CN115025132B - 一种合生元组合物及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于医药生物领域，具体涉及用于预防和治疗代谢性疾病和自身免疫性肝炎的合生元组合物及其制备方法和应用。按照重量份计，本发明的合生元组合物包括嗜酸乳杆菌冻干粉10‑20份、婴儿双歧杆菌冻干粉10‑20份和魔芋葡甘露低聚糖60‑100份。本发明选用嗜酸乳杆菌、婴儿双歧杆菌和魔芋葡甘露低聚糖，并按照特定的配比组合，不仅增加了预防和治疗代谢性疾病(如肥胖、糖尿病、非酒精性脂肪肝)和自身免疫性肝炎的效果，而且很多程度上减少了益生菌和益生元的使用量。

Description

一种合生元组合物及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于医药生物领域，具体涉及用于预防和治疗代谢性疾病和自身免疫性肝炎的合生元组合物及其制备方法和应用。

背景技术

微生态制剂又称微生态调节剂，是利用正常微生物或促进微生物生长的物质制成的活的微生物制剂。微生态制剂具有维持或调整微生态平衡、防治疾病和促进宿主健康的作用。微生态制剂按成分不同分为益生菌、益生元和合生元三大类，临床用于腹泻、功能性胃肠道疾病以及作为肝胆疾病、湿疹等过敏性疾病的辅助用药。

益生菌是对人体有益的微生物，包括乳酸杆菌、双歧杆菌、地衣芽孢杆菌、酵母菌等。益生元它是一种膳食补充剂，通过选择性的刺激一种或少数种菌落中的细菌的生长与活性而对寄主产生有益的影响。合生元是益生菌和益生元的复合制剂，合生元一方面可发挥益生菌的生理活性，另一方面又能选择性地增加益生菌数量，使其作用更加显著和持久。

目前现有技术主要是单独使用益生菌或益生元制剂预防和治疗某代谢疾病。单独使用益生菌或益生元预防和治疗代谢疾病的效果比较差，而且很容易导致一些胃肠道疾病，特别是长期使用会导致肠道菌群失调。同时，单独使用益生菌或益生元时，需要大量服用才能发挥其功能。

目前，还没有用于预防和治疗代谢性疾病和自身免疫性肝炎的合生元，即仅有改善糖尿病的合生元，因其组成成分复杂导致价格高昂，不利于惠及患者。同时，也还未有可同时改善肥胖、糖尿病、非酒精性脂肪肝以及自身免疫性肝炎的合生元。

发明内容

本发明的目的在于提供一种合生元组合物，具体的，用于预防和治疗代谢性疾病和自身免疫性肝炎的合生元组合物。

本发明的再一目的在于提供上述合生元组合物的制备方法。

本发明的再一目的在于提供上述合生元组合物的应用。

根据本发明具体实施方式的用于预防和治疗代谢性疾病和自身免疫性肝炎的合生元组合物，按照重量份计，所述合生元组合物包括嗜酸乳杆菌冻干粉10-20份、婴儿双歧杆菌冻干粉10-20份和魔芋葡甘露低聚糖60-100份。

本发明的合生元组合物包括两种益生菌(一种嗜酸乳杆菌与一种婴儿双歧杆菌)和一种益生元(魔芋葡甘露低聚糖)。使用肥胖、糖尿病和非酒精性脂肪肝动物模型证明：口服合生元可以很好的预防和治疗这些代谢疾病，并且未发现任何副作用。同时，本发明的合生元组合物能够很好的改善肠道微生物态。

