴定了第三个Nogo－A特异性结构域，其以纳摩尔亲和力结合NgR。该19个氨基酸(aa)的第三个结构域不改变细胞伸展或轴突生长。NgR中的表面残基的Ala扫描突变部分地区分了两个Nogo结构域以及MAG、OMgp和Lingo－1的配体结合位点。两个结合NgR的Nogo－A结构域融合形成亲和力增强十倍的NgR配体并使NgR拮抗剂肽转变为激动剂。因此，在与用于MAG和OMgp的位点部分交迭的位点结合亚纳摩尔的双向Nogo－A配体之后，发生由NgR对轴突再生的抑制。

Description

NOGO-A多肽片段、变异NOGO受体-1多肽、及其应用

技术领域

本发明涉及神经生物学、神经病学以及药理学。更具体地，本发明涉及神经元以及用于介导轴突生长的组合物和方法。

背景技术

在成年哺乳动物的大脑和脊髓中，轴突连接是静态的。如果连接由于损伤而中断，则轴突再生会很少或者不再生。在神经元外部，星形胶质瘢痕和CNS髓磷脂抑制轴突生长(Homer，P.J.and Gage，F.H.，Nature 407：963-970(2000)；McGee，A.W.and Strittmatter，S.M.，Trends Neurosci.26：193-198(2003))。如果成人CNS轴突周围的环境发生改变，则可能发生轴突生长(Benfey，M.and Aguayo，A.J.，Nature 296：150-152(1982)；David，S.and Aguayo，A.J.，Science 214：931-933(1981)；Richardson，P.M.，et al.，Nature284：264-265(1980))。人们已经从CNS髓磷脂分离了三种能够在体外抑制轴突生长的蛋白Nogo、MAG和OMgp(McGee，A.W.andStrittmatter，S.M.，Trends Neurosci.26：193-198(2003))。

Nogo以三种异构体存在，它们均含有包括两个疏水片段(segment)的羧基末端片段(Chen，M.S.，et al.，Nature 403：434-439(2000)；GrandPre，T.，et al.，Nature 403：439-444(2000)；McGee，A.W.and Strittmatter，S.M.，Trends Neurosci.26：193-198(2003)；Prinjha，R，et al.，Nature 403：383-384(2000))。该三个异构形式具有独特的亲水氨基末端片段并且Nogo-A是由CNS髓磷脂中的少突胶质细胞产生的主要形式(Chen，M.S.，et al.，Nature403：434-439(2000)；GrandPre，T.，et al.，Nature 403：439-444(2000)；Huber，A.B.，et al.，J.Neurosci.22：3553-3567(2002)；Wang，X.，et al.，J.Neurosci.22：5505-5515(2002c))已证实Nogo-A具有两个抑制性结构域。羧基区(region)内抑制性Nogo-66结构域的两侧是两个疏水片段且可在少突胶质细胞的表面上检测到(Fournier，A.E.，et al.，Nature 409：341-346(2001)；GrandPre，T.，et al.，Nature 403：439-444(2000)；Oertle，T.，et al.，J.Neurosci.23：5393-5406(2003b))。Nogo-A的氨基末端片段可独立表现出轴突抑制(Chen，M.S.，et al.，Nature 403：434-439(2000)；Fournier，A.E.，et al.，Nature 409：341-346(2001))；中心Δ20区似乎对于这种活性最为关键(Oertle，T.，et al.，J.Neurosci.23：5393-5406(2003b))。正如Nogo-66结构域，人们已在少突胶质细胞表面上检测到Amino-Nogo结构域并且已提出了Nogo-A的两种构象(conformation)(Chen，M.S.，et al.，Nature 403：434-439(2000)；GrandPre，T.，et al.，Nature 403：439-444(2000)；(Oertle，T.，et al.，J.Neurosci.23：5393-5406(2003b))。在一种构象中，氨基和羧基末端位于胞浆内，而Nogo-66环具有两个跨膜片段，位于胞外。在另一种拓扑结构中，第一疏水片段在质膜内部成环并伸出质膜，而未形成跨膜片段，因此Amino-Nogo和Nogo-66位于脂质双分子层的同侧。

Nogo途径的抗体或肽微扰导致在脊髓损伤或中风后轴突生长、可塑性以及功能恢复增强(Bregman，B.S.，et al.，Nature 378：498-501(1995)；GrandPre，T.，et al.，Nature 417：547-551(2002)；Lee，J.K.，et al.，J.Neurosci.24：6209-6217(2004)；Li，S.and Strittmatter，S.M.，J.Neurosci.23：4219-4227(2003)；Schnell，L.and Schwab，M.E.，Nature 343：269-272(1990)；Wiessner，C.，et al.，J.Cereb.Blood Flow Metab.23：154-165(2003))关于Nogo在轴突再生中的基本作用，对Nogo功能的遗传学研究所提供的数据相互矛盾(Kim，J.E.，et al.，Neuron 38：187-199(2003b)；Simonen，M.，et al.，Neuron，38：201-211(2003)；Zheng，B.，et al.，Neuron.38：213-224(2003))。尽管在所有研究中Nogo-A-I-髓磷脂的抑制活性均降低，但是在两个研究中这与体内轴突再生的程度相关而在另一研究中则无轴突再生(Kim，J.E.，et al.，Neuron 38：187-199(2003b)；Simonen，M.，et al.，Neuron，38：201-211(2003)；Zheng，B.，et al.，Neuron.38：213-224(2003))。Nogo末梢的转基因表达足以以其它方式减慢快速再生(Kim，J.E.，et al.，Mol.Cell Neurosci.23：451-459(2003a)；Pot，C.，et al.，J.Cell Biol.159：29-35(2002))。据报道，缺乏MAG的小鼠无CNS轴突再生(Bartsch，U.，et al.，Neuron 15：1375-1381(1995))，尽管在某些遗传背景中末梢再生可以被增强(schafer，M.，et al.，Neuron 16：1107-1113(1996))。

Nogo-66结构域的受体通过表达克隆加以鉴定(Nogo-66受体，NgR)(Fournier，A.E.，et al.，Nature 409：341-346(2001))。这种蛋白选择性地在出生后的神经元中表达并且介导对Nogo-66的响应。NgR是一种富亮氨酸重复区(LRR)的蛋白，其通过GPI锚定于神经元表面。LRR结构域形成配体结合位点并且其结构已被确定(Barton，W.A.，et al.，Embo J.22：3291-3302(2003)；Fournier，A.E.，et al.，J.Neurosci.22：8876-8883(2002)；He，X.L.，et al.，Neuron 38：177-185(2003))。值得注意地，在体外MAG和OMgp结合相同NgR蛋白的LRR结构域，以抑制轴突生长(Domeniconi，M.，et al.，Neuron 35：283-290(2002)；Liu，B.P.，et al.，Science 297：1190-1193(2002)；Wang，K.C.，et al.，Nature 417：941-944(2002b))。在体内，脊髓横切后NgR的基因缺失使得部分轴突纤维芽生并且促进功能恢复(Kim，J.E.，et al.，Neuron 44：439-451(2004))。还需要辅助受体将信号从NgR传递至细胞内部以调节轴突的活动性。p75^NTR和Lingo-1跨膜蛋白已在NgR信号转导中涉及(Mi，S.，et al.，Nat.Neurosci.7：221-228(2004)；Wang，K.C.，et al.，Nature 420：74-78(2002a)；Wong，S.T.，et al.，Nat.Neurosci.5：1302-1308(2002))。然而，尚未确定Amino-Nogo结构域的受体以及NgR与多种配体相互作用的分子基础。

我们最初对Nogo-A活性的功能分析已将Amino-Nogo结构域与Nogo-66结构域分开了(Fournier，A.E.，et al.，Nature 409：341-346(2001))。我们已证实，NgR是Nogo-66的受体，而Amino-Nogo则利用其它机制。这里，我们已发现另一种在形态分析中未揭示的活性。

发明内容

本发明是基于这样的发现：Nogo-A的Amino-Nogo结构域含有与NgR的中心结合结构域相互作用的区域。Nogo-66与该Amino-Nogo结构域的组合形成具有显著较高亲和力的NgR配体，其在限制体内轴突再生中可能是非常重要的。此外，NgR利用某些残基与中心结合结构域中的多个配体相互作用，而利用某些周围残基与特异性配体相互作用。基于这些发现，本发明涉及对于增强CNS神经元中的轴突生长抑制非常有用的分子和方法。

在一些具体实施方式中，本发明提供了一种分离的30个残基或更小的多肽片段，其包含的氨基酸序列至少90％与基准氨基酸序列相同，而该基准氨基酸序列选自由以下序列序列构成的组：(a)SEQ ID NO：2的氨基酸995至1013；(b)SEQ ID NO：2的氨基酸995至1014；(c)SEQ ID NO：2的氨基酸995至1015；(d)SEQ ID NO：2的氨基酸995至1016；(e)SEQ ID NO：2的氨基酸995至1017；(f)SEQ ID NO：2的氨基酸995至1018；(g)SEQ ID NO：2的氨基酸992至1018；(h)SEQ ID NO：2的氨基酸993至1018；(i)SEQ ID NO：2的氨基酸994至1018；并且其中该多肽结合NgR1。在一些具体实施方式中，本发明提供的多肽片段至少95％与该基准氨基酸序列相同。在其它具体实施方式中，该多肽片段与所述基准氨基酸序列等同。

在一些具体实施方式中，本发明提供了一种分离的200个残基或更小的多肽片段，其包含的第一氨基酸序列至少90％与SEQ IDNO：2的氨基酸995至1018相同，并且其中该第一氨基酸序列连接SEQ ID NO：2的氨基酸1055至1086，并且其中该多肽片段结合NgR1。在一些具体实施方式中，该第一氨基酸序列包含SEQ IDNO：2的氨基酸995至1018，其连接于SEQ ID NO：2的氨基酸1055至1086。在其它具体实施方式中，该第一氨基酸序列包含SEQ IDNO：2的氨基酸950至1018，其连接于SEQ ID NO：2的氨基酸1055至1086。在一些具体实施方式中，本发明的多肽片段增强NgR介导的神经突生长抑制。在一些具体实施方式中，该多肽片段包含和/或基本上由SEQ ID NO：5组成。

在一些具体实施方式中，本发明提供了经修饰的本发明的多肽。在一些具体实施方式中，所述修饰是生物素化。

在一些具体实施方式中，本发明进一步提供了融合于异源多肽的多肽。在一些具体实施方式中，该异源多肽是谷光甘肽S-转移酶(GST)。在一些具体实施方式中，该异源多肽是组氨酸标签(His标签)。在一些具体实施方式中，该异源多肽是碱性磷酸酶(AP)。在一些具体实施方式中，该异源多肽是Fc。

在一些具体实施方式中，本发明提供了一种分离的人NgR1多肽，包含SEQ ID NO：4的氨基酸27至473，只是在至少选自由(a)氨基酸67、68和71；(b)氨基酸111、113和114；(c)氨基酸133和136；(d)氨基酸158、160、182和186；(e)氨基酸163；以及(f)氨基酸232和234组成的组中的氨基酸位置发生了氨基酸替换，其中NgR1多肽不结合Nogo 66、OMgp、Mag或Lingo-1中的任何一个。在其它具体实施方式中，本发明提供了一种分离的人NgR1多肽，包含SEQ ID NO：4的氨基酸27至473，只是在至少选自由(a)氨基酸78和81；(b)氨基酸87和89；(c)氨基酸89和90；(d)氨基酸95和97；(e)氨基酸108；(f)氨基酸117、119和120；(g)氨基酸139；(h)氨基酸210；以及(i)氨基酸256和259组成的组中的氨基酸位置发生了氨基酸替换，其中该NgR多肽选择性地结合至Nogo 66、OMgp、Mag或Lingo-1中的至少一个但不是全部。

预见的其它具体实施方式包括表达本发明的多肽或其片段的多核苷酸、包含该多核苷酸的载体、以及包含该多核苷酸并表达本发明多肽的宿主细胞。

本发明的其它具体实施方式包括组合物，其包含本发明的多肽、多核苷酸、载体或宿主细胞以及在某些具体实施中的药用载体。该组合物可被配制用于给药，给药路径选自由肠胃外给药、皮下给药、静脉内给药、肌内给药、腹膜内给药、经皮给药、口腔给药、口服给药以及微注射给药组成的组。该组合物可进一步包含载体。

附图说明

图1A：Amino-Nogo片段与NgR的结合。Amino-Nogo片段A、B和Δ20的示意图。

图1B：融合碱性磷酸酶(AP)的Amino-Nogo片段B(AmNgB)而不是片段A(AmNg A)或Δ20与表达NgR的COS-7细胞结合。将来自含有指定浓度的AP融合蛋白的HEK293T细胞的条件培养基施加至未转染的COS-7细胞或表达NgR的COS-7细胞中，并且对结合的AP进行染色。

图1C：Amino-Nogo-A-24是Amino-Nogo中的NgR结合结构域。Amino Nogo的不同片段(如所示)融合于AP，并且其与NgR的结合在细胞结合分析中加以确定，如(B)中所示。

图1D，上图：AP-Amino-Nogo-A-24结合于表达NgR的COS-7细胞，作为为AP-Amino-Nogo-A-24浓度的函数测定的。下图：根据上图重制图表数据。根据4次独立测量确定结合Kd.

图1E：融合AP的Amino-Nogo片段与离解的E13鸡DRG神经元的结合。将来自含有指定的AP融合蛋白的HEK293T细胞的条件培养基(conditioned media)施加至离解的E13鸡DRG神经元，并且对结合的AP进行染色。

图2A：Amino-Nogo片段对成纤维细胞伸展和神经突生长的作用。Amino-Nogo片段对成纤维细胞伸展的不同作用。COS-7细胞被允许可以在涂覆有50ng干GST融合蛋白(如所示)的斑点的载玻片上附着和伸展，并且对F-肌动蛋白进行染色。GST-A：GST与Amino-Nogo A片段(图1)的融合蛋白。GST-A、GST-B、GST-A20、GST-B4和GST-B4C：GST分别与Amino-Nogo的A、B、Δ20、B4或B4C片段(图1)的融合蛋白。

图2B：对用于如(A)中的实验的COS-7细胞面积进行测量并绘图。

图2C：COS-7细胞被允许可以在涂覆有干GST融合蛋白(如所示)的96孔皿上附着并伸展。计数附着的细胞并作为在96孔皿中每孔内各种干蛋白量的函数绘图。

图2D：Amino-Nogo片段对神经突生长的差异作用。将来自E13鸡DRG的离解神经元置于每孔涂覆有1pmol蛋白的96孔皿并对神经丝进行染色定位。

图2E：将每个神经元的神经突长度进行检测，并作为用于(E)中描述实验的具有的干蛋白浓度不断增加的PBS对照的百分数进行绘图。

图3A：Amino-Nogo与NgR的结合需要LRR重复区。AP或融合了AP的Nogo片段与表达NgR突变体的COS-7细胞(如所示)的结合。AP-B和AP-B4：Amino-Nogo的B或B4片段的AP融合蛋白。NgR突变体的表面表达利用抗-Myc抗体进行检测。

图3B：Amino-Nogo不结合NgR2或NgR3。将来自转染的HEK293T细胞的含有20nM指定AP融合蛋白的条件培养基施加至表达小鼠NgR1、人NgR2或小鼠NgR3的COS-7细胞，且对结合的AP加以染色。NgR的表面表达利用抗-Myc或抗-His抗体进行检测。AP-AmNgA：Amino-Nogo片段A的AP融合蛋白。AP-AmNgB：Amino-Nogo片段B的AP融合蛋白。

图4A：表现出与MgR配体差异结合的NgR突变体实例。AP或融合了AP的NgR配体与表达不同NgR突变体(如所示)的COS-7细胞的结合。施加的配体浓度为：AP，30nM；AP-Ng66，5nM；AP-Ng33，10nM；AP-B4C，10nM；AP-B4C66，0.5nM；AP-Lingo-1，10nM；AP-OMGP，10nM；AP-MAG，30nM。这些浓度接近于这些蛋白与NgR的结合Kd，使得Kd的任何降低均可在染色中被线性地反映出来。

图4B：NgR配体与NgR突变体的AP结合，以野生型NgR的百分数表示。与AP融合的配体孵育后的AP、结合于表达NgR或NgR突变体的COS-7的AP被染色并检测。

图4C：表达NgR突变体的COS-7细胞的全细胞溶解产物进行SDS-PAGE并用抗-NgR抗体杂交(blot)。

图5：NgR中的配体结合部位。NgR的分子表面图示为：对于所有配体的结合均必需的残基标记为红色、配体结合不需要的残基标记为蓝色、部分配体需要而其它配体不需要的残基则标记为黄色。Ng66结合需要而B4C不需要的残基用箭头指示。该图示是利用SwissPdb Viewer软件制作的。

