JP2010535529A - マイクロアレイ製造用３’ベースシークエンシング手法 - Google Patents

Abstract

核酸マイクロアレイの作製用設計配列を作る方法が記載される。本方法は、組織試料又は罹患状態の転写産物のハイスループット３’シークエンシングを使用して核酸マイクロアレイ用のプローブを設計する。また、組織中の転写産物の最３’側末端を標的とするプローブを有する核酸マイクロアレイも記載される。こうしたマイクロアレイは、好ましくは、転写産物が由来する組織に特異的な選択的ポリアデニル化配列を表す。また、組織における遺伝子発現について、偽陽性及び偽陰性結果を低減して評価するための、転写産物の最３’側末端を標的とするマイクロアレイの使用方法も記載される。

Description

優先権の主張及び関連出願の相互参照
本願は、参照により本明細書に援用される２００７年８月１３日出願の米国仮特許出願第６０／９６４４７０号の優先権を主張する。

本発明は、ヌクレオチドの３’シークエンシングを用いて核酸マイクロアレイを設計する方法に関する。本発明はまた、３’シークエンシングを用いて組織のトランスクリプトームを同定する方法にも関する。

従来から用いられているＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ及び他のマイクロアレイメーカー製のＤＮＡマイクロアレイは、公的に利用可能なデータから作成されている。ほとんどのアレイは３’バイアスを伴い設計されているが、プローブ設計に用いられる配列データは、主に５’シークエンシングによって作られた公開データベースからとられている。これらの配列はほぼ完全であるが、配列の３’末端における選択的ポリアデニル化は、３’末端が異なる組織及び疾患状況において発現するため、考慮されていない。

例えば、ヒト遺伝子のうち２９％超が、選択的ポリアデニル化［ポリ（Ａ）］部位を有すると推定されている。（Ｂｅａｕｄｏｉｎｇ，Ｅ（２００１）Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．，１１，１５２０−１５２６）。選択的ポリ（Ａ）部位の選択は、細胞型及び疾患状態などの生物学的条件に関連すると考えられている（Ｅｄｗａｌｄｓ−Ｇｉｌｂｅｒｔ，Ｇ ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，２５，２５４７−２５６１）。３’末端のエクソンが選択的スプライシングを受ける場合、選択的ポリアデニル化が関与する。選択的ポリアデニル化の結果、組織又は疾患状態に応じて様々な３’末端を有するｍＲＮＡ、すなわち種々のＣ末端を有するタンパク質が生じ得る。ますます多くの遺伝子がこの機序によって調節されることが分かっている。選択的ポリアデニル化部位のデータベースを作成しようとする取り組みはなされているが、現時点でかかる部位が全て知られているわけではない。（Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２００５，Ｖｏｌ．３３，Ｄａｔａｂａｓｅ ｉｓｓｕｅ Ｄ１１６−Ｄ１２０）。さらに、組織特異的又は疾患特異的マイクロアレイを設計する場合、選択的ポリアデニル化に注意を払わなければ、結果として遺伝子発現プロファイリングが最適以下となり、最終使用時に偽陰性及び偽陽性結果が生じ得る。公開データベースからマイクロアレイを作ると、選択的ポリアデニル化が考慮されない。それほど高度な３’シークエンシングはなく、公開データベースには選択的３’ポリアデニル化は十分に反映されていないことがほとんどである。

また、文献には組織特異的ポリアデニル化が多くみられることも報告されており、そうしたことからも、目的の疾患又は組織において発現するとおりの、真正の３’末端を確立することの重要性がさらに明確となる。ヒトｍＲＮＡ前駆体のうち３分の１超が選択的ＲＮＡプロセシング修飾を受けるため、これは普遍的な生物学的過程となっている。産生されるタンパク質アイソフォームは異なる機能、時に正反対の機能を有し、この過程の重要性を強調するものである。哺乳動物種における数多くの遺伝子が選択的ポリアデニル化を受けることができ、これが様々な３’末端を有するｍＲＮＡにつながっている。ｍＲＮＡの３’末端は、多くの場合、ｍＲＮＡの安定性、ｍＲＮＡの局在化及び翻訳に重要なシスエレメントを含み、そのためポリアデニル化の調節のもつ意味合いは何倍にも倍増し得る。選択的ポリアデニル化はシスエレメント及びトランス因子によって制御され、組織特異的又は疾患特異的な形で起こると考えられている。ｍＲＮＡ代謝の他の側面、例えば転写開始及びスプライシングに特化したデータベースが多く利用可能であることを考えると、選択的ポリアデニル化及びその調節を含め、ポリアデニル化に関する系統的情報は著しく欠如している。

従って、マイクロアレイによる検出を改善するためには、特定の組織及び罹患状態に対応する配列の真正の３’末端を得ることが重要である。

本明細書には、３’シークエンシングによって配列決定されたＲＮＡ転写産物から得られる設計配列を使用してマイクロアレイを作製する方法が提供される。これらの方法により、それ以外では従来のアレイには存在しない、選択的ポリアデニル化転写産物形態に対するプローブを含む組織特異的及び疾患特異的マイクロアレイの作成が可能となる。これらの方法により、最終的に発現プロファイリング又は診断法若しくは予後判定法に使用される場合に、偽陽性及び偽陰性結果を低減するアレイが提供される。

さらに当業者は、組織タイプ及び疾患状態に応じて様々な選択的３’ポリアデニル化転写産物形態があることを理解するであろう。この多様性に対処するべく、被験対象の組織又は疾患由来の転写産物の真正の３’末端を同定するための、転写産物のハイスループット３’シークエンシング方法が提供される。