根据本发明具体实施方式的用于预防和治疗代谢性疾病和自身免疫性肝炎的合生元组合物，所述嗜酸乳杆菌冻干粉由包括以下步骤的方法制备得到：

(1)将嗜酸乳杆菌菌种接种到MRS培养基中，在37℃厌氧条件下培养；

(2)收集步骤(1)培养的嗜酸乳杆菌，并清洗收集到的嗜酸乳杆菌；

(3)真空冷冻干燥步骤(2)所得的嗜酸乳杆菌，即得嗜酸乳杆菌冻干粉。

具体的，嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus，LA)冻干粉的制备方法：

嗜酸乳杆菌菌种接种到De Man,Rogosa and Sharpe(MRS)培养基中，于厌氧***(Oxoid,Basingstoke,UK)中，在37℃厌氧条件下培养48小时；然后，使用冷冻离心机在4000g,4℃条件下离心5分钟收集细菌，再用无菌phosphate-buffered saline(PBS)洗细菌3次，最后真空冷冻干燥获得LA冻干粉，并测定其每克的CFUs；测定结果为10¹¹CFUs/g。

根据本发明具体实施方式的用于预防和治疗代谢性疾病和自身免疫性肝炎的合生元组合物，所述婴儿双歧杆菌冻干粉由包括以下步骤的方法制备得到：

(1)将婴儿双歧杆菌菌种接种到双歧杆菌培养基中，在37℃厌氧条件下培养；

(2)收集步骤(1)培养的婴儿双歧杆菌，并清洗收集到的婴儿双歧杆菌；

(3)真空冷冻干燥步骤(2)所得的婴儿双歧杆菌，即得婴儿双歧杆菌冻干粉。

具体的，婴儿双歧杆菌(Bifidobacterium infantis，BI)冻干粉的制备方法：

婴儿双歧杆菌菌种接种到双歧杆菌培养基中，于厌氧***(Oxoid,Basingstoke,UK)中，在37℃厌氧条件下培养48小时；然后，使用冷冻离心机在4000g,4℃条件下离心5分钟收集细菌，再用无菌phosphate-buffered saline(PBS)洗细菌3次，最后真空冷冻干燥获得BI冻干粉，并测定其每克的CFUs；测定结果为10¹¹CFUs/g。

根据本发明具体实施方式的用于预防和治疗代谢性疾病和自身免疫性肝炎的合生元组合物，按照重量份计，所述合生元组合物包括嗜酸乳杆菌冻干粉15份、婴儿双歧杆菌冻干粉15份和魔芋葡甘露低聚糖78份。

根据本发明具体实施方式的用于预防和治疗代谢性疾病和自身免疫性肝炎的合生元组合物，所述代谢性疾病包括肥胖、糖尿病和/或非酒精性脂肪肝。

根据本发明具体实施方式的合生元组合物的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：分别取嗜酸乳杆菌冻干粉10-20重量份、婴儿双歧杆菌冻干粉10-20重量份和魔芋葡甘露低聚糖60-100重量份，混合均匀，即得。

本发明的合生元组合物在制备预防和治疗代谢性疾病和自身免疫性肝炎的制剂方面的应用。

其中，所述代谢性疾病包括肥胖、糖尿病和/或非酒精性脂肪肝。

肥胖是指一定程度的明显超重与脂肪层过厚，是体内脂肪，尤其是甘油三酯积聚过多而导致的一种状态。当体内贮积的脂肪量超过20％以上时，称为肥胖症，其由有一种遗传因素、环境因素等多种原因相互作用而引起的慢性代谢性疾病。

糖尿病是一组以高血糖为特征的代谢性疾病。高血糖则是由于胰岛素分泌缺陷或其生物作用受损，或两者兼有引起。长期存在的高血糖，导致各种组织，特别是眼、肾、心脏、血管、神经的慢性损害、功能障碍。

非酒精性脂肪肝指没有饮酒因素,而出现脂肪沉积在肝脏,肝细胞脂肪变性的情况。

自身免疫性肝炎是由自身免疫反应介导的慢性进行性肝脏炎症性疾病，其临床特征为不同程度的血清转氨酶升高、高γ-球蛋白血症、自身抗体阳性，组织学特征为以淋巴细胞、浆细胞浸润为主的界面性肝炎，

