CN112980938A - 一种靶向捕获遗传性耳聋基因序列的方法及测序方法 - Google Patents

Abstract

本申请涉及生物技术领域，具体提供一种靶向捕获遗传性耳聋基因序列的方法及测序方法，包括：制备靶向捕获遗传性耳聋基因外显子序列正负链的捕获膜，所述遗传性耳聋基因包括CDH23、COL11A1、DSPP、MYO7A、OTOF、PCDH15、MT‑RNR1、MT‑TL1、MT‑TS1、MYO15A、SLC26A4、DFNA5、GJB2、GJB3、KCNJ10、SOX10、TCOF1、WFS1、DFNB59、USH1G、TMC1、DFNB31；将片段化后的人基因组样品，构建为应用于高通量测序的核酸文库；将所述核酸文库进行变性处理，变性处理后的核酸文库与所述的捕获膜在杂交条件下进行杂交，形成目标核酸分子‑捕获膜复合物；用清洗液清洗所述目标核酸分子‑捕获膜复合物，然后再用洗脱液从捕获膜上洗脱、并纯化经富集后，获得遗传性耳聋基因序列。本发明能遗传性耳聋基因型鉴定准确率的提高，快速便捷。

Description

一种靶向捕获遗传性耳聋基因序列的方法及测序方法

技术领域

本申请涉及生物技术领域，尤其涉及一种靶向捕获遗传性耳聋基因序列的方法及测序方法。

背景技术

随着第二代测序的发展，基因组测序成为了高通量、高深度鉴定相关位点变异，进而识别潜在疾病的最主要手段，同时在科研上具有广泛的应用。高通量测序可直接获得大量相关位点变异信息，对于精准医疗具有重大意义。

DNA靶向富集技术应用到高通量测序，可将基因组目标区域或感兴趣的目标核酸富集后，提高靶区域所占比例。因此，通过DNA靶向富集技术，富集特定疾病相关目标区域，如人外显子组，或者遗传性耳聋基因，可大幅降低测序成本，潜力巨大。如外显子组测序，仅实现约占人基因组全长的1％-2％左右的序列的测序，通过捕获后测序，获得外显子区域的序列信息，相较于全基因组测序，成本降低50-100倍。而对遗传性耳聋基因区域进行捕获，富集出占全基因组0.2％左右的遗传性耳聋基因序列，则大幅降低测序成本。

基于靶向捕获的遗传性耳聋基因分型技术，目前有基于固相载体芯片的富集与基于固相载体磁珠的富集技术。用于核酸杂交的固相载体如玻璃、平板、平皿、微球等均需对固相载体进行修饰后，方可特异性结合核酸，如磁珠，需要对磁珠进行修饰后，进而特异性结合核酸。但核酸的结合具有方向性，所能结合的探针量较低，如目前市场化的基于磁珠靶向核酸分子富集产品，其中某一产品的特性为每毫克磁珠可结合20微克双链DNA，而每毫克磁珠价格在240元左右，成本较高。同时，由于靶向富集技术的不同，造成探针量、探针来源和探针制备方法等也不同，不仅会造成对目标核酸多样性造成影响，同样会对成本造成影响。

已有报导的其他通过富集技术对遗传性耳聋基因鉴定的方法，均需通过人工合成的方式，合成经修饰的单链核酸探针，同时制备经修饰的固相载体。其富集过程也多为先形成核酸探针：靶核酸复合体，再通过核酸复合体：载体富集，获得富集后的靶核酸序列。复合体与载体的结合，则通过核酸探针与固相载体的修饰基团，因此，不可避免的进行探针修饰与固相载体特定基团包被等，故而提高捕获成本，造成步骤的繁琐。

发明内容

本申请实施例的目的是提供一种靶向捕获遗传性耳聋基因序列的方法及测序方法，以解决相关技术中存在的靶向捕获成本较高、捕获多样性低的问题。

为了达到上述目的，根据本发明实施例的第一方面，一种靶向捕获遗传性耳聋基因序列的方法，所述方法包括：

1)制备靶向捕获遗传性耳聋基因外显子序列正负链的捕获膜，所述遗传性耳聋基因包括CDH23、COL11A1、DSPP、MYO7A、OTOF、PCDH15、MT-RNR1、MT-TL1、MT-TS1、MYO15A、SLC26A4、DFNA5、GJB2、GJB3、KCNJ10、SOX10、TCOF1、WFS1、DFNB59、USH1G、TMC1、DFNB31；

