CN113005067B - 多功能复合益生菌制剂及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种多功能复合益生菌制剂及其制备方法与应用，采用植物乳杆菌MiuCul‑01、嗜酸乳杆菌MiuLac‑01、干酪乳杆菌MiaoTech‑01、鼠李糖乳杆菌MiaoTech‑11、嗜热链球菌MiaoPro‑01、两歧双歧杆菌Miuyo‑01、乳双歧杆菌Miuyo‑11、婴儿双岐杆菌Miuyo‑21和短双岐杆菌Miuyo‑31，经混合菌接种、厌氧液态培养、固液分离、固态培养等结合的新工艺制备而成，生产的复合益生菌制剂菌体数量大且活性高，并含有益生菌所产生的代谢产物，在人体胃肠道中具有更好的抗幽门螺杆菌、降血糖、调理肠胃、增加免疫力、抗过敏、降脂减肥等多方面的效果。
Description
技术领域
本发明属于益生菌制剂技术领域，具体涉及一种多功能复合益生菌制剂及其制备方法。
背景技术
幽门螺杆菌是一种螺旋形、微厌氧、对生长条件要求十分苛刻的细菌。幽门螺杆菌感染首先引起慢性胃炎，并导致胃溃疡和胃萎缩，严重者则发展为胃癌。慢性胃炎和消化道溃疡患者的普遍症状为：食后上腹部饱胀、不适或疼痛，常伴有其它不良症状，如嗳气、腹胀、反酸和食欲减退等。有些患者还可出现反复发作性剧烈腹痛、上消化道少量出血等。据统计：大约有1%的慢性胃炎、胃溃疡患者会发展成胃癌，而胃癌是全球最常见的恶性肿瘤之一，在癌症死亡原因中位列第二。因此，及时而有效地用抗菌素杀灭幽门螺杆菌，对预防和控制胃癌有重大意义。
过敏是有机体对某些外界刺激(抗原)的感受性不正常增高的现象，即异常的、过高的免疫应答，简单地说就是对某种物质(抗原)过度敏感。过敏性疾病的发生、发展与机体免疫***有关，其中2型免疫应答机制在过敏性疾病中起着重要作用，能针对过敏原产生特异性IgE抗体，使机体处于致敏状态。当致敏机体再次接触相同过敏原时，吸附在肥大细胞与嗜酸性粒细胞表面的IgE抗体与相应的抗原结合，引起肥大细胞脱颗粒，释放出组织胺等过敏介质，从而引起过敏反应，使机体发生组织损伤或功能紊乱，常见的症状有腹痛、腹泻、呕吐，或是皮肤奇痒难熬，更严重者会发生休克。对于过敏体质人群，曾采用避免接触过敏原的方法来减少过敏的发生，但是效果甚微，避开过敏原只能暂时减轻过敏症状，却不能根治过敏症。于是便出现了诱导免疫耐受的方法，尽管这种方法有一定的可行性，但是，在现在的卫生条件下也很难完全脱敏。
人体中常见的免疫器官是淋巴器官，淋巴中表达CD4的T细胞称为辅助T细胞(Th)。根据辅助T细胞的功能，或者说根据其对不同细胞因子的应答以及分泌细胞因子的能力可再分成两个主要部分，即T辅助细胞可分化为两型（Th1及Th2）。一般地说，Th1有利于增强细胞免疫，而Th2有利于增强体液免疫，正常情况下Th1及Th2间存在动态平衡。而且二者还会互相制衡：Th1的免疫反应旺盛，则Th2的活性及功能会受抑制而大幅降低，反之亦然。而Th1的主要作用是抵抗外界各种微生物的刺激，外来感染愈多，Th1受到的微生物刺激愈多，其被活化的数目也愈多，其结果便是Th2的免疫反应受到抑制。或者说：刺激Th1型免疫应答，会降低可导致过敏的Th2型免疫应答。研究表明过敏性疾病与T辅助细胞失衡有关，Th2过强容易引起过敏。因此，刺激Th1型免疫应答从而降低Th2型免疫应答，就会减少过敏反应的发生。20世纪80年代以来，过敏性疾病有明显上升的趋势，尤其是在西方国家或大多现代化国家。有学者发现在非常干净卫生的环境中长大的城市小孩比在肮脏环境中长大的农村小孩，罹患过敏行疾病的比例要高得多，因此发现了人的生活环境和过敏性疾病之间的关系，从而提出了“卫生假说”。“卫生假设”认为：幼年时期过少暴露于细菌和病毒等病原体导致对Th１细胞的刺激不充分，从而不能与Th2细胞相平衡，最终导致一种过敏易患体质。依据“卫生假说”的观点，认为适度的微生物刺激是形成机体正常免疫功能和口服耐受所必需，有利于诱导Th0细胞向Th1细胞分化，同时抑制Th2细胞反应，从而起到免疫平衡作用。儿童早期接触的微生物越多，则日后发展出过敏性疾病的机会愈低。但是，环境中存在的致病微生物会让人产生严重的疫病，因此，直接让儿童接触环境微生物实际上也存在很大的风险。
糖尿病是由遗传因素、免疫功能紊乱、微生物感染及其毒素、自由基毒素、精神因素等等各种致病因子作用于机体导致胰岛功能减退、胰岛素抵抗等而引发的糖、蛋白质、脂肪、水和电解质等一系列代谢紊乱综合征。糖尿病是全球最严重的慢性病之一，长期的高血糖会导致人体发生慢性并发症，由此引起血管、神经的慢性损伤，最终可能影响到心脏、肾脏、眼睛和神经，并造成严重的并发症。人体必须通过肠内的关键消化酶（α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶）将食物中的多糖类物质水解成葡萄糖才能被人体吸收，因此，抑制α-葡萄糖苷酶就能减少身体摄入葡萄糖。α-葡萄糖苷酶是一种存在于小肠黏膜刷状缘的低聚糖水解酶，能将低聚糖、麦芽糖等水解成葡萄糖，从而促进葡萄糖的吸收，增加血糖含量。因此，通过抑制α-葡萄糖苷酶活性降低餐后血糖已成为糖尿病临床干预的有效靶点。目前临床上使用的药物主要包括阿卡波糖、伏格列波糖和米格列醇。有资料报道：乳酸菌在培养过程中也能产生一些α-葡萄糖苷酶抑制剂，因此，服用益生菌既可以通过益生菌在肠道内的生长繁殖消耗葡萄糖，又可以通过其培养过程中所产生的代谢产物(α-葡萄糖苷酶抑制剂)来降低肠道内的葡萄糖吸收率，从而降低人体血糖。
肥胖是指身体的明显超重与脂肪层过厚，是体内脂肪组织积蓄过剩的状态。造成肥胖的原因主要有：过量摄入高热量的食物、运动过少等。当身体的能量摄入超过能量消耗时，造成身体能量过剩而促进了脂肪的累积，就形成了肥胖；此外，疾病、环境、心理、身体毒素偏多等因素造成身体营养失衡、能量代谢失调等，也会形成肥胖。肥胖不仅影响形体美，而且会引发多种疾病，如：高血压、冠心病、心绞痛、脑血管疾病、糖尿病、高脂血症、高尿酸血症、女性***等，还能增加人们患恶性肿瘤的机率，影响消化***的功能和内分泌***的功能。
人体脂肪的来源主要有两个：一个是直接摄入食物中的脂肪；另一个是利用过量的糖分在体内转化为脂肪。食物中的脂肪在小肠中经各种酶及胆汁酸盐的作用，被分解成脂肪酸、胆固醇和其它脂肪消化产物后，通过小肠壁被吸收进血流，从而使脂肪被人体消化吸收，在人体内有可能被重新合成脂肪；另一方面,当人体摄入的糖分过量时，糖分(如葡萄糖等)也能通过三羧酸循环***转化为脂肪。因此，抑制三羧酸循环***的关键酶--柠檬酸裂解酶能减少人体细胞脂肪的合成，从而降低人体的脂肪含量。益生菌在肠道定殖后，在其生长繁殖的过程中,会利用肠道中的脂类(如甘油三酯、胆固醇等)、小分子糖类(如葡萄糖)、氨基酸类或小肽等物质来合成菌体成分，参与营养物质的消化、吸收、代谢功能，充分发挥降低体内脂肪、降低胆固醇的功效，从而降低身体脂肪率，降低体重，降低食物利用率，促进新陈代谢，改善肥胖体质等。多项研究显示：益生菌能通过减少脂肪的合成以及分解多余的油脂，使人体的脂肪不会过度蓄积。
益生菌为非致病性微生物，但能刺激肠道的免疫***，改变Th1/Th2平衡，使免疫反应向Th1细胞方向进行，抑制Th2细胞反应而发挥其免疫调节作用，从而减少过敏性疾病的发生。此外，益生菌及其代谢产物还有增强肠道屏障功能的作用，减少食物抗原透过肠道粘膜，避免其暴露于免疫***。益生菌大部分是非病原性革兰氏阳性菌，其细胞壁主要组分为肽聚糖(PG)、细菌多糖(PS)和脂磷壁酸(LTA)，它们都有免疫刺激特性。
申请号为201780023391.0的发明专利“用于降低食物、能量和/或脂肪摄入的双歧杆菌”公布了一种具有降脂减肥功能的动物双歧杆菌；申请号为201680007471.2的发明专利“包含双歧杆菌的免疫调节组合物”公布了一种调节免疫力的组合物；申请号为202010455121.0的发明专利“具有提高免疫力和调节肠道功能的动物双歧杆菌BZ11复合菌剂”公布了一种能提高免疫力的动物双歧杆菌；申请号为201510962576.0的发明专利“一种增强免疫力的双歧杆菌组合物”公布了一种能增强免疫力的双歧杆菌组合物；申请号为201610280825.2的发明专利“婴儿型双歧杆菌在防治食物过敏食品或者药物中的应用”公布了一种能防治过敏的婴儿双歧杆菌，并将其应用于食品或者药品中；申请号为202010699202.5的发明专利“一株动物双歧杆菌NX-6及其在制备降脂减肥药物中的应用”公布了一种具有减肥功能的动物双歧杆菌；申请号为201811068444.3的发明专利“一种益生菌粉及其制备方法”公布了一种益生菌粉剂的制备方法，这种益生菌制剂包括嗜酸乳杆菌、乳双歧杆菌、鼠李糖乳杆菌和副干酪乳杆菌等复合益生菌粉及一些辅料，具有提升人体免疫力的作用。这些专利为复合益生菌制剂在降脂减肥、调节免疫力和抗过敏等方面的应用提供了一条新思路。
目前，益生菌生产行业在生产各种益生菌菌粉的过程中，几乎全部采用液态发酵，在液态发酵完成后经离心分离或其它的固液分离方法去除水分而得到湿菌体，然后添加干燥保护剂或载体混匀、冷冻干燥、粉碎、造粒、包衣、包装等。由于在固液分离过程中，去除了益生菌在液态发酵过程中所产生的细菌素、有机酸等具有抑菌作用的物质，在产品中无法体现复合益生菌制剂代谢产物的抑菌效果，因此，这种方法所生产的益生菌产品仅仅利用了益生菌本身的抗过敏、降脂减肥效果，而未能利用其中抑菌物质的抗过敏、降脂减肥效果；此外，由于从液态发酵液中分离得到的湿菌体水分含量高，干燥时菌体应激死亡率高，并且由于在湿菌体中添加适量的干燥保护剂或载体，使得液态发酵的产品在干燥后实际所得到的菌体数量也有所减少。
申请号为201310187056.8的发明专利“一种嗜酸乳杆菌的制备方法”公布了一种采用液态发酵和固态发酵结合生产嗜酸乳杆菌的工艺，即首先进行液态发酵，然后利用液态发酵的产物作为菌种与固态培养基混合，再进行固态发酵，产品中含有嗜酸乳杆菌活菌及其代谢产物，例如：双歧菌素、正丁酸、乙酸、甲酸等；申请号为201510559188.8的发明专利“高密度固态发酵培养乳杆菌的培养基及方法”公布了一种固态发酵培养乳杆菌的方法：将乳杆菌菌种按3-5%v/v的接种量接种到培养基中混匀，于30-37℃的条件下密闭发酵。这两个专利采用的菌种都是用三角瓶或小型发酵罐制备的液态菌种，也可以算是“液态培养-固态培养”结合的工艺，即在固态培养基中添加液态培养所获得的液态菌种，混合均匀后进行固态发酵，从而获得固态发酵产品。但由于液态发酵液中的固含量很低(2-5%)，所以即使添加的液态培养液用量达到50%，在固态培养基中也只能加入少量的液态菌种(1-2.5%)作为固态发酵的菌种，从而造成固态发酵培养基中的初始菌体浓度不高，导致固态发酵时间长，产品中活菌浓度小。
综上所述，无论是传统的益生菌实际生产工艺“液态培养＋离心分离”，还是上述发明的“液态培养＋固态培养”工艺，都存在菌种含量低、发酵效果差、干燥时菌体死亡率高因而成品中菌种活力低等缺陷。
鉴于此，申请此专利。
发明内容
为了解决现有技术存在的问题，本发明提供了一种多功能复合益生菌制剂及其制备方法，新制备工艺使产品菌体数量大且活性高，并含有固态培养时菌种所产生的代谢产物，能增强复合益生菌制剂在使用时的抗幽门螺杆菌、降血糖、调理肠胃、增加免疫力、抗过敏、降脂减肥等多方面的功效。
本发明的目的是提供一种多功能复合益生菌制剂。
本发明的再一目的是提供上述多功能复合益生菌制剂的制备方法。
根据本发明的具体实施方式的多功能复合益生菌制剂，所述多功能复合益生菌制剂包括以下组分：
植物乳杆菌MiuCul-01、嗜酸乳杆菌MiuLac-01、干酪乳杆菌MiaoTech-01、鼠李糖乳杆菌MiaoTech-11、嗜热链球菌MiaoPro-01、两歧双歧杆菌Miuyo-01、乳双歧杆菌Miuyo-11、婴儿双岐杆菌Miuyo-21和短双岐杆菌Miuyo-31。
根据本发明的具体实施方式的多功能复合益生菌制剂，其中，所述多功能复合益生菌制剂按重量份包括以下组分：
10-15份植物乳杆菌MiuCul-01、5-10份嗜酸乳杆菌MiuLac-01、3-7份干酪乳杆菌MiaoTech-01、5-10份鼠李糖乳杆菌MiaoTech-11、3-7份嗜热链球菌MiaoPro-01、3-7份两歧双歧杆菌Miuyo-01、2-6份乳双歧杆菌Miuyo-11、10-15份婴儿双岐杆菌Miuyo-21和3-7份短双岐杆菌Miuyo-31。
根据本发明的具体实施方式的多功能复合益生菌制剂，其中，所述多功能复合益生菌制剂按重量份包括以下组分：
12.5份植物乳杆菌MiuCul-01、7.5份嗜酸乳杆菌MiuLac-01、5份干酪乳杆菌MiaoTech-01、7.5份鼠李糖乳杆菌MiaoTech-11、5份嗜热链球菌MiaoPro-01、5份两歧双歧杆菌Miuyo-01、4份乳双歧杆菌Miuyo-11、12.5份婴儿双岐杆菌Miuyo-21和5份短双岐杆菌Miuyo-31。
根据本发明的具体实施方式的多功能复合益生菌制剂，其中，所述复合益生菌制剂的活菌数为（8-10）×1011CFU/g。