一実施形態において、転写産物は最３’側末端（ｅｘｔｒｅｍｅ ３’ｅｎｄ）から配列決定され、それにより選択的ポリアデニル化部位を考慮に入れた、当該の組織又は疾患状態に特異的な３’末端配列が得られる。結果としてもたらされる最３’側配列（ｅｘｔｒｅｍｅ ３’ｓｅｑｕｅｎｃｅ）が、次にプローブ設計及びアレイ作成用の設計配列として使用される。

別の実施形態において、単離されたＲＮＡ試料の試料中の転写産物は、ＲＮＡ試料中の実質的に全ての転写産物が配列決定されるまで、ハイスループット３’シークエンシングに供される。これらの最３’側配列が、次にプローブ設計及びアレイ作成用の設計配列として使用される。本発明に記載される方法により、結果として標準的な市販アレイと比べて極度に３’側である最３’側バイアス（ｅｘｔｒｅｍｅ ３’ｂｉａｓ）がアレイにもたらされる。マイクロアレイ用のプローブ設計における３’バイアスは、最後の３００塩基が対象となる。しかしながら、重要な違いは設計配列の作成にある。３’シークエンシングでは、関心対象の組織又は疾患状態において発現するとおりの、転写産物の真正かつ正確な３’末端であることが確定した実際の配列に基づいて転写産物の実際の３’末端が得られ、アレイが設計される。

こうした方法を用いる利点としては、組織特異的又は疾患特異的３’変異体の同定；疾患／組織タイプ内における複数の３’変異体の同定、並びに新鮮凍結組織及びホルマリン固定パラフィン包埋組織のいずれによっても、使用される配列がより正確に得られることが挙げられる。

従って本発明の目的は、マイクロアレイ用のプローブ設計に使用される入力配列セットを作る方法を提供することである。

本発明の別の目的は、プローブ設計用の組織及び疾患特異的配列を提供することである。

本発明のさらに別の目的は、組織及び疾患特異的プローブを伴い設計されたマイクロアレイを使用することにより、特定のトランスクリプトームの検出精度を高めることである。

Ｉ．アレイの作製方法
本明細書に提供される方法は、その３’末端から配列決定された転写産物のプールから作られるマイクロアレイを作製することによって、組織又は組織を回収した箇所の疾患状態の、ポリアデニル化部位の正確な表現を提供することに関する。これらの方法は、結果として標準的な市販のマイクロアレイに存在する３’バイアスと比べて極度の最３’側バイアスを、マイクロアレイ設計にもたらす。これらの方法はまた、種々の方法で回収及び保存された患者組織試料の処理、並びに特定の組織タイプ又は疾患状態に特異的なプローブを設計するための転写産物プールの同定に有用である。この既存のマイクロアレイ技術の改良により、患者組織試料をより正確に、目的を絞って分析することが可能となる。

本明細書で使用される場合、マイクロアレイの「３’バイアス」とは、アレイの設計において、代表的な転写産物又は設計配列の３’領域からプローブが選択されることを意味する。概して、核酸マイクロアレイは３’バイアスを有し、主要なマイクロアレイ製造者の間では、３’バイアスを有するプローブを使用することが一般的である。例えば、ほとんどのＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ発現アレイの場合、プローブは最後の６００塩基から選択される。

プローブ設計に使用される転写産物の「最３’側末端」という用語は、本明細書で使用されるとき、概して転写産物の３’側に最も近い約３００ｂｐを指す。プローブ設計は、ポリアデニル化部位から測った配列の最も３’側の部分を使用する。他の実施形態において、最後の５００ｂｐ、４００ｂｐ、２５０ｂｐ又は最後の２００ｂｐが、プローブ設計用の最３’側末端として使用される。

ＦＦＰＥ試料は、ＲＮＡ分子の断片化及び化学修飾の可能性を含め、マイクロアレイ分析に特有の問題を提起する。典型的には新鮮凍結組織のみが調べられ得るが、これは、そのＲＮＡがより良好に保存され、それほど著しい分解がないためである。多くのＦＦＰＥ組織試料は、こうしたマイクロアレイを使用して遡及的に調べられることはないであろうから、これは残念なことである。３’バイアスを有する設計を使用すると、ＲＮＡの５’−３’分解の結果として（例えば、５’−３’エキソヌクレアーゼ活性を介して）起こるこの問題が解消される。最３’側バイアスはまた、結果としてマイクロアレイ実験における検出率の大幅な上昇及びより強力なシグナルをもたらすことも実証されている。転写産物の最３’側末端で設計されたプローブは転写産物の検出効率がより高く、従って、ＦＦＰＥ組織から抽出されたＲＮＡなどの、部分的に分解されたＲＮＡのプロファイリングが可能なため、転写産物の最３’側末端からマイクロアレイプローブを設計することによる本方法によれば、ＦＦＰＥ組織及び新鮮凍結組織のいずれから抽出されたＲＮＡも試験することが可能なマイクロアレイが作製される。さらに、単に公開データベースにある公知の配列の最３’側末端を使用するのとは対照的に、３’シークエンシングを使用すると、プローブ設計用の組織特異的又は疾患特異的転写産物の真正の最３’側配列が提供される。

本明細書で使用される場合、用語「３’シークエンシング」は、３’末端がポリ（Ａ）テールを含む場合における３’末端からの転写産物の配列決定を意味する。転写産物の３’末端の真正の配列を決定するためには、従来のシークエンシング方法が用いられ得る。