所述制剂为药物、药物组合物、保健品、食品或添加剂。

上述制剂中可包括药物赋形剂、稀释剂或载体，并可通过任何适合的方式用于需要治疗的患者。其中，适合方式包括但不限于口服、直肠、鼻部、局部(包括口腔和舌下)、皮下或胃肠外(包括皮下、肌肉、静脉、皮内、鞘内)施用。

本发明的有益效果：

本发明的合生元组合物包括了嗜酸乳杆菌和婴儿双歧杆菌两种益生菌，使用魔芋葡甘露低聚糖作为益生元成分，并调整三种组分达到最佳配比，魔芋葡甘露低聚糖能更好的增加短链脂肪酸合成细菌的丰度，弥补由于长期使用嗜酸乳杆菌与婴儿双歧杆菌造成的肠道菌群失调，更全面调节肠道菌群。

本发明的合生元组合物对预防和治疗肥胖、糖尿病和非酒精性脂肪肝、自身免疫性肝炎均具有良好的作用；治疗糖尿病的效果优于药物二甲双胍；治疗自身免疫性肝炎的效果与***龙激素药物一样。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1显示本发明的合生元组合物干预对HFD小鼠形态的影响情况；

图2显示本发明的合生元组合物干预对HFD小鼠肝脏和脂肪形态的影响情况；

图3显示二甲双胍和本发明的合生元组合物干预对db/db小鼠餐后血糖(FBG)的影响情况，^*P<0.05；

图4显示***龙激素药物和本发明的合生元组合物干预对AIH小鼠肠和肝脏的影响情况；

图5显示***龙激素药物和本发明的合生元组合物干预对AIH小鼠肝脏和结肠组织病理切片(HE染色)影响情况。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明的技术方案进行详细的描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所得到的所有其它实施方式，都属于本发明所保护的范围。

本发明所用试剂：

嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus，LA)菌种和婴儿双歧杆菌(Bifidobacterium infantis，BI)菌种均为实验室保存菌种。

魔芋葡甘露低聚糖(Konjac glucomannan oligosaccharides，KGO)：购买于云南丽江大然生物有限公司，其具体规格参数如下：平均分子量870，甘露糖与葡萄糖的摩尔比是:3:1,聚合度在2-10；其中2-6糖占比超过85％，7-10糖占比14％。

MRS培养基：酪蛋白胨10.0g，牛肉膏10.0g，酵母粉5.0g，葡萄糖5.0g，乙酸钠5.0g，柠檬酸二铵2.0g，Tween 80 1.0g，K₂HPO₄ 2.0g，MgSO₄.7H₂O 0.2g，MnSO₄.H₂O 0.05g，CaCO₃20.0g，琼脂15.0g，蒸馏水1.0L，pH6.8。

双歧杆菌培养基：大豆蛋白胨5.0g，胰蛋白胨5.0g，酵母粉10.0g，葡萄糖10.0g，盐溶液40.0ml，L-半胱氨酸盐酸盐0.5g(培养基煮沸后加入)，0.1％刃天青1.0ml，琼脂15.0g，蒸馏水1.0L，pH7.0。以上液体培养基在接种前煮沸驱氧后接种，于厌氧罐中培养。[注]盐溶液配方：CaCl₂ 0.2g，MgSO₄ 7H₂O 0.48g，K₂HPO₄ 1.0g，KH₂PO₄ 1.0g，NaHCO₃ 10.0g，NaCl2.0g，混合CaCl₂和MgSO₄在300ml蒸馏水中直至溶解。