根据本发明的具体实施方式的多功能复合益生菌制剂，其中，所述两歧双歧杆菌Miuyo-01、婴儿双岐杆菌Miuyo-21、短双岐杆菌Miuyo-31和乳双歧杆菌Miuyo-11均来自婴儿粪便，从婴儿粪便中分离培养得到
进一步的，所述两歧双歧杆菌Miuyo-01、婴儿双岐杆菌Miuyo-21、短双岐杆菌Miuyo-31和乳双歧杆菌Miuyo-11的分离培养条件均为：MRS培养基，pH为6.0-7.5，温度34-40℃。
根据本发明的具体实施方式的多功能复合益生菌制剂，其中，所述植物乳杆菌MiuCul-01从泡菜中分离培养得到。
进一步的，所述植物乳杆菌MiuCul-01培养条件为：MRS培养基，pH6.2～6.4，温度37℃。
进一步的，所述嗜酸乳杆菌MiuLac-01从发酵乳制品中分离培养得到。
进一步的，所述嗜酸乳杆菌MiuLac-01培养条件为：MRS培养基，pH6.2～6.4，温度37℃。
进一步的，所述干酪乳杆菌MiaoTech-01从发酵乳制品中分离培养得到。
进一步的，所述干酪乳杆菌MiaoTech-01培养条件为：MRS培养基，pH6.2～6.4，温度37℃。
进一步的，所述鼠李糖乳杆菌MiaoTech-11从益生菌制剂中分离培养得到。
进一步的，所述鼠李糖乳杆菌MiaoTech-11培养条件为：MRS培养基，pH6.2～6.4，温度37℃。
进一步的，所述嗜热链球菌MiaoPro-01从酸奶发酵剂中分离培养得到。
进一步的，所述嗜热链球菌MiaoPro-01培养条件为：MRS培养基，pH6.2～6.4，温度37℃。
根据本发明的具体实施方式的多功能复合益生菌制剂的制备方法，所述方法包括以下步骤：
（1）按配比将植物乳杆菌MiuCul-01、嗜酸乳杆菌MiuLac-01、干酪乳杆菌MiaoTech-01、鼠李糖乳杆菌MiaoTech-11、嗜热链球菌MiaoPro-01、两歧双歧杆菌Miuyo-01、乳双歧杆菌Miuyo-11、婴儿双岐杆菌Miuyo-21和短双岐杆菌Miuyo-31混合均匀，形成复合益生菌制剂，放入液体培养基中进行第一次厌氧培养，产生的培养液经离心分离后获得复合益生菌制剂湿菌体，备用；
（2）向步骤（1）得到的所述复合益生菌制剂湿菌体与固体培养基混合，在密封状态下进行第二次厌氧培养，培养完成后进行低温干燥或冷冻干燥或真空干燥，形成复合益生菌制剂固体；
（3）将步骤（2）得到的复合益生菌制剂固体粉碎、厌氧造粒、厌氧包衣，即得所述多功能复合益生菌制剂。
根据本发明的具体实施方式的多功能复合益生菌制剂的制备方法，其中，步骤（1）中，采用碟式离心机或管式离心机在无菌条件下进行离心分离后获得复合益生菌制剂湿菌体；所述液体培养基包括乙酸钠、蛋白胨、酵母浸膏和番茄酱；所述第一次厌氧培养的温度为36-38℃，时间为48-72小时。
根据本发明的具体实施方式的多功能复合益生菌制剂的制备方法，其中，步骤（2）中，所述固体培养基包括乙酸钠、大豆肽、酵母浸膏、食品级碳酸钙，所述固体培养基在使用前经过高温干热灭菌，并无菌冷却到38℃以下备用；所述第二次厌氧培养前将所述复合益生菌制剂湿菌体与固体培养基混合物的水分含量调节到45%-55%。
根据本发明的具体实施方式的多功能复合益生菌制剂的制备方法，其中，步骤（2）中，所述第二次厌氧培养的温度为36-38℃，时间为72-120小时；所述低温干燥或真空干燥的温度为30-40℃；所述复合益生菌制剂固体的含水率为4-6%。
益生菌在肠道定殖后，在其生长繁殖的过程中,会利用肠道中的脂类(如甘油三酯、胆固醇等)、小分子糖类(如葡萄糖)、氨基酸类或小肽等物质来合成菌体成分，参与营养物质的消化、吸收、代谢功能，充分发挥降低体内脂肪、降低胆固醇的功效，从而降低身体脂肪率，降低体重，降低食物利用率，促进新陈代谢，改善肥胖体质等。多项研究显示：益生菌能通过减少脂肪的合成以及分解多余的油脂，使人体的脂肪不会过度蓄积。益生菌能有效地调节肥胖患者的体质,其作用机理为：
① 抑制食欲，增加饱腹感
益生菌及其代谢产物可以通过刺激胆囊收缩素(CCK)、胰高血糖素样肽-1(GLP-1)等饱腹因子的释放、减少胃促生长激素的分泌，从而减少食物摄入，降低体重和脂肪的蓄积。有研究表明：短链脂肪酸（比如乙酸、丁酸、丙酸）可以为肠道上皮细胞提供生长所需要的能量，不仅可以促进肠道蠕动、减轻肠道炎症，也可以调节食欲中枢，增加饱腹感。
② 降低胆固醇、降低脂肪
益生菌在生长过程中可同化吸收胆固醇，并可通过产生胆盐水解酶等代谢产物，促进胆固醇与胆酸的沉淀，减少了胆固醇进入血液的机会，干扰肠道对胆固醇的吸收。益生菌及其代谢产物还可产生柠檬酸裂解酶抑制剂、α-葡萄糖苷酶抑制剂、短链脂肪酸等物质，从而影响脂肪代谢和碳水化合物代谢，起到降脂减肥的作用。
③ 调节肠道菌群
益生菌可通过在肠道内释放消化酶，对消化过程起协同作用，并减缓部分肠道吸收不良的症状。且当益生菌进入肠道后，可通过菌群占位、细菌增殖、杀除有害菌等方式促进失衡的肠道菌群相正常化，恢复肠道的正常功能。
④ 益生菌能产生重要的营养物质
益生菌能产生重要的营养物质，如：泛酸、尼克酸、B1、B2、B6及维生素K等维生素，同时能产生短链脂肪酸、抗氧化剂、氨基酸等。这些代谢产物能加速脂肪燃烧分解转化，同时提高人体新陈代谢，以此达到快速瘦身的目的。
综上所述，益生菌及其代谢产物在肠道内参与人体的糖-脂代谢、胆固醇-脂肪代谢，阻断脂肪的形成及加速体内蓄积脂肪的氧化分解，发挥长效减肥的作用。
目前，具有益生作用的菌种较多，但主要还是以乳酸杆菌和双歧杆菌为主，例如：植物乳杆菌、嗜酸乳杆菌、干酪乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、格氏乳杆菌、长双歧杆菌、短双歧杆菌、乳双歧杆菌、两歧双歧杆菌、婴儿双歧杆菌、青春双歧杆菌等，也有少量其它类型的乳酸菌，例如：嗜热链球菌等。
本发明使用的复合益生菌包括几种培养条件类似的兼性厌氧菌和专性厌氧菌，主要以乳杆菌属和双歧杆菌属为主。本发明所使用的各类菌种的特征如下：
植物乳杆菌为直或弯的杆状，圆端直杆菌，厌氧或兼性厌氧，通常缺乏鞭毛，但能运动。革兰氏阳性，不生芽孢。植物乳杆菌常存在于发酵的蔬菜和果汁中，最适生长温度为30~35℃，最适pH6.5左右，能耐pH2.0左右的胃酸和胆盐环境。属于同型发酵乳酸菌，能产生DL-乳酸，有1,6～二磷酸果糖醛缩酶和单磷酸己糖途径的活性，能在葡萄酸盐中生长，并产C02。发酵1分子的核糖或其它的戊糖生成1分子的乳酸和1分子的乙酸。此菌在繁殖过程中能产出特有的乳酸杆菌素，乳酸杆菌素是一种生物型的防腐剂。植物乳杆菌作为人体胃肠道的益生菌群，具有维持肠道内菌群平衡、提高机体免疫力和促进营养物质吸收等多种功能。植物乳杆菌制剂在食品工业中应用十分广泛。由于对食盐、亚硝酸盐具有良好的耐受性，对蛋白质、脂肪无明显直接的分解作用等特点，在发酵肉制品和发酵植物性食品中获得广泛的应用。
嗜酸乳杆菌属于革兰氏阳性杆菌，乳杆菌属，呈短杆状，杆的末端呈圆形，无鞭毛，无荚膜，以单个、成双和短链出现，兼性厌氧或微需氧菌。主要存在于人及一些动物肠道中，其最适生长温度为35-38℃，最适pH为5.5-6.2。在MRS培养基上可以形成明显的菌落，菌落圆形，白色凸起，表面光滑。嗜酸乳杆菌具有耐酸、耐胆汁酸盐的特性，在小肠中，释放乳酸、乙酸和具有抑菌作用的抗生物素类物质（嗜酸乳菌素、嗜酸杆菌素、乳酸菌素等）, 对肠道致病菌具有一定的拮抗作用。嗜酸乳杆菌是目前乳酸菌家族中研究与开发比较广泛的益生菌之一，是人体肠道中重要的微生物，具有平衡肠道微生物区系、调节肠道功能紊乱、增强机体肠粘膜屏障、调节肠道内免疫***、抗癌抗肿瘤的作用。嗜酸乳杆菌在肠道内定殖，能激活机体巨噬活性，诱发体内特异性及非特异性免疫反应，提高人和动物的抗感染能力。因嗜酸乳杆菌的主要代谢产物是有机酸，可降低环境中的氧化还原电位和pH，抑制酸性细菌和需氧细菌生长。
干酪乳杆菌属于乳杆菌属，是革兰氏阳性菌，不产芽孢，无鞭毛，不运动，兼性异型发酵乳糖，不液化明胶；最适生长温度为37℃，菌体长短不一，两端呈方形，常成链；菌落粗糙，灰白色，有时呈微黄色，能发酵多种糖。干酪乳杆菌存在于人的口腔、肠道中，也常常出现在牛奶和干酪、乳制品、饲料、面团和垃圾中。干酪乳杆菌进入人体后可以在肠道内大量存活，起到调节肠内菌群平衡、促进人体消化吸收等作用。同时，干酪乳杆菌具有高效降血压、降胆固醇，促进细胞***，产生抗体免疫，增强人体免疫及预防癌症和抑制肿瘤生长等功能；还具有缓解乳糖不耐症、过敏等益生保健作用。
鼠李糖乳杆菌多存在于人和动物的肠道内，细菌分类学属于乳杆菌属，鼠李糖亚种，是厌氧耐酸、不产芽孢的一种革兰氏阳性益生菌。鼠李糖乳杆菌不能利用乳糖，可发酵多种单糖(葡萄糖、***糖、麦芽糖等)，大多数菌株能产生少量的可溶性氨，但不产生吲哚和硫化氢，它具有耐酸、耐胆汁盐、耐多种抗生素等生物学特点。在耐胃酸和胆汁方面的性能非常突出，可以活体进入人体肠道。
嗜热链球菌是制作酸奶的常用菌株。研究表明这种细菌只能到达小肠的上半部，而不像双歧杆菌那样可以去到大肠。嗜热链球菌能乳糖酶，能帮助乳糖不耐受的人们消化乳糖。
双歧杆菌属的细菌是人和动物肠道菌群的重要组成成员之一。一些双歧杆菌的菌株可以作为益生菌而用在食品、医药和饲料方面。双歧杆菌是一种重要的肠道有益微生物。双歧杆菌作为一种生理性有益菌，对人体健康具有生物屏障、营养作用、抗肿瘤作用、免疫增强作用、改善胃肠道功能、抗衰老等多种重要的生理功能。本发明所使用的双歧杆菌包括以下菌种：两歧双歧杆菌、乳双歧杆菌、婴儿双歧杆菌、短双歧杆菌等4种，均为专性厌氧菌。
通过上述这些乳酸杆菌和双岐杆菌的混合菌接种及混菌培养，可以同时培养获得这5种乳酸杆菌和这4种双歧杆菌的混合物，并通过这些乳酸杆菌和双岐杆菌的协同作用，使得到的益生菌制剂产品具有抗幽门螺杆菌、降血糖、调理肠胃、增加免疫力、抗过敏、降脂减肥等多方面的功能效果。
本发明在固态培养完成后不进行菌种或代谢产物的分离操作，而是将培养后的菌种和代谢产物等一起直接进行低温干燥(冷冻干燥或真空干燥)而得到高活力的复合益生菌制剂固体。因此，这种产品中还含有固态培养时菌种所产生的有机酸、细菌素等具有抑菌能力的代谢产物，还能产生降血糖、增加免疫力的代谢产物，能增强复合益生菌制剂在使用时的抗过敏、降血糖、降脂减肥和增加免疫力等多方面的功能效果。
本发明使用的复合益生菌制剂包括几种培养条件类似的双歧杆菌，这些双歧杆菌在肠道内的生长过程中都具有抗过敏的功能。通过多菌种的协同作用，可以增加各菌种之间的协同抗过敏效果。
免疫力的测定方法较多，例如：NK细胞活性测定、细胞免疫功能测定、体液免疫功能测定、单核-巨噬细胞功能测定等多种免疫功能检测方法。本发明选用“NK细胞活性测定”或“细胞免疫功能测定”这两种方法进行免疫功能的测定。结果表明，本发明的多功能复合益生菌制剂具有较好的降血糖、增加免疫力的效果。
本发明中的两歧双歧杆菌Miuyo-01(拉丁名称：Bifidobacterium bifidum)、婴儿双岐杆菌Miuyo-21(拉丁名称：Bifidobacterium infantis)、短双岐杆菌Miuyo-31(拉丁名称：Bifidobacterium breve)、乳双歧杆菌Miuyo-11(拉丁名称：Bifidobacteriumlactis)、植物乳杆菌MiuCul-01(拉丁名称：Lactobacillus plantarum)、嗜酸乳杆菌MiuLac-01(拉丁名称：Lactobacillus acidophilus)、干酪乳杆菌MiaoTech-01(拉丁名称：Lactobacillus casei)、鼠李糖乳杆菌MiaoTech-11(拉丁名称：Lactobacillusrhamnosus)、嗜热链球菌MiaoPro-01(拉丁名称：Streptococcus thermophilus)，均于2020年10月12日保存于北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC20865、CGMCC20864、CGMCC20863、CGMCC20866、CGMCC20867、CGMCC20868、CGMCC20862、CGMCC20861、CGMCC20869。
本发明采用“混合菌接种”、“厌氧液态培养+固液分离+固态培养”的新工艺进行复合益生菌制剂菌体培养，能增强其抗过敏、降脂减肥的效果：获得具有更高活力的复合益生菌制剂菌体，同时还能保留固态培养过程中所产生的细菌素和有机酸等抗菌物质，能抑制或杀死幽门螺杆菌和引起肠道感染的细菌，具有抗过敏和降脂减肥的功能；同时，还能产生多种具有降血糖、增加免疫力的代谢产物。此外，固态培养物水分含量较低，容易干燥，能减少复合益生菌制剂在干燥期间的应激死亡，结合适当的厌氧造粒、厌氧包衣工序，能大幅提高产品中复合益生菌制剂的活力。综合采用这些措施生产的复合益生菌制剂可增加产品的抗幽门螺杆菌、降血糖、调理肠胃、增加免疫力、抗过敏、降脂减肥等多方面等多方面的功能效果。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