用語「断片」、「セグメント」、又は「ＤＮＡセグメント」は、より大きいＤＮＡポリヌクレオチド又はＤＮＡの一部分を指す。例えば、ポリヌクレオチドは、複数のセグメントに分割されるか、又は断片化され得る。様々な核酸の断片化方法が当該技術分野において周知である。これらの方法は、例えば、化学的な性質のものであっても、或いは物理的な性質のものであってもよい。化学的断片化としては、ＤＮＡｓｅによる部分的分解；酸による部分的脱プリン反応；制限酵素の使用；イントロンがコードするエンドヌクレアーゼ；三重鎖形成及びハイブリッド形成方法などの、切断作用物質を核酸分子の特定の位置に局在化させるための核酸セグメントの特異的ハイブリダイゼーションに依存するＤＮＡベースの切断方法；又は、既知若しくは未知の位置でＤＮＡを切断する他の酵素若しくは化合物を挙げることができる。物理的断片化方法には、ＤＮＡを高剪断速度に供することが関わり得る。高剪断速度は、例えば、ピット若しくはスパイクを有するチャンバ若しくはチャンネルにＤＮＡを通すか、又は制限されたサイズの流路、例えば、ミクロン若しくはサブミクロンスケールの断面寸法を有する開孔にＤＮＡ試料を押し通すことによって生じ得る。他の物理的方法としては、超音波処理及び噴霧化が挙げられる。同様に、熱及びイオンの介在する加水分解による断片化など、物理的断片化と化学的断片化とを組み合わせた方法も用いられ得る。例えば、あらゆる目的のため全体として参照により本明細書に援用されるＳａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ」、第３版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（２００１年）（「Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．」）を参照のこと。これらの方法は、核酸が特定のサイズ範囲の断片に消化されるよう最適化され得る。有用なサイズ範囲は、２０、５０、１００、２００、又は４００塩基対のなかにあり得る。

遺伝子発現について分析される患者組織が、パラフィン包埋組織から抽出されたＲＮＡである場合、転写産物の３’領域と特異的に結合するプローブを使用することが有利である。各プローブは、転写産物の３’末端の５００ｂｐ、４００ｂｐ、３００ｂｐ、又は２００ｂｐ、又は１００ｂｐ以内に出現するそれぞれの転写産物の相補配列とハイブリダイズすることが可能である。

従来の方法とは異なり、本方法を使用すれば、６００００個の転写産物をその上に有するアレイを設計するために、当業者は６００００個のアクセッション番号又は遺伝子ＩＤ及びそれらの配列からの設計プローブを入手するのではなく、６００００個の転写産物を組織試料から実際に取り出すことになる。これらの配列、すなわち「入力配列セット」又は設計配列の作成に３’シークエンシングを用いることは、特に関連性を有する。

本明細書で使用される場合、用語「入力配列セット」又は「設計配列」は、マイクロアレイの設計に使用される配列として定義される。

第１の実施形態において、本発明は、組織試料からＲＮＡを単離するステップと、単離されたＲＮＡの転写産物を配列決定するステップと、及び配列決定された転写産物の最３’側末端を標的とする核酸プローブをマイクロアレイ上に設計するステップとによって、核酸マイクロアレイを設計する方法を提供する。プローブは好ましくは転写産物の最３’側末端と結合し、それにより、ＲＮＡを単離した組織又は疾患状態に特異的な任意の選択的ポリアデニル化部位が考慮される。プローブは、好ましくは転写産物の最３’側末端と相補的であり、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で特異的に結合する。

ＲＮＡ抽出方法は当該技術分野において公知であり、また、市販のＲＮＡ抽出キット、例えば、ＲＮｅａｓｙ（Ｑｉａｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）、ＡｒｒａｙＩｔ（登録商標）マイクロトータルＲＮＡ抽出キット（Ｔｅｌｅｃｈｅｍ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ）及びＴｏＴＡＬＬＹ ＲＮＡ（商標）（Ａｍｂｉｏｎ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）などを使用して組織試料からＲＮＡを単離してもよい。（Ｓａｍｂｒｏｏｋ等）。ｃＤＮＡライブラリを調製する方法もまた当該技術分野において公知であり、逆転写、クローニング及び植菌方法を含む。（Ｓａｍｂｒｏｏｋ 等）。配列の最３’側末端が、単離されたＲＮＡから正確に逆転写されることを保証するためには、転写産物の最３’側末端を標的とするプライマーが特に有用である。例えば、アンカーオリゴｄＴプライマー、又はオリゴｄＴプライマーが、ライブラリ作成について転写産物の最３’側末端の正確な転写を保証するために特に有用である。

シークエンシング反応においてプライマーとして使用されるオリゴヌクレオチドはまた、標識も含み得る。これらの標識としてはラジオヌクレオチド（ｒａｄｉｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）、蛍光標識、ビオチン、化学発光標識が含まれるが、これらに限定されない。当該技術分野において公知の種々のシークエンシング技術、例えば、ジデオキシシークエンシング、サイクルシークエンシング、ミニシークエンシング、ハイブリダイゼーションによるシークエンシング、ＭＳベースのシークエンシング、パイロシークエンシングなどの合成（ＳＢＳ）手法によるＤＮＡシークエンシング、単一ＤＮＡ分子、ポリメラーゼコロニー及びその任意の変異体のシークエンシングが、転写産物の最３’側末端のシークエンシングに有用であり得る。