本发明的合生元组合物，按照重量份计，包括嗜酸乳杆菌冻干粉10-20份、婴儿双歧杆菌冻干粉10-20份和魔芋葡甘露低聚糖60-100份。

具体实施例如下：

实施例1：

以1kg为1重量份计，本发明的合生元组合物包括：

所述合生元组合物包括嗜酸乳杆菌冻干粉10份、婴儿双歧杆菌冻干粉10份和魔芋葡甘露低聚糖60份。

实施例2

以1kg为1重量份计，本发明的合生元组合物包括：

所述合生元组合物包括嗜酸乳杆菌冻干粉20份、婴儿双歧杆菌冻干粉20份和魔芋葡甘露低聚糖100份。

实施例3

以1kg为1重量份计，本发明的合生元组合物包括：

所述合生元组合物包括嗜酸乳杆菌冻干粉15份、婴儿双歧杆菌冻干粉15份和魔芋葡甘露低聚糖78份。

本发明的合生元组合物按照如下方法制备得到：

(1)制备嗜酸乳杆菌冻干粉：

嗜酸乳杆菌菌种接种到MRS培养基中，于厌氧***中，在37℃厌氧条件下培养48小时；然后，使用冷冻离心机在4000g,4℃条件下离心5分钟收集细菌，再用无菌PBS洗细菌3次，最后真空冷冻干燥获得LA冻干粉，并测定其每克的CFUs；测定结果为10¹¹CFUs/g。

(2)制备婴儿双歧杆菌冻干粉：

婴儿双歧杆菌菌种接种到双歧杆菌培养基中，于厌氧***中，在37℃厌氧条件下培养48小时；然后，使用冷冻离心机在4000g,4℃条件下离心5分钟收集细菌，再用无菌PBS洗细菌3次，最后真空冷冻干燥获得BI冻干粉，并测定其每克的CFUs；测定结果为10¹¹CFUs/g。

(3)按配方量，将LA冻干粉、BI冻干粉以及魔芋葡甘露低聚糖，混匀，即得。

实施例4考察LA、BI和KGO之间的协同效果

每天使用LA(0.03g)、BI(0.03g)、KGO(0.078g)以及本发明实施例3的组合物SYN(0.108g:由0.015g LA,0.015g BI和0.078g KGO组成)分别干预小鼠高脂肥胖(High fatdiet,HFD)小鼠模型，共干预12周。

实验分组和动物饲养：

60只无特定病原体(Specified pathogens free，SPF)级健康3周龄雄性C57BL/6J小鼠在SPF级动物实验室中(20-25℃、12h昼夜明暗交替)，自由饮用无菌水和自由进食SPF维持饲料适应喂养1周后，称重后随机分成6组：

(1)正常饮食组(NCD)：自由饮水和自由进食正常饮食喂养12周，同时，每只小鼠每天灌胃给予200μl生理盐水；

(2)高脂肪饮食组(HFD)：自由饮水和自由进食60％高脂肪模型饲料喂养12周，同时，每只小鼠每天灌胃给予200μl生理盐水；

(3)LA干预组(HFD-LA)：自由饮水和自由进食60％高脂肪模型饲料喂养12周，同时，每只小鼠每天灌胃给予0.03g(200μl)LA；

(4)BI干预组(HFD-BI)：自由饮水和自由进食60％高脂肪模型饲料喂养12周，同时，每只小鼠每天灌胃给予0.03g(200μl)BI；

(5)KGO干预组(HFD-BI)：自由饮水和自由进食60％高脂肪模型饲料喂养12周，同时，每只小鼠每天灌胃给予0.078g(200μl)KGO；

(6)KGO干预组(HFD-KGO)：自由饮水和自由进食60％高脂肪模型饲料喂养12周，同时，每只小鼠每天灌胃给予0.108g(由0.015g LA,0.015g BI和0.078g KGO组成)(200μl)SYN。

饲养期间每周测定一次小鼠体重。从尾静脉采血用于测量葡萄糖水平。一般情况下，用酒精反复擦拭尾巴扩展血管，然后剪掉尾巴尖收集血液，用血糖仪测定。

用MesoQMR清醒小动物体成分分析与成像***和称重分析肝脏和总白色脂肪重量。

结果如表1所示。

表1LA、BI、KGO以及SYN干预对HFD小鼠的影响

^aP<0.05 vs normal control diet group,^b P<0.05 vs HFD group,^c P<0.05 vsHFD-SYN group,

