CN111394463B

CN111394463B - 一种与甲状腺癌相关的分子及其应用

Info

Publication number: CN111394463B
Application number: CN202010319430.5A
Authority: CN
Inventors: 张聪; 李美晔; 薛国亮
Original assignee: 960th Hospital of the Joint Logistics Support Force of PLA
Current assignee: 960th Hospital of the Joint Logistics Support Force of PLA
Priority date: 2020-04-22
Filing date: 2020-04-22
Publication date: 2021-03-30
Anticipated expiration: 2040-04-22
Also published as: CN111394463A

Abstract

本发明公开了一种与甲状腺癌相关的分子及其应用，具体的涉及分子RUBCNL。本发明公开了RUBCNL在甲状腺癌中表达上调，通过检测RUBCNL的表达水平，可以辅助诊断受试者是否患有甲状腺癌。本发明同时公开了RUBCNL在构建预测甲状腺癌的计算模型中的应用，以及在治疗甲状腺癌中的应用。

Description

一种与甲状腺癌相关的分子及其应用

技术领域

本发明属于生物医药领域，涉及甲状腺癌的分子诊治标志物，所述标志物为RUBCNL。

背景技术

甲状腺癌是发生在甲状腺组织的恶性肿瘤，目前是内分泌***最常见的恶性肿瘤。依据病理分类，甲状腺癌可分为以下4种类型:第一是甲状腺***状癌(papillarythyroid carcinoma,PTC)，为其中最常见的病理类型(Bhaijee F,NikiforovYE.Molecular analysis of thyroid tumors[J]Endocr Pathol,2011，22:126-133)，其次是甲状腺滤泡状癌(follicular thyroid carcinoma,FTC)，甲状腺未分化癌(anaplasticthyroid carcinoma，ATC)与甲状腺髓样癌(medullary thyroid carcinoma,MTC)。近年来，甲状腺癌是内分泌***最常见的恶性肿瘤，在世界范围内患病率逐年上升。我国甲状腺癌的增长率已升至癌症第一位，在所有病理类型中，甲状腺***状癌约占甲状腺癌的80％～90％，是最为常见的病理类型，并且发病率最高(Luc GT,Morris,Andrew G,et al.TheIncreasing Incidence of Thyroid Cancer:The Influence of Access to Care[J].Thyroid,2013,23(7):885-891.)。目前针对甲状腺***状癌的主要治疗手段为手术切除、¹³¹I及术后TSH抑制治疗，绝大部分甲状腺***状癌患者预后良好但甲状腺***状癌依然会出现复发及远处转移(Hu B,Wang Q,Wang YA,et al.Epigenetic Activation of WNTSADrives Glioblastoma Stem Cell Differentiation and Invasive Growth[J].Ce11,2016，167(5):1281-1295.)。因此更加深入的对甲状腺***状癌的机制进行研究，有利于找到更好的方法预防、治疗以及防止其复发及转移。

甲状腺癌的发生发展伴随着多种分子遗传学改变的发生和积累。近年来甲状腺癌的分子致病机制研究取得了重大进展，研究证实60％-70％的甲状腺癌病例存在至少1种分子遗传学改变，并且在不同组织病理类型中各不相同，研究基因在甲状腺癌中的作用，对于甲状腺癌的个性化诊断以及精准医疗具有重要的意义。

发明内容

为了弥补现有技术的不足，本发明的目的在于提供与甲状腺癌相关的分子诊断标志物，通过标志物进行诊断，可以实现患者的个性化诊疗。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明提供了检测基因及其表达产物水平的试剂在制备诊断甲状腺癌的产品中的应用，所述基因选自RUBCNL。