一実施形態において、ハイスループット３’シークエンシングを使用してアレイ用の設計配列が作成され得る。入力配列セットは、特定の組織又は疾患状態における全ての、又は実質的に全ての転写産物のハイスループットシークエンシングによって作られる。ハイスループットシークエンシング手法を使用すると、他の一般的なマイクロアレイに含まれるものと比べ、転写産物の３’末端により近いプローブの作成が可能となる。

設計配列が作られた後、標的試料における転写産物の最３’側末端に特異的に結合するようにプローブ又はプローブセットが設計される。所与の配列からプローブ及びプローブセットを設計するための市販のソフトウェアが存在し、これはオリゴヌクレオチドと標的との間のクロスハイブリダイゼーションを低減するように最適化されている。かかるソフトウェアプログラムの例としては、限定はされないが、Ｖｉｓｕａｌ ＯＭＰ、ＯｌｉｇｏＷｉｚ ２．０及びＡｒｒａｙＤｅｓｉｇｎｅｒが挙げられる。

本明細書に記載される３’シークエンシング方法を用いて得られるポリヌクレオチド配列は、ヌクレオチドアレイの設計及び構築に使用され得る。配列が得られた後、転写産物の最３’側末端に対応するプローブのセットが選択され得る。プローブ設計において考慮される最も重要な因子の１つとしては、プローブ長、融解温度（Ｔｍ）、及びＧＣ含量、特異性、相補的プローブ配列、及び３’末端配列が挙げられる。一実施形態において、最適なプローブは、概して１７〜３０塩基長であり、約２０〜８０％、例えば、約５０〜６０％のＧ＋Ｃ塩基を含む。典型的には、５０℃〜８０℃、例えば約５０℃〜７０℃のＴｍが好ましい。

プローブ及びプローブセットが設計された後、こうしたプローブを含むマイクロアレイが製造され、これはある組織又は疾患状態のＲＮＡと結合するように特別に設計されたものである。マイクロアレイは、先細ピンによるガラススライドへのプリント、予め作製されたマスクを用いるフォトリソグラフィ、動的マイクロミラー装置を用いるフォトリソグラフィ、インクジェットプリント、又は微小電極アレイへの電気化学処理を含め、様々な技術を用いて製造され得る。ロングオリゴヌクレオチドアレイは６０塩基長又は５０塩基長から構成され、シリカ基板（Ａｇｉｌｅｎｔ）に対するインクジェットプリントによって作製される。ショートオリゴヌクレオチドアレイは２５塩基長又は３０塩基長から構成され、シリカ基板に対するフォトリソグラフィ合成（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）又はアクリルアミドマトリクスに対する圧電成膜（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙｓ）によって作製される。別の方法であるＮｉｍｂｌｅＧｅｎ ＳｙｓｔｅｍｓからのＭａｓｋｌｅｓｓ Ａｒｒａｙ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（マイクロミラーを使用）は、一体となった多数のプローブに対する自在性を有する。

特に、関連する疾患特異的な内容と３’ベースのプローブ設計との組み合わせは、新鮮凍結組織及びＦＦＰＥ組織のいずれからもＲＮＡの強い（ｒｕｂｕｓｔ）プロファイリングが可能な独自の方法及び製品を提供する。

これらの方法はまた、ある組織からの実質的に全てのトランスクリプトームを代表するアレイの作成にも用いられ得る。例えば、一実施形態において、肺癌トランスクリプトームを定義する場合、３’ベースのシークエンシング手法が用いられることで各転写産物の３’側最末端に対するプローブセットの設計が促進される。この手法によると一層高い検出率が確保され、ひいては新鮮凍結組織及びＦＦＰＥ組織のいずれの試料からもＲＮＡ転写産物を検出するよう最適な設計となる。Ａｌｍａｃ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ Ｌｕｎｇ Ｃａｎｃｅｒ ＤＳＡ（商標）は、ＦＦＰＥ組織から抽出されたＲＮＡから生物学的に有意義で再現可能なデータを生成することが可能な研究ツールの一例である。

ＩＩ マイクロアレイ
改良されたマイクロアレイを作るため、転写産物の最３’側末端とハイブリダイズするように設計された核酸プローブを固体支持体上に配列してアレイを作製する。このアレイは、１つ若しくは複数の組織又は１つ若しくは複数の疾患に対応する複数の組織転写産物を表し得る。疾患特異的アレイは、ある一定の疾患状況において発現する転写産物を含む。本明細書に提供される診断、予後判定及び予測アッセイ用のアレイは、当該技術分野において公知の好適な技術を用いて構築される。例えば、米国特許第５４８６４５２号明細書；同第５８３０６４５号明細書；同第５８０７５５２号明細書；同第５８００９９２号明細書及び同第５４４５９３４号明細書を参照のこと。各アレイにおいて、個々の核酸プローブは１回のみ現れてもよく、又は複数回現れてもよい。アレイはまた、場合により対照核酸プローブを含んでもよく、これは、例えば陽性対照の場合にはハウスキーピング遺伝子を標的としたり、又は陰性対照として、その組織で発現しないことが分かっている遺伝子を標的としたりする。

一実施形態において、転写産物及び／又は転写産物断片を代表する組織特異的核酸プローブは、当該技術分野において周知の核酸の固定化又は結合技術を用いて、アレイ上の複数の物理的に異なる位置に固定化される。いくつかの物理的に異なる位置にある断片は、一体となって転写産物全体又は転写産物全体のなかの別個の部分を構成し得る。断片は、転写産物のなかの連続した部分又は転写産物のなかの不連続な部分と相補的であり得る。標的試料の核酸分子がアレイ上の断片とハイブリダイズすると、それは、試料中に標的の転写産物が存在することを示している。ハイブリダイゼーション及びハイブリダイゼーションの検出は、当業者に周知のルーチンの検出方法によって実施され、及び以下でさらに詳細に説明される。