结果如表1所示，LA、BI以及SYN均可以显著降低HFD小鼠的体重、肝重、总白色脂肪组织量和餐后血糖,而KGO仅可以显著降低HFD小鼠的肝重和总白色脂肪。同时，SYN比LA、BI和KGO有显著更好的改善作用。

实施例5考察本发明组合物之间的配比对效果的影响

每天使用SYN-1(0.108g：由0.005g LA,0.025g BI和0.078g KGO组成)、SYN-2(0.108g：由0.025g LA,0.005g BI和0.078g KGO组成)和SYN(0.108g：由0.015g LA,0.015gBI和0.078g KGO组成)分别干预小鼠高脂肥胖(High fat diet,HFD)小鼠模型，共干预12周。

实验分组和动物饲养：

50只无特定病原体(Specified pathogens free，SPF)级健康3周龄雄性C57BL/6J小鼠在SPF级动物实验室中(20-25℃、12h昼夜明暗交替)，自由饮用无菌水和自由进食SPF维持饲料适应喂养1周后，称重后随机分成5组：

(1)正常饮食组(NCD)：自由饮水和自由进食正常饮食喂养12周，同时，每只小鼠每天灌胃给予200μl生理盐水；

(2)高脂肪饮食组(HFD)：自由饮水和自由进食60％高脂肪模型饲料喂养12周，同时，每只小鼠每天灌胃给予200μl生理盐水；

(3)SYN-1干预组(HFD-SYN-1)：自由饮水和自由进食60％高脂肪模型饲料喂养12周，同时，每只小鼠每天灌胃给予0.108g(由0.005g LA,0.025g BI和0.078g KGO组成)(200μl)SYN-1；

(4)SYN-2干预组(HFD-SYN-2)：自由饮水和自由进食60％高脂肪模型饲料喂养12周，同时，每只小鼠每天灌胃给予0.108g(由0.025g LA,0.005g BI和0.078g KGO组成)(200μl)SYN-2；

(5)SYN干预组(HFD-SYN)：自由饮水和自由进食60％高脂肪模型饲料喂养12周，同时，每只小鼠每天灌胃给予0.108g(由0.015g LA,0.015g BI和0.078g KGO组成)(200μl)SYN。

饲养期间每周测定一次小鼠体重。从尾静脉采血用于测量葡萄糖水平。一般情况下，用酒精反复擦拭尾巴扩展血管，然后剪掉尾巴尖收集血液，用血糖仪测定。用MesoQMR清醒小动物体成分分析与成像***和称重分析肝脏和总白色脂肪重量。

表2 SYN-1、SYN-2以及SYN干预对HFD小鼠的影响

^aP<0.05 vs normal control diet group,^bP<0.05 vs HFD group,^cP<0.05 vsHFD-SYN group

结果如表2所示，SYN-1、SYN-2以及SYN均可以显著降低HFD小鼠的体重、肝重、总白色脂肪组织量和餐后血糖。同时，SYN比SYN-1和SYN-2有显著更好的改善作用。

实施例6考察本发明组合物改善肥胖和非酒精性脂肪肝的效果

每天使用本发明实施例3的样品SYN(0.108g：由0.015g LA,0.015g BI和0.078gKGO组成)干预小鼠高脂肥胖(High fat diet,HFD)小鼠模型，共干预12周。

实验分组和动物饲养：

30只无特定病原体(Specified pathogens free，SPF)级健康3周龄雄性C57BL/6J小鼠在SPF级动物实验室中(20-25℃、12h昼夜明暗交替)，自由饮用无菌水和自由进食SPF维持饲料适应喂养1周后，称重后随机分成3组：

