CN113025719B - 预测肝癌复发的生物标志物及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了预测肝癌复发的生物标志物及其应用，所述的生物标志物包括NAV3、PIGM和/或ZNF483。本发明还公开了相关试剂、试剂盒。本发明还公开了所述生物标志物在构建预测肝癌复发的计算模型中的应用。本发明的研究为预测肝癌复发提供了新的策略和思路。

Description

预测肝癌复发的生物标志物及其应用
技术领域
本发明属于生物医药领域，具体涉及预测肝癌复发的生物标志物及其应用。
背景技术
肝癌是最常见的恶性肿瘤之一，在2008年世界卫生组织的调查显示，世界范围内约有748000例新确诊为肝癌的病例，同时期约有695000例死亡病例。依据对肿瘤大小和结节数量的成像来定义，可将肝癌分为最早期、中期、晚期和终末期肝癌。而依据细胞类型不同可将肝癌分为原发性肝癌、肝血管肉瘤、胆管囊腺癌、肝母细胞癌等。原发性肝癌又可以分为胆管细胞癌、肝细胞型肝癌以及肝细胞癌和胆管细胞癌混合型3种类型。其中最为常见的是肝细胞型肝癌，占原发性肝癌90％以上。按肉眼可见的形态不同，肝细胞型肝癌可分为以下5类：弥漫型、块状型、巨块型、结节型和小癌型。
虽然肝癌的治疗技术不断提升，如手术切除、肝移植、放化疗，但肝癌患者总体5年生存率至今仍未明显改善。肝癌主要死因是复发，阐明肝癌复发机理，防止复发是提高肝癌患者生存率的根本。从分子生物学的角度来看，肝癌是一种基因疾病，是因为某些染色体上的DNA损伤导致基因突变的结果，包括癌基因、抑癌基因、细胞凋亡基因、细胞周期调节基因及维持细胞基因组稳定性的基因(如DNA复制、DNA修复及染色体分离基因)等，是一个多阶段逐步演化的过程。
为尽早能预测肝癌复发，国内、外都开展了大量的基础和实验室研究，现在越来越多的研究致力于与肝癌复发相关的分子标记物的研究，期望能够从分子生物学角度弄清楚肝癌复发的分子机制并由此找到可以准确预测肝癌复发的分子标记物，从而研制出能够有效预防、治疗肝癌复发的药物。
发明内容
本发明的目的在于提供可用于预测肝癌复发的生物标志物，对于揭示肝癌复发的分子机制及预防、治疗肝癌复发具有重要的意义。
本发明第一方面提供了一种预测肝癌复发的产品，所述的产品包括检测生物标志物的试剂，所述的生物标志物包括NAV3、PIGM和/或ZNF483。
进一步，所述的生物标志物包括ZNF483和NAV3。
进一步，所述的生物标志物包括ZNF483和PIGM。
进一步，所述的生物标志物包括NAV3、PIGM和ZNF483的组合。
在本发明中，NAV3(基因ID：89795)包括NAV3基因及其编码的蛋白及其同源物，突变，和同等型。该术语涵盖全长，未加工的NAV3，以及源自细胞中加工的任何形式的NAV3。该术语涵盖NAV3的天然发生变体(例如剪接变体或等位变体)。
在本发明中，PIGM(基因ID：93183)包括PIGM基因及其编码的蛋白及其同源物，突变，和同等型。该术语涵盖全长，未加工的PIGM，以及源自细胞中加工的任何形式的PIGM。该术语涵盖PIGM的天然发生变体(例如剪接变体或等位变体)。
在本发明中，ZNF483(基因ID：158399)包括ZNF483基因及其编码的蛋白及其同源物，突变，和同等型。该术语涵盖全长，未加工的ZNF483，以及源自细胞中加工的任何形式的ZNF483。该术语涵盖ZNF483的天然发生变体(例如剪接变体或等位变体)。
“生物标志物”意指与具有第二表型(例如未患疾病)的受试者或受试者组的生物样品相比，差异性地存在于(即增加或降低)具有第一表型(例如患有所述疾病)的受试者或受试者组的生物样品中的化合物，优选代谢物。生物标志物可以任何水平差异性地存在，但一般以这样的水平存在，即增加至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少100％、至少110％、至少120％、至少130％、至少140％、至少150％或更高；或一般以这样的水平存在，即降低至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或100％(即不存在)。生物标志物优选以统计显著的水平差异性地存在(即，如应用Welch T检验或Wilcoxon秩和检验测定，p值小于0.05和/或q值小于0.10)。
一种或多种生物标志物的“水平”意指样品中生物标志物的绝对或相对的量或浓度。
“样品”或“生物样品”意指自受试者分离的生物材料。生物样品可含有适于检测所需生物标志物的任何生物材料，并且可包含受试者的细胞和/或非细胞材料。样品可自任何合适的生物组织或流体例如肝脏组织、血液、血浆、尿液或脑脊液。