2)将片段化后的人基因组样品，构建为应用于高通量测序的核酸文库；

3)将所述核酸文库进行变性处理，变性处理后的核酸文库与所述的捕获膜在杂交条件下进行杂交，形成目标核酸分子-捕获膜复合物；

4)用清洗液清洗所述目标核酸分子-捕获膜复合物，然后再用洗脱液从捕获膜上洗脱、并纯化经富集后，获得遗传性耳聋基因序列。

可选地，所述捕获膜是基于尼龙膜或其衍生物膜、醋酸纤维素膜或其衍生物膜、或纤维素纸膜或其衍生物膜；优选为中性或带正电的尼龙膜、醋酸纤维素膜、或纤维素纸膜。

可选地，所述捕获膜上结合有与所述遗传性耳聋基因外显子序列相似度在90％以上的核酸探针文库。

可选地，所述遗传性耳聋基因外显子序列的正负链在捕获膜上均存在对应的核酸探针，能在杂交条件下结合。

可选地，所述核酸探针文库的制备通过以下步骤制得：

获取并纯化具有遗传性耳聋基因相同、互补、相似的核酸序列，经片段化，形成20bp～10kb片段范围，优选150bp～800bp的片段；

经片段化处理后再通过物理或化学方式变性，即得核酸探针文库。

可选地，所述遗传性耳聋基因外显子序列正负链通过物理、化学、光化学方式中的一种或多种与膜进行结合，形成捕获膜。

可选地，所述的核酸文库的核酸片段两端含有接头序列，具有核酸接头-***片段核酸-核酸接头的形式的序列特征，与高通量测序平台所要求的片段特征相符，可直接用于高通量测序。

可选地，所述变性处理后的核酸文库为在杂交前由双链核酸经过变性后产生单链核酸样品。

可选地，所述杂交条件是指在温度范围为40摄氏度到70摄氏度的杂交液中进行杂交，以实现目标核酸分子与核酸探针在该温度和杂交液中能进行结合，其中优选温度为55到65摄氏度。

可选地，所述杂交液为含有磷酸钠缓冲溶液、EDTA、BSA和SDS的溶液，或含有柠檬酸钠缓冲液(SSC)、Denhardt solution、SDS、甲酰胺的溶液中的一种或多种混合，或含有SSPE、Denhardt solution、SDS、甲酰胺的溶液中的一种或多种混合；优选杂交液为含0.5M磷酸钠缓冲溶液、1mM EDTA、1％(w/v)BSA和7％(w/v)SDS的溶液，或含有5×柠檬酸钠缓冲液(5×SSC),5×Denhardt solution和1％(w/v)SDS的溶液。

可选地，所述清洗液为含有磷酸钠缓冲溶液和SDS的溶液，或含有0.2～2x SSC和1％(w/v)SDS的溶液；优选清洗液为含有0.04M磷酸钠缓冲溶液和1.6％(w/v)SDS的溶液，或含有2x SSC和0.1％(w/v)SDS的溶液，或含有0.2x SSC和0.1％(w/v)SDS的溶液，或含有0.1x SSC和0.1％(w/v)SDS的溶液。

可选地，所述洗脱液为水、TE缓冲溶液、0.4M NaOH溶液、或0.1％(w/v)SDS溶液。

可选地，所述富集后还包括：于80℃～100℃的洗脱液中洗脱，或在pH10-12的洗脱液中对被富集的核酸进行洗脱，其中所述80℃～100℃的洗脱液为水溶液、TE缓冲液或0.1％(w/v)SDS溶液，所述pH 10-12的洗脱液为0.4M NaOH溶液。