(1)正常饮食组(NCD)：自由饮水和自由进食正常饮食喂养12周，同时，每只小鼠每天灌胃给予200μl生理盐水；

(2)高脂肪饮食组(HFD)：自由饮水和自由进食60％高脂肪模型饲料喂养12周，同时，每只小鼠每天灌胃给予200μl生理盐水；

(3)SYN干预组(HFD-SYN)：自由饮水和自由进食60％高脂肪模型饲料喂养12周，同时，每只小鼠每天灌胃给予0.108g(由0.015g LA,0.015g BI和0.078g KGO组成)(200μl)SYN。

饲养期间每周测定一次小鼠体重。将小鼠禁食8小时后，从尾静脉采血用于测量葡萄糖水平。一般情况下，用酒精反复擦拭尾巴扩展血管，然后剪掉尾巴尖收集血液，用血糖仪测定。用MesoQMR清醒小动物体成分分析与成像***和称重分析肝脏、腹股沟白色脂肪组织和附睾白色脂肪组织重量。

摘除眼球取血，收集血清标本，利用商品ELISA试剂盒分别检测生化指标(FBG、TG、TC、HDL、LDL、ALT、AST和LPS)，操作步骤参照试剂盒说明书进行。

肠道通透性测定：将小鼠禁食6小时后，灌胃注射FITC-Dextran(600mg/kg_小鼠体重)；1小时后尾静脉尖端取血120ul,然后在4℃、12000g条件下离心3mins收集血浆，最后用荧光分光光度计测定FITC-Dextran浓度。

结果如表3、图1、2所示。

表3SYN干预对HFD小鼠肥胖指数和血液生化指标的影响

^aP<0.05 vs normal control diet group,^bP<0.05 vs HFD group,

结果表明，SYN可以显著降低HFD小鼠的体重、肝重、肝脏脂肪沉积、白色脂肪量、空腹血糖、血浆甘油三酯、胆固醇、高密度脂蛋白、低密度脂蛋白、脂多糖以及FITC-Dextran，并且如图1和图2所示，SYN可以改善肝脏形态，表明SYN能很好的改善肥胖、非酒精性脂肪肝以及肠道屏障功能。

肠道菌群α多样性分析：先将每只小鼠单独放到一个空的无菌鼠笼里，让其自由***粪便，然后用无菌镊子将小鼠***的粪便夹到1.5ml的无菌离心管中，每管收集3-5颗粪便，速置于-80℃超低温冰箱中保存。肠道菌群总DNA提取、16SrDNA测序和生物信息学分析由上海美吉生物医药科技有限公司完成。结果见表4。

表4SYN干预对HFD小鼠肥胖肠道菌群α多样性的影响

由表4可知，SYN可以显著增加HFD小鼠的Shannon指数、ACE指数和Chao指数，以及显著降低Simpson指数。总之，SYN可以显著增加HFD小鼠肠道菌群α多样性，表明其可以改善肠道菌群。

实施例7考察本发明的合生元组合物对糖尿病的改善作用

每天使用二甲双胍(M)药物(0.3g/kg_{(小鼠体重)})和本发明实施例3的样品SYN(0.108g：由0.015g LA,0.015g BI和0.078g KGO组成)分别干预糖尿病C57BL/KS db/db小鼠模型，共干预6周。

实验分组和动物饲养

无特定病原体(Specified pathogens free，SPF)级健康6周龄雄性C57BL/KS db/+小鼠(10只)和C57BL/KS db/db小鼠(30只)在SPF级动物实验室中(20-25℃、12h昼夜明暗交替)，自由饮用无菌水和自由进食SPF维持饲料适应喂养1周后，称重后随机分成4组：