图6A：B4C与Nogo66的结合产生高亲和力的NgR配体。AP-B4C66与表达NgR的COS-7细胞的结合，作为AP-B4C66浓度的函数进行测量。

图6B：根据(A)的重新制图数据。结合Kd根据4次独立测量进行确定。

图6C：B24/32肽抑制神经突生长。来自E13鸡DRG的离解神经元被置于涂覆有500pmol干肽(如所示)的96孔皿并对神经丝进行染色定位。

图6D：测量每个神经元的神经突长度并作为用于如(C)中实验的PBS对照的百分数进行绘图。

图7：用于NgR信号转导的模型。NgR是用于少突胶质细胞蛋白Nogo、MAG以及OMgp的共同受体。Amino-Nogo和Nogo66中的Ng19区结合于NgR的LRR结构域。Amino-Nogo-19与NgR的结合并不发出信号以抑制生长，但是Nogo中的Amino-Nogo-19和Ng66的同时存在使得Nogo成为NgR的高亲和力激动剂。MAG和OMgp也结合于NgR的LRR结构域。Amino-Nogo的Δ20区不结合NgR但抑制成纤维细胞伸展和神经突生长，可能是通过一种存在于多种细胞类型中的未鉴定受体。由Nogo-A和Nogo-B共享的Nogo的氨基末端结构域可能通过另一未鉴定受体起作用而调节血管重建。

具体实施方式

除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。在相冲突的情况，参照包括定义的本申请。除非上下文另有要求，单数术语将包括复数并且复数术语将包括单数。本文提及的所有出版物、专利以及其它参考文献通过引用将其全部内容如同每一单个出版物或专利申请被具体和单独地指明被并入本文一样并入本文作为参考。

尽管与本文描述的方法和材料类似或等同的方法和材料可用于本发明的实施或测试，但是下面将描述合适的方法和材料。所述材料、方法和实施例仅用于说明目的而不用于限制。本发明的其它特征和优点根据详细描述和权利要求将会显而易见。

为了进一步定义本发明，提供了以下术语和定义。

应当注意，术语“一个”实体指的是一个或多个该实体；例如，“一个免疫球蛋白分子”应被理解为表示一个或多个免疫球蛋白分子。同样地，术语“一”、“一个或多个”、以及“至少一个”可在本文中互换使用。

在本说明书和权利要求的全文中，词语“包含”或变形如“包括”表明含任何所述整体或整体的组但不排除任何其它整体或整体的组。

如本文所使用的，如在说明书和权利要求书全文中使用的，术语“由......组成”或其变形表示包含任何所述整体或整体的组，但是没有其它的整体或整体的组可被加入到具体说明的方法、结构或组合物中。

如本文所使用的，如在说明书和权利要求书全文中使用的，术语“基本上由.......组成”或其变形表示包含任何所述整体或整体的组，并且可选包含不实质性改变所说明的方法、结构或组合物的基本或新颖性能的任何所述整体或整体的组。

如本文所使用的，术语“多肽”用来涵盖单数的“多肽”以及复数的“多肽”，并且指由通过酰胺键(也被称为肽键)线性连接的单体(氨基酸)构成的分子。术语“多肽”指两个或多个氨基酸的任何一个链或多个链，而不是指产物的具体长度。因此，肽、二肽、三肽、寡肽、“蛋白质”、“氨基酸链”或任何其它用来指两个或多个氨基酸的链或多个链的术语都包括在“多肽”的定义范围中，并且术语“多肽”可用这些术语中的任一个替换或互换使用。术语“多肽”也用来指在肽表达后的修饰产物，包括但不限于糖基化、乙酰化、磷酸化、酰胺化、通过已知的保护/阻断基团的衍生化、蛋白水解切割、或通过非天然存在的氨基酸的修饰。多肽可以衍生自天然生物源或通过重组技术形成，但不必需翻译自指定的核酸序列。其可以以任何方式形成，包括通过化学合成。

本发明的多肽的大小可以为约3个或更多个、5个或更多个、10个或更多个、20个或更多个、25个或更多个、50个或更多个、75个或更多个、100个或更多个、200个或更多个、500个或更多个、1000个或更多个、或2000个或更多个氨基酸。多肽可以具有确定的三维结构，尽管它们不必需具有这样的结构。具有确定三维结构的多肽称为折叠的，并将不具有确定的三维结构而是采用大量不同构象的多肽称为未折叠的。如本文所使用的，术语糖蛋白指的是结合至少一个糖部分的蛋白质，该糖部分通过氨基酸残基例如丝氨酸残基或天冬酰胺残基的含氧或含氮侧链连接至该蛋白质。

用“分离的”多肽或其片段、变异体或衍生物来表示不在其天然环境中的多肽。不要求具体纯化水平。例如，分离的肽可获取自其本身或天然环境。对于本发明的目的来说，重组产生的多肽以及在宿主细胞中表达的蛋白质可认为分离的，已被分离、断裂、或者部分地或基本上通过任何合适技术纯化的天然或重组多肽也认为是分离的。

在本发明中，“多肽片段”指的是较大多肽的短氨基酸序列。蛋白质片段可以是“独立的”，或包括在其片段形成一部分区域的较大多肽内。本发明的多肽片段的代表性实例包括例如在长度上包含约5个氨基酸、约10个氨基酸、约15个氨基酸、约20个氨基酸、约30个氨基酸、约40个氨基酸、约50个氨基酸、约60个氨基酸、约70个氨基酸、约80个氨基酸、约90个氨基酸、以及约100个氨基酸或更多个氨基酸。

当提及本发明的多肽时，术语“片段”、“变异体”、“衍生物”以及“类似物”包括保持至少部分生物活性的任何多肽。如本文所述的多肽可以没有限制地包括其中的片段、变异体或衍生物分子，只要该多肽仍发挥其功能。本发明的多肽或其片段可以包括蛋白水解片段、缺失片段，尤其是当递送给动物时更易于到达作用位点的片段。多肽片段进一步包括包含天然多肽的抗原或免疫原表位(包括线性以及三维表位)的多肽的任何部分。本发明的多肽和多肽片段可以包含变异区(包括上述的片段)，以及氨基酸序列由于氨基酸替换、缺失或***而改变的多肽。变异可以自然发生，如等位变异(allelicvariant)。用“等位变异”来表示占据在生物体基因组上特定座位的基因的可替换形式。Genes II，Lewin，B.，ed.，John Wilcy & Sons，New York(1985)。非自然发生的变异可利用本领域已知的基因突变技术来产生。本发明的多肽和多肽片段可以包含保守或非保守氨基酸替换、缺失或***。本发明的多肽和多肽片段还可包括衍生分子。变异多肽在本文中还可称为“多肽类似物”。如本文所使用的，多肽或多肽片段的“衍生物”指的是具有通过功能性侧基的反应而化学衍生的一个或多个残基的主题多肽。同样作为“衍生物”包括的是含有二十个标准氨基酸的一个或多个天然存在的氨基酸衍生物的那些多肽。例如，4-羟基脯氨酸可以是脯氨酸替换的；5-羟基赖氨酸可以是赖氨酸替换的；3-甲基组氨酸可以是组氨酸替换的；高丝氨酸可以是丝氨酸替换的；以及鸟氨酸可以是赖氨酸替换的。

如本文所使用的，术语“二硫键”包括在两个硫原子之间形成的共价键。氨基酸半胱氨酸包含可与第二个硫醇基团形成二硫键或桥的硫醇基团。

如本文所使用的，“融合蛋白”意思是指包含的第一个多肽通过肽键线性连接至第二个多肽。该第一个多肽和第二个多肽可以是相同或不同的，并且它们可以是直接连接的或通过连接肽(参见下文)进行连接的。

术语“多核苷酸”用来涵盖单数核酸以及复数核酸，并且指分离的核酸分子或构建体，例如信使RNA(mRNA)或质粒DNA(pDNA)。多核苷酸可含有全长cDNA序列的核苷酸序列，包括未翻译的5’和3’序列、编码序列。多核苷酸可以包括传统磷酸二酯键或非传统键(例如，如在肽核酸(PNA)中发现的酰胺键)。多核苷酸可由任何多核糖核苷酸或多脱氧核糖核苷酸(其可以是未修饰的RNA或DNA或经修饰的RNA或DNA)组成。例如，多核苷酸可以由单链和双链DNA、单链和双链区的混合物的DNA、单链和双链RNA、以及单链和双链区的混合物的RNA、包含DNA和RNA(其可以是单链或更通常是双链的，或单链和双链区的混合物)的杂合分子所组成。另外，多核苷酸可以由包含RNA或DNA或RNA和DNA二者的三链区构成。多核苷酸还可以含有一个或多个经修饰的碱基或由于稳定性或其它原因而修饰的DNA或RNA主链。“修饰的”碱基包括例如三苯甲基化的碱基和诸如肌苷的非常见碱基。可以对DNA和RNA进行各种修饰；因此，“多核苷酸”包括化学、酶促或代谢修饰的形式。

术语“核酸”指的是存在于多核苷酸中的任何一个或多个核酸片段，例如DNA或RNA片段。用“分离的”核酸或多核苷酸来表示核酸分子DNA或RNA，其已从其天然环境中取出。例如，对于本发明的目的来说，包含于载体的编码本发明的多肽或多肽片段的重组多核苷酸可认为是分离的。分离的多核苷酸的其它实例包括保留在异源性宿主细胞中的重组多核苷酸或溶液中的纯化(部分或基本上)多核苷酸。分离的RNA分子包括本发明的多核苷酸的体内或体外RNA转录体。根据本发明的分离多核苷酸或核酸进一步包括通过合成产生的这样的分子。另外，多核苷酸或核酸可以是或可以包括调节元件，如启动子、核糖体结合位点、或转录终止子。

如本文所使用的，“编码区”是核酸的一部分，其由翻译成氨基酸的密码子组成。尽管“终止密码子”(TAG、TGA、或TAA)没有被翻译成氨基酸，但是其可以被认为是编码区的部分，而任何侧翼序列(侧面序列)例如启动子、核糖体结合位点、转录终止子、内含子等不是编码区的部分。本发明的两个或更多个编码区可以存在于单个多核苷酸构建体，例如在单个载体上，或存在于分开的多核苷酸构建体，例如在分开(不同)的载体上。此外，任何载体可以包含单个编码区，或可以包括两个或更多个编码区，例如单个载体可以分别编码免疫球蛋白重链可变区和免疫球蛋白轻链可变区。另外，本发明的载体、多核苷酸和核酸可以编码异源编码区，其融合或者不融合于编码本发明的多肽或多肽片段的核酸。异源编码区包括但不限于特化元件或基序，如分泌信号肽或异源功能结构域。

在某些具体实施方式中，多核苷酸或核酸是DNA。在DNA的情况下，多核苷酸包含通常编码多肽的核酸的多肽，可以包括启动子和/或其它转录或翻译控制因子，其可操作地联合一个或多个编码区。可操作性联合是基因产物例如多肽的编码区使基因产物的表达处于调节序列的影响或控制之下。如果启动子功能的诱导导致编码预期基因产物的mRNA转录并且如果在两个DNA片段之间的键接的特性不会干扰表达调节序列指导基因产物表达的能力或干扰DNA模板被转录的能力，则两个DNA片段(如多肽编码区和与其相关的启动子)是“可操作地联合的”。因此，如果启动子能够实现核酸的转录则启动子区将与该编码多肽的核酸可操作地联合。启动子可以是仅在预定细胞中指导DNA大量转录的细胞特异性启动子。除了启动子之外，其它转录控制因子例如增强子、操作子、阻遏物、以及转录终止信号能够可操作地联合多核苷酸以指导细胞特异性转录。本文披露了合适的启动子以及其它转录控制区。

本领域的熟练技术人员已知各种转录控制区。这包括但不限于在脊椎动物细胞中起作用的转录控制区，如但不限于来源于巨细胞病毒(立即早期启动子，与内含子-A连接)、猿猴病毒40(早期启动子)、以及逆转录酶病毒(如Rous肉瘤病毒)。其它转录控制区包括来源于脊椎动物基因如肌动蛋白、热休克蛋白、牛生长激素和兔β-球蛋白、以及能够控制真核细胞中基因表达的其它序列。其它合适的转录控制区包括组织特异性启动子和增强子以及淋巴因子诱导的启动子(例如，可通过干扰素或白介素诱导的启动子)。

类似地，各种翻译控制因子对本领域普通技术人员来说是已知的。这包括但不限于核糖体结合位点、翻译起始和终止密码子、以及起源于小核糖核酸病毒(具体地，内部核糖体进入位点或IRES，也称为CITE序列)的元件。

在其它具体实施方式中，本发明的多核苷酸是RNA，例如信使RNA(mRNA)形式。

本发明的多核苷酸和核酸编码区可以联合编码分泌或信号肽的其它编码区，其指导由本发明的多核苷酸编码的多肽的分泌。根据信号假说，由哺乳动物细胞分泌的蛋白质具有信号肽或分泌前导序列，其是在跨过天然内质网的成长蛋白链的排出启动时从成熟蛋白质切割而来的。本领域的普通技术人员注意到，由脊椎动物细胞分泌的多肽具有的信号肽通常融合至该多肽的N-末端，其从完全或“全长”多肽切割下来以产生多肽的分泌或“成熟”形式。在某些具体实施方式中，使用了天然信号肽例如免疫重链或轻链信号肽，或所述序列的可保持指导可操作地与其联合的多肽分泌的能力的功能衍生物。可替换地，可以使用异源哺乳动物信号肽、或其功能衍生物。例如，可以用人组织血纤维蛋白溶酶原活化剂(TPA)或小鼠β-葡糖苷酸酶的前导序列取代野生型前导序列。

如本文所使用的，术语“经改造的”包括通过合成方法(例如通过重组技术、体外肽合成、通过肽的酶促或化学偶联，或这些技术的某些组合)操作核酸或多肽分子。

如本文所使用的，术语“连接的”指的是两个或多个元件或组分通过任何方法包括化学结合或重组方法结合在一起。术语“连接的”可以指通过肽键直接融合的，利用隔离物间接融合的，以及借助于不同于肽键例如通过二硫键或非肽部分钩接在一起的。

“接头(连接物，linker)”序列是分隔开融合蛋白中的两个多肽编码区的一组氨基酸，其包括一个或多个氨基酸。典型的接头包含至少5个氨基酸。其它的接头包含至少10个或至少15个氨基酸。在某些具体实施方式中，对肽接头的氨基酸加以选择以使接头是亲水性的。接头(Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)₃(SEQ ID NO：＿)是优选的接头，其广泛用于许多抗体，因其提供足够的柔性。其它接头包括Glu Ser Gly Arg Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser(SEQ IDNO：＿)，Glu Gly Lys Ser Ser Gly Ser Gly Ser Glu Ser Lys Ser Thr(SEQ ID NO：＿)，GluGly Lys Ser Ser Gly Ser Gly Ser Glu Ser Lys Ser Thr Gln(SEQ ID NO：＿)，Glu Gly LysSer Ser Gly Ser Gly Ser Glu Ser Lys Val Asp(SEQ ID NO：＿)，Gly Ser Thr Ser Gly SerGly Lys Ser Ser Glu Gly Lys Gly(SEQ ID NO：＿)，Lys Glu Ser Gly Ser Val Ser Ser GluGln Leu Ala Gln Phe Arg Ser Leu Asp(SEQ ID NO：＿)，and Glu Ser Gly Ser Val Ser SerGlu Glu Leu Ala Phe Arg Ser Leu Asp(SEQ ID NO：＿)。较短接头的实例包括以上接头的片段，较长接头的实例包括以上接头的组合、以上接头的片段的组合、以及以上接头与以上接头的片段的组合。

如在本文中使用的，关于多肽或多肽片段，术语“融合的”或“融合”可互换使用。这些术语指的两个元件通过肽键直接或间接(例如肽隔离物)相连。“符合阅读框的融合(同义融合，in-frame fusion)”指的是两个或多个开放阅读框(ORF)，以保持初始ORF的正确阅读框的方式结合而形成一个较长的连续ORF。因此，得到的重组融合蛋白是含有两个或多个片段的单个蛋白，其中所述片段对应于由初始ORF(其片段不是如天然中正常结合的)编码的多肽。尽管这样可使阅读框在整个融合片段变得连续，但该片段可通过例如符合阅读框(顺框)的连接子序列而被物理上或空间上分开。

在多肽的上下文中，“线性序列”或“序列”是多肽中氨基末端至羧基末端方向的氨基酸顺序，其中在序列中彼此相邻的残基在多肽的一级结构中是连续的。

如在本文中使用的术语“表达”指的是一个过程，通过该过程基因产生生物化学物质例如RNA或多肽。该过程包括细胞内功能性存在的基因的任何表现形式，包括但不限于基因剔除(knockdown)以及瞬时表达和稳定表达。其包括但不限于将该基因转录为信使RNA(mRNA)、转运RNA(tRNA)、小发夹RNA(shRNA)、小干扰RNA(siRNA)或者任何其它RNA产物以及将这样的mRNA翻译成多肽和调节转录或翻译的任何过程。如果最终期望的产物是生物化学物质，则表达包括生物化学物质以及任何前体的形成。基因的表达产生“基因产物”。如本文所使用的，基因产物可以是核酸例如由基因转录产生的信使RNA，或者是从转录体翻译的多肽。本文描述的基因产物进一步包括带有转录后修饰例如多腺苷化的核酸、或带有翻译后修饰的多肽例如甲基化、糖基化、脂添加、与其它蛋白质亚单位联合、蛋白水解性切割等。

如本文所使用的，术语“治疗”指的是治疗性和预防性措施，其目的是预防或减缓(减轻)非预期的生理变化或失调。有用或预期的临床结果包括但不限于不管是可检测或不可检测的病症的减轻、疾病程度的减小、疾病的稳定(即，没有恶化)状态、疾病进展的延缓或减慢、疾病状态的减轻或缓和、以及好转(不管是部分或全部)，无论可检测到还是不可检测到。“治疗”也可指相比于未接受治疗的预期存活期，可延长存活期。需要治疗的患者包括已患有该病症或失调以及易于患病症或失调或有待预防病症或失调的患者。

