CN112980755B - 高效分泌异淀粉酶的基因工程菌 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了高效分泌异淀粉酶的基因工程菌，属于生物技术和基因工程技术领域。本发明以敲除α淀粉酶的枯草芽孢杆菌为宿主，使用合适的信号肽和分泌辅助蛋白，构建了高效分泌异淀粉酶的基因工程菌。该菌株发酵周期短，生产成本低，与BsCel5融合分泌的异淀粉酶不形成包涵体，且易于纯化，有利于异淀粉酶的大规模生产。本发明还公开包含异淀粉酶基因的重组质粒和用于构建上述基因工程菌的方法。

Description

高效分泌异淀粉酶的基因工程菌
技术领域
本发明属于生物技术和基因工程技术领域，具体地涉及高效分泌异淀粉酶的枯草芽孢杆菌工程菌株。本发明还涉及用于产生所述基因工程菌的方法。
发明背景
异淀粉酶(EC 3.2.1.68)是一种主要的淀粉脱支酶，能够催化支链淀粉、糖原及某些分支糊精中的α-1,6糖苷键的断裂反应。异淀粉酶不仅在淀粉加工工业中具有重要价值，还可用于葡萄糖-1-磷酸的产生。与另一广泛使用的偏好于水解非常短的支链糊精的普鲁兰酶相比，异淀粉酶更偏好于水解具有较长支链的大分子支链淀粉，产生聚合度约20-30的直链糊精。这种长聚合度的直链糊精可更有效被α葡聚糖磷酸化酶转化成葡萄糖-1-磷酸。所产生的葡萄糖-1-磷酸随后可用于在酶燃料电池中产电、为无细胞蛋白质合成提供缓慢释放的ATP再生方法和合成果糖1,6-二磷酸和肌醇等其他生物化学品。尽管异淀粉酶用途广泛，但是，迄今为止仍然只有来源于多支淀粉假单胞菌Pseudomonas amyloderamosa的异淀粉酶实现了工业化生产，并且目前工业生产是以天然菌株进行发酵，生产周期长并且培养基的营养成分要求较高，导致生产成本较高，不利于异淀粉酶的普及利用。有报道使用大肠杆菌进行异淀粉酶的重组表达，然而存在产量较低、包涵体严重等问题。另外，大肠杆菌含有内毒素，影响重组生产的异淀粉酶的应用。
发明内容
本发明的第一个方面提供高效分泌异淀粉酶的基因工程菌，所述基因工程菌以枯草芽孢杆菌为宿主，敲除α淀粉酶的编码基因并分泌表达异淀粉酶。
敲除α淀粉酶的编码基因是为了避免在发酵所述基因工程菌生产的异淀粉酶中污染α淀粉酶，以至于影响异淀粉酶的应用。另一方面，α淀粉酶的敲除可以提高异淀粉酶的分泌水平。
所述异淀粉酶为来源于硫化叶菌(Sulfolobus tokodaii)的天然异淀粉酶或其突变体，包含选自SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.8和 SEQ ID NO.10的氨基酸序列。突变体通过定向进化获得。
所述异淀粉酶作为融合蛋白在基因工程菌中分泌表达，其中来源于枯草芽孢杆菌的糖苷水解酶家族5葡聚糖内切酶(B.subtilis native glycoside hydrolase family5endoglucanase，BsCel5)或其突变体融合在异淀粉酶的N端，作为增强子促进异淀粉酶的分泌。
所述融合蛋白在信号肽的指导下分泌。本领域技术人员可以理解，本领域已知的可在枯草芽孢杆菌中起作用的各种信号肽均可用于本发明，包括但不限于，来源于枯草芽孢杆菌的蛋白酶nprB信号肽、来源于枯草芽孢杆菌的α淀粉酶 amyE信号肽和来源于地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)的amyL信号肽。优选地，本发明中使用的信号肽为来源于枯草芽孢杆菌的蛋白酶nprB信号肽。
本领域技术人员可以理解，本领域已知的各种枯草芽孢杆菌菌株均可用作本发明的宿主。优选地，所述枯草芽孢杆菌宿主为敲除蛋白酶的枯草芽孢杆菌菌株，例如WB800、WB600、SCK6、1A751等。更优选地，所述枯草芽孢杆菌宿主为 SCK6。
本发明的第二个方面提供包含异淀粉酶基因的重组质粒，所述质粒包含启动子、核糖体结合位点、信号肽编码序列、BsCel5或其变体的编码基因、异淀粉酶编码基因和终止序列。其中信号肽编码序列、BsCel5或其变体的编码基因和异淀粉酶编码基因以所述顺序融合在一个开放读码框中，并且与启动子序列操作性连接。