（1）本发明得到的多功能复合益生菌制剂菌体数量大且活性高，并含有益生菌所产生的代谢产物；生产的复合益生菌制剂在人体胃肠道中具有更好的抗幽门螺杆菌、降血糖、调理肠胃、增加免疫力、抗过敏、降脂减肥等多方面的效果；
（2）本发明在制备过程中采用液态厌氧培养，产生的培养液经离心分离后获得复合益生菌制剂的湿菌体；再将湿菌体与无菌固体培养基混合，在密封状态下进行第二次固态厌氧培养；固态培养完成后进行低温干燥而得到高活力复合益生菌制剂固体。
（3）本发明得到的复合益生菌制剂具体的具有以下优点：
①活菌数高
由于液态发酵后离心分离出来的湿菌体在固态培养基中再进行一段时间的固态厌氧培养，菌体数量会大幅增加，活力也明显增加；高活力的益生菌更容易在肠道中定植,在肠道中表现出具有更好的生理功能；
②干燥应激小，菌种干燥损失小
固态培养物含水量仅为45-55%，远低于液态培养物得到的湿菌体，因此，干燥固态培养物对其所造成的损伤和死亡率要远低于干燥液态培养物，使发明所得到的产品活菌数能达到1011cfu/g以上；
③产品中含有菌种繁殖过程中所产生的多种代谢产物
本发明采用多种菌种（包括5种乳酸杆菌和4种双歧杆菌）进行混菌培养，因此，在菌种固态生长繁殖的过程中会产生多种代谢产物，由此制备的含有多种代谢产物的复合益生菌制剂在人体胃肠道中具有更好的抗幽门螺杆菌、降血糖、调理肠胃、增加免疫力、抗过敏、降脂减肥等多方面的功能效果。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明的技术方案进行详细的描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所得到的所有其它实施方式，都属于本发明所保护的范围。
在一些较为具体的实施例中，所述多功能复合益生菌制剂按重量份包括以下组分：
10-15份植物乳杆菌MiuCul-01、5-10份嗜酸乳杆菌MiuLac-01、3-7份干酪乳杆菌MiaoTech-01、5-10份鼠李糖乳杆菌MiaoTech-11、3-7份嗜热链球菌MiaoPro-01、3-7份两歧双歧杆菌Miuyo-01、2-6份乳双歧杆菌Miuyo-11、10-15份婴儿双岐杆菌Miuyo-21和3-7份短双岐杆菌Miuyo-31。
在另一些具体的实施例中，所述多功能复合益生菌制剂按重量份包括以下组分：
12.5份植物乳杆菌MiuCul-01、7.5份嗜酸乳杆菌MiuLac-01、5份干酪乳杆菌MiaoTech-01、7.5份鼠李糖乳杆菌MiaoTech-11、5份嗜热链球菌MiaoPro-01、5份两歧双歧杆菌Miuyo-01、4份乳双歧杆菌Miuyo-11、12.5份婴儿双岐杆菌Miuyo-21和5份短双岐杆菌Miuyo-31。
多功能复合益生菌制剂的制备方法，所述方法包括以下步骤：
（1）按配比将植物乳杆菌MiuCul-01、嗜酸乳杆菌MiuLac-01、干酪乳杆菌MiaoTech-01、鼠李糖乳杆菌MiaoTech-11、嗜热链球菌MiaoPro-01、两歧双歧杆菌Miuyo-01、乳双歧杆菌Miuyo-11、婴儿双岐杆菌Miuyo-21和短双岐杆菌Miuyo-31混合均匀，形成复合益生菌制剂，放入液体培养基中进行第一次厌氧培养，产生的培养液经离心分离后获得复合益生菌制剂湿菌体，备用；
（2）向步骤（1）得到的所述复合益生菌制剂湿菌体与固体培养基混合，在密封状态下进行第二次厌氧培养，培养完成后进行低温干燥或冷冻干燥或真空干燥，形成复合益生菌制剂固体；
（3）将步骤（2）得到的复合益生菌制剂固体粉碎、厌氧造粒、厌氧包衣，即得所述多功能复合益生菌制剂。
步骤（1）中，采用碟式离心机或管式离心机在无菌条件下进行离心分离后获得复合益生菌制剂湿菌体；所述液体培养基包括乙酸钠、蛋白胨、酵母浸膏和番茄酱；所述第一次厌氧培养的温度为36-38℃，时间为48-72小时。
步骤（2）中，所述固体培养基包括乙酸钠、大豆肽、酵母浸膏、食品级碳酸钙，所述固体培养基在使用前经过高温干热灭菌，并无菌冷却到38℃以下备用；所述第二次厌氧培养前将所述复合益生菌制剂湿菌体与固体培养基混合物的水分含量调节到45%-55%；步骤（2）中，所述第二次厌氧培养的温度为36-38℃，时间为72-120小时；所述低温干燥或真空干燥的温度为30-40℃；所述复合益生菌制剂固体的含水率为4-6%。
以下为更为具体的实施例：
实施例1 菌株的分离、菌种特性与鉴定
1.1样品采集：
植物乳杆菌样品从泡菜中采集、分离；
嗜酸乳杆菌样品从自然发酵乳制品中采集、分离；
干酪乳杆菌样品从自然发酵乳制品中采集、分离；
鼠李糖乳杆菌样品从本公司销售的益生菌制剂中分离；
嗜热链球菌从本公司销售的酸奶发酵剂样品分离。
双歧杆菌样品选择出生后3个月-1年、近期未使用过抗菌药物的健康婴儿，从其粪便中采集样品进行分离，即所分离的菌株来自于健康婴儿的肠道。
1.2菌株的分离
1.2.1植物乳杆菌MiuCul-01的分离：
泡菜样品来自于四川农家自制泡菜。取泡菜样品5-10g，剪碎后用研钵充分粉碎，置于无菌的50mL离心管中，加入20mL无菌生理盐水，振荡混匀后置于30℃隔水式培养箱中，静置培养过夜，吸取1mL样液，以无菌生理盐水依次进行10倍梯度稀释至10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6，每个梯度分别取100μL菌悬液涂布于MRS平板上，放置于37℃厌氧培养箱中倒置培养，48h后，从不同梯度的涂布的培养平板中挑选菌落转接培养。在此基础上，挑取符合植物乳杆菌典型特征的菌落进行MRS平板反复划线培养分离，挑取符合植物乳杆菌菌落生长形态的单菌落接入MRS液态培养基中，于37℃厌氧培养箱中培养。最后获得一株具有良好生长性能的菌株。
1.2.2嗜酸乳杆菌MiuLac-01的分离：
发酵乳样品来自于自然发酵的牛奶。取牛奶公司已经发酵变质的酸牛奶5ml，置于无菌的50mL离心管中，加入20mL新鲜牛奶，振荡混匀后置于30℃隔水式培养箱中，静置培养过夜，吸取1mL样液，以无菌生理盐水依次进行10倍梯度稀释至10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6，每个梯度分别取100μL菌悬液涂布于MRS平板上，放置于37℃厌氧培养箱中倒置培养，48h后，从不同梯度的涂布的培养平板中挑选菌落转接培养。在此基础上，挑取符合嗜酸乳杆菌典型特征的菌落进行MRS平板反复划线培养分离，挑取符合嗜酸乳杆菌菌落生长形态的单菌落接入MRS液态培养基中，于37℃厌氧培养箱中培养。最后获得一株具有良好生长性能的菌株。
1.2.3干酪乳杆菌MiaoTech-01的分离：
发酵乳样品来自于自然发酵的牛奶。取牛奶公司已经发酵变质的酸牛奶5ml，置于无菌的50mL离心管中，加入20mL新鲜牛奶，振荡混匀后置于30℃隔水式培养箱中，静置培养过夜，吸取1mL样液，以无菌生理盐水依次进行10倍梯度稀释至10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6，每个梯度分别取100μL菌悬液涂布于加有碳酸钙的MRS平板上，放置于37℃厌氧培养箱中倒置培养，48h后，从不同梯度的涂布的培养平板中挑选有典型溶钙圈的单个菌落转接培养。在此基础上，挑取符合干酪乳杆菌典型特征的菌落进行MRS平板反复划线培养分离，挑取符合干酪乳杆菌菌落生长形态的单菌落接入MRS液态培养基中，于37℃厌氧培养箱中培养。最后获得一株具有良好生长性能的菌株。
1.2.4鼠李糖乳杆菌MiaoTech-11的分离：
在本公司销售的益生菌制剂样品中进行分离纯化。取益生菌制剂4g，置于无菌的50mL离心管中，加入20mL无菌生理盐水，振荡混匀后置于30℃隔水式培养箱中，静置培养过夜，吸取1mL样液，以无菌生理盐水依次进行10倍梯度稀释至10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6，每个梯度分别取100μL菌悬液涂布于MRS平板上，放置于37℃厌氧培养箱中倒置培养，48h后，从不同梯度的涂布的培养平板中挑选菌落转接培养。在此基础上，挑取符合鼠李糖乳杆菌典型特征的菌落进行MRS平板反复划线培养分离，挑取符合鼠李糖乳杆菌菌落生长形态的单菌落接入MRS液态培养基中，于37℃厌氧培养箱中培养。最后获得一株具有良好生长性能的菌株。
1.2.5嗜热链球菌MiaoPro-01的分离：
在本公司销售的酸奶发酵剂样品中进行分离纯化。取酸奶发酵剂样品4g，置于无菌的50mL离心管中，加入20mL无菌生理盐水，振荡混匀后置于30℃隔水式培养箱中，静置培养过夜，吸取1mL样液，以无菌生理盐水依次进行10倍梯度稀释至10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6，每个梯度分别取100μL菌悬液涂布于MRS平板上，放置于37℃厌氧培养箱中倒置培养，48h后，从不同梯度的涂布的培养平板中挑选菌落转接培养。在此基础上，挑取符合嗜热链球菌典型特征的菌落进行MRS平板反复划线培养分离，挑取符合嗜热链球菌菌落生长形态的单菌落接入MRS液态培养基中，于37℃厌氧培养箱中培养。最后获得一株具有良好生长性能的菌株。
1.2.5双歧杆菌菌株的分离
取婴儿粪便样品5-10g，置于无菌的50ml离心管中，加入20ml无菌生理盐水，振荡混匀后置于37℃厌氧培养箱中，静置培养过夜，吸取1ml样液，以无菌生理盐水依次进行10倍梯度稀释至10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6，每个梯度分别取100μl菌悬液涂布于改良MRS平板上，放置于37℃厌氧培养箱中倒置培养，24h后，从不同梯度的涂布的培养平板中挑选菌落转接培养，在此基础上，挑取符合双歧杆菌典型特征的菌落在改良MRS平板上进行反复划线培养分离，挑取符合双歧杆菌菌落生长形态的单菌落接入改良MRS液态培养基中，于37℃厌氧培养箱中培养。最后获得4株具有良好生长性能的双歧杆菌菌株。
1.3菌株的鉴定
1.3.1菌落形态与生理生化实验分析
菌落形态和细胞形态观测实验、微生物生化分析实验等参考文献(1)、(2)、(3)和(4)的方法进行：
(1) 凌代文，东秀珠．乳酸细菌分类鉴定及实验方法[M]．北京：中国轻工业出版社，1999；
(2) 李玉峰，唐洁．工科微生物学实验[M]．四川：西南交通大学出版社，2007；
(3) 秦玲玲等．双歧杆菌的分离与培养．齐齐哈尔大学学报. 2008(3)；
(4) 赵笑笑等．婴幼儿粪便中双歧杆菌的分离及其菌株特性研究．工业微生物.2019(2)；
实验结果见表1、表2和表3：
表1 菌落和细胞的形态特征
| 菌株名称 | 菌落形态 | 细胞形态 | 运动性 |
| 植物乳杆菌MiuCul-01 | 白色、圆形、凸起、表面光滑、细密。 | 细胞呈杆状、无芽孢、无夹膜、 | 能运动 |
| 嗜酸乳杆菌MiuLac-01 | 白色、圆形、凸起、表面光滑、细密、具有一定的粘性。 | 细胞呈杆状、无芽孢、无夹膜、 | 不运动 |
| 干酪乳杆菌MiaoTech-01 | 白色、圆形、凸起、表面光滑、湿润、边缘整齐、 | 细胞呈杆状、无芽孢、无夹膜、 | 不运动 |
| 鼠李糖乳杆菌MiaoTech-11 | 白色、圆形、凸起、表面光滑、边缘整齐。 | 细胞呈杆状、无芽孢、无夹膜、 | 不运动 |
| 嗜热链球菌MiaoPro-01 | 米白色、圆形、凸起、菌落偏小、湿润、边缘整齐。 | 细胞呈球状、常成对聚合形成约0.7至0.9微米的长链、无芽孢、无夹膜、 | 不运动 |
| 两歧双歧杆菌Miuyo-01 | 菌落光滑，凸圆，边缘完整，呈乳脂状白色，闪光，质地柔软。 | 细胞呈现Y字型、V字型、弯曲状、刮勺状等，末端常出现分叉，无芽孢、无夹膜。 | 不运动 |
| 乳双歧杆菌Miuyo-11 | 菌落光滑，凸圆，边缘完整，呈乳脂状白色，闪光，质地柔软。 | 细胞呈现Y字型、V字型、弯曲状、刮勺状等，末端常出现分叉，无芽孢、无夹膜。 | 不运动 |
| 婴儿双岐杆菌Miuyo-21 | 菌落光滑，凸圆，边缘完整，呈乳脂状白色，闪光，质地柔软。 | 细胞呈现Y字型、V字型、弯曲状、刮勺状等，末端常出现分叉，无芽孢、无夹膜。 | 不运动 |
| 短双岐杆菌Miuyo-31 | 菌落光滑，凸圆，边缘完整，呈乳脂状白色，闪光，质地柔软。 | 细胞呈现Y字型、V字型、弯曲状、刮勺状等，末端常出现分叉，无芽孢、无夹膜。 | 不运动 |
乳酸杆菌是革兰氏阳性杆菌，属于厌氧菌，细胞呈杆状、细长形，但无分枝。无芽孢、无夹膜、菌落圆形、白色（有时黄色）、半透明、光滑形凸起，边缘整齐。
双歧杆菌是革兰氏阳性杆菌，属于严格的厌氧菌。不运动、细胞呈一端有分叉的杆状。菌落光滑、凸圆、边缘完整、乳脂呈白色、闪光并有柔软质地。
表2 菌株的生化分析结果
| 菌株名称 | 明胶液化试验 | H2O2酶活性试验 | 硝酸盐还原实验 | 吲哚反应 | 革兰氏染色 |