用“受治疗者(受试者或患者，subject)”或“个体”或“动物”或“病人”或“哺乳动物”来指任何受治疗者，尤其是哺乳动物受治疗者，其需要预防、预后或治疗。哺乳动物受治疗者包括但不限于人、家畜、农畜、动物园动物、体育动物、宠物如狗、猫、豚鼠、兔、大鼠、小鼠、马、牛、奶牛；灵长类动物如猿、猴、猩猩和黑猩猩；犬科动物如狗、狐狸；猫科动物如猫、狮和虎；马科动物如马、驴、和斑马；食品动物如奶牛、猪和绵羊；有蹄动物如鹿和长颈鹿；啮齿动物如小鼠、大鼠、仓鼠和豚鼠等。在某些具体实施方式中，哺乳动物是人类受治疗者。

如本文所使用的，短语如“受益于给予本发明的Nogo多肽或多肽片段的受治疗者”和“需要治疗的动物”包括受益于给予用于例如检测(例如用于诊断程序)和/或用于治疗，即利用本发明的Nogo多肽或多肽片段来减轻或防止疾病如精神***症的本发明的Nogo多肽或多肽片段的受治疗者如哺乳动物受治疗者。如本文更详细描述的，多肽或多肽片段可以以未结合形式或可以结合例如药物、前药或同位素使用。

如本文所使用的，“治疗有效量”指的是在必要剂量和必要时间期内可有效获得预期治疗结果的量。治疗结果可以是例如病症减轻、延长存活、改进活动性等。治疗结果不必是“治愈性的”。

如本文所使用的，“预防有效量”指的是剂量在必要剂量和必要时间期内可有效用来获得预期预防结果的量。通常，由于预防剂量是在疾病前或疾病早期阶段在受治疗者中使用，所以预防有效量低于治疗有效量。

本发明针对某些增强神经突生长抑制或抑制异常神经元芽生例如CNS神经元的Nogo多肽和多肽片段。例如，本发明提供了Nogo多肽或多肽片段，其抑制在轴突生长过度活跃或活性过低的情况下的异常神经元生长。因此，本发明的Nogo多肽和多肽片段在治疗某些可通过抑制异常神经元生长或抑制神经突生长而减轻的损伤、疾病或失调方面很有用。

示例性疾病、失调、或损伤包括但不限于精神***症、双相型障碍、强迫症(OCD)、注意力缺陷多动障碍(ADHD)、唐氏综合症、以及阿尔茨海默氏症。

Nogo和Nogo受体多肽和多肽片段

本发明针对某些对于抑制神经突生长和抑制异常神经元芽生很有用的Nogo多肽和多肽片段。通常，本发明的Nogo多肽和多肽片段发挥作用以增强NgR1介导的中枢神经***(CNS)神经元的神经元存活、神经突生长和轴突再生抑制。本发明进一步针对作为用于靶向神经元和特异性表达NgR的细胞的药物递送工具很有用的某些Nogo多肽和多肽片段。本发明还针对用于有效候选药物的筛选方法中的某些NgR多肽和多肽片段。

将人Nogo-A多肽以SEQ ID NO：2在下面示出。

全长人Nogo-A(SEQ ID NO：2)：

MEDLDQSPLVSSSDSPPRPQPAFKYQFVREPEDEEEEEEEEEEDEDEDLEEL

EVLERKPAAGLSAAPVPTAPAAGAPLMDFGNDFVPPAPRGPLPAAPPVAP

ERQPSWDPSPVSSTVPAPSPLSAAAVSPSKLPEDDEPPARPPPPPPASVSPQ

AEPVWTPPAPAPAAPPSTPAAPKRRGSSGSVDETLFALPAASEPVIRSSAEN

MDLKEQPGNTISAGQEDFPSVLLETAASLPSLSPLSAASFKEHEYLGNLST

VLPTEGTLQENVSEASKEVSEKAKTLLIDRDLTEFSELEYSEMGSSFSVSPK

AESAVIVANPREEIIVKNKDEEEKLVSNNILHNQQELPTALTKLVKEDEVV

SSEKAKDSFNEKRVAVEAPMREEYADFKPFERVWEVKDSKEDSDMLAAG

GKIESNLESKVDKKCFADSLEQTNHEKDSESSNDDTSFPSTPEGIKDRSGA

YITCAPFNPAATESIATNIFPLLGDPTSENKTDEKKIEEKKAQIVTEKNTSTK

TSNPFLVAAQDSETDYVTTDNLTKVTEEVVANMPEGLTPDLVQEACESEL

NEVTGTKIAYETKMDLVQTSEVMQESLYPAAQLCPSFEESEATPSPVLPDI

VMEAPLNSAVPSAGASVIQPSSSPLEASSVNYESIKHEPENPPPYEEAMSVS

LKKVSGIKEEIKEPENINAALQETEAPYISIACDLIKETKLSAEPAPDFSDYS

EMAKVEQPVPDHSELVEDSSPDSEPVDLFSDDSIPDVPQKQDETVMLVKE

SLTETSFESMIEYENKEKLSALPPEGGKPYLESFKLSLDNTKDTLLPDEVST

LSKKEKIPLQMEELSTAVYSNDDLFISKEAQIRETETFSDSSPIEIIDEFPTLIS

SKTDSFSKLAREYTDLEVSHKSEIANAPDGAGSLPCTELPHDLSLKNIQPK

VEEKISFSDDFSKNGSATSKVLLLPPDVSALATQAEIESIVKPKVLVKEAEK

KLPSDTEKEDRSPSAIFSAELSKTSVVDLLYWRDIKKTGVVFGASLFLLLSL

TVFSIVSVTAYIALALLSVTISFRIYKGVIQAIQKSDEGHPFRAYLESEVAISE

ELVQKYSNSALGHVNCTIKELRRLFLVDDLVDSLKFAVLMWVFTYVGAL

FNGLTLLILALISLFSVPVIYERHQAQIDHYLGLANKNVKDAMAKIQAKIP

GLKRKAE

将全长人NgR-1以SEQ ID NO：4在下面示出。

全长人NgR-1(SEQ ID NO：4)：

MKRASAGGSRLLAWVLWLQAWQVAAPCPGACVCYNEPKVTTSCPQQGL

QAVPVGIPAASQRIFLHGNRISHVPAASFRACRNLTILWLHSNVLARIDAA

AFTGLALLEQLDLSDNAQLRSVDPATFHGLGRLHTLHLDRCGLQELGPGL

FRGLAALQYLYLQDNALQALPDDTFRDLGNLTHLFLHGNRISSVPERAFR

GLHSLDRLLLHQNRVAHVHPHAFRDLGRLMTLYLFANNLSALPTEALAPL

RALQYLRLNDNPWVCDCRARPLWAWLQKFRGSSSEVPCSLPQRLAGRDL

KRLAANDLQGCAVATGPYHPIWTGRATDEEPLGLPKCCQPDAADKASVL

EPGRPASAGNALKGRVPPGDSPPGNGSGPRHINDSPFGTLPGSAEPPLTAV

RPEGSEPPGFPTSGPRRRPGCSRKNRTRSHCRLGQAGSGGGGTGDSEGSG

ALPSLTCSLTPLGLALVLWTVLGPC

将全长大鼠NgR-1以SEQ ID NO：6在下面示出。

全长大鼠NgR-1(SEQ ID NO：6)：

MKRASSGGSRLTWVLWLQAWRVATPCPGACVCYNEPKVTTSRPQQGL

QAVPAGIPASSQRIFLHGNRISYVPAASFQSCRNLTILWLHSNALAGIDAAA

FTGLTLLEQLDLSDNAQLRVVDPTTFRGLGHLHTLHLDRCGLQELGPGLG

LAALQYLYLQDNNLQALPDNTFRDLGNLTHLFLHGNRIPSVPEHAFRGLH

SLDRLLLHQNHVARVHPHAFRDLGRLMTLYLFANNLSMLPAEVLVPLRS

LQYLRLNDNPWVCDCRARPLWAWLQKFRGSSSGVPSNLPQRLAGRDLK

RLATSDLEGCAVASGPFRPFQTNQLTDEELLGLPKCCQPDAADKASVLEP

GRPASVGNALKGRVPPGDTPPGNGSGPRHINDSPFGTLPGSAEPPLTALRP

GGSEPPGLPTTGPRRRPGCSRKNRTRSHCRLGQAGSGSSGTGDAEGSGAL

PALACSLAPLGLALVLWTVLGPC

在某些具体实施方式中，本发明提供了分离的30、40、50、60、70、80、90、或100个残基或更小的多肽片段，其中该多肽片段包含至少90％与其中多肽片段结合NgR1的Nogo基准氨基酸序列相同的氨基酸序列。在特殊的具体实施方式中，该多肽片段为30个残基或更小。根据该具体实施方式，Nogo基准氨基酸序列包括但不限于SEQ ID NO：2的氨基酸995至1013；SEQ ID NO：2的氨基酸995至1014；SEQ ID NO：2的氨基酸995至1015；SEQ ID NO：2的氨基酸995至1016；SEQ ID NO：2的氨基酸995至1017；SEQ IDNO：2的氨基酸995至1018；SEQ ID NO：2的氨基酸995至1019；SEQ ID NO：2的氨基酸995至1020；SEQ ID NO：2的氨基酸992至1018；SEQ ID NO：2的氨基酸993至1018；以及SEQ ID NO：2的氨基酸993至1018。编码该多肽片段的多核苷酸、以及载体、和包含所述多核苷酸的宿主细胞都涵盖于本发明中。多核苷酸、载体、以及通过与表达控制元件如启动子可操作相关来表达该多肽的宿主细胞也被包括在内。

用“Nogo基准氨基酸序列”或“基准氨基酸序列”来表示没有引入任何氨基酸替换的规定序列。作为本领域的技术人员将理解，如果不存在替换，则本发明的“分离的多肽”包含与基准氨基酸序列等同的氨基酸序列。

根据该具体实施方式的示例性基准氨基酸序列包括SEQ IDNO：2的氨基酸995至1013、和SEQ ID NO：2的氨基酸995至1018。

本文描述的至少70％、75％、80％、85％、90％、或95％与SEQ ID NO：2或其片段相同的Nogo多肽或多肽片段的相应片段也被考虑到。如本领域已知的，在两个多肽之间的“序列同一性”是通过将一个多肽的氨基酸序列与另一个多肽的序列进行比对而确定的。当在本文中讨论时，可利用本领域已知的方法和计算机程序/软件如但不限于BESTFIT程序(Wisconsin Sequence AnalysisPackage，Vcrsion 8 for Unix，Genetics Computer Group，University Research Park，575Science Drive，Madison，WI 53711)来确定任何特定多肽是否是至少少70％、75％、80％、85％、90％、或95％等同于另一多肽。BESTFIT利用Smith and Waterman，Advances in Applied Mathematics 2：482-489(1981)的局部同源性算法，以找到两个序列之间同源性最好的片段。当利用BESTFIT或任何其它序列比对程序来确定特定序列是否是例如95％与根据本发明的基准序列相同时，设定参数以在基准多肽序列的全长上计算等同性百分数，并且允许基准序列中氨基酸总数5％的同源性间隔。

在一方面，本发明包括如上所述包含于融合蛋白中的两个或多个多肽片段的多肽，以及如上所述包含融合于异源氨基酸序列的多肽片段的融合蛋白。本发明进一步涵盖如上所述的多肽片段的变异体、类似物或衍生物。

在一个具体实施方式中，本发明提供200个残基或更小、或190、180、170、160、150、140、130或125个残基或更小的分离的多肽片段，其包含的第一氨基酸序列至少80％、90％或95％与SEQ ID NO：2的氨基酸995至1018相同，其中该第一氨基酸序列直接或者间接连接至SEQ ID NO：2的氨基酸1055至1086。在另一具体实施方式中，该多肽片段包含的SEQ ID NO：2的氨基酸995至1018融合于SEQ ID NO：2的氨基酸1055至1086。在其它具体实施方式中，该多肽片段包含的氨基酸序列至少80％、90％或95％与SEQ ID NO：2氨基酸950至1018、960至1018、970至1018、980至1018、990至1018、995至1028、995至1038、995至1048、995至1054相同，其中该多肽片段连接或融合于SEQ ID NO：2的氨基酸1055至1086。在另一具体实施方式中，该多肽片段结合NgR1。在某些具体实施方式中，该多肽片段增强NgR介导的神经突生长抑制。在该具体实施方式中也考虑到了大鼠NgR1。在另一具体实施方式中，该多肽片段包含SEQ ID NO：5。在进一步的具体实施方式中，该多肽片段基本上由SEQ ID NO：5组成。编码该多肽片段的多核苷酸、以及载体和包含所述多核苷酸的宿主细胞也由本发明所涵盖。多核苷酸、载体和通过与表达控制元件如启动子可操作相关来表达该多肽的宿主细胞也包括在内。

将24-32融合肽以SEQ ID NO：5在下面示出。

融虫合至NEP32的Amino-Nogo24(SEQ ID NO：5)：

IFSAELSKTSVVDLLYWRDIKKTGGRIYKGVIQAIQKS

DEGHPFRAYLESEVAISEE

在另一具体实施方式中，本发明提供了配体结合特性发生改变的NgR1多肽变异体。例如，本发明提供了包含SEQ ID NO：4的氨基酸27至473的分离多肽，即成熟NgR1多肽，只是在选自由(a)SEQ ID NO：4的氨基酸67、68和71；(b)SEQ ID NO：4的氨基酸111、113和114；(c)SEQ ID NO：4的氨基酸133和136；(d)SEQID NO：4的氨基酸158、160、182和186；(e)SEQ ID NO：4的氨基酸163；以及(f)SEQ ID NO：4的氨基酸232和234组成的组中的氨基酸位置发生了氨基酸替换。在某些具体实施方式中，本发明的多肽不结合Nogo-66、OMgp、Mag、和Lingo-1中的任何一个。

在另一具体实施方式中，本发明提供了包含SEQ ID NO：4的氨基酸27至473并且在至少选自由(a)SEQ ID NO：4的氨基酸78和81；(b)SEQ ID NO：4的氨基酸87和89；(c)SEQ ID NO：4的氨基酸89和90；(d)SEQ ID NO：4的氨基酸95和97；(e)SEQ IDNO：4的氨基酸108；(f)SEQ ID NO：4的氨基酸117、119和120；(g)SEQ ID NO：4的氨基酸13；(h)SEQ ID NO：4的氨基酸210；以及(i)SEQ ID NO：4的氨基酸256和259组成的组中的氨基酸位置发生了的氨基酸替换。在某些具体实施方式中，本发明的多肽结合至Nogo66、OMgp、Mag或Lingo-1中的至少一个但非全部。大鼠或小鼠NgR1的类似NgR1多肽变异体也被考虑到。编码该多肽片段的多核苷酸、以及载体和包含所述多核苷酸的宿主细胞也由本发明所涵盖。多核苷酸、载体和通过与表达控制元件如启动子可操作相关来表达该多肽的宿主细胞也包括在内。

预见的另外的具体实施方式包括编码本发明的多肽或其片段的多核苷酸、以及表达本发明的多肽或其片段的宿主细胞或载体。

本发明的多肽或其片段中的氨基酸残基可以用任何异源氨基酸加以取代。在某些具体实施方式中，氨基酸用较小的不带电氨基酸(其最小可能地改变所述多肽的三维构象)例如丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸、优选丙氨酸加以取代。在其它具体实施方式中，氨基酸用丙氨酸加以取代。

在本发明中，多肽或其片段可由通过肽键或修饰的肽键(即肽电子等排体)相互结合的氨基酸构成，并且可以含有20个编码基因的氨基酸之外的氨基酸(例如，非天然存在的氨基酸)。本发明的多肽可通过天然过程(如翻译后加工)或通过本领域熟知的化学修饰技术加以修饰。这些修饰在基础教材和更详细的专著以及大量研究文献中有详细地描述。修饰可以在多肽的任何地方发生，包括肽主链、氨基酸侧链以及氨基或羧基末端。应当理解，相同类型的修饰可以在特定多肽中的若干部位以相同或不同程度存在。而且，特定多肽可以含有许多类型的修饰。多肽可以被支化，例如由于泛素化导致的，并且它们可以是环状的(具有或没有支化)。环状、支化、以及支化环状的多肽可以由翻译后天然过程导致或者可以通过合成方法形成。修饰包括乙酰化、酰化、ADP-核糖基化、酰胺化、生物素化、核黄素的共价连接、血红素部分的共价连接、核苷酸或核苷酸衍生物的共价连接、脂或脂衍生物的共价连接、磷脂酰肌醇的共价连接、交联、环化、二硫键形成、去甲基化、共价交联的形成、半胱氨酸的形成、焦谷氨酸酯(盐)的形成、甲酰化、γ-羧化、糖基化、GPI锚形体形成、羟基化、碘化、甲基化、十四烷基化、氧化、PEG化、蛋白水解加工、磷酸化、异戊二烯化、外消旋、硒化、硫化、转运RNA介导的氨基酸***蛋白质如精氨酰化、以及泛素化。(参见例如，Proteins-Structure And Molecular Properties，2nd Ed.，T.E.Creighton，W.H.Freemanand Company，New York(1993)；Posttranslational Covalent Modification of Proteins，B.C.Johnson，Ed.，Academic Press，New York，pgs.1-12(1983)；Seifter et al.，MethEnzymol 182：626-646(1990)；Rattan et al.，Ann NY Acad Sci 663：48-62(1992).)。