进一步，所述产品包括通过测序技术、核酸杂交技术、核酸扩增技术、蛋白免疫技术检测样本中RUBCNL水平的试剂。

进一步，所述试剂选自：

特异性识别RUBCNL基因的寡核苷酸探针；或

特异性扩增RUBCNL基因的引物；或

特异性结合RUBCNL基因编码的蛋白的抗体或配体。

进一步，特异性扩增RUBCNL的引物序列如SEQ ID NO.1～2所示。

进一步，所述甲状腺癌为滤泡型甲状腺***状癌。

本发明提供了一种诊断甲状腺癌的检测产品，所述产品包括检测样本中RUBCNL基因及其表达产物水平的试剂。

进一步，所述产品包括芯片、试剂盒或核酸膜条。

进一步，所述芯片包括基因芯片、蛋白芯片，所述基因芯片包括用于检测RUBCNL基因转录水平的针对RUBCNL基因的寡核苷酸探针，所述蛋白芯片包括RUBCNL蛋白的特异性结合剂；所述试剂盒包括基因检测试剂盒、蛋白检测试剂盒，所述基因检测试剂盒包括用于检测RUBCNL基因转录水平的试剂、或芯片，所述蛋白检测试剂盒包括用于检测RUBCNL蛋白表达水平的试剂、或芯片。

本发明提供了RUBCNL在构建预测甲状腺癌的计算模型中的应用。

本发明提供了RUBCNL在制备治疗甲状腺癌的药物组合物中的应用。

进一步，所述药物组合物包括RUBCNL的抑制剂。

进一步，所述抑制剂为siRNA。

进一步，所述siRNA的序列如SEQ ID NO.5～6所示。

本发明提供了一种治疗甲状腺癌的药物组合物，所述药物组合物包括RUBCNL的抑制剂。

进一步，所述抑制剂为siRNA。

进一步，所述siRNA的序列如SEQ ID NO.5～6所示。

本发明提供了RUBCNL在筛选治疗甲状腺癌的候选药物中的应用。

进一步，用待筛选物质处理表达或含有RUBCNL基因或其编码的蛋白的培养体系；和检测所述体系中RUBCNL基因或其编码的蛋白的表达或活性；其中，当所述待筛选物质抑制RUBCNL基因的水平或表达活性时，该待筛选物质是治疗甲状腺癌的候选药物。

本发明的优点和有益效果：

本发明首次发现了在甲状腺癌中呈现差异表达的分子诊断标志物，通过检测标志物的水平，可以判断受试者是否患有甲状腺癌，利用标志物进行疾病的诊断，特异性更高，灵敏度更好，可以指导临床医师给受试者提供精准化的治疗方案。

附图说明

图1显示利用QPCR检测RUBCNL基因在甲状腺癌组织中的表达情况图。

图2是MTT检测细胞增殖情况图。

图3是Transwell小室检测细胞侵袭情况图。

发明详述

本发明利用高通量测序的方法结合生物信息学分析，通过检测甲状腺癌患者和正常人中的差异表达的基因，寻找可用于表征甲状腺癌的标志物。本发明通过分析，首次发现了RUBCNL在甲状腺癌患者中呈现差异性表达，提示RUBCNL可作为检测指标应用于甲状腺癌的临床诊断。

RUBCNL

在本发明中，(gene ID：80183)包括人基因及其所编码的蛋白，其位于人13号染色体长臂1区4带上。目前在genebank中存在8个转录本，核酸序列分别如NM_001286761.2、NM_001286762.3、NM_001286763.3、NM_001286764.3、NM_001286765.2、NM_001286766.2、NM_001349772.2、NM_025113.4所示。一种代表性的的核酸序列如NM_001286761.2所示，相对应的氨基酸序列如NP_001273690.1所示。

本发明的实用性并不局限于对本发明的靶标基因的任何特定变体的基因表达进行定量。本领域技术人员知道，进行生物信息学分析时，通常会将测序序列和已知的基因进行比对，只要有关序列可以比对到相关基因上，就可以看做是该基因的表达，因此，在提及差异表达的基因时，该基因的不同的转录本、突变型或其片段也包含在本发明中。