“受试者”意指任何动物，但优选哺乳动物，例如人、猴、小鼠、兔或大鼠。
进一步，所述的产品包括芯片、试剂盒、试纸。
进一步，所述的芯片包括基因芯片、蛋白芯片，所述的基因芯片包括固相载体以及固定在固相载体的探针，优选的，所述的探针包括用于检测生物标志物转录水平的针对所述生物标志物的探针；所述的蛋白质芯片包括固相载体以及固定在固相载体的与所述生物标志物编码的蛋白特异性结合的抗体；所述的试剂盒包括基因检测试剂盒和蛋白免疫检测试剂盒；所述的基因检测试剂盒包括用于检测所述生物标志物转录水平的试剂；所述的蛋白免疫检测试剂盒包括与所述生物标志物编码的蛋白特异性结合的抗体；所述的试纸包括用于检测所述生物标志物转录水平的试剂。
本发明的试剂盒中还可附有试剂盒的使用说明书，其中记载了如何采用试剂盒进行检测，和如何利用检测结果对肝癌复发进行判断、对治疗方案进行选择。
试剂盒的组分可以以水介质的形式或以冻干的形式来包装。试剂盒中适当的容器通常至少包括一种小瓶、试管、长颈瓶、宝特瓶、针筒或其它容器，其中可放置一种组分，并且优选地，可进行适当地等分。在试剂盒中存在多于一种的组分时，试剂盒中通常也将包含第二、第三或其它附加的容器，其中分离地放置附加的组分。然而，不同组合的组分可被包含在一个小瓶中。本发明的试剂盒通常也将包括一种用于容纳反应物的容器，密封以用于商业销售。这种容器可包括注模或吹模的塑料容器，其中可保留所需的小瓶。
本发明第二方面提供了生物标志物的检测试剂在制备预测肝癌复发的产品中的应用，所述的生物标志物包括NAV3、PIGM和/或ZNF483。
进一步，所述的生物标志物包括ZNF483和NAV3。
进一步，所述的生物标志物包括ZNF483和PIGM。
进一步，所述的生物标志物包括NAV3、PIGM和ZNF483的组合。
进一步，所述的试剂包括通过RT-PCR、实时定量PCR、免疫检测、原位杂交、芯片或高通量测序平台检测所述生物标志物表达水平的试剂。
进一步，所述的通过RT-PCR检测所述生物标志物表达水平的试剂包括特异扩增所述生物标志物的引物；所述通过实时定量PCR检测所述生物标志物表达水平的试剂包括特异扩增所述生物标志物的引物；所述通过免疫检测检测所述生物标志物表达水平的试剂包括与所述生物标志物编码的蛋白特异性结合的抗体；所述通过原位杂交检测所述生物标志物表达水平的试剂包括与所述生物标志物的核酸序列杂交的探针；所述通过芯片检测所述生物标志物表达水平的试剂包括蛋白芯片、基因芯片，所述的蛋白芯片包括与所述生物标志物编码的蛋白特异性结合的抗体，所述的基因芯片包括与所述生物标志物的核酸序列杂交的探针。
与所述生物标志物编码的蛋白特异性结合的抗体包括单克隆抗体、多克隆抗体。所述抗体包括完整的抗体分子、抗体的任何片段或修饰(例如嵌合抗体、scFv、Fab、F(ab’)2、Fv等。只要所述片段能够保留与所述生物标志物编码蛋白的结合能力即可。用于蛋白质水平的抗体的制备是本领域技术人员公知的，并且本发明可以使用任何方法来制备所述抗体。
术语“单克隆抗体”是指来自基本上同种类的抗体群的抗体。基本上同种类的抗体群包含基本上相似且结合相同抗原表位的抗体，在单克隆抗体产生过程中通常可能出现的变体除外。这些变体通常仅以少量存在。通常单克隆抗体通过包括从多种抗体中选择单一抗体的方法获得。例如，所述选择过程可以是从多个克隆中选择独特的克隆，例如杂交瘤克隆库、噬菌体克隆、酵母克隆、细菌克隆或其他重组DNA克隆。例如，所选抗体可以进一步改变，以提高对靶标的亲和力(“亲和力成熟”)，使抗体人源化，改善其在细胞培养物中的产物，和/或降低其在受试者中的免疫原性。
如本文所用，“探针”意指与目标核酸序列至少部分互补从而能够与目标核酸序列杂交的寡核苷酸分子(例如核苷酸序列)。在一些情况下，探针可以被称为“捕获探针”。探针可以天然存在于纯化的限制性消化物中或者由合成、重组或PCR扩增产生。探针可以是单链或双链。探针可用于特定基因的序列的检测、鉴别和分离。在本发明的实施方案中，探针可以包含多种不同的探针。探针可以例如溶解在任何合适的无机或有机溶液中，包括但不限于水溶液、磷酸盐缓冲液(PBS)、EB缓冲液、TE缓冲液(10mM Tris-HCl和1mM EDTA，pH 8.0)等。
探针的设计和合成的具体方法不受限制，并且可以根据目标核酸序列，使用本领域中任何适宜的方法来进行。例如，可以从商业公司(包括但不限于ThermoFisherScientific，Agilent、Nimblegen、IDT等)订购针对感兴趣的目标核酸序列定制的探针。