本文描述的多肽或其片段可以是环状的。多肽的环化减少了线形肽的构象自由度并形成结构上更受限制的分子。许多肽环化的方法在本领域中是已知的。例如，通过在肽的N-末端和C-末端氨基酸残基之间形成酰胺键的“主链-主链”环化。“主链-主链”环化方法包括在两个ω-硫代氨基酸残基(例如半胱氨酸、高半胱氨酸)之间形成二硫桥。本发明的某些肽包括在该肽的N-和C-末端上的修饰以形成环状多肽。这样的修饰包括但不限于半胱氨酸残基、乙酰化半胱氨酸残基、具有NH₂部分和生物素的半胱氨酸残基。肽环化的其它方法描述在Li & Roller.Curr.Top.Med.Chem.3：325-341(2002)中，其全部内容结合于此作为参考。

在本发明的某些方法中，本发明的多肽或其片段可作为预形成多肽直接给予、或通过核酸载体间接给予。在本发明的一些具体实施方式中，本发明的多肽或其片段在治疗方法中被给予，该治疗方法包括：(1)用表达本发明的多肽或其片段的核酸例如载体转化或转染可植入宿主细胞，该宿主细胞；以及(2)在疾病、失调或损伤部位处将转化的宿主细胞植入哺乳动物中。在本发明一些具体实施方式中，该可植入宿主细胞从哺乳动物取出、短暂培养、用编码本发明多肽或其片段的分离的核酸进行转化或转染，并植回到同一哺乳动物(从其取出宿主细胞)中。该细胞可以但不要求从其被植入的同一位置取出。这样的具体实施方式，有时称为体外基因治疗，在有限的时间期内可以定位于起作用的部位，持续供应本发明的多肽或其片段。

下面将描述本发明另外的示例性多肽或其片段以及获得用于实施本发明的这些分子的方法和材料。

融合蛋白和轭合多肽

本发明的一些具体实施方式涉及本发明的多肽的应用，该多肽不是全长蛋白质，例如多肽片段，融合至异源多肽部分以形成融合蛋白。这样的融合蛋白可用来实现各种目的，例如增加血清半衰期、改善生物利用度、体内靶向于特定器官或组织类型、提高重组表达效能、提高宿主细胞分泌、易于纯化以及更高亲合强度。根据要实现的目的，该异源部分可以是惰性或生物学活性的。而且，对其可加以选择以被稳定地融合至本发明的多肽部分或者在体外或体内可切割。用来实现这些其它目的的异源部分在本领域是已知的。

作为融合蛋白表达的替换方法，选择的异源部分并化学轭合至本发明的多肽部分。在大多数情况下，所选异源部分将类似地发挥作用，而不管是否融合或轭合至该多肽部分。因此，在下面论及异源氨基酸序列时，除非另有注释，则应当理解，异源序列可以以融合蛋白的形式或作为化学轭合物结合至该多肽部分。

药理学活性多肽如本发明的多肽或其片段可能表现出快速的体内清除，所以需要大剂量以在体内达到治疗有效浓度。另外，小于约60kDa的多肽可能经过肾小球滤过，有时会导致肾毒性。可采用相对较小的多肽的融合或结合体以减少或避免这样的肾毒性危险。用于增大治疗用多肽的体内稳定性即血清半衰期的各种异源性氨基酸序列，即多肽部分或“载体”是已知的。实例包括血清白蛋白例如牛血清白蛋白(BSA)或人血清白蛋白(HSA)。

由于其较长半衰期、广泛的体内分布以及缺少酶促或免疫功能，所以基本上全长的人血清白蛋白(HSA)或HSA片段通常用作异源部分。通过利用诸如在Yeh et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，89：1904-08(1992)and Sycd et al.Blood 89：3243-52(1997)中教导的那些方法和材料，HSA可用来形成融合蛋白或多肽轭合体，其通过多肽部分表现药理活性，同时表现出显著增加的例如10倍至100倍的更高体内稳定性。HSA的C-末端融合至该多肽部分的N-末端。由于HSA是天然分泌的蛋白质，所以当融合蛋白在真核细胞例如哺乳动物的表达***中形成时，可以利用HSA信号序列以获得分泌到细胞培养基中的融合蛋白。

本发明的一些具体实施方式采用的多肽部分融合至铰链和Fc区，即Ig重链恒定区C末端部位。多肽-Fc融合体的可能优点包括可溶性、体内稳定性、以及多价例如二聚合。使用的Fc区可以是IgA、IgD或IgG Fc区(铰链-CH2-CH3)。可替换地，其可以是IgE或IgM Fc区(铰链-CH2-CH3-CH4)。通常使用IgG Fc区，例如IgG1Fc区或IgG4Fc区。用于构建和表达编码Fc融合体的DNA的材料和方法在本领域是已知的，并且无需过度实验即可用来获得融合体。本发明一些具体实施方式使用如在Capon等的美国专利第5,428,130和5,565,335号中描述的那些融合蛋白。

信号序列是编码氨基酸序列的多核苷酸，其中所述氨基酸序列启动蛋白质通过内质网膜的转运。对于构建免疫融合体很有用的信号序列包括抗体轻链信号序列例如抗体14.18(Gillies et al.，J.Immunol.Meth.，125：191-202(1989))、抗体重链信号序列例如MOPC141抗体重链信号序列(Sakano et al.，Nature 286：5774(1980))。可替换地，也可使用其它信号序列。参见，例如Watson，Nucl.Acids Res.12：5145(1984)。信号肽通常是通过信号肽酶在内质网的腔中切割的，这导致含有Fc区和多肽部分的免疫融合蛋白的分泌。

在一些具体实施方式中，DNA序列可以编码在分泌盒和多肽部分之间的蛋白水解性切割位点。这样的切割位点可以适用于例如编码的融合蛋白的蛋白水解性切割，从而将Fc结构域与靶蛋白分开。有用的蛋白水解性切割位点包括由蛋白水解酶(如胰蛋白酶、纤溶酶、凝血酶、因子Xa或肠激酶K)识别的氨基酸序列。

分泌盒可以被整合到可复制的表达载体中。有用的载体包括线性核酸、质粒、噬菌粒、粘粒等。示例性表达载体是pdC，其中免疫融合DNA的转录处于人巨细胞病毒的增强子和启动子的控制之下。参见例如Lo et al.，Biochim.Biophys.Acta 1088：712(1991)；and Lo etal.，Protein Engineering 11：495-500(1998)。合适的宿主细胞可以利用编码本发明的多肽或其片段的DNA加以转化或转染，并用于该多肽的表达和分泌。通常使用的宿主细胞包括永生化的杂交瘤细胞、骨髓瘤细胞、293细胞、中华仓鼠卵巢(CHO)细胞、海拉细胞(Hela cell)、以及COS细胞。

全部完整的野生型Fc区显示效应器功能，其一般在本发明方法中的Fc融合蛋白中是不必要的并且是不希望的。因此，某些结合位点通常在分泌盒的构建过程中从该Fc区缺失。例如，由于与轻链的共表达不必要，所以重链结合蛋白的结合位点Bip(Hendershot et al.，Immunol.Today 8：111-14(1987))从IgE Fc区的CH2结构域被缺失，使得这个位点不会干扰免疫融合体的有效分泌。跨膜结构域序列如存在于IgM中的那些序列通常也被缺失。

IgG1 Fc区是最常使用的。可替换地，免疫球蛋白γ的其它亚类(γ-2，γ-3和γ-4)的Fc区也被用于分泌盒。免疫球蛋白γ-1的IgG1 Fc区通常用于分泌盒，并且包括至少部分铰链区、CH2区以及CH3区。在一些具体实施方式中，免疫球蛋白γ-1的Fc区是CH2-缺失的Fc，其包括部分铰链区和CH3区，但不包括CH2区。CH2-缺失的Fc已在Gillies et al.，Hum.Antibod.Hybridomas 1：47(1990)中描述过了。在一些具体实施方式中，使用IgA、IgD、IgE或IgM其中之一的Fc区。

多肽部分-Fc融合蛋白可被构建成若干不同构型。在一种构型中，多肽部分的C-末端直接融合至Fc铰链部分的N-末端。在稍微不同的构型中，较短的多肽(例如2-10个氨基酸)被并入多肽部分的N-末端和Fc部分的C-末端之间的融合体中。这种接头提供构象柔性，其可提高在一些情况下的生物学活性。如果铰链区足够的部分保留在Fc部分中，则多肽部分-Fc融合体将发生二聚化，从而形成二价分子。单体Fc融合体的同源性种群将产生单特异性的二价二聚体。两个单体Fc融合体(每一个具有不同的特异性)的混合物将产生双特异性的二价二聚体。

大量含有相应氨基反应性基团和硫醇反应性基团的交联剂中任何一个均可用来将本发明的多肽或其片段连接至血清白蛋白。合适的接头(连接物)的实例包括***硫醇反应性马来酰亚胺(例如SMCC、AMAS、BMPS、MBS、EMCS、SMPB、SMPH、KMUS以及GMBS)的胺反应***联剂。其它合适的接头***硫醇反应性的氯乙酸基团例如SBAP、SIA、SIAB。提供与巯基反应以生成可还原键的保护或非保护硫醇的接头包括SPDP、SMPT、SATA以及SATP。这样的试剂可商业上获得(例如Pierce Chemical Company，Rockford，IL)。

轭合不必须涉及本发明多肽或其片段的N-末端或血清白蛋白上的硫醇部分。例如，多肽-白蛋白融合体可利用遗传改造技术来获得，其中多肽部分可在其N-末端、C-末端或两端融合至血清白蛋白基因。

本发明的多肽或其片段可被融合至多肽标签。如本文所使用的，术语“多肽标签(polypeptide tag)”是指可结合至、连接至或键接至本发明的多肽或其片段并且可用来鉴定、纯化、浓缩、或分离该多肽或其片段的任何氨基酸序列。该多肽标签与所述多肽或其片段的连接可通过例如构建核酸分子来进行，其中的核酸分子包括：(a)编码该多肽标签的核酸序列；和(b)编码本发明的多肽或其片段的核酸序列。示例性多肽标签包括例如能够被翻译后修饰的氨基酸序列如被生物化的氨基酸序列。其它示例性多肽标签包括例如能够被抗体(或其片段)或其它特异性结合试剂所识别和/或结合的氨基酸序列。能够被抗体(或其片段)或其它特异性结合试剂所识别的多肽标签包括例如本领域称为“表位(抗原决定基)标签”的那些标签。表位标签可以是天然或人工表位标签。天然和人工表位标记签在本领域是已知的，包括例如人工表位如FLAG、Strep、或聚组氨酸肽。FLAG肽包括序列Asp-Tyr-Lys-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys(SEQ ID NO：＿)或Asp-Tyr-Lys-Asp-Glu-Asp-Asp-Lys(SEQ ID NO：＿)(Einhauer，A.and Jungbaucr，A.，J.Biochem.Biophys.Methods 49：1-3：455-465(2001))。Strep表位具有序列Ala-Trp-Arg-His-Pro-Gln-Phe-Gly-Gly(SEQ ID NO：＿)。VSV-G表位也可使用并具有序列Tyr-Thr-Asp-Ile-Glu-Met-Asn-Arg-Leu-Gly-Lys(SEQ ID NO：＿)。另一人工表位是具有六个组氨酸残基的聚-His序列(His-His-His-His-His-His(SEQ ID NO：＿)。天然存在的表位包括由单克隆抗体12CA5识别的流感病毒血凝素(HA)序列Tyr-Pro-Tyr-Asp-Val-Pro-Asp-Tyr-Ala-Ile-Glu-Gly-Arg(SEQ ID NO：＿)(Murray et al.，Anal.Biochem.229：170-179(1995))，和由单克隆抗体9E10识别的来自人c-myc(Myc)的十一个氨基酸序列(Glu-Gln-Lys-Leu-Leu-Ser-Glu-Glu-Asp-Leu-Asn(SEQ ID NO：＿)(Manstein et al.，Gene162：129-134(1995))。另一有用的表位是三肽Glu-Glu-Phe，其由单克隆抗体YL 1/2识别(Stammers et al.FEBS Lett.283：298-302(1991))。

在某些具体实施方式中，本发明的多肽或其片段和所述多肽标签可通过键接用氨基酸序列加以连接。如本文所使用的，“键接用氨基酸序列”可以是能够被一个或多个蛋白酶识别和/或切割的氨基酸序列。可被一个或多个蛋白酶识别和/或切割的氨基酸序列在本领域是已知的。示例性氨基酸序列是由以下蛋白酶识别的那些序列：因子VIIa，因子IXa，因子Xa，APC，t-PA，u-PA，胰蛋白酶，胰凝乳蛋白酶，肠激酶，胃蛋白酶，组织蛋白酶B、H、L、S、D，组织蛋白酶G，高血压蛋白原酶，血管紧张肽转化酶，基质金属蛋白酶(胶原酶、基质溶素、明胶酶)，巨噬细胞弹性蛋白酶，Cir和Cis。由前述蛋白酶识别的氨基酸序列在本领域是已知的。由某些蛋白酶识别的示例性序列可在美国专利第5,811,252号中找到。

多肽标签有利于利用商业上可获得的层析介质进行纯化。

在本发明的一些具体实施方式中，多肽融合构建体被用来增强本发明的多肽部分在细菌中生产。在这种构建体中，通常以高水平表达和/或分泌的细菌蛋白被用作本发明多肽或其片段的N-末端融合分子伴侣。参见例如Smith et al.，Gene 67：31(1988)；Hopp et al.，Biotechnology6：1204(1988)；La Vallie et al.，Biotechnology 11：187(1993)。

通过在合适融合分子伴侣的氨基和羧基末端融合本发明的多肽部分，可获得本发明多肽或其片段的二价或四价形式。例如，本发明的多肽部分可融合至Ig部分的氨基和羧基末端，而形成含有两个本发明的多肽部分的二价单体多肽。通过这些单体中的两个二聚合(借助于Ig部分)，获得本发明多肽的四价形式。这种多价形式可用来获得增大的靶结合亲和力。本发明多肽或其片段的多价形式也可通过将本发明的多肽或其片段串联放置以形成串联体(concatamer)而获得，其可被单独使用或融合至融合分子伴侣如Ig或HAS而使用。

轭合(结合)聚合物(不同于多肽)

本发明的一些具体实施方式涉及本发明的多肽或其片段，其中一个或多个聚合物被轭合(共价键接)至本发明的多肽或其片段。适用于这样的轭合的聚合物的实例包括多肽(上述的)、糖聚合物以及聚亚烷基二醇链。通常但非必需的，聚合物被轭合至本发明的多肽或其片段用于提高以下性质中的一个或多个：溶解性、稳定性、或生物可利用性。

通常用于轭合至本发明多肽或其片段的聚合物种类是聚亚烷基二醇。聚乙二醇(PEG)是最常用的。PEG部分，例如1、2、3、4或5个PEG聚合物，可轭合至本发明的每一个多肽或其片段，相比于单独的本发明多肽或其片段可增大血清半衰期。PEG部分是非抗原性且基本上是生物学惰性的。用于本发明实践中的PEG部分可以是支化或未支化的。

结合至本发明多肽或其片段的PEG部分的数量和单个PEG链的分子量可以变化。总体上说，聚合物分子量越高，结合至多肽的聚合物链越少。通常，结合至本发明多肽或其片段的聚合物总质量为20kDa至40kDa。因此，如果一个聚合物链被结合，则该链的分子量通常为2-40kDa。如果两个链被结合，则每个链的分子量通常为10-20kDa。如果三个链被结合，则其分子量通常为7-14kDa。

聚合物(例如PEG)可通过多肽上任何合适的暴露的反应性基团而键接至本发明的多肽或其片段。该暴露的反应性基团可以是例如内部赖氨酸残基的N-末端氨基或ε氨基、或这二者。活化的聚合物可发生反应并在本发明多肽或其片段上的任何游离氨基处共价键接。本发明的多肽或其片段(如果可利用)的游离羧基、适当活化的羧基、羟基、胍基、咪唑、氧化的糖部分以及巯基也可被用作用做聚合物结合的反应性基团。

在轭合反应中，根据多肽的浓度，通常采用每摩尔多肽加入约1.0至约10摩尔的活化聚合物。通常地，所选比率表示在使反应最大化同时使可减弱本发明多肽的预期药理活性的副反应(常常是非特异的)最小化之间的平衡。优选地，本发明多肽或其片段的至少50％的生物学活性(如证实的，例如，在本文中描述的或本领域已知的任何测定中证实的)被保留，最优选近100％被保留。

可利用传统化学将聚合物轭合至本发明的多肽或其片段。例如，聚亚烷基二醇部分可偶联至本发明多肽或其片段的赖氨酸ε氨基。键接至赖氨酸侧链可利用N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)活性酯，如琥珀酰亚胺基琥珀酸PEG酯(SS-PEG)和琥珀酰亚胺基丙酸PEG酯(SPA-PEG)。合适的聚亚烷基二醇部分包括例如羧甲基-NHS和正亮氨酸-NHS、SC。这些试剂是商业上可获得的。其它胺反应性PEG连接物可代替琥珀酰亚胺基部分。这些包括例如异硫氰酸酯、硝基苯基碳酸酯(PNP)、环氧、苯并***碳酸酯、SC-PEG、三氟乙基磺酸酯(tresylate)、醛、环氧树脂、羰基咪唑以及PNP碳酸酯。通常对条件进行优化以使反应的选择性和反应程度最大化。这样的反应条件优化在本领域技术人员的能力范围之内。