| 植物乳杆菌MiuCul-01 | － | － | － | － | ＋ |
| 嗜酸乳杆菌MiuLac-01 | － | － | － | － | ＋ |
| 干酪乳杆菌MiaoTech-01 | － | － | － | － | ＋ |
| 鼠李糖乳杆菌MiaoTech-11 | － | － | － | － | ＋ |
| 嗜热链球菌MiaoPro-01 | － | － | － | － | ＋ |
| 两歧双歧杆菌Miuyo-01 | － | － | － | － | ＋ |
| 乳双歧杆菌Miuyo-11 | － | － | － | － | ＋ |
| 婴儿双岐杆菌Miuyo-21 | － | － | － | － | ＋ |
| 短双岐杆菌Miuyo-31 | － | － | － | － | ＋ |
注：“＋”为阳性；“－”为阴性。
表3 糖类发酵试验
| 菌株名称 | 葡萄糖 | 蔗糖 | 果糖 | 麦芽糖 | 乳糖 | 棉籽糖 | 木糖 | 海藻糖 | 纤维二糖 | 山梨醇 | 甘露醇 |
| 植物乳杆菌MiuCul-01 | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ |
| 嗜酸乳杆菌MiuLac-01 | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ | － | ＋ | ＋ | － | － |
| 干酪乳杆菌MiaoTech-01 | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ | － | － | ＋ | ＋ | － | － |
| 鼠李糖乳杆菌MiaoTech-11 | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ | － | － | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ |
| 嗜热链球菌MiaoPro-01 | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ | － | － | － | － |
| 两歧双歧杆菌Miuyo-01 | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ | － | － | － | － | － | － |
| 乳双歧杆菌Miuyo-11 | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ | － | － | － | － | － |
| 婴儿双岐杆菌Miuyo-21 | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ | － | － | － | － | － |
| 短双岐杆菌Miuyo-31 | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ | － | － | － | － | － |
注：“＋”为阳性；“－”为阴性。
乳酸杆菌和双歧杆菌大部分都能发酵葡萄糖、蔗糖、果糖、麦芽糖、乳糖等；发酵葡萄糖时都产酸、不产气；大部分乳酸杆菌能发酵棉籽糖、木糖、海藻糖、纤维二糖、山梨醇、甘露醇等；大部分双歧杆菌不能发酵棉籽糖、木糖、海藻糖、纤维二糖、山梨醇、甘露醇等。
1.3.2 16S rRNA部分序列分析
将筛选菌株的基因组DNA进行PCR扩增，用1％琼脂糖进行凝胶电泳检测。使用细菌通用引物27F(5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’)，1492R(5’GGTTACCTTGTTCGACTT-3’)进行PCR扩增，纯化后测序，得到的PCR产物序列，并进行菌种鉴定。
综合菌落形态分析、生理生化实验分析和16S rRNA部分序列分析的结果，将本发明分离纯化所得到的9个菌株分别鉴定为：植物乳杆菌、嗜酸乳杆菌、干酪乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、嗜热链球菌、两歧双歧杆菌、乳双歧杆菌、婴儿双岐杆菌、短双岐杆菌，并分别命名为“植物乳杆菌MiuCul-01”、“嗜酸乳杆菌MiuLac-01”、“干酪乳杆菌MiaoTech-01”、“鼠李糖乳杆菌MiaoTech-11”、“嗜热链球菌MiaoPro-01”、“两歧双歧杆菌Miuyo-01”、“乳双歧杆菌Miuyo-11”、“婴儿双岐杆菌Miuyo-21”、“短双岐杆菌Miuyo-31”。
实施例2 菌株的特性
2.1 产品中活菌数的测定方法
本发明使用的菌株共9只，分为“乳酸杆菌”和“双歧杆菌”两大类，用灭菌生理盐水梯度稀释至一定倍数后，乳酸杆菌和双歧杆菌分别采用MRS琼脂培养基倾注法和改良MRS琼脂培养基平板倾注法，37℃培养48h后计菌落总数。
2.2在不同pH下的生长情况
将经过活化的上述9株菌种分别接种于MRS液体培养基和改良MRS液体培养基中，培养后得到菌种种子液，取1mL种子液接种于19mL pH分别为6.0、6.5、7.0和7.5的MRS液体培养基和改良MRS液体培养基中，在37℃下厌氧培养24h，测定初始和结束后的OD600值(即在600nm波长处的吸光度值，通常可以用来比较培养液中的菌体细胞密度或菌体生长情况)。以生长速度最大时的pH作对照（乳酸杆菌为pH6.0，而双歧杆菌为pH7.0），测定OD600值，即分别以pH6.0和pH7.0时培养的菌数为100%计，按照下列公式计算不同pH培养基中的菌体生长情况：
菌体生长情况(%)＝(其它pH培养的OD)/最适pH培养的OD×100%。
结果见表4：
表4 各菌种在不同pH培养基中的生长情况
结果如表4所示：在初始pH6.0、6.5和7.5的培养基中培养得到的乳酸菌，与最适pH的培养基培养的乳酸菌OD值相比，有一定程度的降低，但与不进行培养的空白对照组比较，仍然具有较高的生长速率；而对双歧杆菌而言，其最适pH为pH7.0，
将上述在最适pH条件培养的各菌种，经过离心分离、磷酸缓冲液(PBS)洗涤2次后用PBS重悬。取1mL重悬液分别与9mL pH2.0、2.5、3.0人工胃液混合，在37℃处理3h，然后分别测定处理前后的益生菌总数。
以未经人工胃液处理的菌数作对照，按照下列公式计算人工胃液处理前后的存活率：
存活率(%)＝(处理前的菌数-处理后的菌数)/处理前的菌数×100%。
结果见表5：
表5 各菌种在不同pH人工胃液处理后的存活率
结果如表5所示：
在pH6.0培养得到的乳酸杆菌菌体，经过不同pH的人工胃液处理后，存活率为75%以上，仍然具有较高的存活率，因此，能够在正常的食用条件下以活菌形式进入肠道。
在pH7.0培养得到的双歧杆菌菌体，经过不同pH的人工胃液处理后，存活率为30-40%之间，存活率较低。因此，通常需要采取包衣的形式才能在正常的食用条件下以活菌形式进入肠道。
双歧杆菌菌种在pH6.0-7.5之间的环境下培养生长良好，最适pH为7.0。在pH7.0培养得到的菌体，置于pH2.0的人工胃液中3h的存活率低于40%。
2.3 在不同温度下的生长情况
将经过活化的各菌种分别接种于MRS液体培养基和改良MRS液体培养基中，培养后得到菌种种子液，取1mL各菌种种子液分别接种于19mL pH为7.0的MRS液体培养基和改良MRS液体培养基中，分别在31℃、34℃、37℃、40℃的温度下厌氧培养24h，测定初始和结束后的OD600值。
以最适生长温度时的OD600值作对照(即以生长速度最大时培养的菌数为100%计)，按照下列公式计算不同温度的菌体生长情况：
菌体生长情况(%)＝其它温度时培养的菌数/最适生长温度时培养的菌数×100%。
各菌种不同温度下的生长情况见表6：
表6 各菌种在不同温度下的生长情况
根据表6的实验结果，可以得出如下的结论：
根据实验，植物乳杆菌的最适生长温度为34℃，嗜热链球菌的最适生长温度为45℃；其余乳酸杆菌和各种双歧杆菌的最适生长温度均为37℃，具有与人体体温类似的最适生长温度。大部分菌种在31～40℃温度环境下也生长良好，具有在良好的耐温性；
综上所述：本发明所分离纯化的上述9种菌株大多数在pH7.0时生长良好，在pH6.0-7.5之间仍然有一定的生长速度；大多数菌株的最适生长温度为37℃, 在31-40℃之间仍然有一定的生长速度。部分嗜热或嗜酸的菌株，例如嗜热链球菌、植物乳杆菌、嗜酸乳杆菌等，虽然其最适生长pH和最适生长温度可能不在pH7.0和37℃，但这些菌株在pH7.0和37℃仍然具有较高的生长速度，在多菌种混菌培养时，采用大多数菌株的最适生长条件（pH7.0和37℃）时，这些菌株仍然具有一定的生长速度。因此，本发明的菌种发酵条件为pH7.0和37℃，这样可以保证大部分菌种能达到最适生长条件，而未达到最适生长条件的少量菌种也能有较良好的生长速度。
2.4 复合菌株的功能效果
本发明的复合菌株是由：嗜酸乳杆菌MiuLac-01、干酪乳杆菌MiaoTech-01、鼠李糖乳杆菌MiaoTech-11、植物乳杆菌MiuCul-01、嗜热链球菌MiaoPro-01等5株乳酸杆菌；两歧双歧杆菌Miuyo-01、乳双歧杆菌Miuyo-11、婴儿双岐杆菌Miuyo-21和短双岐杆菌Miuyo-31等4株双歧杆菌等共计9株益生菌组成，因而，复合菌株也具有各种乳酸杆菌和双歧杆菌所具有的功能效果。本发明通过各种功能实验，确认了复合菌株的功能效果。
2.4.1 植物乳杆菌的抗幽门螺杆菌效果
参考文献的方法（喻钢等. 体外拮抗幽门螺杆菌抑菌方法的研究. 药物分析杂志. 2014 (10)），采用体外抑菌试验(打孔法)进行植物乳杆菌的抗幽门螺杆菌实验。
2.4.2嗜酸乳杆菌的降血糖效果
参考文献的方法（朱运平等. 产α-葡萄糖苷酶抑制剂菌株筛选及固态发酵条件优化.食品工业科技. 2014(3)），测定了嗜酸乳杆菌的α-葡萄糖苷酶抑制率，从而推测其具有降血糖作用，在此基础上，进一步采用人体试验确认了其降血糖的效果。
2.4.3干酪乳杆菌的调理肠胃功能效果
参考文献的方法（范治云等. 全蝎保健酒的增强免疫力功能研究. 食品研究与开发. 2017(19)），采用人体试验的方法，确认了干酪乳杆菌的调理肠胃功能的效果。
2.4.4鼠李糖乳杆菌和嗜热链球菌的增加人体免疫力的功能效果
参考文献的方法（范治云等. 全蝎保健酒的增强免疫力功能研究. 食品研究与开发. 2017(19)），采用小鼠NK细胞活性和对ConA诱导的小鼠脾淋巴细胞转化反应，确认了鼠李糖乳杆菌和嗜热链球菌具有增加人体免疫力功能的效果。
2.4.5复合双岐杆菌的抗过敏效果
参考文献的方法（刘志刚等. Balb/c小鼠花生过敏模型的建立及发病机理. 深圳大学学报理工版. 2012(2)），采用小鼠试验测定复合双岐杆菌的抗过敏效果。
2.4.6复合双岐杆菌的增加免疫力效果
参考文献的方法（范治云等. 全蝎保健酒的增强免疫力功能研究. 食品研究与开发. 2017(19)），采用人体试验的方法，确认了复合双岐杆菌增加免疫力的功能效果。
2.4.7复合双岐杆菌的降血糖效果
参考朱运平的方法（朱运平等.产α-葡萄糖苷酶抑制剂菌株筛选及固态发酵条件优化.食品工业科技.2014(3)），测定其α-葡萄糖苷酶抑制率，并采用人体试验确认了其降血糖的效果。
2.4.4复合双歧杆菌的降脂减肥效果
参考文献的方法（李建新等.苹果多酚的减肥降脂作用研究.食品科学. 2008(8)），采用小鼠试验测定其降脂减肥效果。
实验结果见表7：
表7 各菌株的功效实验方法及结果（具体数据见实施例7、8、9、10）
| 试验方法 | 试验结果 |
| 体外抑菌试验(打孔法)；人体实验。 | 体外实验和人体实验菌表明复合益生菌具有良好的抗幽门螺杆菌效果。 |
| 采用小鼠试验测定血清中总IgE抗体含量。 | 与对照组相比有显著差异，具有良好的抗过敏效果。 |
| 小鼠NK细胞活性和对ConA诱导的小鼠脾淋巴细胞转化反应。 | 与对照组相比有显著差异，具有增加人体免疫力功能的效果。 |
| α-葡萄糖苷酶抑制测定；降低人体空腹血糖和餐后血糖实验 | 体外实验具有良好的α-葡萄糖苷酶抑制效果；人体实验具有良好的降低人体空腹血糖和餐后血糖的效果。 |
| 小鼠体重测定、李氏指数测定、血脂测定等。 | 与对照组相比有显著差异，具有降低体重、降低血脂效果。 |
实施例3 液态法制备的复合益生菌原粉及其制剂
本发明所使用的菌种包括：
植物乳杆菌MiuCul-01、嗜酸乳杆菌MiuLac-01、干酪乳杆菌MiaoTech-01、鼠李糖乳杆菌MiaoTech-11、“嗜热链球菌MiaoPro-01等5种乳酸杆菌；
两歧双歧杆菌Miuyo-01、乳双歧杆菌Miuyo-11、婴儿双岐杆菌Miuyo-21、短双岐杆菌Miuyo-31等4种双歧杆菌。