(1)正常对照组(NC)：C57BL/KS db/+小鼠自由饮水和自由进食SPF维持饲料喂养6周，同时，每只小鼠每天灌胃给予200μl生理盐水；

(2)糖尿病模型组(D)：C57BL/KS db/db自由饮水和自由进食SPF维持饲料喂养6周，同时，每只小鼠每天灌胃给予200μl生理盐水；

(3)二甲双胍干预组(D-M)：自由饮水和自由进食SPF维持饲料喂养6周，同时，每只小鼠每天灌胃给予0.3g/kg_{(小鼠体重)}(200μl)二甲双胍；

(4)SYN干预组(D-S)：自由饮水和自由进食SPF维持饲料喂养6周，同时，每只小鼠每天灌胃给予0.108g(由0.015g LA,0.015g BI和0.078g KGO组成)(200μl)SYN。

饲养期间每周测定一次小鼠体重。将小鼠禁食8小时后，从尾静脉采血用于测量葡萄糖水平。一般情况下，用酒精反复擦拭尾巴扩展血管，然后剪掉尾巴尖收集血液，用血糖仪测定。

结果如图3所示，二甲双胍和SYN干预均可以显著降低糖尿病db/db小鼠的空腹血糖(FBG)；同时，SYN干预降低FBG的作用显著优于二甲双胍。总之，实验结果表明SYN可以改善糖尿病；同时，SYN的治疗效果显著优于二甲双胍药物。

实施例8考察本发明的合生元组合物对自身免疫性肝炎的效果

每天使用***龙(Pre)激素药物(0.15mg/kg_{(小鼠体重)})和本发明实施例3的样品SYN(0.108g：由0.015g LA,0.015g BI和0.078g KGO组成)分别干预自身免疫性肝炎(AIH)小鼠模型，共干预42天。

实验分组和动物饲养：

无特定病原体(Specified pathogens free，SPF)级健康6周龄雄性C57BL/6J小鼠(46只)在SPF级动物实验室中(20-25℃、12h昼夜明暗交替)，自由饮用无菌水和自由进食SPF维持饲料适应喂养1周后，先从中随机挑取6只小鼠用来获得肝脏提取S 100，制备成S100/CFA；再将剩余小鼠称重后随机分成4组：

(1)正常对照组(Ctrl)：自由饮水和自由进食SPF维持饲料喂养42天，同时，每只小鼠每天灌胃给予200μl生理盐水；

(2)自身免疫性肝炎组(AIH)：自由饮水和自由进食SPF维持饲料喂养42天，同时，每只小鼠每天灌胃给予200μl生理盐水；以及在第7天和14天的时候腹腔注射1mL新鲜制备的S100/CFA；

(3)***龙干预组(AIH-Pre)：自由饮水和自由进食SPF维持饲料喂养42天，同时，每只小鼠每天灌胃给予0.15mg/kg_{(小鼠体重)}(200μl)***龙，以及在第7天和14天的时候腹腔注射1mL新鲜制备的S100/CFA；

(4)SYN干预组(AIH-Syn)(10只)：自由饮水和自由进食SPF维持饲料喂养42天，同时，每只小鼠每天给予0.108g(由0.015g LA,0.015g BI和0.078g KGO组成)(200μl)SYN，以及在第7天和14天的时候腹腔注射1mL新鲜制备的S100/CFA。

饲养期间每周测定一次小鼠体重。用MesoQMR清醒小动物体成分分析与成像***和称重分析体重和肝脏重量，并计算肝脏指数。

摘除眼球取血，收集血清标本，利用商品ELISA试剂盒分别检测生化指标(ALT、AST和LPS)，操作步骤参照试剂盒说明书进行。

取小鼠肝脏组织，制备肝脏匀浆，利用商品ELISA试剂盒分别检测LPS。

肝脏和结肠组织切片HE染色：取小鼠肝组织和结肠组织固定24h，石蜡包埋，切成3μm切片，苏木精和伊红染色。然后在显微镜(AxioObser Z1，德国)200倍下观察，并拍照。

表5 SYN干预对AIH小鼠肝指数和血液生化指标的影响

结果表5、图4、5所示，***龙激素药物和SYN均可以显著降低AIH小鼠的血浆AST、ALT和肝脏LPS含量，并且改善AIH小鼠肠和肝脏形态、肝脏损伤和肠道屏障功能，表明SYN可以改善自身免疫肝炎，同时，SYN的治疗效果与***龙激素药物相当。