本领域技术人员应当理解，测定基因表达的手段不是本发明的重要方面。本发明可以利用本领域内已知的任何方法测定基因的表达水平。

本发明的RUBCNL使用本领域普通技术人员已知的多种核酸以及蛋白技术进行检测，这些技术包括但不限于：核酸测序、核酸杂交、核酸扩增技术、蛋白免疫技术。

核酸测序技术的示例性非限制性实例包括但不限于链终止子(Sanger)测序和染料终止子测序。本领域的普通技术人员将认识到，由于RNA在细胞中不太稳定并且在实验中更易受到核酸酶攻击，因此在测序前通常将RNA逆转录成DNA。

核酸测序技术的另一示例性非限制性实例包括下一代测序(深度测序/高通量测序)，高通量测序技术是一种基于单分子簇的边合成边测序技术，基于专有的可逆终止化学反应原理。测序时将基因组的DNA的随机片段附着到光学透明的玻璃表面，这些DNA片段经过延伸和桥式扩增后，在玻璃表面形成数以亿计的簇，每个簇是具有数千份相同模板的单分子簇，然后利用带荧光基团的四种特殊脱氧核糖核苷酸，通过可逆性的边合成边测序技术对待测的模板DNA进行测序。

核酸杂交技术的示例性非限制性实例包括但不限于原位杂交(ISH)、微阵列和Southern或Northern印迹。原位杂交(ISH)是一种使用标记的互补DNA或RNA链作为探针以定位组织一部分或切片(原位)或者如果组织足够小则为整个组织(全组织包埋ISH)中的特异性DNA或RNA序列的杂交。DNA ISH可用于确定染色体的结构。RNA ISH用于测量和定位组织切片或全组织包埋内的mRNA和其他转录本(例如，ncRNA)。通常对样本细胞和组织进行处理以原位固定靶转录本，并增加探针的进入。探针在高温下与靶序列杂交，然后将多余的探针洗掉。分别使用放射自显影、荧光显微术或免疫组织化学，对组织中用放射、荧光或抗原标记的碱基标记的探针进行定位和定量。ISH也可使用两种或更多种通过放射性或其他非放射性标记物标记的探针，以同时检测两种或更多种转录本。

将Southern和Northern印迹分别用于检测特异性DNA或RNA序列。使从样本中提取的DNA或RNA断裂，在基质凝胶上通过电泳分离，然后转移到膜滤器上。使滤器结合的DNA或RNA与和所关注的序列互补的标记探针杂交。检测结合到滤器的杂交探针。该程序的一种变化形式是反向Northern印迹，其中固定到膜的底物核酸为分离的DNA片段的集合，而探针是从组织提取并进行了标记的RNA。

核酸扩增技术的示例性非限制性实施例包括但不限于：聚合酶链式反应(PCR)、逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)、转录介导的扩增(TMA)、连接酶链式反应(LCR)、链置换扩增(SDA)和基于核酸序列的扩增(NASBA)。本领域的普通技术人员将认识到，某些扩增技术(例如，PCR)需要在扩增前将RNA逆转录成DNA(例如，RT-PCR)，而其他扩增技术则直接扩增RNA(例如，TMA和NASBA)。

蛋白免疫技术包括夹心免疫测定，例如夹心ELISA，其中使用识别生物标志物上不同表位的两种抗体进行该生物标志物的检测；放射免疫测定(RIA)、直接、间接或对比酶联免疫吸附测定(ELISA)、酶免疫测定(EIA)、荧光免疫测定(FIA)、蛋白质印迹法、免疫沉淀法和基于任何颗粒的免疫测定(如使用金颗粒、银颗粒或乳胶颗粒、磁性颗粒或量子点)。可例如在微量滴定板或条的形式中实施免疫法。