上述9株菌种可分为乳酸杆菌和双歧杆菌两大类，两类菌种的生长的最适条件略有不同：乳酸杆菌能在偏酸性的培养基中生长，而双歧杆菌一般在中性的培养基中才能良好的生长；大多数菌种的最适生长条件均为37℃，但植物乳杆菌的最适生长温度略低，约为33-34℃，而嗜热链球菌的最适生长温度偏高，大约为45℃左右。
在复合益生菌的混菌培养过程中，为了能最大限度的获得益生菌总数，本发明采用中性pH的培养基、在37℃的培养温度，并在培养基中加入适量乙酸钠、碳酸钙等pH调节剂，确保大部分菌种都能正常的生长。虽然在37℃的培养温度可能不是植物乳杆菌和嗜热链球菌的最适温度，但这两种菌在37℃仍然有一定的生长量。这9种菌都需要在厌氧的环境下进行培养，但对氧气的耐受量也是不同的，相对而言乳酸杆菌较双歧杆菌更耐微量的氧气，因此，当它们混菌培养时，培养前期乳酸杆菌可能会生长得好一些，但后期随着氧气的逐步消耗，在培养的后期双歧杆菌的生长可能会更快一些。为了尽量减少培养基中的氧气，本发明采用的培养基是更适合双歧杆菌生长的改良MRS培养基，即在MRS培养基中加入了L-半胱氨酸盐酸盐0.5g/L。
3.1 培养基
(1) 改良MRS固体培养基(用于斜面培养和平板培养，在分离和保存菌种时使用)：
葡萄糖20g/L，蛋白胨10g/L，牛肉浸膏10g/L，酵母浸膏5g/L，琼脂15g/L，K2HP042g/L，柠檬酸氢二铵2g/L，乙酸钠5g/L，Tween-80 1g/L，MgS04.7H20 0.5g/L，MnS04.4H200.05g/L，L-半胱氨酸盐酸盐0.5g/L。
用1 mol/L NaOH调节pH为7.0，121℃高温杀菌20min，冷却到40℃左右倒斜面或平板。
(2) 改良MRS液体培养基（用于三角瓶培养和发酵罐培养）：
葡萄糖粉20g/L，蛋白胨粉10g/L，牛肉浸膏10g/L，酵母浸膏5g/L，乳清粉10g/L，番茄酱10g/L，K2HP04 2g/L，柠檬酸氢二铵2g/L，乙酸钠5g/L，Tween-80 1g/L，MgS04.7H200.5g/L，MnS04.4H20 0.05g/L，L-半胱氨酸盐酸盐0.5g/L。
用1 mol/L NaOH调节pH为7.0，121℃高温杀菌20min。
3.2 液态法复合益生菌制备方法
本制法属于传统的益生菌制备方法，在此用作本专利的对照，是采用液态培养、离心分离后直接干燥得到的产品，没有经过固态培养，其制法包括以下步骤：
(1) 菌种培养
使用上述改良MRS固体培养基进行复合益生菌菌种的斜面培养或平板培养，使用的菌种为上述的9株益生菌菌株组成的复合益生菌。
（2）三角瓶培养或菌种罐培养：
将斜面或平板培养得到的各菌种分别接种于三角瓶改良MRS液体培养基中，于厌氧培养箱中在37℃下培养24h得到三角瓶液体菌种。
（3）液态培养：
按照“某种菌种液:液体培养基=1:100”的比例接种上述5种菌种，全部接种于发酵罐，这样总接种量为5:100，在发酵罐中37℃下厌氧液态培养24h，获得菌体培养液。
（4）离心分离：
将上述液态培养液用管式离心机或碟式离心机进行分离，离心机转速为10000r/min，离心时间为20min，得到湿菌体，水分含量为80%。
（5）干燥
将湿菌体置于冷冻干燥机中在-40℃冷冻干燥20h即得到液态法复合益生菌原粉；经测定：本发明制备所得的复合益生菌原粉产品，其总菌数为3.63×1011CFU/g。
（6）造粒、包衣和包装。
在益生菌原粉中加入适量的辅料（如：海藻糖、脱脂奶粉等），即得到液态法制备的复合益生菌制剂产品；
经测定：本实例所制备的复合益生菌产品，其总菌数为3.15×1011CFU/g。
实施例4固态法制备的复合益生菌原粉及其制剂 (固态法1)
4.1 培养基
(1) 改良MRS固体培养基（用于斜面培养和平板培养）：
葡萄糖20g/L、蛋白胨10g/L、牛肉浸膏10g/L、酵母浸膏5g/L、琼脂15g/L、K2HP042g/L、柠檬酸氢二铵2g/L、乙酸钠5g/L、Tween-80 1g/L、MgS04·7H20 0.5g/L、MnS04·4H200.05g/L，L-半胱氨酸盐酸盐0.5g/L。用1 mol/L NaOH调节pH为7.0，121℃高温杀菌20min。
(2) 改良MRS液体培养基（用于三角瓶培养和发酵罐培养）：
葡萄糖20g/L、蛋白胨10g/L、牛肉浸膏10g/L、酵母浸膏5g/L、乳清粉10g/L、番茄酱10g/L、K2HP04 2g/L、柠檬酸氢二铵2g/L、乙酸钠5g/L、Tween-80 1g/L、MgS04·7H20 0.5g/L、MnS04·4H20 0.05g/L，L-半胱氨酸盐酸盐0.5g/L。用1 mol/L NaOH调节pH为7.0，121℃高温杀菌20 min。
(3) 固体培养的培养基（用于固态培养）：
按照下列配方的比例准备固态培养的原料：
湿菌体100g、葡萄糖20g、蛋白胨粉10g、酵母浸出物粉10g、乳清粉10g、番茄粉10g、K2HP04 2g、L-半胱氨酸盐酸盐0.5g/L，食品级碳酸钙2g。
除了湿菌体外，其余各种原料分别杀菌（分别用高温瞬时杀菌设备在150℃杀菌10s），冷却后无菌混合均匀，作为固态培养基的原料备用。
4.2 菌剂的制备方法
本发明的复合益生菌菌剂的制备方法，包括以下步骤：
（1）菌种培养：
使用上述改良MRS固体培养基进行菌种的斜面培养或平板培养。
（2）三角瓶培养或菌种罐培养：
将斜面或平板培养得到的菌种接种于三角瓶改良MRS液体培养基中，于厌氧培养箱中在37℃下培养24h得到三角瓶液体菌种，
（3）液态培养：
采用上述三角瓶液体菌种或种子罐液体菌种接种于发酵罐，在发酵罐中37℃下厌氧液态培养24h，获得菌体培养液；
（4）离心分离：
将上述液态培养液用管式离心机或碟式离心机进行分离，离心机转速为10000r/min，离心时间为20min，得到湿菌体，水分含量为80%；立即将湿菌体转入固态培养基培养；
（5）固态培养：
在无菌室按照配方将上述湿菌体与无菌的固态培养基混合，其配方为：
湿菌体100g、葡萄糖20g、蛋白胨粉10g、酵母浸出物粉10g、乳清粉10g、番茄粉10g、K2HP04 2g、L-半胱氨酸盐酸盐0.5g/L，食品级碳酸钙2g，控制固体培养基的水分含量为50%-55%。然后置于厌氧固态发酵罐中，在37℃下密封厌氧固态培养72h。
（6）干燥：
在-40℃下冷冻干燥20h，即得到复合益生菌原粉。
经测定：本发明制备所得的复合益生菌原粉产品，其总菌数为5.82×1011CFU/g。
（7）造粒、包衣和包装。
将复合益生菌原粉造粒、包衣，即得到复合益生菌制剂产品。
经测定：本实例所制备的复合益生菌制剂产品，其总菌数为5.25×1011CFU/g。
实施例5 固态法制备的复合益生菌制剂 (固态法2)
实施例5的工艺操作与实施例4基本相同，仅更改部分操作参数，用于说明在不同的操作条件下生产的固态培养复合益生菌产品的效果。
5.1 培养基
实施例4的固体培养基未加乳清粉，其他同实施例4。
5.2 菌剂的制备方法
实施例5控制固体培养基的水分含量为52%，在37℃下密封厌氧固态培养96h。采用冷冻干燥方法对固体培养物进行干燥，其他步骤同实施例4，分别制成原粉产品和制剂产品。
经测定：本实施例所制备的复合益生菌原粉产品总菌数为6.76×1011CFU/g；将其制成制剂所得到的制剂产品的总菌数为5.86×1011CFU/g。
实施例6固态法制备的复合益生菌制剂 (固态法3)
6.1培养基
实施例6培养基同实施例4。
6.2菌剂的制备方法
三角瓶培养、液体培养和固体培养的温度为37℃，控制固体培养基的水分含量为55%，在37℃下密封厌氧固态培养120h，其他参数同实施例4，分别制成原粉产品和制剂产品。
经测定：本实施例所制备的复合益生菌原粉产品总菌数为6.21×1011CFU/g；将其制成制剂所得到的制剂产品的总菌数为6.35×1011CFU/g。
本发明的制备方法中，若发酵罐培养基较大，可将三角瓶液体菌种再接种于1-3级菌种罐中扩大培养，从而获得用于发酵罐的液体菌种，小规模培养则直接只用三角瓶培养的菌种进行接种。
此外，为比较液态法与固态法之间的差异，实施例4还做了一个未经制剂的液态法产品，干燥后称为原粉。
实施例7复合益生菌的抗幽门螺杆菌功能效果
参考文献的方法（喻钢等. 体外拮抗幽门螺杆菌抑菌方法的研究. 药物分析杂志. 2014 (10)），采用体外抑菌试验(打孔法)进行植物乳杆菌的抗幽门螺杆菌实验。
7.1.1 相同重量浓度下产品的抗幽门螺杆菌效果对比
分别称取上述各组样品各1g，加入10mL无菌水，配成0.1g/mL的益生菌溶液，备用。
用测量抑菌环直径大小，判断复合益生菌对HP的抑菌效果，结果以“平均值±标准差”来表示，结果见表8：
表8 相同重量浓度下不同工艺生产的复合益生菌产品的抗幽门螺杆菌效果
如表8所示：
对于复合益生菌原粉产品，本发明实施例4采用固态法所制备的复合益生菌原粉的抑菌圈较实施例3采用液态法所制备的益生菌原粉的抑菌圈更大。
对于益生菌制剂产品，本发明实施例4、5、6采用固态法所制备的益生菌制剂的抑菌圈比采用液态法所制备的益生菌制剂的抑菌圈更大；采用SPSS 24.0软件对实验数据进行单因素方差分析(ANOVA)，用LSD法进行多重比较，以P<0.05为差异显著性判断标准，结果表明本发明制备方法所得菌剂的抗幽门杆菌效果，较液态法有显著性差异，说明通过本发明的制备方法得到的抗幽门螺杆的益生菌菌剂的效果更明显。
7.1.2 相同菌数时复合益生菌产品的抗幽门螺杆菌效果对比
分别称取复合益生菌成品1g，加入适量无菌水，经菌数测定后，加入无菌水调整复合益生菌总数浓度为1x1010CFU/ml，每次服用10ml，故每次服用的复合益生菌总数为10x1010CFU，即1x1011CFU。
抗幽门螺杆菌的实验方法见7.1.1。
测量抑菌环直径大小，判断复合益生菌对HP的抑菌效果，结果以“平均值±标准差”来表示。结果见表9：
表9 相同菌数时复合益生菌产品的抗幽门螺杆菌效果
如表9所示，当制剂中含有相同菌数时，4、5、6制备所得的菌剂的抑菌圈较利用液态法所得菌剂的抑菌圈更大；采用t检验，P＜0.05，本发明制备方法所得菌剂的抗幽门杆菌效果，较液态法有显著性差异。
复合益生菌对于幽门螺杆菌的抑制作用，如果仅仅是活菌的效果，那么当采用相同的菌数时应该具有大致相同的抑制效果，但表10的结果表明：与液态法所制备的复合益生菌菌剂相比，本发明的实施例4、5、6采用固态法制备的复合益生菌菌剂的抑菌圈更大，说明其抗幽门螺杆菌的效果更明显。液态法在制备过程中由于离心分离去除了液态培养过程所产生的代谢产物，所以其抑菌效果主要来自于菌种本身；而本发明制备所得菌剂中除了含有复合益生菌具体外，还含有固态培养过程中所产生的细菌素、有机酸等代谢产物，复合益生菌与代谢产物协同增效，提高了菌剂整体的抗幽门螺杆菌效果。
7.1.3 复合益生菌制剂治疗幽门杆菌感染的效果
将180名被诊断患有幽门螺杆菌感染的患者随机分成6组，每组30名。
空白对照组或安慰剂组采用未加药的空白淀粉片进行治疗，每天2次，每次1袋，每袋2克，持续4周。
阳性实验组采用标准三联疗法治疗，奥美拉唑(0.8mg/kg.d)胶囊、阿莫西林(50mg/kg.d)、克林霉素(15mg/kg.d)治疗2周，两周后停用抗生素，继续服用奥美拉唑2周，总疗程4周。
液态法对照组采用传统的液态培养法制备复合益生菌，经离心分离后干燥制备的复合益生菌菌体制剂，进行治疗，每天3次，每次1袋，每袋2克，持续4周。
实施例组共分3组，分别口服实施例1-3中的制剂进行治疗，每天3次，每次1袋，每袋2克，持续4周。
用药期间通过问诊来确定是否有不良反应。停药两周后，通过14C-尿素呼气试验来评估治愈情况。结果见表10：
表10 不同工艺生产的复合益生菌对幽门螺杆菌感染的治疗效果
| 实施例 | 治疗人数(人) | 治愈人数(人) | 有效(人) | 无效(人) | 总有效率(%) |
| 空白对照 | 30 | 0 | 0 | 30 | 0 |
| 阳性对照 | 30 | 18 | 8 | 4 | 86.7 |
| 实施例3 (液态法对照) | 30 | 16 | 7 | 7 | 76.7 |
| 实施例4(固态法1) | 30 | 20 | 6 | 4 | 86.7 |
| 实施例5(固态法2) | 30 | 23 | 6 | 1 | 96.7 |
| 实施例6(固态法3) | 30 | 21 | 5 | 4 | 86.7 |
说明：病人症状完全消失为治愈；症状有好转的为有效；症状没有好转的为无效。
由表10可知，与传统的液态法制备所得菌剂相比，本发明的实施例4、5、6的复合益生菌菌剂对幽门杆菌的总有效率更高，说明本发明制备的菌剂对抗幽门杆菌的效果更显著。
实施例8 复合益生菌的抗敏效果
参考文献的方法（刘志刚等. Balb/c小鼠花生过敏模型的建立及发病机理. 深圳大学学报理工版. 2012(2)），采用小鼠试验测定复合双岐杆菌的抗过敏效果，方法如下：
8.1 实验方法
一、实验材料：
试验动物：选用SPF级Balb/c雌性小鼠，5-6周龄(体重18-20g)，共120只，随机分为8组，每组15只。
花生粗蛋白(crude peanut extract protein，CPE)，按文献的方法自制。