PEG化可通过本领域已知的任何PEG化反应来实现。参见例如Focus on Growth Factors，3：4-10，1992和欧洲专利申请EP 0 154 316和EP 0 401 384。PEG化可以利用与反应性聚乙二醇分子(或类似的反应性水溶性聚合物)的酰化反应或烷基化反应来实现。

通过酰化的PEG化通常涉及使聚乙二醇的活性酯衍生物反应。任何反应性PEG分子在PEG化中均可采用。经常使用的活化PEG酯是酯化于N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)的PEG。如本文所使用的，“酰化”包括但不限于以下类型的在治疗用蛋白质和水溶性聚合物如PEG之间的键接：酰胺、氨基甲酸酯、聚氨酯等。参见例如Bioconjugate Chem.5：133-140，1994。通常对反应参数进行选择以避免损害或使本发明的多肽或其片段失活的温度、溶剂以及pH条件。

通常，连接性键接是酰胺，并且典型地，至少95％的所得产物是单、二或三PEG化的。然而，一些具有更高程度PEG化的产物可能形成，其量取决于所使用的特异反应条件。可选地，通过传统纯化方法包括例如透析、盐析、超滤、离子交换层析、凝胶过滤层析、疏水交换层析、以及电泳将纯化的PEG化产物尤其是未反应产物从混合物分离出来。

通过烷基化的PEG化通常包括存在还原剂下，使PEG的端醛衍生物与本发明的多肽或其片段反应。另外，人们可操控反应条件以利于基本上仅在本发明多肽或其片段的N-末端氨基基团进行PEG化(即单-PEG化的蛋白质)。在单PEG化或多PEG化的情况下，PEG基团通常通过-CH2-NH-基团连接至该蛋白质。尤其优选-CH2-基团，这种类型的键接称为“烷基”键接。

通过还原性烷基化以产生N-末端靶向的单PEG化产物的衍生化利用了用于衍生的不同类型的伯氨基基团(赖氨酸相对的N-末端)的差异反应性。该反应在允许利用赖氨酸残基的ε-氨基基团和蛋白质的N-末端氨基基团之间的pKa差异的pH下完成。通过这种选择性衍生化，可对含有诸如醛的反应性基团的水溶性聚合物连接至蛋白质进行控制：与聚合物的轭合主要发生在蛋白质的N-末端处并且没有发生其它反应性基团如赖氨酸侧链氨基基团的显著修饰。

用于酰化和烷基化方法中的聚合物分子选自水溶性聚合物。所选聚合物通常加以修饰以具有单个反应性基团，如用于酰化的活性酯或用于烷基化的醛，使得可以控制提供用于本方法的聚合的程度。示例性反应性PEG醛是聚乙二醇丙醛(其是水稳定的)，或其单C1-C10烷氧基或芳氧基衍生物(参见例如Harris等的美国专利5,252,714)。聚合物可以是支化或未支化的。对于酰基化反应，所选聚合物通常具有单个反应性酯基团。对于还原性烷基化，所选聚合物通常具有单个反应性醛基基团。通常，水溶性聚合物不选自天然存在的糖基残基，这是因为这些残基通常通过哺乳动物重组表达***可更方便制得。

用于制备本发明的PEG化多肽或其片段的方法通常包括步骤(a)在分子可结合至一个或多个PEG基团的条件下，使本发明的多肽或其片段与聚乙二醇(如PEG的反应性酯或醛衍生物)进行反应，以及(b)获得反应产物。通常，用于酰基化反应的最佳条件要根据已知参数和预期结果来具体确定。例如，PEG：蛋白质的比率越大，通常导致聚PEG化产物的百分比越大。

用来生成大致同源性种群的单聚合物/本发明多肽或其片段的还原性烷基化通常包括步骤：(a)在还原性烷基化条件下，在适于选择性修饰本发明多肽或其片段的N-末端氨基基团的pH下，使本发明的多肽或其片段与反应性PEG分子进行反应；以及(b)获得反应产物。

对于大致是同源性种类的单聚合物/本发明多肽或其片段，还原性烷基化反应条件是允许水溶性聚合物部分选择性地连接至本发明多肽或其片段的N-末端的条件。这样的反应条件通常提供在赖氨酸侧链氨基基团和N-末端氨基基团之间的pKa差异。对于本发明的目的来说，pH通常在在3-9的范围，典型的在3-6的范围内。

本发明的多肽或其片段可包括标签，例如随后可由蛋白水解释放的部分。因此，赖氨酸部分可选择性地通过首先用低分子量接头如Traut试剂(Pierce Chemical Company，Rockford，IL)(将与赖氨酸和N-末端二者发生反应)修饰的His-标签加以修饰，然后释放这个His标签。然后该多肽将含有游离SH基团，其可选择性地用含有硫醇反应性头基如马来酰亚胺基团、乙烯基砜基团、卤代乙酸酯基团、或游离或经保护的SH的PEG加以修饰。

Traut试剂可用任何可构建PEG结合的特异性位点的接头所代替。例如，Traut试剂可用SPDP、SMPT、SATA、或SATP(Pierce Chemical Company，Rockford，IL)所代替。类似地，可使蛋白质与***马来酰亚胺(例如SMCC、AMAS、BMPS、MBS、EMCS、SMPB、SMPH、KMUS、或GMBB)、卤代乙酸酯基团(SBAP、SIA、SIAB)、或乙烯基砜基团的胺反应性接头反应，并使所得产物与含有游离SH的PEG进行反应。

在一些具体实施方式中，聚亚烷基二醇部分偶联至本发明的多肽或其片段的赖氨酸基团。偶联可利用例如马来酰亚胺基团、乙烯基砜基团、卤代乙酸酯基团或硫醇基团来实现。

可选地，本发明的多肽或其片段通过不稳定键轭合至聚乙二醇部分。该不稳定键可在例如生物化学水解、蛋白水解、或巯解中断裂。例如，该键可在体内(生理)条件下断裂。

该反应可通过任何合适的用于使生物活性物质与惰性聚合物起反应的方法来进行，如果反应性基团是在N-末端处的α-氨基基团上，则优选在约pH5-8，例如pH5、6、7或8下进行反应。通常该过程涉及制备活化聚合物，然后使蛋白质与活化的聚合物反应以生成适用于制剂的可溶性蛋白。

本发明的多肽或其片段，在某些具体实施方式中，是可溶性多肽。用于使多肽可溶或提高多肽的溶解性的方法在本领域是已知的。

多核苷酸

本发明还包括编码本发明的多肽或其片段中任何一个的分离的多核苷酸。本发明还包括在中度限制性或高度限制性条件下杂交于编码本发明的多肽或其片段中任何一个的分离的多核苷酸的非编码链或互补物的多核苷酸。限制性条件对于本领域技术人员是已知的并且可在CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY，John Wiley & Sons，N.Y.(1989)，6.3.1-6.3.6中找到。

将人Nogo-A多核苷酸在下面示出作为SEQ ID NO：1。

由核苷酸135至核苷酸3710编码的全长人Nogo-A(SEQ IDNO：1)：

caccacagta ggtccctcgg ctcagtcggc ccagcccctc tcagtcctcc ccaaccccca caaccgcccg

cggctctgag acgcggcccc ggcggcggcg gcagcagctg cagcatcatc tccaccctcc agccatggaa

gacctggacc agtctcctct ggtctcgtcc tcggacagcc caccccggcc gcagcccgcg ttcaagtacc agttcgtgag

ggagcccgag gacgaggagg aagaagagga ggaggaagag gaggacgagg acgaagacct ggaggagctg

gaggtgctgg agaggaagcc cgccgccggg ctgtccgcgg ccccagtgcc caccgcccct gccgccggcg

cgcccctgat ggacttcgga aatgacttcg tgccgccggc gccccgggga cccctgccgg ccgctccccc

cgtcgccccg gagcggcagc cgtcttggga cccgagcccg gtgtcgtcga ccgtgcccgc gccatccccg

ctgtctgctg ccgcagtctc gccctccaag ctccctgagg acgacgagcc tccggcccgg cctccccctc

ctcccccggc cagcgtgagc ccccaggcag agcccgtgtg gaccccgcca gccccggctc ccgccgcgcc

cccctccacc ccggccgcgc ccaagcgcag gggctcctcg ggctcagtgg atgagaccct ttttgctctt cctgctgcat

ctgagcctgt gatacgctcc tctgcagaaa atatggactt gaaggagcag ccaggtaaca ctatttcggc tggtcaagag

gatttcccat ctgtcctgct tgaaactgct gcttctcttc cttctctgtc tcctctctca gccgcttctt tcaaagaaca

tgaatacctt ggtaatttgt caacagtatt acccactgaa ggaacacttc aagaaaatgt cagtgaagct tctaaagagg

tctcagagaa ggcaaaaact ctactcatag atagagattt aacagagttt tcagaattag aatactcaga aatgggatca

tcgttcagtg tctctccaaa agcagaatct gccgtaatag tagcaaatcc tagggaagaa ataatcgtga aaaataaaga

tgaagaagag aagttagtta gtaataacat ccttcataat caacaagagt tacctacagc tcttactaaa ttggttaaag

aggatgaagt tgtgtcttca gaaaaagcaa aagacagttt taatgaaaag agagttgcag tggaagctcc tatgagggag

gaatatgcag acttcaaacc atttgagcga gtatgggaag tgaaagatag taaggaagat agtgatatgt tggctgctgg

aggtaaaatc gagagcaact tggaaagtaa agtggataaa aaatgttttg cagatagcct tgagcaaact aatcacgaaa

aagatagtga gagtagtaat gatgatactt ctttccccag tacgccagaa ggtataaagg atcgttcagg agcatatatc

acatgtgctc cctttaaccc agcagcaact gagagcattg caacaaacat ttttcctttg ttaggagatc ctacttcaga

aaataagacc gatgaaaaaa aaatagaaga aaagaaggcc caaatagtaa cagagaagaa tactagcacc

aaaacatcaa acccttttct tgtagcagca caggattctg agacagatta tgtcacaaca gataatttaa caaaggtgac

tgaggaagtc gtggcaaaca tgcctgaagg cctgactcca gatttagtac aggaagcatg tgaaagtgaa ttgaatgaag

ttactggtac aaagattgct tatgaaacaa aaatggactt ggttcaaaca tcagaagtta tgcaagagtc actctatcct

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atgaaagcat aaaacatgag cctgaaaacc ccccaccata tgaagaggcc atgagtgtat cactaaaaaa agtatcagga

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atacctgacg ttccacaaaa acaagatgaa actgtgatgc ttgtgaaaga aagtctcact gagacttcat ttgagtcaat

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aatccaagca aaaatccctg gattgaagcg caaagctgaa tgaaaacgcc caaaataatt agtaggagtt catctttaaa

ggggatattc atttgattat acgggggagg gtcagggaag aacgaacctt gacgttgcag tgcagtttca cagatcgttg

ttagatcttt atttttagcc atgcactgtt gtgaggaaaa attacctgtc ttgactgcca tgtgttcatc atcttaagta

ttgtaagctg ctatgtatgg atttaaaccg taatcatatc tttttcctat ctgaggcact ggtggaataa aaaacctgta

tattttactt tgttgcagat agtcttgccg catcttggca agttgcagag atggtggagc tag

将人Nogo受体-1多核苷酸在下面示出作为SEQ ID NO：3。

由核苷酸13至核苷酸1422编码的全长人Nogo受体-1(SEQ IDNO：3)：

ccaaccccta cgatgaagag ggcgtccgct ggagggagcc ggctgctggc atgggtgctg tggctgcagg

cctggcaggt ggcagcccca tgcccaggtg cctgcgtatg ctacaatgag cccaaggtga cgacaagctg

cccccagcag ggcctgcagg ctgtgcccgt gggcatccct gctgccagcc agcgcatctt cctgcacggc

aaccgcatct cgcatgtgcc agctgccagc ttccgtgcct gccgcaacct caccatcctg tggctgcact cgaatgtgct

ggcccgaatt gatgcggctg ccttcactgg cctggccctc ctggagcagc tggacctcag cgataatgca cagctccggt

ctgtggaccc tgccacattc cacggcctgg gccgcctaca cacgctgcac ctggaccgct gcggcctgca

ggagctgggc ccggggctgt tccgcggcct ggctgccctg cagtacctct acctgcagga caacgcgctg

caggcactgc ctgatgacac cttccgcgac ctgggcaacc tcacacacct cttcctgcac ggcaaccgca tctccagcgt

gcccgagcgc gccttccgtg ggctgcacag cctcgaccgt ctcctactgc accagaaccg cgtggcccat

gtgcacccgc atgccttccg tgaccttggc cgcctcatga cactctatct gtttgccaac aatctatcag cgctgcccac

tgaggccctg gcccccctgc gtgccctgca gtacctgagg ctcaacgaca acccctgggt gtgtgactgc

cgggcacgcc cactctgggc ctggctgcag aagttccgcg gctcctcctc cgaggtgccc tgcagcctcc

cgcaacgcct ggctggccgt gacctcaaac gcctagctgc caatgacctg cagggctgcg ctgtggccac

cggcccttac catcccatct ggaccggcag ggccaccgat gaggagccgc tggggcttcc caagtgctgc

cagccagatg ccgctgacaa ggcctcagta ctggagcctg gaagaccagc ttcggcaggc aatgcgctga

agggacgcgt gccgcccggt gacagcccgc cgggcaacgg ctctggccca cggcacatca atgactcacc

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cctcgggccc tcgccggagg ccaggctgtt cacgcaagaa ccgcacccgc agccactgcc gtctgggcca

ggcaggcagc gggggtggcg ggactggtga ctcagaaggc tcaggtgccc tacccagcct cacctgcagc

ctcacccccc tgggcctggc gctggtgctg tggacagtgc ttgggccctg ctgaccccca g

载体

包含编码本发明多肽或其片段的核酸的载体可以用来制备用于本发明方法中的多肽。选择载体和这样的核酸可操作连接的表达控制序列依赖于所希望的功能性质，例如蛋白质表达以及待转化的宿主细胞。

对于调节可操作连接的编码序列表达非常有用的表达控制元件在本领域是已知的。实例包括但不限于可诱导启动子、组成型启动子、分泌信号、以及其它调节元件。当使用可诱导启动子时，其可通过例如宿主细胞介质中营养状态的变化或温度的变化加以控制。

载体可包括原核复制子，即具有指导细菌宿主细胞中染色体外的重组DNA分子自主复制和维持的能力的DNA序列。这种复制子在本领域是熟知的。另外，包括原核复制子的载体也可包括表达赋予可检测标记物如抗药性的基因。细菌抗药性基因的实例是赋予氨苄西林或四环素抗性的那些基因。

包括原核复制子的载体也可包括用于指导细菌宿主细胞中的编码基因序列表达的原核或抗菌素启动子。与细菌宿主相容的启动子序列通常在含有限制性位点的质粒载体中提供，该限制性位点方便待表达DNA片段***。这种质粒载体的实例为pUC8、pUC9、pBR322和pBR329(BioRad Laboratories，Hercules，CA)、pPL以及pKK223(Pharmacia)。任何合适的原核宿主可以用来表达编码用于本发明方法中蛋白的重组DNA分子。

对于本发明的目的来说，可以采用多种表达载体***。例如，一类载体利用DNA元件，其衍生自动物病毒如牛***瘤病毒、多瘤病毒、腺病毒、牛痘病毒、杆状病毒、逆转录酶病毒(RSV，MMTV或MOMLV)或SV40病毒。其它涉及具有内部核糖体结合位点的多顺反子***的应用。另外，已将DNA并入其染色体中的细胞可以通过引入允许选择已转染的宿主细胞的一个或多个标记物加以选择。标记物可以为自养宿主提供原营养、杀生剂抗性(例如抗生素)或对重金属如铜的耐受性。该可选择的标记基因可以或者直接连接至待表达的DNA序列、或者通过共转化引入到同一细胞中。新霉素磷酸转移酶(neo)基因是可选标记基因的一个实例(Southernet al.，J.Mol.Anal.Genet.1：327-341(1982))。可能还需要其它元件用于mRNA的最佳合成。这些元件可以包括信号序列、剪接信号、以及转录启动子、增强子以及终止信号。

在一个具体实施方式中，可以使用Biogen IDEC，Inc.的称为NEOSPLA的专利表达载体(美国专利6,159,730)。这种载体含有巨细胞病毒启动子/增强子、小鼠β球蛋白主要启动子、SV40复制起始区、牛生长素多腺苷酸化序列、新霉素磷酸转移酶外显子1和外显子2、二氢叶酸还原酶基因以及前导序列。已发现这种载体实现在CHO细胞中转染时非常高水平的表达，随后是在含有介质的G418中选择和氨甲喋呤扩增。当然，能够在真核细胞中引导表达的任何表达载体均可用于本发明。合适载体的实例包括但不限于质粒pcDNA3、pHCMV/Zeo、PCR3.1、pEF1/His、pIND/GS、pRc/HCMV2、pSV40/Zeo2、pTRACER-HCMV、pUB6/V5-His、pVAX1、和pZeoSV2(可获自Invitrogen，San Diego，CA)、以及质粒pCI(可获自Promega，Madison，WI)。另外的真核细胞表达载体在本领域是已知的并且可商业性获得。通常，这样载体含有用于***希望的DNA片段的便利限制性位点。示例性载体包括pSVL和pKSV-10(Pharmacia)、pBPV-1、pm12d(InternationalBiotechnologies)、pTDT1(ATCC 31255)、逆转录酶病毒表达载体pMIG以及pLL3.7、腺病毒穿梭载体pDC315、以及AAV载体。其它示例性载体***披露于例如美国专利6,413,777中。