根据本发明实施例的第二方面，还提供一种对靶向捕获遗传性耳聋基因序列的测序方法，其特征在于，所述方法包括：

制备靶向捕获遗传性耳聋基因外显子序列正负链的捕获膜，所述遗传性耳聋基因包括CDH23、COL11A1、DSPP、MYO7A、OTOF、PCDH15、MT-RNR1、MT-TL1、MT-TS1、MYO15A、SLC26A4、DFNA5、GJB2、GJB3、KCNJ10、SOX10、TCOF1、WFS1、DFNB59、USH1G、TMC1、DFNB31；

获取片段化后的人基因组样品，构建为应用于高通量测序的核酸文库；

将所述核酸文库进行变性处理，变性处理后的核酸文库与所述的捕获膜在杂交条件下进行杂交，形成目标核酸分子-捕获膜复合物；

用清洗液清洗所述目标核酸分子-捕获膜复合物，然后再用洗脱液从捕获膜上洗脱、并纯化经富集后，获得遗传性耳聋基因序列；

将所述遗传性耳聋基因序列进行高通量测序。

本发明实施例的方法中，作为实施方案之一，本发明提供一种对靶向捕获遗传性耳聋基因序列的测序方法，所述方法包括如下步骤：

(1)通过生物合成方式和/或生物酶促反应获取并纯化含有与遗传性耳聋基因序列相同、互补、或相似的核酸序列，其序列相似度与遗传性耳聋基因的cDNA大于90％。所述核酸序列可为基因组DNA、质粒、柯斯质粒、细菌人工染色体、酵母人工染色体、人工合成序列、酶切产物、PCR产物、DNA转录、RNA反转录所得的核酸片段；

(2)将所述核酸片段制备生成核酸探针文库，若核酸片段较长，如超过10kb，则先通过片段化；若核酸片段处于20bp-10kb之间，则直接进行步骤(4)，或通过转录的方式，由核酸片段转录生成用于富集遗传性耳聋基因序列的核酸探针文库；

(3)将步骤(2)较长的核酸片段通过酶切、超声波等技术手段进行片段化，片段化范围为20bp-10kp；优选150bp-800bp；

(4)将核酸片段通过加热/骤冷变性或碱变性法变性15分钟，使核酸片段成为核酸探针文库；

(5)将包含探针核酸的溶液直接转移到所述固相载体膜上；

(6)将步骤(5)的固相载体膜，放入真空箱中，真空下室温使其自然干燥约40分钟或至干燥，使探针核酸固定至固相载体膜；

(7)将步骤(6)的固相载体膜，在真空箱中，真空状态下80℃烘焙1-2小时，优选1小时，使单链核酸探针与固相载体膜牢固结合；

(8)将步骤(7)的固相载体膜，转移至含有杂交液的杂交瓶中，置于65摄氏度杂交箱中，进行预杂交，时间取决于所使用的固相载体膜，作为示例性说明，如尼龙膜可以为30分钟，醋酸纤维膜可以为6小时；

(9)在98摄氏度变性含有遗传性耳聋基因序列的核酸样品与阻断剂探针，所述核酸文库若含有接头序列和或标签核酸序列、具备进行高通量测序的序列特征，则所述阻断剂探针是与所述核酸文库中的接头序列互补的单链核酸，取出后立即置于冰上，保持核酸变性状态；(10)将步骤(9)变性后特定核酸文库，转移至步骤(8)的杂交瓶中，在杂交箱中65摄氏度旋转过夜；

(11)将步骤(10)杂交后的固相载体膜，转移至含有10倍于固相载体膜体积的清洗液密封管中，置于63摄氏度杂交箱中，清洗15分钟，共清洗三次；

(12)将步骤(11)清洗三次的固相载体膜，转移至含有500ul 1xTE缓冲液的1.5ml离心管中，置于100摄氏度水浴中，煮沸5分钟，使富集后的DNA洗脱；

(13)将步骤(12)的固相载体膜取出，后将离心管液体置于室温冷却，所得溶液含有所述的经过富集的含有遗传性耳聋基因序列的核酸文库；

(14)将步骤(13)的核酸文库纯化并处理为可进行高通量测序的文库，后用于高通量测序。

本申请的实施例提供的技术方案可以包括以下有益效果：

(1)本发明所采用捕获膜上的核酸探针文库，是通过生物合成方式和/或生物酶促反应获取并制备的，只需具有与遗传性耳聋基因序列互补或相似度达80％以上即可用于遗传性耳聋基因的富集。