磷酸缓冲盐溶液(PBS)，pH 7.2～7.4。
二、试验方法：
1、剂量与分组：
每组小鼠分别用空白对照组(不致敏和也不用益生菌治疗)、模型组或阳性对照组(用花生粗蛋白致敏、不用复合益生菌制剂治疗)、其余各组均用花生组蛋白致敏，且均使用本发明制备得到的复合双歧杆菌制剂进行灌胃治疗，其复合双歧杆菌用量分别为：液态法对照组(实施例3)、本发明的固态法实验组实施例4、实施例5、实施例6，剂量均为0.1g/ml，详见表8。每日2次，所有小鼠连续服用10天。
2、小鼠的致敏和激发：
先分出10只小鼠作为空白对照组，空白对照组采用PBS缓冲溶液注射，不致敏；其余所有小鼠均采用花生粗蛋白溶液注射致敏，然后选出过敏的小鼠，将其随机分组，每组10只，多余的小鼠废弃不用。每日按表6的样品和剂量用益生菌溶液对过敏小鼠进行灌胃治疗，连续灌胃10天，阴性对照组和阳性对照组用无菌纯净水灌服。
Balb/c小鼠分为空白对照组和花生致敏模型组(简称模型组，为阳性对照组)，每组10只，致敏方式：模型组皮下注射致敏两次，间隔3周，每次注射100μg花生粗蛋白和1mg氢氧化铝佐剂；第2次免疫1周后，皮下注射200μg CPE进行激发，PBS对照组用相同体积溶液的PBS溶液代替花生粗蛋白，其它与模型组相同。
3、血清中总IgE抗体的检测：
复合双歧杆菌制剂喂养实验结束后，将各剂量组小鼠取血，室温静置2h后，于4000r/min离心10min，小心取出上层血清。血清中总IgE抗体的含量采用ELISA试剂进行检测，参照产品说明书进行。
8.2 相同重量浓度下产品的抗过敏效果对比
分别称取上述各组样品各1g，加入10mL无菌水，配成0.1g/mL的益生菌溶液，备用。
测量血清中总IgE抗体的含量，测定结果以“平均值±标准差”表示。本实验采用SPSS 24.0软件对实验数据进行单因素方差分析(ANOVA)，用LSD法进行多重比较，以P<0.05为差异显著性判断标准，结果见表11：
表11 相同重量浓度下不同工艺生产的复合益生菌产品的抗过敏效果
| 产品 | 益生菌剂量 | IgE(ng/ml) | P值 |
| 模型组(阳性对照) | 0 | 916±13 | － |
| 空白对照组(阴性对照) | 0 | 786±6 | 0.000** |
| 实施例3原粉 | 0.1g/ml | 888±11 | 0.032* |
| 实施例4原粉 | 0.1g/ml | 881±12 | 0.010** |
| 实施例3制剂 | 0.1g/ml | 882±18 | 0.012* |
| 实施例4制剂 | 0.1g/ml | 875±21 | 0.003** |
| 实施例5制剂 | 0.1g/ml | 851±15 | 0.000** |
| 实施例6制剂 | 0.1g/ml | 863±16 | 0.000** |
实验结果如表11所示：
IgE介导的过敏反应是引起过敏的主要原因，血清中IgE抗体是过敏反应发生的关键作用因子。从空白对照组和模型组小鼠血清中总IgE抗体含量可以看出小鼠IgE变化与过敏症状是对应的，即空白小鼠的血清IgE抗体含量较低，而模型组小鼠的血清IgE抗体含量很高。而经过益生菌灌胃治疗后，各个益生菌治疗组均表现出良好的治疗过敏的效果。
当制剂中含有相同重量浓度的益生菌时，益生菌实施例3、4、5、6制备所得的菌剂的IgE较空白对照组的IgE值更大，具有显著差异；而固态法制备所得菌剂（实施例4、5、6）的抗过敏效果比液态法（实施例3）更好，都具有非常显著的差异。因此，由固态法制备的实例4、实例5、实例6所生产的复合双歧杆菌制剂对减少小鼠的过敏症状具有特别显著的效果。
益生菌制剂产品与益生菌原粉产品相比，其抗过敏效果略差，其原因可能是益生菌在制剂过程中会略有损失造成的，但制剂产品更方便人们服用。
8.3 相同菌数时产品的抗过敏效果对比
分别称取益生菌成品1g，加入适量无菌水，经菌数测定后，加入无菌水调整益生菌总数浓度为1x1010CFU/ml，每次服用10ml，故每次服用的复合益生菌总数为10x1010CFU，即1x1011CFU。
抗过敏的实验方法见8.1。
测量血清中总IgE抗体的含量，测定结果以“平均值±标准差”表示。本实验采用SPSS 24.0软件对实验数据进行单因素方差分析(ANOVA)，用LSD法进行多重比较，以P<0.05为差异显著性判断标准，结果见表12：
表12 相同菌数时复合益生菌产品的抗过敏效果
| 产品 | 益生菌剂量 | IgE(ng/ml) | P值 |
| 模型组(阳性对照) | 0 | 916±13 | － |
| 空白对照组(阴性对照) | 0 | 786±6 | 0.000** |
| 实施例3原粉 | 1x1011CFU | 902±14 | 0.159 |
| 实施例4原粉 | 1x1011CFU | 888±11 | 0.009** |
| 实施例3制剂 | 1x1011CFU | 899±9 | 0.092* |
| 实施例4制剂 | 1x1011CFU | 892±15 | 0.022** |
| 实施例5制剂 | 1x1011CFU | 876±13 | 0.001** |
| 实施例6制剂 | 1x1011CFU | 889±9 | 0.012** |
如表12所示，当制剂中含有相同菌数时，复合益生菌实施例3、4、5、6制备所得的菌剂的IgE较空白对照组的IgE值更大，具有显著差异；而固态法制备所得菌剂（实施例4、5、6）的抗过敏效果比液态法（实施例3）更好，都具有非常显著的差异。因此，由固态法制备的实例4、实例5、实例6所生产的复合双歧杆菌制剂对减少小鼠的过敏症状具有特别显著的效果。复合益生菌制剂产品与复合益生菌原粉产品相比，其抗过敏效果略差。
复合益生菌的抗过敏作用，如果仅仅是活菌的效果，那么当采用相同的菌数时应该具有大致相同的抗过敏效果，但表９的结果表明：与液态法所制备的复合益生菌菌剂相比，本发明的实施例4、5、6采用固态法制备的复合益生菌菌剂所产生的IgE值更大，说明其抗过敏的效果更明显。液态法在制备过程中由于离心分离去除了液态培养过程所产生的代谢产物，所以其抗过敏效果主要来自于菌种本身；而本发明制备所得菌剂中除了含有复合益生菌具体外，还含有固态培养过程中所产生的细菌素、有机酸等代谢产物，复合益生菌与代谢产物协同增效，提高了菌剂整体的抗过敏效果。
实例9：复合益生菌的增加免疫力效果对比
9.1复合益生菌制剂对NK细胞活性的影响
9.1.1 实验方法
一、实验材料：
试验动物：选用SPF级昆明种雌性小鼠，6-8周龄(体重18-22g)，共120只，随机分为8组，每组15只。
其它材料：小鼠淋巴瘤细胞(YAC-1)、Hank's液、RPMI1640完全培养液、LDH基质液等。
二、试验方法：
1、剂量与分组：
每组小鼠分别用阴性对照组(纯水)、液态法对照组(实施例3)、本发明的固态法实验组实施例4、实施例5、实施例6，剂量均为0.1g/ml。每日2次，所有小鼠连续服用30天。
2、灌喂方法：
实验时分别取样品用纯净水配制成20ml的样液，分别供动物灌胃使用。动物在实验室条件下适应3天后，随机分组，每日按表4的样品和剂量进行灌胃，连续灌胃30天，对照组灌服无菌纯净水。
3、效应细胞(小鼠脾细胞)的制备：
复合益生菌制剂喂养实验结束后，将各剂量组小鼠无菌取脾，置于盛有适量无菌Hank's液的小平皿中，用镊子轻轻将脾磨碎，制成单细胞悬液。经200目筛网过滤，或用4层纱布将脾磨碎，或用Hank's液洗2次，每次离心10min(1000r/min)。弃上清将细胞浆弹起，加入0.5mL灭菌水20秒，裂解红细胞后再加入0.5mL 2倍Hank’s液及8mL Hank’s液，1000rpm，10min离心，用1mL含10%小牛血清的RPMI1640完全培养液重悬，用1%冰醋酸稀释后计数(活细胞数应在95%以上)，用台酚兰染色计数活细胞数(应在95%以上)，最后用RPMI1640完全培养液调整细胞浓度为2×107个/mL。
4、靶细胞(YAC-1细胞)的传代
实验前24h将靶细胞进行传代培养。应用前以Hank's液洗3次，用RPMI1640完全培养液调整细胞浓度为4×105个/mL。
5、NK细胞活性测定(LDH法)
取浓度为4×105个/ml的靶细胞(YAC-1)和效应细胞(小鼠脾细胞)各100μl(效靶比50:1)，加入U型96孔培养板，靶细胞自然释放孔加靶细胞和培养液各100μl，靶细胞最大释放孔加靶细胞和1% NP40各100μl；上述各项均设3个复孔，于37℃，5%CO2培养箱中培养4小时，然后将96孔培养板以1500 r/min离心5分钟，每孔吸取上清100μl置平底96孔培养板中，同时加入LDH基质液100μl，反应3分钟，每孔加入1mol/L HCl 30μl，在酶联仪492nm处测定光密度值。
按下式计算NK细胞活性：
NK细胞活性(%)=(反应孔OD－自然释放孔OD)/(最大释放孔OD－自然释放孔OD)×100%
受试样品组的NK细胞活性显著高于阴性对照组的NK细胞活性，即可判定该项实验结果阳性。
9.1.2 相同重量浓度下产品的增加免疫力效果对比（对小鼠NK细胞活性的影响）
分别称取上述各组样品各1g，加入10mL无菌水，配成0.1g/mL的益生菌溶液，备用；阴性对照组只用无菌水，不用益生菌。
测量复合益生菌对小鼠NK细胞活性的影响，测定结果以“平均值±标准差”表示。本实验采用SPSS 24.0软件对实验数据进行单因素方差分析(ANOVA)，用LSD法进行多重比较，以P<0.05为差异显著性判断标准，结果见表13：
表13 相同重量浓度下不同工艺生产的复合益生菌产品对小鼠NK细胞活性的影响
| 产品 | 益生菌剂量 | 动物数(只) | NK细胞活性(A,％) | NK细胞活性转换值 | P值 |
| 阴性对照组 | 0 | 15 | 36.3±2.3 | 41.2±1.5 | － |
| 实施例3原粉 | 0.1g/ml | 15 | 42.6±2.6 | 45.3±1.6 | 0.011* |
| 实施例4原粉 | 0.1g/ml | 15 | 44.2±3.2 | 46.3±2.0 | 0.003** |
| 实施例3制剂 | 0.1g/ml | 15 | 42.5±2.1 | 45.2±1.4 | 0.012* |
| 实施例4制剂 | 0.1g/ml | 15 | 43.3±3.6 | 45.7±2.3 | 0.006** |
| 实施例5制剂 | 0.1g/ml | 15 | 49.1±2.3 | 49.4±1.5 | 0.000** |
| 实施例6制剂 | 0.1g/ml | 15 | 47.3±2.2 | 48.3±1.4 | 0.000** |
注：NK细胞活性转换值＝sin-1(A1/2)
如表13所示：
对于益生菌原粉产品，本发明实施例4饲喂固态法所制备的益生菌原粉时的小鼠血清中NK细胞活性，较实施例3饲喂液态法所制备的益生菌原粉更大。
对于益生菌制剂产品，本发明实施例4、5、6饲喂固态法所制备的益生菌制剂时的小鼠血清中NK细胞活性，比饲喂液态法(实施例3)所制备的益生菌制剂更大；本发明饲喂固态法制备菌剂的增加免疫力效果，较液态法有显著性差异，说明通过本发明的制备方法得到的益生菌菌剂增加免疫力的效果更明显。
9.1.3 相同菌数时产品的增加免疫力效果对比（对小鼠NK细胞活性的影响）
分别称取益生菌成品1g，加入适量无菌水，经菌数测定后，加入无菌水调整益生菌总数浓度为1x1010CFU/ml，每次服用10ml，故每次服用的复合益生菌总数为10x1010CFU，即1x1011CFU。
增加免疫力的实验方法见9.1.1。
测量小鼠血清中复合益生菌制剂对小鼠NK细胞活性的影响，测定结果以“平均值±标准差”表示。本实验采用SPSS 24.0软件对实验数据进行单因素方差分析(ANOVA)，用LSD法进行多重比较，以P<0.05为差异显著性判断标准，结果见表14：
表14 相同菌数时复合益生菌产品（对小鼠NK细胞活性的影响）
| 产品 | 益生菌剂量 | 动物数(只) | NK细胞活性(A,％) | NK细胞活性转换值 | P值 |
| 阴性对照组 | 0 | 15 | 36.3±2.3 | 41.2±1.5 | － |
| 实施例3原粉 | 1x1011CFU | 15 | 41.1±2.8 | 44.3±1.8 | 0.037* |
| 实施例4原粉 | 1x1011CFU | 15 | 43.3±2.8 | 45.7±1.8 | 0.005** |
| 实施例3制剂 | 1x1011CFU | 15 | 41.5±2.1 | 44.6±1.3 | 0.024* |
| 实施例4制剂 | 1x1011CFU | 15 | 42.2±3.2 | 45.0±2.0 | 0.013* |
| 实施例5制剂 | 1x1011CFU | 15 | 47.5±2.5 | 50.0±1.5 | 0.000** |
| 实施例6制剂 | 1x1011CFU | 15 | 46.2±2.3 | 47.6±1.5 | 0.000** |