一実施形態において、罹患組織試料中の標的配列を他の核酸配列と区別する複数のプローブ配列が使用される。いくつかの実施形態において、設計配列の少なくとも２％がアレイ上のプローブの組み合わせによって表される。さらなる実施形態において、標的配列の少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、又は少なくとも９０％が、アレイ上のプローブによって表される。

一実施形態において、転写産物は、プローブ配列の少なくとも５０％と相補的である。他の実施形態において、転写産物は、プローブ配列の少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％又は１００％と相補的である。

別の実施形態において、転写産物の最３’側末端全体に対応する核酸プローブ又は転写産物の最３’側末端全体の断片が、アレイ上の唯１つの物理的に異なる位置に「スポット状アレイ」方式で固定化される。特定の核酸プローブの複数のコピーが、アレイ基板に別々の位置で結合し得る。好ましくは、このタイプの「スポット状アレイ」は、本明細書で新規に同定された核酸分子の１つ又は複数を含む。

所与のアレイについて、各核酸プローブは、配列全体又は種々の長さに断片化された配列であり得る。転写産物全体を構成する全ての断片がアレイ上に存在する必要はない。全転写産物のうちの一部分に相当するアレイ上のプローブと転写産物がハイブリダイズすると、それは、転写産物を単離した組織におけるその転写産物の存在又は発現レベルを示したものであり得る。

当業者は、所与のアレイ上の核酸プローブが、所与の組織試料中の転写産物特異的標的と相補的であることを理解するであろう。天然配列を含むアレイが設計されてもまたよく、それにより標的試料中のアンチセンス分子の存在が同定される。最近の文献では、癌及び他の疾患において内在性アンチセンスが関与しているとされ、その点で内在性アンチセンスＲＮＡ転写産物は興味深い。

上述されるとおり、特定の疾患、例えば特定の癌に特異的なアレイは、特定のポリアデニル化部位を標的とするプローブを含むように設計され得る。

核酸プローブを固定化し、又は結合させる固相としては、任意の好適な基板が使用され得る。例えば、基板は、ガラス、プラスチック、金属、金属被覆基板又は任意の材料のフィルタであってよい。基板表面は、任意の好適な形状であってよい。例えば、表面は平面状であってもよく、又は基板上に固定化された核酸プローブを分離するための***若しくは溝を有してもよい。他の実施形態では、核酸がビーズに付着され、これらのビーズは別々に同定可能である。核酸プローブは、共有結合又は非共有結合を含め、そのハイブリダイゼーションを可能とする任意の好適な方法で基板に付着される。

ＩＩＩ．アレイの使用方法
本明細書に記載されるアレイは、発現プロファイリング、診断、予後判定、薬物療法、及び薬物スクリーニングなど、任意の好適な目的に使用され得るが、これらに限定されない。

概して、ＲＮＡを組織試料から単離してアレイと接触させ、組織試料由来の標的配列とマイクロアレイ上の相補的プローブとの間の特異的結合を可能とするのに十分なストリンジェンシーのもとでハイブリダイズさせる。基板に固定化されたプローブは、ストリンジェントな条件下で核酸試料由来の転写産物とハイブリダイズするのに好適である。蛍光標識されたヌクレオチドプローブが、対象となる組織から抽出したＲＮＡを逆転写することによる蛍光ヌクレオチドの取り込みを介して作成され得る。アレイに付着させた標識プローブは、アレイ上の各ヌクレオチドと特異性を伴いハイブリダイズする。ストリンジェントな洗浄により、特異的に結合しなかったプローブを除去した後、共焦点レーザー顕微鏡法か、又は別の検出方法、例えばＣＣＤカメラなどによってアレイをスキャンする。配列化された各要素のハイブリダイゼーションを定量化することにより、対応する転写産物の存在量を評価することができる。

用語「実質的に」同一である、又は相同である、又は類似しているとは、当業者が理解するとおり文脈によって変わり、概して、少なくとも７０％の同一性を意味し、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、及び最も好ましくは少なくとも９５％の同一性を意味する。

ハイブリダイゼーション反応の「ストリンジェンシー」は、当業者が容易に決定可能であり、概して、プローブ長、洗浄温度、及び塩濃度に応じた経験的計算である。一般に、プローブが長いほど、適切なアニーリングのためにより高い温度が求められ、一方、プローブが短いほど必要な温度は低くなる。ハイブリダイゼーションは、概して、融解温度未満の環境において相補鎖が存在するときの変性ＤＮＡの再アニーリング能力に依存する。プローブとハイブリダイズ可能な配列との間に所望される相同性の程度が高いほど、用いられる相対温度はより高くなり得る。結果として、相対温度が高いほど反応条件はよりストリンジェントとなり、一方、温度が低いほどそうではなくなる傾向があることになる。ハイブリダイゼーション反応のストリンジェンシーについてのさらなる詳細及び説明については、Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，（１９９５年）を参照のこと。