(2)本发明所采用的靶向核酸富集技术，与现有的核酸富集技术相比，更易操作，成本更低。由于捕获膜的特性，固相载体膜不需要进行过度的修饰使其特异性结合特定的核酸修饰基团，因此，可以使得捕获膜上的探针能由生物合成方式和/或生物酶促反应获得而来，与现有靶向核酸富集技术中，通过人工合成探针的方式相比，具有周期短、成本低廉的优势。

(3)本发明所富集的遗传性耳聋基因序列，最终将应用于高通量测序服务，通过高通量测序，获得所富集的遗传性耳聋基因序列的具体信息，能应用于遗传性耳聋基因分型。

应当理解的是，以上的一般描述和后文的细节描述仅是示例性和解释性的，并不能限制本申请。

附图说明

此处的附图被并入说明书中并构成本说明书的一部分，示出了符合本申请的实施例，并与说明书一起用于解释本申请的原理。

图1是根据一示例性实施例示出的核酸探针经片段化后的片段范围大小。

图2是根据一示例性实施例示出的核酸探针文库的探针为单碱基位移。

具体实施方式

这里将详细地对示例性实施例进行说明，其示例表示在附图中。下面的描述涉及附图时，除非另有表示，不同附图中的相同数字表示相同或相似的要素。以下示例性实施例中所描述的实施方式并不代表与本申请相一致的所有实施方式。相反，它们仅是与如所附权利要求书中所详述的、本申请的一些方面相一致的装置和方法的例子。

实施例1制备靶向捕获遗传性耳聋基因外显子序列正负链的捕获膜

一、获得用于制备捕获探针的核酸分子

1.收集本实验室的遗传性耳聋基因CDH23、COL11A1、DSPP、MYO7A、OTOF、PCDH15、MT-RNR1、MT-TL1、MT-TS1、MYO15A、SLC26A4、DFNA5、GJB2、GJB3、KCNJ10、SOX10、TCOF1、WFS1、DFNB59、USH1G、TMC1、DFNB31的cDNA质粒。

2.经过转化、鉴定、质粒提取，获得大量cDNA质粒，用于制备捕获探针。

二、捕获探针的制备：

1.将22种质粒溶液，按照相同的分子数量进行混合，包括了CDH23、COL11A1、DSPP、MYO7A、OTOF、PCDH15、MT-RNR1、MT-TL1、MT-TS1、MYO15A、SLC26A4、DFNA5、GJB2、GJB3、KCNJ10、SOX10、TCOF1、WFS1、DFNB59、USH1G、TMC1、DFNB31；