本领域技术人员可以理解，本领域已知的各种启动子均可用作本发明的启动子，只要其在枯草芽孢杆菌中起作用即可。这些启动子包括但不限于P43启动子、PamyL启动子、Plaps启动子、PhpaII启动子、PamyE启动子、Pgrac启动子等。
优选地，所述重组质粒还包含标记基因，用于筛选含有重组质粒的工程菌。更优选地，所述标记基因为抗性基因。
优选地，所述重组质粒为游离型质粒，即，其可在枯草芽孢杆菌中自主复制。
本发明的第三个方面提供用于构建第一方面的基因工程菌的方法，其步骤是：
(1)敲除枯草芽孢杆菌宿主中的α淀粉酶编码基因amyE；
(2)构建本发明第二方面的重组质粒，并将其转入步骤(1)中所获得的菌株中；
(3)根据载体上的标记基因筛选正确的转化子。
本发明的有益效果为：
(1)分泌的异淀粉酶在有利于蛋白质在低还原环境下正确折叠，无包涵体形成。
(2)枯草芽孢杆菌是一般认为安全(Generally Recognized As Safe,GRAS)的食品级微生物，不产生内毒素，有利于异淀粉酶的应用。
(3)在异淀粉酶的N端融合了BsCel5，后者包含纤维素结合模块，可以与固体纤维素特异性结合，有利于产品的分离纯化。
(4)枯草芽孢杆菌易于培养、发酵工艺成熟，有利于异淀粉酶的大规模生产。
(5)通过定向进化获得了分泌量和比酶活大幅提高的突变体。
附图说明
图1为表达异淀粉酶的工程菌的培养上清的SDS-PAGE电泳图。泳道1，蛋白marker；泳道2，枯草芽孢杆菌菌株SCK6/ΔamyE/pNWP43N-BsCel5-StIA的培养上清；泳道3：吸附在再生无定形纤维素(Regenerated amorphous cellulose， RAC)上的异淀粉酶融合蛋白。
图2为重组菌株SCK6/ΔamyE/pNWP43N-6-1的生长和产酶曲线。
具体实施方式
为更进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下通过具体实施例来进一步说明本发明的技术方案。但是应理解所述实施例仅是范例性的，不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改或替换均落入本发明的保护范围。
实施例1：表达异淀粉酶的工程菌的构建
1)α淀粉酶编码基因amyE的敲除：
感受态制备：在包含0.3μg/mL红霉素的LB固体平板上划线活化SCK6菌株，37℃培养过夜。次日挑取单克隆接种于5mL包含0.3μg/mL红霉素的LB 液体培养基中，37℃ 200rpm培养8-12h。测量600nm处的吸光值，然后用37 ℃预热的包含0.3μg/mL红霉素的新鲜LB液体培养基将培养物稀释至 A600＝～1.0。加入终浓度为1％(w/v)的D-木糖，继续在37℃200rpm培养2h，即可用于转化。
转化：取50ng PDG1730质粒与200μL感受态细胞混合，37℃ 200rpm孵育1.5h，然后涂布包含100μg/mL奇霉素的LB固体平板，37℃培养过夜。
菌落PCR鉴定：从平板上挑取少量转化子菌体稀释于30μL无菌水中，沸水浴5min,再置于-20℃冷冻5min后，室温溶解，12000rpm离心1min，取2 μL上清液作为模板，使用引物amyE-F：5′-ACCTCTTTACTGCCGTTATTCG-3′和amyE-R：5′-TAGCACGTAATCAAAGCCAGG-3′按照下列条件进行PCR扩增： 98℃变性2min，按如下参数循环30次：98℃变性15s，58℃退火15s，72℃延伸30s，最后72℃延伸5min。电泳分析PCR结果，仅扩增出～2.6kb大小的单一条带的即为成功敲除的菌株amyE，标记为SCK6/amyE。
2)重组质粒的构建
全基因合成如SEQ ID NO.1中所示的异淀粉酶编码序列，并使用下列引物扩增：
StIA-IF：
5′-
ACTGATTTGGGGAACAGAACCAAATATGGTGTTCAGCCATAAAGATCGTC-
3′
StIA-IR：
5′-
CACAACGCAAACCTCCTATTAGATGTTAATATTCAATGCGACGATAAACC-3′
编码成熟糖苷水解酶BsCel5(GenBank登录号：CAA82317，30-499氨基酸) 的DNA片段使用下列引物从枯草芽孢杆菌168的基因组扩增：
BsCel5-IF：
5′-