「ストリンジェント条件」又は「高ストリンジェンシー条件」は、本明細書に定義されるとおり、典型的には：（１）洗浄に低いイオン強度及び高い温度、例えば０．０１５Ｍの塩化ナトリウム／０．００１５Ｍのクエン酸ナトリウム／０．１％のドデシル硫酸ナトリウムを５０℃で用いるか；（２）ハイブリダイゼーション中にホルムアミドなどの変性剤、例えば、０．１％ウシ血清アルブミン／０．１％Ｆｉｃｏｌｌ／０．１％ポリビニルピロリドン／５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ６．５、７５０ｍＭ塩化ナトリウム、７５ｍＭクエン酸ナトリウム含有、を含む５０％（ｖ／ｖ）ホルムアミドを４２℃で用いるか；又は（３）５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ（０．７５ＭのＮａＣｌ、０．０７５Ｍのクエン酸ナトリウム）、５０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ６．８）、０．１％ピロリン酸ナトリウム、５倍デンハルト溶液、超音波処理したサケ***ＤＮＡ（５０μｇ／ｍｌ）、０．１％ＳＤＳ、及び１０％硫酸デキストランを４２℃で用いて、０．２×ＳＳＣ（塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム）中４２℃で洗浄し、及び５０％ホルムアミドを５５℃で用い、これに続いてＥＤＴＡ含有０．１×ＳＳＣからなる高ストリンジェンシー洗浄を５５℃で行う。

「中程度にストリンジェントな条件」は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，１９８９年によって記載されるものと特定することができ、上述されたものより低いストリンジェンシーの洗浄溶液及びハイブリダイゼーション条件（例えば、温度、イオン強度及び％ＳＤＳ）の使用を含む。中程度にストリンジェントな条件の例は、２０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ（１５０ｍＭのＮａＣｌ、１５ｍＭのクエン酸三ナトリウム）、５０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ７．６）、５×デンハルト溶液、１０％硫酸デキストラン、及び２０ｍｇ／ｍｌの変性剪断サケ***ＤＮＡを含む溶液中で一晩３７℃でインキュベートし、続いて１×ＳＳＣ中約３７〜５０℃でフィルタを洗浄することである。当業者は、温度、イオン強度等を、必要に応じてプローブ長などの因子に適合するよういかに調節すればよいか、認識しているであろう。

本マイクロアレイは、種々の疾患状態の研究に有用である。用語「疾患」又は「疾患状態」は、その疾患に罹患した生物体における細胞、細胞コンパートメント、又は細胞小器官の小分子プロファイルの変化を結果的にもたらすか、又は潜在的に引き起こし得るあらゆる疾患を含む。かかる疾患は、主に３つの種類、すなわち、新生物疾患、炎症性疾患、及び変性疾患に分類することができる。

疾患の例としては、代謝疾患（例えば、肥満症、悪液質、糖尿病、食欲不振症等）、心血管疾患（例えば、アテローム性動脈硬化症、虚血／再灌流、高血圧症、心筋梗塞、再狭窄、心筋症、動脈炎等）、免疫不全（例えば、慢性炎症性疾患及び障害、例えばクローン病、炎症性腸疾患、反応性関節炎、関節リウマチ、ライム病を含む変形性関節症、インスリン依存性糖尿病、多発性硬化症と、橋本甲状腺炎と、グレーブス病とを含む臓器特異的自己免疫病、接触性皮膚炎、乾癬、移植片拒絶反応、移植片対宿主病、サルコイドーシス、アレルギー性鼻炎を含む喘息及びアレルギーなどのアトピー性病態、食物アレルギーを含む消化管アレルギー、好酸球増加症、結膜炎、糸球体腎炎、蠕虫などの特定の病原体への易罹患性（例えば、リーシュマニア症）及びＨＩＶを含む特定のウイルス感染症、並びに結核及びらい腫らいを含む細菌感染症等）、ミオパチー（例えば、多発筋炎、筋ジストロフィー、特定のコア病、中心核（筋細管）ミオパチー、先天性筋強直症、ネマリンミオパチー、先天性パラミオトニア、周期性四肢麻痺、ミトコンドリアミオパチー等）、神経系障害（例えば、ニューロパチー、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、筋萎縮性側索硬化症（ａｍｙｏｔｒｏｐｉｃ ｌａｔｅｒａｌ ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ）、運動ニューロン疾患、外傷性神経損傷、多発性硬化症、急性散在性脳脊髄炎、急性壊死性出血性白質脳炎、髄鞘形成不全疾患、ミトコンドリア病、片頭痛障害、細菌感染症、真菌感染症、脳卒中、加齢、認知症、末梢神経系疾患、並びにうつ病及び統合失調症などの精神障害等）、腫瘍障害（例えば、白血病、脳癌、前立腺癌、肝癌、卵巣癌、胃癌、結腸直腸癌、咽喉癌、乳癌、皮膚癌、メラノーマ、肺癌、肉腫、子宮頸癌、精巣癌、膀胱癌、内分泌癌、子宮内膜癌、食道癌、神経膠腫、リンパ腫、神経芽細胞腫、骨肉腫、膵癌、下垂体癌、及び腎癌など）並びに眼疾患（例えば色素性網膜炎及び黄斑変性症）が挙げられるが、これらに限定されない。この用語はまた、公知の、及び未知の、酸化的ストレス、遺伝性癌症候群、及び代謝疾患によって引き起こされる障害も含む。