因此，可使用熟知的方法进行根据本发明的免疫法。在本发明的生物标志物的检测中可使用任何直接(如使用传感器芯片)或间接的方法。

芯片、试剂盒、核酸膜条

在本发明中芯片包括基因芯片、蛋白芯片；所述基因芯片包括固相载体；以及有序固定在所述固相载体上的寡核苷酸探针，所述的寡核苷酸探针特异性地对应于RUBCNL所示的部分或全部序列。所述蛋白芯片包括固相载体，以及固定在固相载体上的RUBCNL编码的蛋白的抗体或配体。所述固相载体包括无机载体和有机载体，所述无机载体包括但不限于有硅载体、玻璃载体、陶瓷载体等；所述有机载体包括聚丙烯薄膜、尼龙膜等。

“抗体”在本文中以最广义使用，而且明确覆盖单克隆抗体、多克隆抗体、自至少两种完整抗体形成的多特异性抗体(例如双特异性抗体)、及抗体片段，只要它们展现期望的生物学活性。

“抗体片段”包含完整抗体的一部分，优选包含其抗原结合区。抗体片段的例子包括Fab、Fab'、F(ab')2、和Fv片段；双抗体；线性抗体；单链抗体分子；及自抗体片段形成的多特异性抗体。

“双抗体”(diabody)指具有两个抗原结合位点的抗体片段，该片段在同一条多肽链(VH-VL)中包含相连接的重链可变域(VH)和轻链可变域(VL)。通过使用过短的接头使得同一条链上的两个结构域之间不能配对，迫使这些结构域与另一条链的互补结构域配对并创建两个抗原结合位点。双抗体可以是二价的或双特异性的。

本发明提供了一种试剂盒，所述试剂盒可用于检测RUBCNL基因或蛋白的表达水平，包含用于RUBCNL检测和/或定量的引物、寡核苷酸探针、配体、和/或芯片。选自下组的一种或多种物质：容器、使用说明书、阳性对照物、阴性对照物、缓冲剂、助剂或溶剂。

本发明的试剂盒中还可附有试剂盒的使用说明书，其中记载了如何采用试剂盒进行检测，和如何利用检测结果对疾病发展进行判断、对治疗方案进行选择。

试剂盒的组分可以以水介质的形式或以冻干的形式来包装。试剂盒中适当的容器通常至少包括一种小瓶、试管、长颈瓶、宝特瓶、针筒或其它容器，其中可放置一种组分，并且优选地，可进行适当地等分。在试剂盒中存在多于一种的组分时，试剂盒中通常也将包含第二、第三或其它附加的容器，其中分离地放置附加的组分。然而，不同组合的组分可被包含在一个小瓶中。本发明的试剂盒通常也将包括一种用于容纳反应物的容器，密封以用于商业销售。这种容器可包括注模或吹模的塑料容器，其中可保留所需的小瓶。

在本发明中，核酸膜条包括基底和固定于所述基底上的特异性识别RUBCNL的探针；所述基底可以是任何适于固定探针的基底，例如尼龙膜、硝酸纤维素膜、聚丙烯膜、玻璃片、硅胶晶片、微缩磁珠等。

本发明中诊断甲状腺癌的产品可用于检测包括RUBCNL基因在内的多个基因(例如，与甲状腺癌相关的多个基因)的表达水平，将甲状腺癌的多个标志物同时进行检测，可大大提高甲状腺癌诊断的准确率。

本发明提供了RUBCNL在构建预测甲状腺癌的计算模型中的应用，可以以不同方式实施和实现将标志物水平与某种可能性或风险关联起来的步骤。优选地，在数学上组合标志物和一种或多种其它标志物的测定浓度，并将组合值与根本的诊断问题关联起来。可以通过任何适宜的现有技术数学方法将标志物值的测定组合。

本发明提供了RUBCNL在制备治疗甲状腺癌的药物组合物中的应用，所述药物组合物RUBCNL的抑制剂。所述RUBCNL的抑制剂包括核酸抑制物，蛋白抑制剂，蛋白水解酶，蛋白结合分子。其中核酸抑制物选自：以RUBCNL或其转录本为靶序列、且能够抑制RUBCNL基因表达或基因转录的干扰分子，包括：shRNA(小发夹RNA)、小干扰RNA(siRNA)、dsRNA、微小RNA、反义核酸，或能表达或形成所述shRNA、小干扰RNA、dsRNA、微小RNA、反义核酸的构建物。蛋白结合分子选自：与RUBCNL蛋白特异性结合的物质，如能够抑制RUBCNL蛋白活性的抗体或配体。