注：NK细胞活性转换值＝sin-1(A1/2)
如表14所示，当制剂中含有相同菌数时，4、5、6制备所得的菌剂对小鼠NK细胞活性的影响更大；本发明采用固态法制备所得菌剂的增强免疫力效果，较液态法有显著性差异。
益生菌的增强免疫力作用，如果仅仅是活菌的效果，那么当采用相同的菌数时应该具有大致相同的增加免疫力效果，但表14的结果表明：与液态法所制备的复合益生菌菌剂相比，本发明的实施例4、5、6采用固态法制备的复合益生菌菌剂对小鼠NK细胞活性的影响更大，说明其增加免疫力的效果更明显。液态法在制备过程中由于离心分离去除了液态培养过程所产生的代谢产物，所以其增加免疫力效果主要来自于菌种本身；而本发明制备所得菌剂中除了含有复合益生菌具体外，还含有固态培养过程中所产生的代谢产物，复合益生菌与代谢产物协同增效，提高了菌剂整体的增加免疫力效果。
9.2复合益生菌制剂对ConA诱导的小鼠脾淋巴细胞转化反应的影响
9.2.1 实验方法
一、实验材料：
试验动物：选用SPF级昆明种雌性小鼠，6-8周龄(体重18-22g)，共105只，随机分为7组，每组15只。
其它材料：Hank's液、RPMI1640完全培养液等。
二、试验方法：
1、剂量与分组：
每组小鼠分别用阴性对照组(纯水)、液态法对照组(实施例3)、本发明的固态法实验组实施例4、实施例5、实施例6，剂量均为0.1g/ml。每日2次，所有小鼠连续服用30天。
2、灌喂方法：
实验时分别取样品用纯净水配制成20ml的样液，分别供动物灌胃使用。动物在实验室条件下适应3天后，随机分组，每日按表12的样品和剂量进行灌胃，连续灌胃30天，对照组灌服无菌纯净水。
三、ConA诱导的小鼠脾淋巴细胞转化实验(MTT法)：
1、淋巴细胞增殖反应：
复合益生菌制剂喂养实验结束后，将各剂量组小鼠无菌取脾，置无菌Hank’s液中磨碎，经1000r/min离心洗涤后，将细胞悬于1ml的完全培养液中，活细胞计数并调整浓度3×106个/ml，将细胞悬液分两孔加入24孔培养板中，每孔1ml，1孔75μl ConA液(相当于7.5μl/ml)，另一孔作对照。置于5% CO2，37℃培养72h。培养结束前4小时，每孔吸去上清液0.7ml，每孔加入0.7ml无血清RPMI 1640培养液，同时加入MTT(5mg/ml) 50μl/ml/孔，继续培养4h。培养结束后，每孔加入1ml异丙醇，吹打均匀，使紫色结晶溶解，分别加入96孔培养板中，作3个孔的平行样，以570nm波长测定光密度值，按下式计算淋巴细胞的增殖转化能力。
淋巴细胞的增殖能力 = OD(ConA孔)－OD(对照孔)
2、实验结果：
对ConA诱导的小鼠脾淋巴细胞转化反应，其高剂量组光密度差值高于对照组，差异具有显著意义(见表12)。结果表明实例1的样品脾淋巴细胞转化试验结果为阳性，受试样品增强细胞免疫作用。
复合益生菌制剂对ConA诱导的小鼠脾淋巴细胞转化反应的影响见表15：
表15 不同工艺生产的复合益生菌对ConA诱导的小鼠脾淋巴细胞转化反应的影响
| 组别 | 益生菌剂量 | 动物数(只) | 光密度差值 | P值(与对照组比) |
| 阴性对照组 | 0 | 15 | 0.25±0.01 | － |
| 实施例3原粉 | 0.1g/ml | 15 | 0.35±0.06 | 0.017* |
| 实施例4原粉 | 0.1g/ml | 15 | 0.36±0.05 | 0.010* |
| 实施例3制剂 | 0.1g/ml | 15 | 0.33±0.04 | 0.049 |
| 实施例4制剂 | 0.1g/ml | 15 | 0.35±0.05 | 0.017* |
| 实施例5制剂 | 0.1g/ml | 15 | 0.39±0.05 | 0.002** |
| 实施例6制剂 | 0.1g/ml | 15 | 0.37±0.04 | 0.006** |
由表15的结果可以看出：与阴性对照和液态法相比，由实施例4、实施例5和实例６采用固态法生产的复合益生菌制剂对ConA诱导的小鼠脾淋巴细胞转化反应具有特别显著的效果。
根据实施例8的实验结果，复合益生菌制剂能够提高小鼠的NK细胞活性，增加ConA诱导的小鼠脾淋巴细胞转化反应，说明其有增强免疫力的效果，其中以采用固态法的实施例4、实施例5和实施例6效果更为明显。
实施例10 复合益生菌的降血糖效果对比试验（α-葡萄糖苷酶抑制剂含量测定）
10.1复合益生菌的α-葡萄糖苷酶抑制剂含量测定
10.1.1试验方法
选取上述各实施例所得到的产品，参考朱运平的方法，测定其α-葡萄糖苷酶抑制剂含量。试验方法如下：
材料与试剂：
4-硝基苯基-D-吡喃葡糖苷（PNPG）、α-葡萄糖苷酶；无菌0.1mol/L磷酸盐缓冲溶液（PBS，pH6.8）；其余试剂均为分析纯。
样品提取液的制备：
用无菌0.1 mol/L磷酸盐缓冲溶液(PBS，pH6.8)将菌体制成悬液，并将细菌浓度调至1×109CFU/mL，37℃孵育12h，4℃、8000r/min离心15min，将上清液通过0.22μm水系微滤膜过滤以获得样品提取液，-80℃保存。
α-葡萄糖苷酶抑制率的测定：
采用PNPG法测定α-葡萄糖苷酶抑制活性。
PNPG法的原理：
由于α-葡萄糖苷酶催化水解PNPG释放出的PNP在405nm处有一定的吸光度，因此，可通过检测PNP的量来测定α-葡萄糖苷酶活性的变化，从而测定样品对α-葡萄糖苷酶的抑制率。
在96孔酶标板上，经过稀释的样品中加入50μLα-葡萄糖苷酶溶液(25mg /mL)，50μL 4-PNPG ( 0.9133mg /mL) 及120μL 0.5mol /L的磷酸缓冲液(pH 6.8)。混匀后在37℃的培养箱中反应45min。加入50μL碳酸钠溶液(0.67mol/L)终止反应，在405nm下用酶标仪测定吸光度值。以相同体积的缓冲液代替样品所得的吸光度值作为对照。用下面的公式计算得出α-葡萄糖苷酶的抑制率。
α-葡萄糖苷酶的抑制率%=(OD对照－OD样品) /OD对照×100
式中：
OD对照是未加入样品孔的吸光度值，即空白对照。
OD样品是加入样品提取液（即含有α-葡萄糖苷酶抑制剂）孔的吸光度值。
10.1.2相同重量浓度下时产品的降血糖效果对比（α-葡萄糖苷酶抑制率测定）
分别称取上述各组样品各1g，加入10mL无菌水，配成0.1g/mL的益生菌溶液，备用。PNPG法测定各组样品对α-葡萄糖苷酶的抑制效果，从而判断复合双歧杆菌的降血糖效果，结果以“平均值±标准差”来表示，详见表16：
实验结果：
表16 相同重量时不同工艺生产的复合双歧杆菌的α-葡萄糖苷酶抑制率（%）
| 样品 | 剂量 | α-葡萄糖苷酶抑制率（%） |
| 阴性对照组 | 0.1g/ml | 0 |
| 实施例3原粉 | 0.1g/ml | 68.6 |
| 实施例4原粉 | 0.1g/ml | 82.8 |
| 实施例3制剂 | 0.1g/ml | 61.5 |
| 实施例4制剂 | 0.1g/ml | 75.8 |
| 实施例5制剂 | 0.1g/ml | 88.4 |
| 实施例6制剂 | 0.1g/ml | 82.6 |
10.1.3相同菌数时产品的降血糖效果对比（α-葡萄糖苷酶抑制率测定）
分别称取益生菌成品1g，加入适量无菌水，经菌数测定后，加入无菌水调整益生菌总数浓度为1x1010CFU/ml，备用。
按照实施例9.1.1类似的试验方法，测定相同菌数的实施例样品对α-葡萄糖苷酶的抑制效果，结果以“平均值±标准差”来表示，详见表17：
表17 相同菌数时不同工艺生产的复合双歧杆菌的α-葡萄糖苷酶抑制率（%）
| 样品 | 剂量 | α-葡萄糖苷酶抑制率（%） |
| 阴性对照组 | 1x1010CFU/ml | 0 |
| 实施例3原粉 | 1x1010CFU/ml | 62.2 |
| 实施例4原粉 | 1x1010CFU/ml | 78.3 |
| 实施例3制剂 | 1x1010CFU/ml | 56.6 |
| 实施例4制剂 | 1x1010CFU/ml | 65.3 |
| 实施例5制剂 | 1x1010CFU/ml | 82.6 |
| 实施例6制剂 | 1x1010CFU/ml | 76.2 |
上述实验结果，实际上是测定样品的α-葡萄糖苷酶活性与α-葡萄糖苷酶标准品的活性之间的差异，即规定不含样品的缓冲液的α-葡萄糖苷酶抑制率为0，而将样品的α-葡萄糖苷酶抑制率规定为样品与对照之间的吸光度的差值百分比。需要说明的是：为简化测定程序，本发明未设置阳性对照，即未使用阳性的α-葡萄糖苷酶抑制剂阿卡波糖或DNJ作为对照，也未扣除样品背景，所以所测定的抑制率可能与实际略有差异，但由于差异不大，所以表16和表17的结果对于了解益生菌样品的对α-葡萄糖苷酶的抑制效果仍然具有良好的参考价值。
根据表16和表17的实验结果，本发明的益生菌产品比传统的液态法益生菌产品具有更好的α-葡萄糖苷酶抑制率，加上本发明的益生菌产品具有更高的益生菌数量。因此，可以预期本发明的产品总体上会具有比液态法生产的益生菌制剂具有更好的降血糖效果。
10.2 复合益生菌的降血糖效果对比试验（高血糖的治疗效果）
根据上述各实施例所得到的产品，进行了产品的降血糖实验，实验方案及实验结果如下：
实验材料与方法：
受试对象：选择空腹血糖≥7.8mmol/L的二型糖尿病患者作为实验对象，将210名被诊断患有成人二型糖尿病的患者随机分成7组，每组30名。
空白对照组或安慰剂组：采用未加药的空白淀粉制剂进行治疗，每天3次，每次1袋，每袋2克，持续4周。
阳性实验组：采用阿卡波糖治疗，75mg/d，分三次服用，每次25mg，治疗4周。
液态法对照组(实施例3)：采用传统的液态培养法培养复合益生菌，经离心分离后干燥制备的复合益生菌菌体制剂进行治疗，每天3次，每次1袋，每袋2克，持续4周。
实施例组：共分3组(实施例4-6)，按表15分别口服复合益生菌进行治疗，每天3次，每次1袋，每袋2克，持续4周。
用药期间通过问诊来确定是否有不良反应。
实验结果：
表18 不同工艺生产的复合益生菌的降血糖效果（空腹血糖值，mmol/L）
| 实施例 | 实验前(0天) | 第7天 | 第14天 | 第21天 | 第28天 |
| 空白对照组 | 8.0±0.2 | 8.0±0.3 | 8.0±0.2 | 7.9±0.2 | 8.2±0.2 |
| 阳性对照 | 8.0±0.2 | 7.6±0.5 | 7.1±0.4 | 6.3±0.3 | 5.0±0.3 |
| 实施例3原粉 | 7.9±0.4 | 7.7±0.1 | 7.2±0.3 | 7.1±0.2 | 6.9±0.4 |
| 实施例4原粉 | 8.1±0.3 | 7.5±0.3 | 7.1±0.4 | 7.0±0.5 | 6.8±0.3 |
| 实施例3制剂 | 8.0±0.3 | 7.6±0.3 | 7.4±0.5 | 7.2±0.2 | 7.0±0.4 |
| 实施例4制剂 | 8.1±0.2 | 7.5±0.3 | 7.2±0.5 | 7.1±0.3 | 6.9±0.2 |
| 实施例5制剂 | 7.9±0.5 | 7.2±0.2 | 6.7±0.3 | 6.0±0.3 | 5.6±0.5 |
| 实施例6制剂 | 7.9±0.2 | 7.2±0.2 | 6.8±0.3 | 6.3±0.1 | 5.8±0.4 |
表19 不同工艺生产的复合益生菌的降血糖效果（餐后2h血糖值，mmol/L）
| 实施例 | 实验前(0天) | 第7天 | 第14天 | 第21天 | 第28天 |
| 阴性对照组 | 13.0±0.3 | 13.8±0.5 | 13.2±0.5 | 13.5±0.3 | 13.9±0.5 |
| 阳性对照 | 12.9±0.5 | 11.8±0.5 | 8.2±0.3 | 7.5±0.4 | 7.0±0.3 |
| 实施例3原粉 | 12.9±0.5 | 11.6±0.3 | 9.6±0.4 | 8.3±0.4 | 7.8±0.3 |
| 实施例4原粉 | 13.1±0.5 | 10.6±0.5 | 8.9±0.5 | 8.0±0.2 | 7.8±0.3 |
| 实施例3制剂 | 13.0±0.4 | 11.9±0.5 | 9.8±0.3 | 8.6±0.4 | 8.1±0.3 |
| 实施例4制剂 | 12.9±0.3 | 11.0±0.3 | 8.5±0.4 | 7.6±0.3 | 7.5±0.2 |
| 实施例5制剂 | 13.0±0.3 | 10.8±0.5 | 8.3±0.3 | 8.1±0.4 | 7.6±0.4 |
| 实施例6制剂 | 12.9±0.2 | 11.5±0.5 | 9.0±0.5 | 7.8±0.3 | 7.7±0.3 |
综上所述，采用本发明所制备的复合益生菌制剂，具有良好的降血糖作用，其效果优于液态法复合益生菌制剂，虽然略低于常用的降血糖药物--阿卡波糖，但由于其副作用小，且复合益生菌制剂还具有调节肠道、增加免疫力等其它效果，且不受药品剂量限制。因此，可将复合益生菌作为糖尿病人的辅助调理用品，协助其它降血糖药物发挥降血糖的作用。