2.取5μg混合溶液，用超声仪(Bioruptor)使核酸片段化，条件为开30s/关90s,6个循环，所产生片段范围为150bp-800bp；

3.取适量超声后的溶液，通过Agilent bioanalyzer 2200进行检测超声后片段大小，大小在150bp-800bp范围内(附图1)；

4.使用碱变性法对上述核酸片段进行变性，在室温配制：

24μl 500ng/μl DNA文库

12μl 3M NaCl

1.44μl 10N NaOH

5.室温放置15分钟，所得即为核酸探针。

6.用剪刀裁剪约0.3cm²带正电荷的尼龙膜(NG0312，RPN3038，GE)；

7.用移液枪转移步骤5中，经变性后的单链核酸探针的溶液至尼龙膜上；

8.将尼龙膜转移至真空箱内，在真空环境下室温干燥40分钟或至尼龙膜干燥；

9.将尼龙膜转移至真空箱内，温度调至80摄氏度，在真空环境下对尼龙膜烘焙1小时，使单链核酸探针与尼龙膜牢固结合。

10.冷却后，即为靶向捕获遗传性耳聋基因外显子序列正负链的捕获膜。

三、用于形成探针的质粒片段质量控制：

1.取500ng片段化后的质粒片段，用

Ultra^TMDNA Library PrepKitfor Illumina(E7645，NEB)构建样品DNA文库。

2.对构建好的文库，进行定量(Agilent bioanalyzer 2200)；

3.进行高通量测序并分析，每个基因的序列数量基本一致，片段化后的核酸，呈单碱基位移的形式，表明多样性高(附图2)。

实施例2构建DNA样品文库

1.所述DNA样品，共3个样品。

2.取500ng DNA样品，用超声仪(Bioruptor)使DNA片段化，条件为开30s/关90s,5个循环，所产生片段范围为300bp-600bp；

3.取5μl超声后溶液，加1μl 6x loading Buffer，通过琼脂糖凝胶电泳检验超声后片段大小，大小在300bp-600bp范围内；

4.对剩余样品，用

Ultra^TMDNA Library Prep Kit for Illumina(E7645，NEB)构建样品DNA文库，***片段大小范围300-600bp。

实施例3富集遗传性耳聋基因序列

一、变性DNA样品文库：

1.所述DNA样品文库为实施例2中的DNA样品文库。

2.将DNA样品文库与有助于提高杂交效率的组分混合：

20μl 50ng/μl DNA样品文库，共1μg

5ul 1μg/μl human Cot-1 DNA

8ul Blocker探针

3.混匀后置于98摄氏度加热5分钟，使文库双链DNA变性成单链；

4.取出后立即置于冰上，使DNA保持单链状态。

二、耳聋基因核酸序列的富集：

1.配制杂交液：

混匀至澄清；

2.将捕获膜置于含有1毫升杂交液的杂交瓶中，将杂交瓶置于65摄氏度杂交箱内，预杂交0.5小时，后更换新鲜杂交液并预热至65摄氏度；

3.将步骤一中的混合溶液，转移至含有捕获膜与杂交液的杂交瓶中，65摄氏度杂交24小时；

4.配制清洗液：

磷酸钠缓冲液 0.04M

SDS 1.6％

混匀至澄清，预热至63摄氏度；

5.将捕获膜转移至含有4毫升预热的清洗液的5毫升离心管中，63摄氏度清洗15分钟，共清洗三次；

6.将清洗三次后的捕获膜，转移至含有500微升TE缓冲液的1.5毫升离心管中；

7.加热1.5毫升离心管至98摄氏度，对富集后的核酸进行洗脱，5分钟后将捕获膜取出，剩余溶液冷却至温室。

三、对富集后的核酸样品文库纯化：

1.将步骤二中的剩余液体进行纯化(QIAquick PCR Purification Kit)，用30μlTE缓冲液进行洗脱；

2.纯化后的DNA，即为所得。

四、(可选)进行捕获第二次：

1.重复捕获第二次，可进一步提高目标核酸分子占核酸样品的比例；

2.扩增配制PCR体系：

20μl 含有目标核酸的TE缓冲液

2.5μl 10μm P5引物

(5’-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACAC-3’)

2.5μl 10μm P7引物(5’-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT-3’)

25μl预混Taq酶(Takara)

混匀，总体积50μl；

3.PCR条件如下：

4.重复步骤一到步骤四。

实施例4高通量测序及数据分析

1.对实例3中的产物通过Agilent bioanalyzer 2200进行定量；

2.对实施例3中的3个样本进行高通量测序，使用illumina测序平台Hiseq2500进行2x150bp的测序；

3.获得raw data，处理并分析数据，得到关键参数的统计结果，见表1。

表1：

实施例5样品突变分析

基于实例4中的数据，共3个样本，通过二代测序数据分析流程找出突变位点，见表2。

表2：

本领域技术人员在考虑说明书及实践这里公开的内容后，将容易想到本申请的其它实施方案。本申请旨在涵盖本申请的任何变型、用途或者适应性变化，这些变型、用途或者适应性变化遵循本申请的一般性原理并包括本申请未公开的本技术领域中的公知常识或惯用技术手段。说明书和实施例仅被视为示例性的，本申请的真正范围和精神由下面的权利要求指出。

应当理解的是，本申请并不局限于上面已经描述并在附图中示出的精确结构，并且可以在不脱离其范围进行各种修改和改变。本申请的范围仅由所附的权利要求来限制。

Claims (10)