以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。

Claims (9)

1.一种用于预防和治疗代谢性疾病和自身免疫性肝炎的合生元组合物，其特征在于，按照重量份计，所述合生元组合物的组成为：

嗜酸乳杆菌冻干粉10-20份、婴儿双歧杆菌冻干粉10-20份和魔芋葡甘露低聚糖60-100份，其中，

嗜酸乳杆菌冻干粉和婴儿双歧杆菌冻干粉作为益生菌；

魔芋葡甘露低聚糖为益生元。

2.根据权利要求1所述的用于预防和治疗代谢性疾病和自身免疫性肝炎的合生元组合物，其特征在于，所述嗜酸乳杆菌冻干粉由包括以下步骤的方法制备得到：

（1）将嗜酸乳杆菌菌种接种到MRS培养基中，在37℃厌氧条件下培养；

（2）收集步骤（1）培养的嗜酸乳杆菌，并清洗收集到的嗜酸乳杆菌；

（3）真空冷冻干燥步骤（2）所得的嗜酸乳杆菌，即得嗜酸乳杆菌冻干粉。

3.根据权利要求1所述的用于预防和治疗代谢性疾病和自身免疫性肝炎的合生元组合物，其特征在于，所述婴儿双歧杆菌冻干粉由包括以下步骤的方法制备得到：

（1）将婴儿双歧杆菌菌种接种到双歧杆菌培养基中，在37℃厌氧条件下培养；

（2）收集步骤（1）培养的婴儿双歧杆菌，并清洗收集到的婴儿双歧杆菌；

（3）真空冷冻干燥步骤（2）所得的婴儿双歧杆菌，即得婴儿双歧杆菌冻干粉。

4.根据权利要求1-3任一项所述的用于预防和治疗代谢性疾病和自身免疫性肝炎的合生元组合物，其特征在于，按照重量份计，所述合生元组合物包括嗜酸乳杆菌冻干粉15份、婴儿双歧杆菌冻干粉15份和魔芋葡甘露低聚糖78份。

5.根据权利要求1所述的用于预防和治疗代谢性疾病和自身免疫性肝炎的合生元组合物，其特征在于，所述代谢性疾病包括肥胖、糖尿病和/或非酒精性脂肪肝。

6.权利要求1所述的合生元组合物的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：分别取嗜酸乳杆菌冻干粉10-20重量份、婴儿双歧杆菌冻干粉10-20重量份和魔芋葡甘露低聚糖60-100重量份，混合均匀，即得。

7.根据权利要求6所述的合生元组合物的制备方法，其特征在于，所述嗜酸乳杆菌冻干粉由包括以下步骤的方法制备得到：

（1）将嗜酸乳杆菌菌种接种到MRS培养基中，在37℃厌氧条件下培养；

（2）收集步骤（1）培养的嗜酸乳杆菌，并清洗收集到的嗜酸乳杆菌；

（3）真空冷冻干燥步骤（2）所得的嗜酸乳杆菌，即得嗜酸乳杆菌冻干粉。

8.根据权利要求6所述的合生元组合物的制备方法，其特征在于，所述婴儿双歧杆菌冻干粉由包括以下步骤的方法制备得到：

（1）将婴儿双歧杆菌菌种接种到双歧杆菌培养基中，在37℃厌氧条件下培养；

（2）收集步骤（1）培养的婴儿双歧杆菌，并清洗收集到的婴儿双歧杆菌；

（3）真空冷冻干燥步骤（2）所得的婴儿双歧杆菌，即得婴儿双歧杆菌冻干粉。

9.权利要求1所述的合生元组合物在制备预防和治疗代谢性疾病和自身免疫性肝炎的制剂方面的应用，其特征在于，所述代谢性疾病为肥胖、糖尿病和/或非酒精性脂肪肝。