探针的长度不受限制，其是可变化的，并通常取决于实验设计。例如，探针的平均长度可以是约20到约200个核苷酸，约50到约200个核苷酸，约20到约100个核苷酸，优选约40到约85个核苷酸，优选约45到约75个核苷酸，例如45个核苷酸，但是可选地还可以多于200个核苷酸，例如约250个核苷酸或更长。
本发明第三方面提供了生物标志物在构建预测肝癌复发的计算模型中的应用，其特征在于，所述的生物标志物包括NAV3、PIGM和/或ZNF483。
正如熟练技术人员可以领会的，可以使用两种或更多种标志物的测量来改进调查中的诊断问题。生化标志物可以个别测定，或者在本发明的一个实施方案中，它们可以同时测定，例如使用芯片或基于珠的阵列技术。然后独立解读生物标志物的浓度，例如使用每种标志物的个别截留，或者它们组合进行解读。
在本发明中，可以以不同方式实施和实现将标志物水平与某种可能性或风险关联起来的步骤。优选地，在数学上组合基因和一种或多种其它标志物的测定浓度，并将组合值与根本的诊断问题关联起来。可以通过任何适宜的现有技术数学方法将标志物值的测定组合。
进一步，所述的生物标志物包括ZNF483和NAV3。
进一步，所述的生物标志物包括ZNF483和PIGM。
进一步，所述的生物标志物包括NAV3、PIGM和ZNF483的组合。
进一步，所述的计算模型以NAV3和/或PIGM和/或ZNF483表达水平作为输入变量，通过生物信息学方法进行运算，输出肝癌复发的风险概率。
本发明第四方面提供了一种组合物，所述的组合物包括如下试剂的一种或多种：
(1)促进NAV3表达的试剂；
(2)抑制PIGM表达的试剂；
(3)抑制ZNF483表达的试剂。
进一步，所述的试剂包括促进NAV3表达的试剂和抑制ZNF483表达的试剂。
进一步，所述的试剂包括抑制PIGM表达的试剂和抑制ZNF483表达的试剂。
进一步，所述的试剂包括促进NAV3表达的试剂、抑制PIGM表达的试剂和抑制ZNF483表达的试剂。
本发明第五方面提供了本发明第四方面所述的组合物在制备预防和/或治疗肝癌复发的药物中的应用。
在制备本发明的药物时，通常将活性成分与赋形剂混合，或用赋形剂稀释，或包在可以以胶囊或药囊形式存在的载体中。当赋形剂起稀释剂作用时，它可以是固体、半固体或液体材料作为赋形剂、载体或活性成分的介质。因此，药物可以是片剂、丸剂、粉剂、溶液剂、糖浆剂、灭菌注射溶液等。合适的赋形剂的例子包括:乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨醇、甘露醇、淀粉、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、纤维素、水、等。制剂还可包括:湿润剂、乳化剂、防腐剂(如羟基苯甲酸甲酯和丙酯)、甜味剂等。
本发明的优点和有益效果：
本发明首次发现通过检测NAV3、PIGM、ZNF483基因表达水平可以预测肝癌复发，从而指导临床医师给受试者提供预防方案或者治疗方案，采用生物标记物进行诊断，具有及时性、灵敏性、特异性。
附图说明
图1是NAV3、PIGM、ZNF483在训练集中联合诊断预测肝癌复发的ROC曲线图。
图2是NAV3、PIGM、ZNF483在验证集中联合诊断预测肝癌复发的ROC曲线图。
具体实施方式
以下通过具体的实施例进一步说明本发明的技术方案，具体实施例不代表对本发明保护范围的限制。其他人根据本发明理念所做出的一些非本质的修改和调整仍属于本发明的保护范围。
实施例1筛选肝癌复发差异表达基因
1、数据来源
从GEO下载了GSE76427数据集的芯片数据及临床信息作为训练集，样本量为未复发:复发＝63:45。从TCGA数据库下载肝癌复发的RNA-seq数据及临床信息作为验证集，样本量为未复发:复发＝203:168。
2、数据预处理
利用fastp软件对raw data进行接头处理、修剪和质控，分析使用软件默认参数，输出高质量的测序数据进行后续分析。接头处理利用fastp软件默认双端序列自动检测模式。分析得到的clean data使用ICGC软件比对到人类参考基因组，参考基因组版本为GRCh38.d1.vd1，使用Voom方法进行标准化。
而GEO数据使用RMA方法进行标准化，通过Platform文件进行注释，多个探针对应同一个基因的，取平均值作为该基因的表达量。
3、差异表达分析
使用R软件中的“limma”包进行差异表达分析，差异基因的筛选标准为adj.Pvalue<0.05。
4、结果
与肝癌未复发样本相比，NAV3在GEO与TCGA的肝癌复发样本中表达水平显著下调(GEO中p＝0.004，TCGA中p＝0.006)；PIGM在GEO与TCGA的肝癌复发样本中表达水平显著上调(GEO中p＝0.013，TCGA中p＝0.042)；ZNF483在GEO与TCGA的肝癌复发样本中表达水平显著上调(GEO中p＝0.019，TCGA中p＝0.000)。