本发明的药物组合物还包括药学上可接受的载体，学上可接受的载体包括(但并不限于)：稀释剂、赋形剂如乳糖、氯化钠、葡萄糖、尿素、淀粉、水等、填充剂如淀粉、蔗糖等；粘合剂如单糖浆、葡萄糖溶液、淀粉溶液、纤维素衍生物、藻酸盐、明胶和聚乙烯吡咯烷酮；湿润剂如甘油；崩解剂如干淀粉、海藻酸钠、海带多糖粉末、琼脂粉末、碳酸钙和碳酸氢钠；吸收促进剂季铵化合物、十二烷基硫酸钠等；表面活性剂如聚氧化乙烯山梨聚糖脂肪酸酯、十二烷基硫酸钠、硬脂酸单甘油酯、十六烷醇等；致湿剂如甘油、淀粉等；吸附载体如淀粉、乳糖、斑脱土、硅胶、高岭土和皂粘土等；润滑剂如滑石粉、硬脂酸钙和镁、聚乙二醇、硼酸粉末等。

本发明的药物还可与其他治疗甲状腺癌的药物联用，其他治疗性化合物可以与主要的活性成分(例如，RUBCNL的抑制剂)同时给药，甚至在同一组合物中同时给药。还可以以单独的组合物或与主要的活性成分不同的剂量形式单独给予其它治疗性化合物。主要成分(如RUBCNL抑制剂)的部分剂量可以与其它治疗性化合物同时给药，而其它剂量可以单独给药。

具体的实施方式

下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细的说明。以下实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。根据本发明的实质对本发明进行的简单改进都属于本发明要求保护的范围。

实施例1筛选与甲状腺癌相关的基因标志物

1、样品收集

分别收集4例滤泡型甲状腺***状癌组织和癌旁组织样本，排除其他恶性肿瘤患者。

2、RNA样品的制备

使用TRIZOL法提取组织总RNA

1)用剪刀组织剪碎，加入1ml Trizol,振荡器上震荡1min；常温放置10min，使核蛋白体完全分解。

2)加入200μl三氯甲烷(氯仿)，盖紧管盖，剧烈震荡15s，常温静置10min。

3)4℃，11000rpm离心15min。

4)将水样层转移到一个新的离心管中，加入500μl异丙醇；颠倒混匀后，常温静置10min。

5)4℃，11000rpm离心15min。

6)用枪小心吸走液体，留沉淀在管底，加入1ml 75％的乙醇，在振荡器上震荡5s，洗涤沉淀一次。

7)4℃，8000rpm离心5min。

8)将上清小心去掉，干燥沉淀10min，加入适量的水溶解沉淀10min。

9)检测RNA浓度，鉴定RNA的产量和纯度。

3、构建cDNA文库

使用用Epicentre的Ribo-Zero试剂盒除去总RNA中的核糖体RNA；利用金属离子将完整的RNA随机打断成200bp左右的小片段。

利用Illumina的TruseqTM RNA sample Prep Kit进行cDNA文库的构建，具体操作详见说明书。

4、测序

检测合格的文库，加入NaOH变性成单链，变性稀释后的文库加入到FlowCell内，与FlowCell上的接头杂交，在cBot上完成桥式PCR扩增，使用Illumina X-Ten测序平台进行测序。