通常，筛选大量用于适宜表达高水平拮抗剂的转化细胞是常规实验，其可由例如机器人***来完成。

经常使用的用于哺乳动物宿主细胞表达的调节序列包括在哺乳动物细胞中指导高水平蛋白质表达的病毒元件，如衍生自逆转录酶病毒LTR、巨细胞病毒(CMV)(如CMV启动子/增强子)、猿病毒40(SV40)(如SV40启动子/增强子)、腺病毒(例如腺病毒主要晚期启动子(AdmlP))的启动子和增强子，多瘤和大哺乳动物启动子如本身的免疫球蛋白和肌动蛋白启动子。对于病毒调节性因子及其序列的进一步描述，参见例如Stinski的美国专利第5,168,062号；Bell的美国专利第4,510,245号；以及Schaffner的美国专利第4,968,615号。

重组表达载体可以携带调节宿主细胞中载体(例如，复制起始区)复制以及可选标记基因的序列。可选标记基因促进宿主细胞(载体已被引入其中)的选取(参见，例如Axel的美国专利第4,399,216、4,634,665以及5,179,017号)。例如，通常可选标记基因在宿主细胞(载体已被引入其中)上赋予对药物如G418、潮霉素或甲氨蝶呤的抗性。经常使用的可选标记基因包括二氢叶酸还原酶(DHFR)基因(用于具有甲氨蝶呤选择/扩增的dhfr-宿主细胞)以及neo基因(用于G418选择)。

编码多肽或其片段的载体可用于合适宿主细胞的转化。可以通过任何合适的方法进行转化。用于将外源DNA引入哺乳动物细胞中的方法在本领域是熟知的，并且包括葡聚糖介导的转染、磷酸钙沉淀、1，5-二甲基-1，5-二氮十一亚甲基聚甲溴化物(polybrene)介导的转染、原生质体融合、电穿孔、脂质体中的多核苷酸的包封(encapsulation)，并将DNA直接显微注射导入细胞核中。另外，核酸分子可以通过病毒载体引入哺乳动物细胞中。

宿主细胞的转化可通过适合于所采用的载体和宿主细胞的传统方法来完成。对于原核宿主细胞的转化，可采用电穿孔和盐处理方法(Cohen et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 69：2110-14(1972))。对于脊椎动物细胞的转化，可采用电穿孔、阳离子脂或盐处理方法。参见例如Graham et al.，Virology 52：456-467(1973)；Wigler et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA76：1373-76(1979)。

用于蛋白质表达的宿主细胞系最优选为哺乳动物来源；相信本领域的技术人员具有优先确定特定宿主细胞系(其最适于所希望的基因产物在其中表达)的能力。示例性宿主细胞系包括但不限于NSO、SP2细胞、幼年仓鼠肾(BHK)细胞、猴肾细胞(COS)、人肝细胞癌细胞(例如Hep G2)、A549细胞DG44以及DUXB11(中华仓鼠卵巢系，没有DHFR)、HELA(人***)、CVI(猴肾系)、COS(具有SV40T抗原的CVI的衍生物)、R1610(中华仓鼠成纤维细胞)、BALBC/3T3(小鼠成纤维细胞)、HAK(仓鼠肾系)、SP2/O(小鼠骨髓瘤)、P3x63-Ag3.653(小鼠骨髓瘤)、BFA-1c1BPT(牛内皮细胞)、RAJI(人淋巴细胞)以及293(人肾)。宿主细胞系通常可从商业服务点、美国组织培养中心或从公开文献获得。

来自生产细胞系的多肽表达可利用已知技术来增强。例如，谷酰胺合成酶(GS)***通常用于在某些条件下增强表达。参见例如欧洲专利第0 216 846、0 256 055、和0 323 997号以及欧洲专利申请第89303964.4号。

真核细胞表达载体在本领域是已知的并且可商业性获得。通常，这种载体含有用于***预期DNA片段的便利限制位点。示例性载体包括pSVL和pKSV-10、pBPV-1、pm12d、pTDT1(ATCC31255)、逆转录病毒表达载体pMIG、腺病毒穿梭载体pDC315、以及AAV载体。

真核细胞表达载体可以包括可选标记物，例如抗药性基因。新霉素磷酸转移酶(neo)基因是这样的基因的一个实例(Southern et al.，J.Mol.Anal.Genet.1：327-341(1982))

经常使用的哺乳动物宿主细胞表达调节序列包括在哺乳动物细胞中引导高水平蛋白质表达的病毒元件，如衍生自逆转录酶病毒LTR、细胞巨化病毒(CMV)(如CMV启动子/增强子)、猿病毒40(SV40)(如SV40启动子/增强子)、腺病毒(例如腺病毒主要晚期启动子(AdmlP))的启动子和增强子，多瘤和大哺乳动物启动子如本身的免疫球蛋白和肌动蛋白启动子。对于病毒调节性元件及其序列的进一步描述，参见例如Stinski的美国专利第5,168,062号；Bell的美国专利第4,510,245号；以及Schaffner的美国专利第4,968,615号。

重组表达载体可以携带调节宿主细胞中载体(例如，复制起始区)复制以及可选标记基因的序列。可选标记基因促进宿主细胞(载体已被引入其中)的选取(参见，例如Axel的美国专利第4,399,216、4,634,665以及5,179,017号)。例如，通常可选标记基因在宿主细胞(载体已被引入其中)上赋予对药物如G418、潮霉素或甲氨蝶呤的抗性。经常使用的可选标记基因包括二氢叶酸还原酶(DHFR)基因(用于具有甲氨蝶呤选择/扩增的dhfr-宿主细胞)以及neo基因(用于G418选择)。

编码多肽或其片段的核酸以及包含这些核酸分子的载体可被用于合适宿主细胞的转化。可以通过任何合适的方法进行转化。用于将外源DNA引入哺乳动物细胞中的方法在本领域是熟知的，并且包括葡聚糖介导的转染、磷酸钙沉淀、1，5-二甲基-1，5-二氮十一亚甲基聚甲溴化物(polybrene)介导的转染、原生质体融合、电穿孔、脂质体中的多核苷酸的包封(encapsulation)，并将DNA直接显微注射导入细胞核中。另外，核酸分子可以通过病毒载体引入哺乳动物细胞中。

宿主细胞的转化可通过适合于所采用的载体和宿主细胞的传统方法来完成。对于原核宿主细胞的转化，可采用电穿孔和盐处理方法(Cohen et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 69：2110-14(1972))。对于脊椎动物细胞的转化，可采用电穿孔、阳离子脂类或盐处理方法。参见例如Graham et al.，Virology 52：456-467(1973)；Wigler et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 76：1373-76(1979)。

宿主细胞

用于表达用于本发明方法中的本发明多肽或其片段的宿主细胞可以是原核或真核细胞。示例性真核宿主细胞包括但不限于酵母细胞和哺乳动物细胞例如中华仓鼠卵巢(CHO)细胞(ATCC登记号CCL61)、NIH瑞士小鼠胚胎细胞NIH-3T3(ATCC登记号CRL1658)、以及幼年仓鼠肾细胞(BHK)。其它有用的真核宿主细胞包括昆虫细胞以及植物细胞。示例性原核宿主细胞是大肠杆菌和链霉菌(Streptomyces)。

可用作用于表达的宿主的哺乳动物细胞系在本领域是已知的，并且包括许多获自美国典型培养中心(ATCC)的永生化细胞系。这些包括(尤其是)中华仓鼠卵巢(CHO)细胞、NSO、SP2细胞、海拉细胞、幼年仓鼠肾细胞(BHK)细胞、猴肾细胞(COS)、人肝癌细胞(例如Hep G2)、A549细胞以及多种其它细胞系。

来自生产细胞系的多肽表达可利用已知技术来增强。例如，谷酰胺合成酶(GS)***通常用于在某种条件下增强表达。参见例如欧洲专利第0 216 846、0 256 055、和0 323 997号以及欧洲专利申请第89303964.4号。

药物组合物

本发明的多肽、多肽片段、多核苷酸、载体以及宿主细胞可以制成药物组合物，用于给予哺乳动物(包括人)。在本发明方法中使用的药物组合物包含药用载体(carrier)，其包括例如离子交换剂、氧化铝、硬脂酸铝、卵磷脂、血清蛋白如人血清白蛋白、缓冲物质如磷酸盐、甘氨酸、山梨酸、山梨酸钾、饱和植物脂肪酸的部分甘油酯、水、盐或电解质如鱼精蛋白硫酸盐、磷酸氢二钠、磷酸氢钾、氯化钠、锌盐、胶体硅、三硅酸镁、聚乙烯基吡咯烷酮、纤维素基物质、聚乙二醇、羧甲基纤维素钠、聚丙烯酸酯、石蜡、聚乙烯-聚氧丙烯嵌段聚合物、聚乙二醇以及羊毛脂。

在本发明方法中使用的组合物可以通过任何合适的方法给予，例如肠胃外、心室内、口服、通过吸入喷雾、局部、直肠、鼻内、口腔、***或借助于植入式药盒(implanted reservoir)进行给予。如在本发明中所使用的，术语“肠胃外”包括皮下、静脉内、肌内、动脉内、滑膜内(intra-synovial)、胸内(intrasternal)、鞘内、肝内、伤口内以及头颅内注射或灌注技术。在本发明的方法中本发明的多肽或其片段的给予方式使得其能够穿越血-脑屏障(blood-brainbarrier)。这种穿越可由多肽分子本身固有的物化性质所导致、由药物制剂中的其它成分所导致、或由使用机械装置如针、插管或手术器械来破坏血-脑屏障。在本发明的多肽或其片段本身是不能穿越血-脑屏障的分子的情况下，例如融合至促进穿越的部分，合适的给予路径是例如鞘内或头颅内给予。在本发明的多肽或其片段是本身可穿越血-脑屏障的分子的情况下，给予的路径可以是下述的各种路径中的一种或多种。

在本发明方法中所使用的组合物的无菌可注射剂型可以为含水或含油悬浮液。这些悬浮液可以利用合适的分散剂或润湿剂以及悬浮剂根据本领域已知技术制成。该无菌、可注射制剂还可以是在非毒性肠胃外可接受的稀释剂或溶剂中的无菌、可注射溶液或悬浮液，例如作为在1，3-丁二醇中的悬浮液。在可接受赋形剂和溶剂之中，可以被采用的是水、林格氏溶液、以及等渗氯化钠溶液。另外，无菌、固定油(不挥发性油，fixed oil)通常被用作溶剂或悬浮介质。因此，可以使用任何柔和的固定油，包括合成的单-或二-甘油酯。脂肪酸如油酸及其甘油酯衍生物作为天然药用油在可注射的制剂中很有用，如橄榄油或蓖麻油，尤其是以其聚氧乙烯化形式。这些油溶液或悬浮液还可以含有长链醇稀释剂或分散剂如羧甲基纤维素或类似分散剂，其通常用于药用剂型(包括乳液和悬浮液)的制剂中。对于制剂来说，还可以使用其它通常使用的表面活性剂如吐温、司盘类以及其它乳化剂或生物可利用增强子，其通常用于制造药用固体、液体、或其它剂型。

肠胃外制剂可以是单一推注剂量、灌注液或加载推注剂量，随后是维持剂量。这些组合物可以以特殊的固定或可变间隔期，例如每天一次或基于“根据需要”的间隔期而给予。

在本发明方法中使用的某些药物组合物可以以可接受的剂型，(包括例如胶囊、片剂、水性悬浮液或溶液)口服给予。某些药物组合物也可以通过鼻内气雾剂或吸入进行给予。这样的组合物可以被制成在盐水中的溶液，采用苯甲醇或其它合适的防腐剂、吸收促进剂以增强生物可利用度、和/或其它传统增溶剂或分散剂。

本发明的多肽或其片段(其可以与载体物质结合以产生单剂型)的量根据所处理的宿主和给予的具体方式而变化。该组合物可以作为单剂量、多剂量或在灌注中已确定的时间期内给予。给药方案还可以调整以提供最优的预期反应(例如治疗性或预防性反应)。

本发明的方法使用“治疗有效量”或“预防有效量”的本发明的多肽或其片段。这种治疗或预防有效量可以根据许多因素(如疾病状态、年龄、性别、个体的重量)而变化。治疗或预防有效量还指一个剂量，其中治疗有利作用超过了任何毒性或有害作用。

用于任何特定患者的特定剂量和治疗方案依赖于各种因素，包括所用的特定的本发明多肽或其片段、患者的年龄、体重、总体健康状况、性别、饮食、以及给药时间、***速率、联合用药、以及要治疗的具体疾病的严重性。医疗者(caregiver)对这样的因素的判断是在本领域普通技术人员的能力范围内。该量还将依赖于要治疗的个体患者、给药途径、制剂类型、所用化合物的性质、疾病的严重性以及预期的效果。所用的量可以通过本领域技术人员熟知的药理学和药物动力学原理确定。

在本发明的方法中，本发明的多肽或其片段通常可以直接经脑心室内或鞘内地给予至神经***。根据本发明的方法，用于给予的组合物可以被配制以便以每天0.001-10mg/kg体重的剂量给予本发明的多肽或其片段。在本发明的一些具体实施方式中，该剂量为每天0.01-1.0mg/kg体重。在一些具体实施方式中，该剂量为每天0.001-0.5mg/kg体重。

补充活性化合物也可组合到用于本发明方法中的组合物中。例如，本发明的多肽或其片段或其融合蛋白可以与一种或多种另外的治疗剂共配制和/或共同给予，从而用作药物递送靶向剂。

对于利用本发明的多肽或其片段的治疗，剂量可以按宿主体重为例如约0.001到100mg/kg，并且更通常为0.01到5mg/kg(例如，0.02mg/kg、0.25mg/kg、0.5mg/kg、0.75mg/kg、1mg/kg、2mg/kg等)的范围内。例如，剂量可以是1mg/kg体重或10mg/kg体重或在1-10mg/kg的范围内，优选至少1mg/kg。上述范围内的剂量中间值也在本发明的范围内。患者可以被给予这样的剂量，给予时间为每天、交替几天、每周或根据由试验分析确定的任何其它时间表。示例性的治疗需要在较长时间内(例如至少六个月)以多个剂量给予。其它示例性的治疗方案需要每2周给予一次或每个月一次或每3-6个月一次。示例性的剂量时间表包括每隔一天的1-10mg/kg或15mg/kg，或者交替多天的30mg/kg或每周60mg/kg。

在一些方法中，两个或多个本发明的多肽被同时给予，其中给予的每一个多肽的剂量落入所指定的范围。补充活性化合物也可组合到用于本发明方法中的组合物中。例如，一种抗体可以与一种或多种另外的治疗剂共配制和/或共同给予。

本发明涵盖任何合适的用于将本发明的多肽或其片段递送至选择的靶组织的方法，包括水性溶液的推注或控释***的植入。控释植入物的应用减少了对重复注射的需要。

用于本发明方法中的本发明的多肽或其片段可直接注入脑中。用于化合物的直接脑注入的各种植入物是已知的，并且在将治疗化合物递送至患有神经性失调的人患者时很有效。这些包括利用泵来慢慢注入大脑中、定向植入、暂时性空隙导管、永久性头颅内导管植入、以及手术植入的生物可降解植入物。参见例如Gill et al.，supra；Scharfen et al.，“High Activity lodine-125 Interstitial Implant For Gliomas，”Int.J.Radiation Oncology Biol.Phys.24(4)：583-591(1992)；Gaspar et al.，“Pennanent 125IImplants for Recurrent Malignant Gliomas，”Int.J.Radiation Oncology Biol.Phys.43(5)：977-982(1999)；chapter 66，pages 577-580，Bellezza et al.，“Stereotactic InterstitialBrachytherapy，”in Gildenberg et al.，Textbook of Stereotactic and FunctionalNeurosurgery，McGraw-Hill(1998)；and Brem et al.，“The Safety of InterstitialChemotherapy with BCNU-Loaded Polymer Followed by Radiation Therapy in theTreatment of Newly Diagnosed Malignant Gliomas：Phase I Trial，”J.Neuro-Oncology26：111-23(1995)。

该组合物还可包含分散在生物相容性载体材料(作为化合物的合适递送或支撑***发挥作用)中的本发明的多肽或其片段。缓释载体的合适实例包括呈成型制品形式如栓剂或胶囊的半渗透性聚合物基质。可植入或微胶囊缓释基质包括聚乳酸(美国专利3,773,319；EP58,481)、L-谷氨酸和γ-乙基-L-谷氨酰胺的共聚物(Sidman et al.，Biopolymers 22：547-56(1985))、聚(2-羟乙基-甲基丙烯酸酯)、乙烯基乙酸乙烯酯(Langer et al.，J.Biomed.Mater.Res.15：167-277(1981)；Langer，Chem.Tech.12：98-105(1982))或聚-D-(-)-3-羟基丁酸(EP 133,988)。