实施例2诊断效能验证
1、实验方法
使用R包“pROC”(版本1.15.0)绘制受试者工作曲线(ROC)，分析AUC值、敏感性和特异性，判断指标单独或者联合的诊断效能。在判断指标联合的诊断效能时，对各基因的表达水平进行logistics回归，通过拟合出的回归曲线计算出每个个体患癌与否的概率，确定不同的概率划分阈值，根据确定的概率划分阈值，计算得出联合检测方案的灵敏度、特异性以及准确性等。
2、实验结果
NAV3、PIGM、ZNF483在训练集和验证集中单独或者联合的诊断效能如表1和2以及图1和2所示，NAV3、PIGM、ZNF483三者联合不管在训练集还是验证集中都显示较高的诊断效能，AUC值分别为0.725和0.713，训练集中的敏感性和特异性分别为0.644、0.778。验证集中的敏感性和特异性分别为0.750、0.591。
表1基因在训练集中的AUC值
基因 AUC
NAV3 0.615
PIGM 0.649
ZNF483 0.635
NAV3+ZNF483 0.683
PIGM+ZNF483 0.679
NAV3+PIGM+ZNF483 0.725
表2基因在验证集中的AUC值
Figure BDA0003029900710000081
Figure BDA0003029900710000091
上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。

Claims (11)

1.生物标志物的检测试剂在制备预测肝癌复发的产品中的应用，其特征在于，所述的生物标志物包括PIGM和/或ZNF483。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的生物标志物包括ZNF483和PIGM。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的生物标志物包括NAV3、PIGM和ZNF483的组合。
4.根据权利要求1-3任一项所述的应用，其特征在于，所述的试剂包括通过RT-PCR、实时定量PCR、免疫检测、原位杂交、芯片或高通量测序平台检测所述生物标志物表达水平的试剂。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述的通过RT-PCR检测所述生物标志物表达水平的试剂包括特异扩增所述生物标志物的引物；所述通过实时定量PCR检测所述生物标志物表达水平的试剂包括特异扩增所述生物标志物的引物；所述通过免疫检测检测所述生物标志物表达水平的试剂包括与所述生物标志物编码的蛋白特异性结合的抗体；所述通过原位杂交检测所述生物标志物表达水平的试剂包括与所述生物标志物的核酸序列杂交的探针；所述通过芯片检测所述生物标志物表达水平的试剂包括蛋白芯片、基因芯片，所述的蛋白芯片包括与所述生物标志物编码的蛋白特异性结合的抗体，所述的基因芯片包括与所述生物标志物的核酸序列杂交的探针。
6.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的产品包括芯片、试剂盒、试纸。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述的芯片包括基因芯片、蛋白芯片，所述的基因芯片包括固相载体以及固定在固相载体的探针，所述的探针包括用于检测生物标志物转录水平的针对所述生物标志物的探针；所述的蛋白质芯片包括固相载体以及固定在固相载体的与所述生物标志物编码的蛋白特异性结合的抗体；所述的试剂盒包括基因检测试剂盒和蛋白免疫检测试剂盒；所述的基因检测试剂盒包括用于检测所述生物标志物转录水平的试剂；所述的蛋白免疫检测试剂盒包括与所述生物标志物编码的蛋白特异性结合的抗体；所述的试纸包括用于检测所述生物标志物转录水平的试剂。
8.生物标志物在构建预测肝癌复发的计算模型中的应用，其特征在于，所述的生物标志物包括PIGM和/或ZNF483。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述的生物标志物包括ZNF483和PIGM。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述的生物标志物包括NAV3、PIGM和ZNF483的组合。
11.根据权利要求8-10任一项所述的应用，其特征在于，所述的计算模型以所述的生物标志物表达水平作为输入变量，通过生物信息学方法进行运算，输出肝癌复发的风险概率。
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