5、高通量转录组测序数据分析

对测序结果进行生物信息学分析，使用R软件中的DESeq包对基因的reads数进行分析，设定筛选标准为P<0.05。

6、结果

高通量测序结果分析显示，RUBCNL基因在滤泡型甲状腺***状癌组织中的表达量显著高于癌旁组织。

实施例2 QPCR测序验证RUBCNL基因的差异表达

1、对RUBCNL基因差异表达进行大样本QPCR验证。按照实施例1中的样本收集方式分别收集30例癌组织样本和癌旁组织样本。

2、RNA提取步骤同实施例1

3、实时定量PCR检测

1)逆转录：使用TAKARA公司的反转录试剂盒(Takara code：DRR047A)进行操作。

a.去除基因组DNA

在试管中加入5×gDNA Eraser Bμffer 2.0μl，gDNA Eraser 1.0μl，总RNA 1μg，加Rnase Free ddH₂O使总体积至10μl，水浴锅中42℃加热2min。

b.反转录反应

将

2 4.0μl，

Enzyme Mix I 1.0μl，RTPrimer Mix 1.0μl，RNase Free ddH₂O 4.0μl加入上述试管中一起混合共20μl，水浴锅中37℃15min，85℃5s。

2)QPCR扩增

a.引物设计

根据RUBCNL和GADPH的基因序列设计引物，具体引物序列如下：

RUBCNL基因(5’to3’)：

TATATCAGCAATGGAGAA(SEQ ID NO.1)；

TGTATGAAGAAGTAGAAGA(SEQ ID NO.2)。

GAPDH基因：

AATCCCATCACCATCTTCCAG(SEQ ID NO.3)；

GAGCCCCAGCCTTCTCCAT(SEQ ID NO.4)。

b.QPCR扩增检验

用

Ex Taq^TMII(Takara Code:DRR081)试剂盒配置PCR反应体系，在Thermal Cycler

Time System扩增仪上进行PCR扩增，反应结束后确认Real TimePCR的扩增曲线和溶解曲线，ΔΔCT法进行相对定量。

配置25μl反应体系：

Ex TaqTM II(2×)12.5μl，正(反)向引物各1μl，DNA模板2μl，灭菌蒸馏水8.5μl。

反应条件：95℃30s，(95℃5s，60℃30s)×40

4、结果

QPCR结果如图1所示，RUBCNL在甲状腺癌组织中表达显著上调，差异具有统计学意义(P<0.05)，同高通量测序结果一致，其中，RUBCNL上调的样本有31例，甲状腺癌组织有26例，癌旁组织有5例，提示RUBCNL在甲状腺癌的诊断中具有较高的应用价值。

实施例3和RUBCNL基因的功能性研究

1、RUBCNL干扰RNA的设计与合成

由上海吉码制药技术有限公司设计并合成针对RUBCNL的干扰siRNA-RUBCNL，对照为通用的siRNA-NC，siRNA-RUBCNL的序列如下：

序列5’to3’：

AUUUGCAAAUCUCUUUCACAU(SEQ ID NO.5)；

GUGAAAGAGAUUUGCAAAUGC(SEQ ID NO.6)。

2、细胞培养

在37℃5％CO₂培养箱内，将K1细胞置于含10％FBS的DMEM培养液中培养，取对数生长期的K1细胞用于实验。实验分为K1组(空白对照组即未进行转染的细胞)，阴性对照组：siRNA-NC组；实验组：siRNA-RUBCNL组。

3、转染

实验前一天使用无双抗含血清培养基铺6孔板，细胞密度为6×10⁵/孔。细胞融合度达70％时开始转染。取1.5ml EP管，每管各加入OPTI-MEM稀释siRNA，室温静置5min。另取1.5ml EP管，每管各加入OPTI-MEM稀释Lipofectamine 2000，室温静置5min；将稀释好的siRNA与Lipofectamine2000轻轻混合，室温静置20min。将混合液加入到每个已经含有OPTI-MEM的6孔板中，前后左右轻轻混匀；培养箱中箱孵育6h后，将转染液换为无双抗含血清培养基。