实例11：复合益生菌的降脂减肥效果对比试验
复合益生菌对小鼠的降脂减肥效果可以通过测定饲喂复合益生菌的小鼠体重、Lee's指数和血脂等指标来进行表征。
11.1相同重量浓度下菌剂对小鼠降脂减肥效果的影响
选取上述实施例3-6所得到的产品，按表3的剂量每次饲喂同样重量的复合益生菌，实验期结束后测定复合益生菌对小鼠的降脂减肥效果，实验方案及实验结果如下：
11.1.1材料与试剂：
昆明种小鼠，雌雄各半，4周龄，体重18-22g。
11.1.2试验方法：
动物分组：买来的小鼠用基础饲料经过1周的适应性饲养后测定体重作为初始体重，剔除体重过大过小的小鼠，挑选80只小鼠随机分成8组，每组10只，雌雄各半。
空白对照组(蒸馏水)、模型对照组(高脂饲料3g)、阳性对照组(奥利司他400μg)、实施例3(液体法对照组)原粉、实施例3(液体法对照组)制剂、实施例4原粉、实施例4制剂、实施例5制剂、实施例6制剂。
小鼠每日3餐正常饲喂基础饲料。在每餐饲喂基础饲料之后30分钟左右，再用表3各组相应的剂量配成10ml溶液灌胃，然后每周测量1次体重，共进行4周饲养实验,实验结束时测定最终体重并采血测定血脂含量。
11.1.3观察指标及方法：
① 一般情况观察：
活动程度，体毛色泽、体形、饮食、饮水及粪便状况。
② 生长指标检测：
生长指标主要检测体重(g)和肥胖指数(Lee's指数)，其中Lee's指数的计算方法为：
Lee's指数=[体重(g)]1/3/体长(cm)×1000
③ 血脂检测：
血脂测定(总胆固醇、甘油三酯、高密度脂蛋白、低密度脂蛋白)，采用全自动生化分析仪测定。
11.1.4实验结果：
① 一般情况：
六组小鼠的体毛色泽均无变化。
模型对照组食欲增强，体形变圆，活动较正常对照组迟钝，大便略有增加；
阳性对照组小鼠大便偏稀，复合益生菌组小鼠无腹泻现象。
复合益生菌组小鼠与模型对照组比较，进食量较少，活动较灵活，大便量明显增多。
② 体重变化：
实验各组经过1周的适应性饲养后随机分组，各组间小鼠的初始体重差异无统计学意义(P＞0.05)；4周的喂养实验结束时，模型对照组与空白对照组比较，体重显著升高；阳性对照组与空白对照组比较，体重显著降低；不同实施例的益生菌组与空白对照组相比，体重显著降低；与模型对照组比较，体重显著降低，结果见表20：
表20复合益生菌对小鼠体重的影响
4周的饲养实验结束后，采血测定血脂含量，结果见表21：
表21复合益生菌对小鼠血脂的影响
由表20、表21的结果可以看出：
与空白对照相比，由实施例3和实施例4生产的复合益生菌原粉对小鼠降脂减肥具有特别显著的效果。
与空白对照相比，由实施例3、实施例4、实施例5和实施例6等生产的复合益生菌制剂对小鼠降脂减肥效果具有特别显著的效果。
与液态培养法(实施例3)制备的复合益生菌制剂相比，固态培养法(实施例4-6)制备的复合益生菌制剂对小鼠降脂减肥效果有特别显著的效果。
上述实验结果表明：复合益生菌对小鼠体重具有一定的降低作用，复合益生菌在肠道内利用葡萄糖、脂肪酸等小分子营养物质合成肠道菌体成分，增加大便的排出，有助于驱除脂肪；此外，复合益生菌所产生的代谢产物也有利于降低体内脂肪的合成。因此，复合益生菌具有抑制小鼠体重增加的作用。复合益生菌对小鼠血脂影响的实验结果表明：复合益生菌能降低TG、CHO、LDL-C，增加HDL-C，因此，复合益生菌有助于改善体内脂肪代谢，具有良好的降脂功能。根据表20和表21的实验结果还发现：本发明的固态法益生菌产品比传统的液态法益生菌产品具有更好的降脂减肥作用。
综上所述，采用本发明所制备的固态法复合益生菌制剂，具有良好的降脂减肥作用，其效果优于液态法复合益生菌制剂，虽然略低于常用的降脂减肥药物--奥利司他，但由于其副作用小，且复合益生菌制剂还具有调节肠道、增加免疫力等其它效果，且不受药品剂量限制。因此，可将复合益生菌作为肥胖病人的辅助调理用品，协助其它降脂减肥药物发挥降脂减肥的作用。
11.2 相同菌数时产品对小鼠降脂减肥效果的影响
试验方法同实施例11.1。
分别称取复合益生菌成品1g，加入适量无菌水，经菌数测定后，加入无菌水调整复合益生菌总数浓度为1x1010CFU/ml，每次灌服10ml，故每次服用的复合益生菌总数为10x1010CFU，即1x1011CFU。
按照实施例11.1类似的试验方法，测定相同菌数的实施例样品对小鼠降脂减肥效果的影响，结果以“平均值±标准差”来表示，详见表22：
表22相同菌数时制剂产品对小鼠降脂减肥效果的影响
4周的饲养实验结束后，采血测定血脂含量，结果见表23：
表23相同菌数时制剂产品对小鼠血脂的影响
如表22、表23所示，实施例3为液态法制备的制剂产品对小鼠降脂减肥效果的影响，而实施例4、5、6则分别为3种固态法制备的制剂产品对小鼠降脂减肥效果的影响。
表22、表23的实验结果表明：相同菌数的制剂产品也具有大致相同降脂减肥效果。综合上述表20、表21、表22和表23的实验结果还发现：本发明的固态培养法制备的复合益生菌产品比传统的液态法制备的复合益生菌产品具有更好的降脂减肥作用。
益生菌对小鼠降脂减肥效果的影响，如果仅仅是活菌的效果，那么当采用相同的菌数时应该具有大致相同的效果，但上述结果表明：与液态法(实施例3)所制备的复合益生菌产品相比，本发明的实施例4、5、6采用固态法制备的复合益生菌产品具有更好的降脂减肥效果。液态法制剂在制备过程中由于离心分离去除了液态培养过程所产生的代谢产物，所以其降脂减肥的效果主要来自于菌种本身；而本发明制备所得固态法制剂中除了含有复合益生菌菌体外，还含有固态培养过程中所产生的柠檬酸裂解酶抑制剂、α-葡萄糖苷酶抑制剂、短链脂肪酸等具有降脂减肥能力的代谢产物，复合益生菌与代谢产物协同增效，提高了菌剂整体对小鼠降脂减肥效果的影响。
上述实验结果表明：复合益生菌对小鼠体重具有一定的降低作用，复合益生菌在肠道内利用葡萄糖、脂肪酸等小分子营养物质合成肠道菌体成分，增加大便的排出，有助于驱除脂肪；此外，益生菌所产生的代谢产物也有利于降低体内脂肪的合成。因此，益生菌具有抑制小鼠体重增加的作用。复合益生菌对小鼠血脂影响的实验结果表明：复合益生菌能降低TG、CHO、LDL-C，增加HDL-C，因此，复合益生菌有助于改善体内脂肪代谢，具有良好的降脂功能。根据表22和表23的实验结果还发现：本发明的复合益生菌产品比传统的液态法复合益生菌产品具有更好的降脂减肥作用。采用本发明所制备的复合益生菌制剂，具有良好的降脂减肥作用，其效果优于液态法复合益生菌制剂，虽然略低于常用的降脂减肥药物--奥利司他，但由于其副作用小，且复合益生菌制剂还具有调节肠道、增加免疫力等其它效果，且不受药品剂量限制。因此，可将复合益生菌作为肥胖病人的辅助调理用品，协助其它降脂减肥药物发挥降脂减肥的作用。
综合上述各实例的实验结果，发现采用混菌接种复合双歧杆菌、液态培养、离心分离、固态培养等工艺制成的复合益生菌制剂，具有菌种含量高、富含益生菌代谢产物、具有良好的抗幽门螺杆菌、降血糖、调理肠胃、增加免疫力、抗过敏、降脂减肥等多方面的功能效果。
以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。
Claims (9)
1.一种多功能复合益生菌制剂，其特征在于，所述多功能复合益生菌制剂包括以下组分：
10-15份植物乳杆菌MiuCul-01(Lactobacillus plantarum)，保藏号为：CGMCC 20865；5-10份嗜酸乳杆菌MiuLac-01(Lactobacillus acidophilus)，保藏号为：CGMCC 20864；3-7份干酪乳杆菌MiaoTech-01(Lactobacillus casei)，保藏号为：CGMCC 20863；5-10份鼠李糖乳杆菌MiaoTech-11(Lactobacillus rhamnosus)，保藏号为：CGMCC 20862；3-7份嗜热链球菌MiaoPro-01(Streptococcus thermophilus)，保藏号为：CGMCC 20861；3-7份两歧双歧杆菌Miuyo-01(Bifidobacterium bifidum)，保藏号为：CGMCC 20866；2-6份乳双歧杆菌Miuyo-11(Bifidobacterium lactis)，保藏号为：CGMCC 20867；10-15份婴儿双歧杆菌Miuyo-21(Bifidobacterium infantis)，保藏号为：CGMCC 20868；3-7份短双歧杆菌Miuyo-31(Bifidobacterium breve)，保藏号为：CGMCC 20869；
所述的多功能复合益生菌制剂的方法，包括以下步骤：
（1）按配比将植物乳杆菌MiuCul-01、嗜酸乳杆菌MiuLac-01、干酪乳杆菌MiaoTech-01、鼠李糖乳杆菌MiaoTech-11、嗜热链球菌MiaoPro-01、两歧双歧杆菌Miuyo-01、乳双歧杆菌Miuyo-11、婴儿双歧杆菌Miuyo-21和短双歧杆菌Miuyo-31混合均匀，形成复合益生菌制剂，放入液体培养基中进行第一次厌氧培养，产生的培养液经离心分离后获得复合益生菌制剂湿菌体，备用；
（2）向步骤（1）得到的所述复合益生菌制剂湿菌体与固体培养基混合，在密封状态下进行第二次厌氧培养，培养完成后进行低温干燥或冷冻干燥或真空干燥，形成复合益生菌制剂固体；
（3）将步骤（2）得到的复合益生菌制剂固体粉碎、厌氧造粒、厌氧包衣，即得所述多功能复合益生菌制剂。
2.根据权利要求1所述的多功能复合益生菌制剂，其特征在于，所述多功能复合益生菌制剂按重量份包括以下组分：
12.5份植物乳杆菌MiuCul-01、7.5份嗜酸乳杆菌MiuLac-01、5份干酪乳杆菌MiaoTech-01、7.5份鼠李糖乳杆菌MiaoTech-11、5份嗜热链球菌MiaoPro-01、5份两歧双歧杆菌Miuyo-01、4份乳双歧杆菌Miuyo-11、12.5份婴儿双歧杆菌Miuyo-21和5份短双歧杆菌Miuyo-31。
3.根据权利要求1所述的多功能复合益生菌制剂，其特征在于，所述复合益生菌制剂的活菌数为（8-10）×1011CFU/g。
4.根据权利要求1-3任一所述的多功能复合益生菌制剂，其特征在于，所述两歧双歧杆菌Miuyo-01、婴儿双歧杆菌Miuyo-21、短双歧杆菌Miuyo-31和乳双歧杆菌Miuyo-11均来自婴儿粪便，从婴儿粪便中分离培养得到；所述两歧双歧杆菌Miuyo-01、婴儿双歧杆菌Miuyo-21、短双歧杆菌Miuyo-31和乳双歧杆菌Miuyo-11的分离培养条件均为：MRS培养基，pH为6.0-7.5，温度34-40℃。
5.根据权利要求1-3任一所述的多功能复合益生菌制剂，其特征在于，所述植物乳杆菌MiuCul-01从泡菜中分离培养得到；所述嗜酸乳杆菌MiuLac-01从发酵乳制品中分离培养得到；所述干酪乳杆菌MiaoTech-01从发酵乳制品中分离培养得到；所述鼠李糖乳杆菌MiaoTech-11从益生菌制剂中分离培养得到；所述嗜热链球菌MiaoPro-01从酸奶发酵剂中分离培养得到。
6.制备权利要求1-5任一所述的多功能复合益生菌制剂的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
（1）按配比将植物乳杆菌MiuCul-01、嗜酸乳杆菌MiuLac-01、干酪乳杆菌MiaoTech-01、鼠李糖乳杆菌MiaoTech-11、嗜热链球菌MiaoPro-01、两歧双歧杆菌Miuyo-01、乳双歧杆菌Miuyo-11、婴儿双歧杆菌Miuyo-21和短双歧杆菌Miuyo-31混合均匀，形成复合益生菌制剂，放入液体培养基中进行第一次厌氧培养，产生的培养液经离心分离后获得复合益生菌制剂湿菌体，备用；
（2）向步骤（1）得到的所述复合益生菌制剂湿菌体与固体培养基混合，在密封状态下进行第二次厌氧培养，培养完成后进行低温干燥或冷冻干燥或真空干燥，形成复合益生菌制剂固体；
（3）将步骤（2）得到的复合益生菌制剂固体粉碎、厌氧造粒、厌氧包衣，即得所述多功能复合益生菌制剂。
7.根据权利要求6所述的多功能复合益生菌制剂的制备方法，其特征在于，步骤（1）中，采用碟式离心机或管式离心机在无菌条件下进行离心分离后获得复合益生菌制剂湿菌体；所述液体培养基包括乙酸钠、蛋白胨、酵母浸膏和番茄酱；所述第一次厌氧培养的温度为36-38℃，时间为48-72小时。
8.根据权利要求6所述的多功能复合益生菌制剂的制备方法，其特征在于，步骤（2）中，所述固体培养基在使用前经过高温干热灭菌，并无菌冷却到38℃以下备用；所述第二次厌氧培养前将所述复合益生菌制剂湿菌体与固体培养基混合物的水分含量调节到45%-55%。
9.根据权利要求6所述的多功能复合益生菌制剂的制备方法，其特征在于，步骤（2）中，所述第二次厌氧培养的温度为36-38℃，时间为72-120小时；所述低温干燥或真空干燥的温度为30-40℃；所述复合益生菌制剂固体的含水率为4-6%。
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