在一些具体实施方式中，本发明的多肽或其片段通过直接注入脑的合适区中来给予至患者。参见例如Gill et al.，“Direct brain infusion of glial cell line-derived neurotrophic factor in Parkinson disease，”Nature Med.9：589-95(2003)。可获得替换技术并且可以用于给予根据本发明的多肽或其片段。例如，导管或植入物的定向放置可利用Riechert-Mundinger装置和ZD(Zamorano-Dujovny)多用途定位装置来实现。对比增强的计算机化x线体层照相术(CT)扫描，注射120ml的椎管造影剂(omnipaque)、350mg碘/ml，利用2mm薄片厚度，可获得三维多平面治疗方案(STP，Fisher，Freiburg，Germany)。这种装置允许在磁共振成像研究的基础上进行设计，集中CT和MRI靶信息用于清楚的靶确认。

经改进以与GE CT扫描装置(General Electric Company，Milwaukee，WI)以及Brown-Roberts-Wells(BRW)定向***(Radionics，Burlington，MA)一起使用的Leksell定向***(Downs Surgical，Inc.，Decatur，GA)可用于该目的。因此，在植入的开始，BRW定向框架的环形底座圈可连接至患者的颅骨。尽管具有石墨棒***框架的(靶组织)区夹住基板，但连续的CT部分可以以3mm间隔获得。计算机化治疗设计程序可在VAX 11/780计算机(Digital Equipment Corporation，Maynard，Mass.)上运行，其中利用石墨棒照片来描绘CT间隔和BRW间隔之间的图的CT坐标。

治疗方法

本发明的一个具体实施方式提供用于治疗与神经元活性过高或过低、异常神经元芽生和/或神经突生长相关的疾病、失调或损伤(例如患有这样的疾病的动物中的精神***症)的方法，该方法包括、基本上由或由给予该动物有效量的本发明Nogo片段组成。

另外，本发明涉及用于增强哺乳动物中神经突生长抑制的方法，包括、基本上由或由给予治疗有效量的本发明的Nogo多肽片段组成。

还包括在本发明范围内的增强神经突生长抑制的方法，包括、基本上由或由将神经元与如上所述的有效量的本发明的多肽或其片段进行接触组成。

本发明的Nogo多肽片段可被制成并用作增强负性调节神经元生长或再生的能力的治疗剂。

可通过本发明方法治疗或减轻的疾病或失调包括与神经元活性过高或过低、异常神经元芽生和/或异常神经突生长相关的疾病、失调或损伤。这种疾病包括但不限于精神***症、双相型障碍、强迫症(OCD)、注意力缺陷多动障碍(ADHD)、唐氏综合症以及阿尔茨海默氏症。

体外方法

本发明还包括增强体外神经元细胞生长抑制的方法。例如，本发明包括用于抑制异常神经元细胞生长、抑制神经突生长或抑制异常神经元芽生的体外方法。

靶向和筛选分析

本发明还包括利用本发明的多肽或其片段筛选候选药的方法。例如，本发明的多肽或其片段可用来筛选结合NgR的小分子。另外，本发明的多肽或其片段可被用作药物递送靶向剂，以靶向特异性表达NgR的神经元或细胞。

对相关领域的普通技术人员来说是易于显而易见的，即在不背离本发明或其任何具体实施方式的范围的情况下，很明显并且可以对本文所述的方法和应用作出其它合适的修饰和调整。现已详细地描述了本发明，通过参考以下实施例将更清楚地理解本发明，这里包括的实施例仅用于说明的目的而不用于限制本发明。

                      实施例

                      实施例1

              Amino Nogo片段结合NgR

本实施例证实，Amino-Nogo结构域的羧基末端以高亲和力与NgR相互作用。考察了若干含有不同Nogo-A片段(来源于氨基末端和第一疏水片段之间的区域)的碱性磷酸酶(AP)融合蛋白以鉴定Amino-Nogo-A作用机制。为了生成另外的AP融合蛋白，人Amino-Nogo片段被扩增并连接于用如所描述(Fournier，A.E.，et al.，Nature 409：341-346(2001))的限制性酶EcoR I和Xhol消化的pcAP6载体。随后质粒被转染入HEK293T细胞，7天后收集条件培养基。这些片段中没有一个以高亲和力结合于未转染的COS-7细胞。在检查假设的对照条件时，我们出乎意料的观察到Amino-Nogo的羧基部分(片段B)表现出对表达NgR的COS-7细胞的高亲和力结合(图1B)。该结合是可饱和的，其Kd与AP-Nogo-66结合NgR的Kd不可区分(表I)。为了更好地确定负责Amino-Nogo与NgR相互作用的区域，对一系列Amino-Nogo截短突变体作为AP融合蛋白加以检查。将B片段细分为互相交迭的150aa的片段，表明NgR相互作用位点局限于主要羧基末端的片段。实际上，Amino-Nogo的NgR相互作用片段完全位于最羧基的24个氨基酸(aa995-1018，Amino-Nogo-A-24)(表I和图1D)。位于aa995的Ile残基对于高亲和力结合非常重要，如同相邻的残基996-1013也非常重要(表I)一样。我们命名这个结构域(aa995-1013)为Amino-Nogo-A-19。

Amino-Nogo-A的19aa NgR结合残基由跨越在Nogo基因的Nogo-A特异性外显子和该基因的5’通用外显子之间的剪切位点(aa1004/1005)的核苷酸编码(Chen，M.S.，et al.，Nature 403：434-439(2000)；GrandPre，T.，et al.，Nature 403：439-444(2000)；Oertle，T.，et al.，J.Mol.Biol.325：299-323(2003a))。仅由来自Nogo-A特异区域的aa构成的AP融合蛋白不结合NgR(aa 950-1004)。Nogo-B或Nogo-C的Amino-Nogo残基也不能结合表达NgR的细胞(表I)。因此，该第二个高亲和力NgR相互作用结构域是Nogo-A特异的，并且为紧邻将其与Nogo-66分开的疏水片段的氨基末端。

如果这些Amino-Nogo片段将在调节神经突生长的过程中发挥作用，那么将预期其结合神经元突(瘤)。之前，我们已经表明Amino-Nogo-66结合于DRG突上的NgR(Fournier，A.E.，et al.，Nature 409：341-346(2001))。正如从COS-7NgR结合试验中预期的，Amino-Nogo的羧基末端24aa也可以介导AP融合蛋白结合于DRG轴突，但Nogo-A的较短片段(aa999-1018)则不能与DRG神经元相互作用(图1E)。Amino-Nogo的氨基末端A片段也结合于DRG轴突，推测是通过非NgR依赖的机制。

据报道，少突胶质细胞中Nogo-A的一部分所处的构象使氨基末端和Nogo-66结构域均暴露在细胞表面(Oertle，T.，et al.，J.Neurosci.23：5393-5406(2003b))。推测Nogo-A更大氨基末端的疏水片段以环的形式***质膜中。尽管未与理论结合，推测该构象可使得细胞表面的Amino-Nogo-A-19片段与Nogo-66结构域在细胞表面紧密相邻(图7)。这两个结构域与NgR相互作用的能力与其对该构象的生理作用相一致。

表I.Amino-Nogo片段对NgR的结合亲和力

氨基酸编号	氨基酸序列	NgR Kd(nM)
			a.a.181-864(AmNg A)		在150nM无结合
a.a.622-1018(AmNg B)		6.66±1.49
			a.a.877-1018(AmNg B4)		9.01±6.36
a.a.950-1018(AmNg B4C)		3.51±3.36
			a.a.971-1018		2.69±1.32
a.a.995-1018(Amino-Nogo-A-24)	IFSAELSKTSVVDLLYWRDIKKTG	2.43±0.51
			a.a.995-1015	IFSAELSKTSVVDLLYWRDIK	4.55±3.66
a.a.995-1014	IFSAELSKTSVVDLLYWRDI	3.19±0.12
			a.a.995-1013(Amino-Nogo-A-19)	IFSAELSKTSVVDLLYWRD	2.48±0.72
a.a.996-1018	FSAELSKTSVVDLLYWRDIKKTG	26.59±6.86
			a.a.1000-1018	LSKTSVVDLLYWRDIKKTG	在25nM无结合
a.a.1005-1018	VVDLLYWRDIKKTG	在25nM无结合
			a.a.950-1004	............IFSAELSKTS	在50nM无结合
NgC的Amino	MDGQKKNWKDKVVDLLYWRDIKKTG	在25nM无结合
			NgB的Amino		在100nM无结合

融合AP的Amino-Nogo片段的结合Kd通过将含有AP融合蛋白的条件培养基施用到表达NgR的COS-7细胞而进行测量。对结合的AP进行染色并测量。

                    实施例2

Amino Nogo对细胞伸展和轴突生长的抑制与NgR结合是分开的

已经认识到，当蛋白为底物结合时，Amino-Nogo-A蛋白抑制非神经元细胞伸展和轴突生长(Chen，M.S.，et al.，Nature 403：434-439(2000)；Fournier，A.E.，et al.，Nature 409：341-346(2001))。Oertle等的工作表明，特异性aa伸展于氨基末端附近，Amino-Nogo-A的中部负责该活性(Oertle，T.，et al.，J.Neurosci.23：5393-5406(2003b))。后一个结构域已经命名为Δ20。为了确定实施例1中描述的Amino-Nogo-A的与NgR相互作用的aa是否调节细胞伸展和轴突生长，多个片段被表达为AP融合蛋白并从大肠杆菌(E.coli)中纯化。为了生成GST融合蛋白，Amino Nogo片段在pGEX2T(Amersham Pharmacia)中克隆。天然和可溶性的GST融合蛋白如所描述的被表达并纯化(GrandPre，T.，et al.，Nature 403：439-444(2000))。COS-7结合分析如所描述(Fournier，A.E.，et al.，Nature 409：341-346(2001))的进行。结合于COS-7细胞的AP利用NIH成像软件进行测量。成纤维细胞伸展以及cDRG生长也如所描述(Fournier，A.E.，et al.，Nature 409：341-346(2001))的作了一些调整而进行。简单而言，将50μl稀释于PBS中的GST融合蛋白或肽移入用聚赖氨酸预涂覆的96孔板(Becton Dickson Biocoat plates)中，室温干燥过夜。对于成纤维细胞伸展分析，未融合的COS-7细胞随后在含血清培养基中放置1小时，然后进行固定并用罗丹明-鬼笔环肽(rhodamine-phalloidin)染色。

含有Δ20的一部分的片段显著降低COS-7细胞的连接和伸展(图2A-C)。全部Δ20区域似乎对于COS-7细胞的调节并非必需，因为Amino-Nogo的B片段有活性但仅含有Δ20的一部分。由羧基末端75aa(B4C)或150aa(B4)组成的片段缺少Δ20区域，但拥有全部19aa的NgR结合区域(图1C)。当作为底物存在时，B4和B4C蛋白不改变COS-7形态(图2A-C)。因此，成纤维细胞伸展的抑制可与通过Amino-Nogo-A的NgR结合分开。

对相同的GST-Amino-Nogo蛋白的降低来自鸡E13 DRG神经元的神经突长出的能力也加以检测。对于cDRG生长分析，解离的E13 cDRG神经元固定前放置6小时。神经元用抗神经丝(sigma Catalog #N4142)和抗-HuC/D(Molecular Probes A-21271)抗体进行染色。细胞面积、附着细胞的数量以及神经突长度利用Imageexpress机器和软件(Axon Instrument)进行测量。

正如之前所示的全部Amino-Nogo结构域，那些含有Δ20的一部分的亚片段抑制神经突生长(Fournier，A.E.，et al.，Nature 409：341-346(2001)；Oertle，T.，et al.，J.Neurosci.23：5393-5406(2003b))(图2D和2E)。由于已知这些培养物表达NgR并负责与Nogo-66的结合，我们检测了Amino-Nogo中结合NgR的B4和B4C片段是否会改变神经突生长。出乎意料的是，涂覆了Amino-Nogo-A的结合NgR的B4和B4C片段的底物对于轴突生长并不是抑制性的(图2D和2E)。因此，Amino-Nogo的结合NgR的结构域并不结合于NgR阴性的COS-7细胞，而且当结合于NgR阳性的神经元时并不改变轴突生长。假设19aa的结合NgR的结构域(Amino-Nogo-A-19)不改变细胞伸展或轴突生长，则可解释为什么其在最初的分析中未检测到。该结构域仅存在于Nogo-A中，提供了一个基础，使得Nogo-A成为比Nogo-C更有效的轴突生长抑制剂(Chen，M.S.，et al.，Nature 403：434-439(2000)；GrandPre，T.，et al.，Nature 403：439-444(2000))。

另外，我们以及其它人以前曾经记录了底物结合或聚集的Amino-Nogo抑制成纤维细胞伸展和神经突生长(Chen，M.S.，et al.，Nature 403：434-439(2000)；Fournier，A.E.，et al.，Nature 409：341-346(2001)；Oertle，T.，et al.，J.Neurosci.23：5393-5406(2003b))。正如这些性质所表明的，我们证实了负责这些活性的Amino-Nogo结构域不结合NgR。这些作用的分子基础至今未知。至少该活性的一个主要部分可以定位于Amino-Nogo中部附近的Δ20片段。最近人们认识到Nogo的氨基末端具有另一种非NgR依赖的作用，该作用通过Nogo-A和Nogo-B共享的主要氨基末端的结构域。该结构域在损伤后脉管重建过程中发挥选择性作用(Acevedo，L.，et al.，Nat Med，10：382-388(2004))。因此，Nogo似乎具有多个功能性结构域和受体。Nogo-A的Δ20区域不结合NgR但非允许的作为多种细胞类型的底物。Nogo-A和Nogo-B的氨基末端片段对NgR无亲和力，但确实通过一种尚未鉴定的受体调节血管内皮和平滑肌细胞迁移。

                    实施例3

Amino-Nogo-A的羧基区域结合NgR的LRR结构域

由于Amino-Nogo结合于神经元NgR不抑制轴突生长，所以我们试图确定Amino-Nogo对NgR的特异性是否类似于Nogo-66结构域。正如对于Nogo-66、MAG和OMgp(Barton，W.A.，et al.，Embo J.22：3291-3302(2003)；Fournier，A.E.，et al.，Nature 409：341-346(2001)；Wang，K.C.，etal.，Nature 417：941-944(2002b))，任何两个LRR的缺失消除了Amino-Nogo-B4C与NgR的结合(图3A)。类似地，富含半胱氨酸的LRR-NT和LRR-CT帽化结构域对于Amino-Nogo-B4C结合是必需的。相反，缺失从LRR区域伸展到GPI锚定位点(CT结构域)的NgR的独特信号转导结构域并不改变Amino-Nogo-B4C结合。NgR是包括NgR2和NgR3的基因家族的一部分。当在COS-7细胞表面表达时，这些相关蛋白并不结合AP-Nogo-66或AP-MAG或AP-OMGp(Barton，W.A.，et al.，Embo J.22：3291-3302(2003))。类似地，NgR2和NgR3不是Amino-Nogo的结合伴侣(图3B)。通过这些检测，Nogo-66和Amino-Nogo-B4C结合的NgR的必要条件是不可区分的。

                      实施例4

              不同配体结合需要的NgR残基

NgR具有结合Nogo-66、MAG、OMgp和Lingo-1以及Amino-Nogo的能力。关于Nogo-66和MAG的结合位点是分开的还是互相交迭的，以前的工作一直比较矛盾。利用Nogo-66的NEP1-40拮抗剂，我们未观察到MAG与NgR相互作用的抑制(Liu，B.P.，et al.，Science 297：1190-1193(2002))。用空间位阻的AP-Nogo-66配体，检测到一些对MAG-Fc结合NgR的竞争(Domeniconi，M.，et al.，Neuron 35：283-290(2002))。由于NgR的结构现在已经确定(Barton，W.A.，et al.，Embo J.22：3291-3302(2003)；Domeniconi，M.，et al.，Neuron 35：283-290(2002)；He，X.L.，etal.，Neuron 38：177-185(2003))，所以我们利用Ala替换探查其表面的配体结合位点。

为了更好确定多个配体如何结合于NgR蛋白，我们检查了一系列Ala替换的NgR的配体结合活性。利用快速改变多部位指导的致突变试剂盒(Quick Change Multisite Directed Mutagenesis Kit(Stratagene catalog #200514))进行NgR突变。人NgR用作模板。对NgR的配体结合结构域表面的每一个预测为溶剂可及的带电残基均进行Ala替换(Barton，W.A.，et al.，Embo J.22：3291-3302(2003)；Ile，X.L.，et al.，Neuron 38：177-185(2003))我们生成的突变体中，位于彼此5A内的1-8个表面残基是Ala替换的。由于LRR结构的螺旋性质，蛋白表面的并列残基通常由一级结构中约2.5个残基分开。除了特定带电表面斑块的突变，其它突变均靶向于糖基化位点以及根据NgR结构预测在配体结合时涉及的区域(Barton，W.A.，et al.，Embo J.22：3291-3302(2003)；He，X.L.，et al.，Neuron 38：177-185(2003))。另外，检查了对应于人类多态的一个变异体(D259N)。这些突变中没有一个改变确定LRR结构的亮氨酸残基本身，也未改变在氨基和羧基末端加帽结构域中关键的半胱氨酸残基。绝大多数这样的Ala表面替换突变体表达为免疫反应性多肽，其分子量和表达水平与野生型NgR不可区分(图4C，数据未显示)。那些未引起改变的突变体从进一步分析中排除。此外，所有经配体结合分析的突变NgR在转染的COS-7中均表现出与野生型蛋白相同的分布。值得注意的是，那些去除aa 27-310区域中的糖基化位点的突变不改变表面表达的水平，尽管免疫印迹分析显示分子量减小(数据未显示)。