本発明のさらなる詳細が、以下の非限定的な実施例に記載される。

実施例１：ハイスループット３’シークエンシングを用いたマイクロアレイ設計配列の同定
ライブラリ作成及びｃＤＮＡシークエンシング
組織からのＲＮＡ抽出
ＲＮＡ ＳＴＡＴ−６０を使用して、製造者の指示に従い凍結肺組織塊からＲＮＡを単離した。使用説明書に対し、抽出開始前にＴｉｓｓｕｅ Ｌｙｓｅｒ（Ｑｉａｇｅｎ）を使用してＲＮＡ−ＳＴＡＴ−６０中、２０Ｈｚで６分間にわたり各組織塊を均質化する修正を含めた。Ｂｉｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）を使用してＲＮＡ収率を決定し、Ａｇｉｌｅｎｔ ２１００ ＢｉｏａｎａｌｙｚｅｒをＲＮＡ Ｎａｎｏ ＬａｂＣｈｉｐキット（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ；Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ）と共に使用してＲＮＡ品質を確認した。等量の高品質のＲＮＡ（明確に定義されている２８Ｓ及び１８Ｓリボソームピークを有するＲＮＡ）をｍＲＮＡ単離用にプールした。

全ＲＮＡからのｍＲＮＡの単離
μＭＡＣＳ ｍＲＮＡ単離キット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）を使用して、製造者の指示に従いプールした肺の全ＲＮＡからｍＲＮＡを単離した。ｍＲＮＡは、５３８μｇのプールした肺の全ＲＮＡから単離し、１２μｌのヌクレアーゼフリー水に溶出した。Ｂｉｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）を使用してｍＲＮＡ収率を決定した。Ａｇｉｌｅｎｔ ２１００ ＢｉｏａｎａｌｙｚｅｒをＲＮＡ Ｎａｎｏ ＬａｂＣｈｉｐキット（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ；Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ）と共に使用してｍＲＮＡ品質を確認した。ｍＲＮＡ Ｎａｎｏアッセイを使用してリボソーム混入率を決定した。

肺ｃＤＮＡライブラリの構築
ＣｌｏｎｅＭｉｎｅｒ（商標）ｃＤＮＡライブラリ構築キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して肺ｃＤＮＡライブラリの構築を実施した。使用説明書に従い、放射性標識していないｃＤＮＡライブラリの構築を実施した。先に単離した３μｇの肺ｍＲＮＡを使用してライブラリを作成した。ｃＤＮＡインサートをｐＤＯＮＲ（商標）２２２ベクターに組み換え、ＤＨ１０Ｂ（商標）Ｔ１ファージ耐性細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に電気穿孔した。１μｌの組換えｐＤＯＮＲ（商標）２２２ベクターを４０μｌのエレクトロコンピテント細胞に加えた。管の内容物全てを、予冷した１ｍｍ間隔幅のキュベットに移し替え、Ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｏｒ ２５１０（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）に挿入して、以下の設定、すなわち１６６０Ｖで時定数（τ）５ｍｓを使用した。電気穿孔後、細胞に１ｍｌのＳＯＣ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を添加して１５ｍｌ管に移し替え、３７℃で１時間、Ｉｎｎｏｖａ ４３００インキュベーターシェイカー（Ｎｅｗ Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）において２２５ｒｐｍで振盪した。次に、等容量の無菌凍結培地（６０％ＳＯＣ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、４０％グリセロール（Ｓｉｇｍａ））を試料に添加した後、複数の管にアリコートを分取し、−８０℃で保存した。５０μｇ／ｍｌのカナマイシン（Ｓｉｇｍａ）を含む３つの予熱したＬＢプレート上で力価測定を実施した。各プレートに、１μｌ、５μｌ又は１０μｌの形質転換細胞を播種し、ＢＤ１１５インキュベーター（Ｂｉｎｄｅｒ）の中で一晩３７℃でインキュベートした。各プレート上のコロニーの数を計数してライブラリの平均力価を決定した。平均力価を総容量で乗じることにより総コロニー形成単位（ｃｆｕ）を決定した。

ｃＤＮＡライブラリの検定
２４個の陽性形質転換体をＢｓｒＧ １で消化することによりｃＤＮＡライブラリの検定を実施した。１２μｌのプラスミドＤＮＡを３７℃で１６時間、３．０μｌのＮＥ ２、０．３μｌのＢＳＡ、０．１μｌのＢｓｒＧ １及び１４μｌの無ヌクレアーゼ水と共にインキュベートした。次に、消化した試料をＡｇｉｌｅｎｔ ２１００ Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒにおいて、ＤＮＡ ７５００アッセイプロトコルを使用して分析した。インサートを含まないｐＤＯＮＲ（商標）２２２ベクターは、以下の長さ、すなわち２．５ｋｂ、１．４ｋｂ及び７９０ｂｐの消化パターンを示すはずであり、かつ各ｃＤＮＡエントリークローンは２．５ｋｂのベクター骨格バンドと追加的なインサートバンドとを有するはずである。各クローンの個々の消化されたバンドサイズを足し合わせて総インサート長を求めた。次に、２４個の形質転換体についての平均インサートサイズ長及び形質転換率を計算した。

個々のｃＤＮＡライブラリの菌叢をプレートから取り出し、トレイ当たり約２０００ｃｆｕの密度でバイオアッセイトレイＱＴｒａｙｓ（Ｇｅｎｅｔｉｘ）に置いた。ＱＰｉｘ ２^ＸＴコロニーピッカーを使用して個々のコロニーをピッキングし、ＣｉｒｃｌｅＧｒｏｗ培地（ＭＰ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ ＬＬＣ）において一晩３７℃で振盪を伴い生育した。

修正版Ｍｏｎｔａｇｅ（登録商標）アルカリ溶菌法（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用してプラスミドの調製を実施した。この方法は、真空ろ過ではなく、遠心ライセート清澄化用のＭｕｌｔｉＳｃｒｅｅｎ（登録商標）Ｐｌａｓｍｉｄ３８４ Ｍｉｎｉｐｒｅｐクリアリングプレートを用いるものであった。液体を取り扱う工程は全て、Ｂｉｏｍｅｋ ＮＸワーキングステーション（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）で行った。