1.一种靶向捕获遗传性耳聋基因序列的方法，其特征在于，所述方法包括：

1)制备靶向捕获遗传性耳聋基因外显子序列正负链的捕获膜，所述遗传性耳聋基因包括CDH23、COL11A1、DSPP、MYO7A、OTOF、PCDH15、MT-RNR1、MT-TL1、MT-TS1、MYO15A、SLC26A4、DFNA5、GJB2、GJB3、KCNJ10、SOX10、TCOF1、WFS1、DFNB59、USH1G、TMC1、DFNB31；

2)将片段化后的人基因组样品，构建为应用于高通量测序的核酸文库；

3)将所述核酸文库进行变性处理，变性处理后的核酸文库与所述的捕获膜在杂交条件下进行杂交，形成目标核酸分子-捕获膜复合物；

4)用清洗液清洗所述目标核酸分子-捕获膜复合物，然后再用洗脱液从捕获膜上洗脱、并纯化经富集后，获得遗传性耳聋基因序列。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述捕获膜是基于尼龙膜或其衍生物膜、醋酸纤维素膜或其衍生物膜、或纤维素纸膜或其衍生物膜；优选为中性或带正电的尼龙膜、醋酸纤维素膜、或纤维素纸膜。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述捕获膜上结合有与所述遗传性耳聋基因外显子序列相似度在90％以上的核酸探针文库。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述核酸探针文库的制备通过以下步骤制得：

获取并纯化具有遗传性耳聋基因相同、互补、相似的核酸序列，经片段化，形成20bp～10kb片段范围，优选150bp～800bp的片段；

经片段化处理后再通过物理或化学方式变性，即得核酸探针文库。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述遗传性耳聋基因外显子序列正负链通过物理、化学、光化学方式中的一种或多种与膜进行结合，形成捕获膜。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述杂交条件是指在温度范围为40摄氏度到70摄氏度的杂交液中进行杂交，以实现目标核酸分子与核酸探针在该温度和杂交液中能进行结合，其中优选温度为55到65摄氏度。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述杂交液为含有磷酸钠缓冲溶液、EDTA、BSA和SDS的溶液，或含有柠檬酸钠缓冲液(SSC)、Denhardt solution、SDS、甲酰胺的溶液中的一种或多种混合，或含有SSPE、Denhardt solution、SDS、甲酰胺的溶液中的一种或多种混合；优选杂交液为含0.5M磷酸钠缓冲溶液、1mM EDTA、1％(w/v)BSA和7％(w/v)SDS的溶液，或含有5×柠檬酸钠缓冲液(5×SSC),5×Denhardt solution和1％(w/v)SDS的溶液。

8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述清洗液为含有磷酸钠缓冲溶液和SDS的溶液，或含有0.2～2x SSC和1％(w/v)SDS的溶液；优选清洗液为含有0.04M磷酸钠缓冲溶液和1.6％(w/v)SDS的溶液，或含有2x SSC和0.1％(w/v)SDS的溶液，或含有0.2x SSC和0.1％(w/v)SDS的溶液，或含有0.1x SSC和0.1％(w/v)SDS的溶液。

9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述洗脱液为水、TE缓冲溶液、0.4M NaOH溶液、或0.1％(w/v)SDS溶液。

10.一种对靶向捕获遗传性耳聋基因序列的测序方法，其特征在于，所述方法包括：

制备靶向捕获遗传性耳聋基因外显子序列正负链的捕获膜，所述遗传性耳聋基因包括CDH23、COL11A1、DSPP、MYO7A、OTOF、PCDH15、MT-RNR1、MT-TL1、MT-TS1、MYO15A、SLC26A4、DFNA5、GJB2、GJB3、KCNJ10、SOX10、TCOF1、WFS1、DFNB59、USH1G、TMC1、DFNB31；

获取片段化后的人基因组样品，构建为应用于高通量测序的核酸文库；

将所述核酸文库进行变性处理，变性处理后的核酸文库与所述的捕获膜在杂交条件下进行杂交，形成目标核酸分子-捕获膜复合物；

用清洗液清洗所述目标核酸分子-捕获膜复合物，然后再用洗脱液从捕获膜上洗脱、并纯化经富集后，获得遗传性耳聋基因序列；

将所述遗传性耳聋基因序列进行高通量测序。

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