对这组共74个个体NgR突变体，探寻其与AP-Nogo-66、AP-Amino-Nogo-B4C、AP-MAG、AP-OMgp以及AP-Lingo-1的结合。AP-Nogo-66、AP-MAG、AP-OMgp以及AP-Lingo-1构建体在其它地方有描述(Fournier，A.E.，et al.，Nature 409：341-346(2001)；Liu，B.P.，et al.，Science 297：1190-1193(2002)；Mi，S.，et al.，Nat.Neurosci.7：221-228(2004)；Wang，K.C.，et al.，Nature 417：941-944(2002b))。NgR突变体的性质可分为三个主要类别(表II和图5)。大量Ala替换的NgR多肽以野生型水平结合所有配体。我们推断，该相应的aa在配体相互作用中不发挥必要作用。这些残基中多个位于NgR结构的凸起“外部”，表明这个表面不是分子间相互作用的主要位点。另外，凹入表面的显著程度对于配体结合是非必需的。

另外一组突变体对于每一个配体均表现为弱结合或不结合。尽管未与理论相结合，一个解释是这些残基对于NgR折叠是必需的，以至于用Ala对其进行替换得到无法结合配体的错误折叠蛋白。然而，还有几种原因支持另外的假说，即这些残基中的多个可促进多个NgR配体在通用结合区的结合。

关键的是，对于这些突变体，NgR表达水平以及亚细胞分布未发生改变。相反，未折叠或错误折叠的蛋白被预期是不稳定并错误定位的。还应该注意的是，那些不能突变为Ala且不丧失配体结合能力的残基中的大多数彼此邻近聚集。因此，我们推断，由某些残基生成的表面构成这些配体的主要结合位点，所述残基包括但不限于67/68、111/113、133/136、158/160、163、182/186以及232/234。大鼠和人NgR在所有这13个位点均等同。在这些位点，NgR相关蛋白NgR2和NgR3，每个具有10个等同残基、2个相似/非等同残基以及一个不同残基。

第三组Ala替换的NgR突变体表现为选择性丧失对某些配体而非其它配体的结合(表III和图4)。由这类突变体的每个成员对至少一个配体的结合亲和力的保持表明，Ala替换不阻碍NgR折叠和表面表达。大多数负责差异配体结合的NgR残基位于上述主要结合位点的周围。这些替换中的多个可降低或消除MAG、OMgp以及Lingo-1结合而不减弱Amino-Nogo-A的Nogo-66或B4C片段的结合。尽管未与理论相结合，这种结构关系最简单的解释是MAG、OMgp以及Lingo-1不仅需要部分与Nogo-66共享的中心配体结合结构域，还需要邻近aa基团达到高亲和力结合。该邻近区域包括例如aa 78/81、87/89、89/90、95/97、108、119/120、139、210以及256/259。小鼠和人NgR在这14个位点中的11个等同，14个中的13个相似。NgR2表现出在这14个位点的保守性较差，其中8个等同aa、1个相似/非等同aa以及5个不同aa。对于NgR3，存在6个等同aa、4个相似/非等同aa以及4个不同aa。

尤其使人感兴趣的是aa 95/97和139的Ala替换，其使Nogo-66结合比Amino-Nogo B4C有较大程度的降低。这些残基位于NgR凹入面上的核心结合位点的非糖基化侧面。这些Ala替换的NgR蛋白的差异结合表明，Nogo-66和Amino-Nogo与NgR上可部分分开的位点相互作用。这个发现提出一种可能性，即一个Nogo-A分子上的两个结构域均能够与一个NgR蛋白相互作用。

该分析表明了，结合不同配体所必需的残基之间的相似和差异。似乎存在一个Amino-Nogo-A-19、Nogo-66、MAG和OMgp配体所必需的中心结合结构域。另外，不同配体需要该中心位点周围的特殊残基。这些发现与配体之间的部分而非完全竞争相一致。因为所有配体均需要集中于NgR凹入面中间部分的表面残基，因此其活化NgR信号转导的机制可能是相似的。通过融合于Amino-Nogo-A-24而将Nogo-66拮抗剂NEP1-32转化为激动剂提出了这样一种可能性，即该活化机制涉及到通过该中心结构域的连接使受体聚集体的化学价发生改变。

因为NgR可能被认为是开发轴突再生治疗的靶(Lee，D.H.，et al.，Nat.Rev.Drug Discov.2：872-878(2003))，由多个配体共享的该中心结合结构域的确定可能利于设计和/或开发封闭所有NgR配体的小分子治疗剂。因此，本发明的变异NgR1多肽可用于筛选分析中。相反，如果每个配体为了以高亲和力结合均需要完全分开的残基，那么要用低分子量化合物开发所有髓磷脂蛋白在NgR的作用的阻断剂的机会将会显著较低。

Lingo-1已被报道为一个信号转导NgR复合体的组分(Mi，S.，et al.，Nat.Neurosci.7：221-228(2004))。这里值得注意的是，结合于NgR必需的残基非常类似于配体MAG和OMgp所必需的那些。尽管未与理论相结合，因为Lingo-1也由少突胶质细胞表达，所以结合分析表明其可能充当配体。可替换的，辅助受体功能可能如激动剂结合一样在相同位点调节NgR化学价。需要进一步的结构和生物化学研究来确定事实(即NgR上的Lingo-1结合位点类似于配体结合位点)的全部提示作用。

表II NgR突变体总结：突变为丙氨酸的残基列表

无结合	结合于所有配体	差异结合
			163	61	82
133，136	92	108
			158，160	122	139
182，186	127	210
			232，234	131	78，81
82，179	138	87，89
			67，68，71	151	89，90
111，113，114	176	95，97
			114，117，163	179	108，131
182，186，210	227	256，259
			210，232，234	250	36，38，61
67，68，95，97	D259N	95，97，122
			87，89，133，136	36，38	114，117，139
182，186，158，160	63，65	117，119，120
			111，113，114，138	114，117	216，218，220
117，119，120，139	127，151	220，223，224
			202，205，227，250，277，279	127，176	237，256，259
95，97，188，189，191，192	143，144	256，259，284
			95，97，117，119，120，188，189	189，191	61，108，131
	196，199	63，65，87，89
				202，205	237，256，284
	267，269	196，199，220，223，224
				277，279	211，213，237，256，259，284
	189，191，237	189，191，211，213，237，256，259，284
				189，191，284
	202，205，227
				202，205，250
	296，297，300
				171，172，175，176
	292，296，297，300
				171，172，175，176，196，199

将丙氨酸替换的NgR突变体和NgR配体的结合与野生型NgR进行比较，并且将结合水平分级为++(WT水平)、+(弱于野生型)、tr(痕量结合)、-(无结合)、N/A(未确定)。NgR突变蛋白还进行SDS-PAGE，并用抗NgR抗体进行探查。表达水平类似于WT NgR的突变体标记为“y”。

表III表现为差异结合于NgR配体的NgR突变体的列表

残基	Ng66	B4C	B4C-66	Liugo-1	OMgp	MAG	抗-NgR	NgR带western
									WT	++	++	++	++	++	++	++	y
82	++	++	++	+	+	-	++	y
									108	++	++	++	tr	+	-	++	y
139	++	++	++	-	tr	-	++	y
									210	+	+	+	-	-	-	+	y
108，131	+	+	+	-	+	tr	++	y
									256，259	++	++	++	++	+	-	++	y
78，811	++	++	++	tr	++	N/A	++	y
									87，89	++	++	++	-	+	+	++	y
89，90	+	+	+	-	-	-	++	y
									95，97	+	++	+	+	tr	tr	++	y
95，97，122	+	+	+	-	tr	tr	++	y
									36，38，61	+	++	++	tr	+	tr	++	y
114，117，139	+	+	+	-	-	-	++	y
									117，119，120	++	++	++	tr	tr	-	++	y
216，218，220	++	++	++	+	+	tr	++	y
									220，223，224	+	+	+	-	-	tr	++	y
237，256，259	tr	tr	+	+	tr	-	++	y
									256，259，284	+	+	++	++	+	-	++	y
61，108，131	tr	+	+	-	-	-	++	y
									63，65，87，89	++	++	++	-	+	-	++	y
237，256，284	++	++	++	++	+	-	++	y
									211，213，237，256，259，234	-	-	-	++	-	-	++	y
189，191，211，213，237，256，259，284	-	-	-	++	-	N/A	++	y

检测丙氨酸替换的NgR突变体与AP-Nogo66、AP-B4C、AP-B4C66、AP-Lingo-1、AP-OMgp以及AP-MAG的结合，并将其分为三类：(1)丧失与所有NgR配体结合的突变体；(2)仍然保持与所有NgR配体结合的突变体；(3)仍然结合某些配体但丧失了与其它配体结合的差异结合突变体。D259N突变体是天冬氨酸突变物以模拟人类多态性。

                     实施例5

来自Nogo-A的两个NgR结合结构域的并列产生高亲和力激动剂活性

我们考虑Nogo-66和Amino-Nogo结构域是否可以同时结合于NgR。如果两个结构域同时结合于受体，则由于两个位点结合，该两个结构域的融合拥有的受体亲和力可能增高。对于完整的Nogo-A，这两个结构域可能在质膜表面处彼此相邻，因为在一级结构中它们由一个伸入脂质双层的疏水环分开(Oertle，T.，et al.，J.Neurosci.23：5393-5406(2003b))。为了形成一个可溶的类似这种构象的带标签配体，我们生成了一个AP融合蛋白，如上所述其带有直接融合于Nogo-66的Amino-Nogo-A的B4C片段。该NgR的AP-B4C-66配体的亲和力显著大于AP-B4C或AP-Nogo-66的亲和力。这种结合的Kd是亚纳摩尔(图6A和6B)。因此，两个相连的Nogo-A结构域的二价结合生成了一个更有效的NgR配体。

Amino-Nogo-A-19结合并不活化NgR而抑制轴突生长。然而，该结构域融合于Nogo-66产生的双价NgR配体具有显著增强的受体亲和力。尽管未与理论相结合，这种增强的亲和力可以解释该发现，即体外和体内分析表明在抑制轴突生长方面Nogo-A比MAG具有较大的作用，尽管在髓磷脂制备中MAG的量更大。

接下来我们考虑这两个肽结构域对神经突生长的作用。尽管合成的Nogo-66肽片段作为激动剂通过结合于NgR而抑制神经突生长，但较短的Nogo-66肽作为拮抗剂结合于NgR且并不改变生长。以前我们证明了由Nogo-66氨基末端40aa构成的肽(NEP1-40)的拮抗活性(GrandPre，T.，et al.，Nature 417：547-551(2002))。类似的NgR拮抗结果可从短至32aa的肽获得(数据未显示)，表明该33-66区域对于受体活化是必需的但不是高亲和力结合(GrandPre，T.，et al.，Nature 417：547-551(2002))。Nogo-66的较短片段不与NgR相互作用(GrandPre，T.，et al.，Nature 417：547-551(2002)，数据未显示)。Amino-Nogo-A的羧基24aa片段介导AP融合蛋白结合于NgR(图1C和1D)，但该肽不抑制或增强Nogo-66对神经突生长的作用(图6C和6D)。

我们推测，将Amino-Nogo-A的24aa片段融合于NEP32拮抗剂肽可能生成高亲和力拮抗剂，其强度类似于AP-B4C-66与NgR的结合。为了考察这个假说，合成了一种生物素化的肽，其含有Amino-Nogo-24序列，且在其羧基末端融合于NEP32。利用W.M.Keck设备，在耶鲁大学合成并纯化生物素标记的Ng24(生物素-IFSAELSKTSVVDLLYWRDIKKTG)以及24/32(B24/32：生物素-IFSAELSKTSVVDLLYWRDIKKTGGRIYKGVIQAIQKSDEGHP FRAYLESEVAISEE)。为了cDRG生长分析，将解离的E13cDRG神经元在固定前放置6个小时。神经元用抗神经丝(Sigma Catalog #N4142)和抗-HuC/D(Molecular Probes A-21271)抗体进行染色。细胞面积、连接细胞的数量以及神经突长度利用Imageexpress机器和软件(Axon Instrument)进行测量。

出乎意料的是，该24-32融合肽有效地抑制DRG神经元的轴突生长(图6C和6D)。很清楚，Amino-Nogo-24结构域可以独立结合NgR，但当融合于NEP32时则产生高亲和力的Nogo-A选择性NgR激动剂。因此，Nogo-66(33-66)区域对于受体活化并非必需。相反，该结果表明，配体与NgR的二价相互作用可能比较关键。由于NgR可以结合其自身，并在脂筏(lipid raft)内聚集(Fournier，A.E.，et al.，J.Neurosci.22：8876-8883(2002)；Liu，B.P.，et al.，Science 297：1190-1193(2002))，因此二价配体可能通过调整其在脂双层平面的聚集状态而活化受体。

应该理解，具体实施方式部分(而非发明内容和摘要部分)是用来解释权利要求的。发明内容和摘要部分可以披露本发明发明者所构思到的一个或多个但非全部示例性具体实施方式，因此，其不以任何方式限制本发明和所附权利要求。

Claims (19)

1.一种分离的30个残基或更小的多肽片段，包括至少90％与基准氨基酸序列相同的氨基酸序列，所述基准氨基酸序列选自由

(a)SEQ ID NO：2的氨基酸995至1013；

(b)SEQ ID NO：2的氨基酸995至1014；

(c)SEQ ID NO：2的氨基酸995至1015；

(d)SEQ ID NO：2的氨基酸995至1016；

(e)SEQ ID NO：2的氨基酸995至1017；

(f)SEQ ID NO：2的氨基酸995至1018；

(g)SEQ ID NO：2的氨基酸992至1018；

(h)SEQ ID NO：2的氨基酸993至1018；以及

(i)SEQ ID NO：2的氨基酸994至1018；

其中，所述多肽结合NgR1。

2.根据权利要求1所述的多肽片段，其中所述氨基酸序列至少95％与所述基准氨基酸序列相同。

3.根据权利要求2所述的多肽片段，其中所述基准氨基酸序列与所述基准氨基酸序列相同。

4.一种分离的200个残基或更小的多肽片段，包含一个至少90％与SEQ ID NO：2的氨基酸995至1018相同的第一氨基酸序列，其中所述第一氨基酸序列连接于SEQ ID NO：2的氨基酸1055至1086，并且其中所述多肽片段结合NgR1。

5.根据权利要求4所述的多肽片段，其中所述第一氨基酸序列包含SEQ ID NO：2的氨基酸995至1018。

6.根据权利要求5所述的多肽片段，其中所述第一氨基酸序列包含SEQ ID NO：2的氨基酸950至1018。

7.根据权利要求4-6中任一项所述的多肽片段，其中所述多肽片段增强NgR介导的神经突生长抑制。

8.根据权利要求5所述的多肽片段，包含SEQ ID NO：5。

9.根据权利要求5所述的多肽片段，基本上由SEQ ID NO：5组成。

10.根据权利要求4-9中任一项所述的多肽片段，其中所述多肽片段是经过修饰的。

11.根据权利要求10所述的多肽片段，其中所述修饰是生物素化。

12.根据权利要求1-11中任一项所述的多肽片段，其中所述多肽片段连接于一异源多肽。

13.根据权利要求12所述的多肽片段，其中所述异源多肽选自由谷光甘肽S转移酶(GST)、组氨酸标签(His标签)、碱性磷酸酶(AP)以及Fc组成的组。

14.一种分离的人NgR1多肽，包含SEQ ID NO：4的氨基酸27至473，只是在至少选自由下列位置组成的组中的氨基酸位置发生了氨基酸替换：

(a)氨基酸67、68和71；

(b)氨基酸111、113和114；

(c)氨基酸133和136；

(d)氨基酸158、160、182和186；

(e)氨基酸163；以及

(f)氨基酸232和234；

其中，所述NgR1多肽不结合Nogo 66、OMgp、Mag或Lingo-1中的任何一个。

15.一种分离的人NgR1多肽，包含SEQ ID NO：4的氨基酸27至473，只是在至少选自由下列位置组成的组中的氨基酸位置发生了氨基酸替换：

(a)氨基酸78和81；

(b)氨基酸87和89；

(c)氨基酸89和90；

(d)氨基酸95和97；

(e)氨基酸108；

(f)氨基酸117、119和120；

(g)氨基酸139；

(h)氨基酸210；以及

(i)氨基酸256和259；

其中，所述NgR多肽选择性地结合至Nogo 66、OMgp、Mag或Lingo-1中的至少一个但不是全部。

16.一种宿主细胞，包含权利要求14-15中任一项所述的多肽。

17.一种组合物，包含权利要求1-13中任一项所述的多肽以及药用载体。

18.根据权利要求17所述的组合物，其中所述组合物可被配制用于给药，其中给药路径选自由肠胃外给药、皮下给药、静脉内给药、肌内给药、腹膜内给药、经皮给药、口腔给药、口服给药以及微注射给药组成的组。

19.根据权利要求18所述的组合物，其中所述组合物进一步包含载体。

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