4、Real-time PCR检测

各组细胞转染培养48h后，使用Trizol法提取细胞总RNA，按照实施例2中的方法进行逆转录以及实时定量PCR检测。

5、MTT检测

收集对数生长期细胞，细胞浓度调为1×10³个细胞悬液，于96孔板中加入100μL，同时设置调零孔，放入37℃,5％CO₂培养箱中培养，于48h取出细胞，每孔加入20μL MTT溶液，培养箱中孵育2h加入150μL DMSO，震荡10min，使结晶物充分溶解。选择490nm波长，在酶联免疫监测仪上测定各孔光吸收值，记录结果。

6、Transwell实验

用30μL 1:8稀释的Matrigel胶铺于Transwell小室上层，2h后加100μL DMEM培养基水化，上室加入转染好的K1细胞2×10⁵个，下室加入500μL含10％FBS的培养基，每组设3个复孔。放置培养箱中培养48h。然后取出小室，PBS清洗3遍，棉签轻轻擦去上室内细胞，无水甲醇固定30min，0.5％的结晶紫染色30min，PBS清洗3次，自然风干，于显微镜下观察。

7、统计学方法

实验都是按照重复3次来完成的，结果数据都是以平均值±标准差的方式来表示，两者之间的差异采用配对t检验，认为当P<0.05时具有统计学意义。

8、结果

1)以RUBCNL在对照组中(K1)的表达量作为基准定为1，相比对照组，实验组在转染siRNA-RUBCNL后，RUBCNL的表达水平(0.28±0.085)显著低于对照组(K1 vs siRNA-RUBCNL，P值＝0.0047，**)，而转染siRNA-NC的阴性对照中的RUBCNL的表达水平(0.917±0.0451)则无显著变化(K1 vs siRNA-NC，P值＝0.0853，ns)。

2)MTT检测结果如图2显示，相比阴性对照组siRNA-NC的OD值，实验组siRNA-RUBCNL的OD值显著降低，差异具有统计学意义(siRNA-NC vs siRNA-RUBCNL，P＝0.0031，**)，表明敲低RUBCNL后K1的增殖明显受到抑制。

3)细胞侵袭实验结果如图3显示，敲低RUBCNL后，穿过基底膜的细胞数目与对照组相比明显减少，差异具有统计学意义(P＝0.0169，*)；以上结果表明，敲低RUBCNL能够抑制癌细胞在体外的侵袭能力。

上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。

序列表

<110> 中国人民解放军联勤保障部队第九六0医院

<120> 一种与甲状腺癌相关的分子及其应用

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

tatatcagca atggagaa 18

<210> 2

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

tgtatgaaga agtagaaga 19

<210> 3

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

aatcccatca ccatcttcca g 21

<210> 4

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

gagccccagc cttctccat 19

<210> 5

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

auuugcaaau cucuuucaca u 21

<210> 6

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

gugaaagaga uuugcaaaug c 21

Claims

1.检测基因水平的试剂在制备诊断滤泡型甲状腺***状癌的产品中的应用，其特征在于，所述基因为RUBCNL。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述产品包括通过测序技术、核酸杂交技术、核酸扩增技术检测样本中RUBCNL水平的试剂。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述试剂选自：

特异性识别RUBCNL基因的寡核苷酸探针；或

特异性扩增RUBCNL基因的引物。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，特异性扩增RUBCNL基因的引物序列如SEQID NO.1~2所示。

5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述产品包括芯片、试剂盒或核酸膜条。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述芯片包括基因芯片，所述基因芯片包括用于检测RUBCNL基因转录水平的针对RUBCNL基因的寡核苷酸探针；所述试剂盒包括基因检测试剂盒，所述基因检测试剂盒包括用于检测RUBCNL基因转录水平的试剂、或芯片。

7. RUBCNL在构建预测甲状腺癌的计算模型中的应用。

8.RUBCNL的抑制剂在制备治疗甲状腺癌的药物组合物中的应用，其特征在于，所述抑制剂为siRNA。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述siRNA的序列如SEQ ID NO.5~6所示。