約１００ｎｇの鋳型ＤＮＡ、５μＭのプライマー（ユニバーサルＭ１３＿リバース、アンカーオリゴｄＴ又はオリゴｄＴのいずれか）、Ｂｉｇ Ｄｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ ｖ．３．１（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｃ．）及びＳｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｃ．）を含む３８４ウェルシークエンス反応プレートを準備した。サイクルシークエンシング条件は、９５℃で１０秒間、５０℃で５秒間、６０℃で２分３０秒間のサイクルを４０サイクルとした。シークエンス反応液は、Ｂｉｏｍｅｋ ＮＸ液体処理装置上のＣｌｅａｎＳＥＱ（Ａｇｅｎｃｏｕｒｔ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して清澄化した。Ａｐｐｌｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ３７３０／３７３０ｘｌ ＤＮＡ Ａｎａｌｙｓｅｒにおいて、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓソフトウェアを使用してシークエンスプレートを分析した。

実施例２：肺癌の疾患特異的トランスクリプトームの同定
Ｌｕｎｇ Ｃａｎｃｅｒ疾患特異的アレイ（ＤＳＡ（商標））研究ツールを設計するために使用される転写産物情報を、ハイスループット３’ベースシークエンシング手法により作成し、肺癌トランスクリプトームを定義した。同定された各転写産物の３’末端でプローブを作成し、Ｌｕｎｇ ｃａｎｃｅｒ ＤＳＡ研究ツールをＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ（Ａｆｆｙｍｔｅｒｉｘ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ，ＣＡ）によりカスタム設計した。この、関連する疾患特異的な内容と３’ベースのプローブ設計との組み合わせにより、ホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）切片由来のＲＮＡからのロバストなプロファイリングが可能となる。

本発明は、具体的な実施形態と考えられるものを参照して記載されているが、本発明はかかる実施形態に限定されないことは理解されるべきである。むしろ、本発明は、添付の特許請求の範囲の趣旨及び範囲内に含まれる様々な修正例及び等価物を網羅することが意図される。

Claims (17)

1. 組織試料からＲＮＡを単離するステップと、
   前記組織試料中の転写産物を、前記転写産物が実質的に全て配列決定されて前記転写産物の最３’側配列が得られるまで、前記転写産物の３’末端から配列決定するステップと、
   前記配列を使用して前記マイクロアレイ用のプローブを設計するステップと、
   組織試料における転写産物の最３’側末端を標的とする前記プローブを有するマイクロアレイを作製するステップ
   とを含む、核酸マイクロアレイを設計する方法。
2. 前記転写産物の最３’側末端が、前記転写産物の最も３’側の３００塩基対を含む、請求項１に記載の方法。
3. 前記転写産物の最３’側末端が、前記転写産物の最も３’側の４００塩基対を含む、請求項１に記載の方法。
4. 前記転写産物の最３’側末端が、前記転写産物の最も３’側の５００塩基対を含む、請求項１に記載の方法。
5. 前記転写産物の最３’側末端が、前記転写産物の最も３’側の２００塩基対を含む、請求項１に記載の方法。
6. 前記転写産物の最３’側末端が、前記転写産物の最も３’側の１００塩基対を含む、請求項１に記載の方法。
7. 転写産物の最３’側末端を標的とするプローブを含む、組織特異的又は疾患特異的マイクロアレイ。
8. 前記プローブが、特定の組織又は疾患状態に特異的なポリアデニル化部位を標的とする、請求項７に記載のマイクロアレイ。
9. 前記転写産物の最３’側末端が、前記転写産物の最も３’側の３００塩基対を含む、請求項７に記載のマイクロアレイ。
10. 前記転写産物の最３’側末端が、前記転写産物の最も３’側の４００塩基対を含む、請求項７に記載のマイクロアレイ。
11. 前記転写産物の最３’側末端が、前記転写産物の最も３’側の５００塩基対を含む、請求項７に記載のマイクロアレイ。
12. 前記転写産物の最３’側末端が、前記転写産物の最も３’側の２００塩基対を含む、請求項７に記載のマイクロアレイ。
13. 前記転写産物の最３’側末端が、前記転写産物の最も３’側の１００塩基対を含む、請求項７に記載のマイクロアレイ。
14. 組織における発現をプロファイリングするための請求項７〜１３のいずれか一項に記載のマイクロアレイの使用方法であって、
    組織から得られた核酸試料を、前記試料中の核酸標的が前記アレイ上のプローブと特異的にハイブリダイズする条件下で前記アレイと接触させるステップと、
    結合しなかった核酸標的を前記マイクロアレイから洗浄して取り除くステップと、
    前記マイクロアレイと結合した標的を検出するステップと、
    を含み、前記マイクロアレイと結合した標的の存在が、前記組織における遺伝子発現を示す、方法。
15. 前記組織が罹患組織を含む、請求項１４に記載の方法。
16. 前記罹患組織が癌組織である、請求項１４に記載の方法。
17. 前記癌が、白血病、脳癌、前立腺癌、肝癌、卵巣癌、胃癌、結腸直腸癌、咽喉癌、乳癌、皮膚癌、メラノーマ、肺癌、肉腫、子宮頸癌、精巣癌、膀胱癌、内分泌癌、子宮内膜癌、食道癌、神経膠腫、リンパ腫、神経芽細胞腫、骨肉腫、膵癌、下垂体癌、又は腎癌から選択される、請求項１４に記載の方法。