GTAACACATGCCTCAGCTGCAGCAGGGACAAAAACGCCAGTAGCCA-3′
BsCel5-IR：
5′-
GACGATCTTTATGGCTGAACACCATATTTGGTTCTGTTCCCCAAATCAGT-3′
pNWP43N载体线性骨架使用下列引物以pNWP43N质粒为模板扩增，其包含P43启动子和来源于枯草芽孢杆菌168的蛋白酶NprB的信号肽：
pNWP43N-VF：
5′-
GGTTTATCGTCGCATTGAATATTAACATCTAATAGGAGGTTTGCGTTGTG-3′
pNWP43N-VR：
5′-TGGCTACTGGCGTTTTTGTCCCTGCTGCAGCTGAGGCATGTGTTAC-
3′
PCR条件为98℃变性2min，按如下参数循环30次：98℃变性15s，58 ℃退火15s，72℃延伸1min，最后72℃延伸5min。PCR反应所得到的产物分别用1％的琼脂糖凝胶电泳分析结果。经凝胶成像***成像确认片段大小正确后，采用DNA纯化回收试剂盒(天根生化科技有限公司，中国)回收目的片段。
然后使用POE-PCR组装异淀粉酶基因片段、BsCel5基因片段和pNWP43N 载体骨架。POE-PCR体系如下：纯化后的pNWP3N线性骨架，200ng；纯化后的异淀粉酶基因片段131ng；纯化后的BsCel5基因片段，2×PrimeSTAR MAX DNA Polymerase(大连宝生物，中国)，25μL，加水补足50μL。POE-PCR条件为98℃变性2min，按如下参数循环30次：98℃变性15s，58℃退火15s， 72℃延伸3.5min，最后72℃延伸5min。
3)工程菌的构建
如上文对于SCK6所描述的制备SCK6/ΔamyE感受态。将2μL POE-PCR产物与200μLSCK6/ΔamyE感受态细胞混合，37℃ 200rpm孵育1.5h，然后涂布包含5μg/mL氯霉素的LB固体平板，37℃培养过夜。次日挑选2-3个转化子测序验证，测序结果显示成功获得pNWP3N-BsCel5-StIA重组质粒以及相应的表达异淀粉酶的工程菌SCK6/ΔamyE/pNWP43N-BsCel5-StIA。
实施例2：摇瓶发酵产酶
将实施例1中获得的表达异淀粉酶的工程菌SCK6/ΔamyE/pNWP43N- BsCel5-StIA在SR培养基(1.5％蛋白胨,2.5％酵母提取物和0.3％K2HPO4)中以30 ℃和250rpm培养48h。将40μL无细胞上清与10μL 5×SDS上样缓冲液混合，100℃煮5min后取20μL上样至12％SDS-PAGE。120V恒压处理～1-1.5h，待溴酚蓝指示剂条带离开凝胶后停止电泳。考马斯亮蓝染色检测蛋白分泌情况。另外，用RAC吸附培养上清中的蛋白，具体过程如下：将0.5mg RAC加入10mL 培养上清中，混匀，冰上吸附15-30min，4℃ 5000×g离心5min，用40μL 40 mM醋酸钠缓冲液(pH 5.5)重悬，然后与10μL 5×SDS上样缓冲液混合，100℃煮5min后取10μL样品SDS-PAGE电泳分析。如图1中所示，上清中可以观察到明显的分子量大小对应于BsCel5-StIA(135kDa)的蛋白条带，并且该蛋白可以特异性地吸附在RAC上。
使用碘法以玉米支链淀粉为底物分析培养上清中的异淀粉酶活性。酶活测定体系包含0.35％(wt/v)玉米支链淀粉、40mM醋酸钠缓冲液(pH 5.5)、0.5mM MgCl2和适量浓缩后的上清，总体积500μL。50℃孵育30min后，取50μL反应混合物，与50μL 0.01M I2-0.1M KI溶液混合，然后用蒸馏水稀释至1mL，立即测量在610nm处的吸光值。1U酶活定义为在上述测定条件下使得610nm处的吸光值在1h内增加0.1所需要的酶量。在同样的条件下测定比酶活以确定蛋白的分泌量。结果显示，培养上清具有异淀粉酶分泌，酶活为1.19U/mL，相当于9.75mg/L融合蛋白。
实施例3：定向进化提高分泌水平
1)构建具有合适突变率的突变体文库
以质粒pNWP43N-BsCel5-IA作为模板，利用高保真DNA聚合酶扩增获得除SPnprB-BsCel5-IA编码基因之外的部分作为线性质粒骨架；以表达载体 pNWP43N-BsCel5-IA作为模板，采用易错PCR技术获得含有随机突变新分泌调控元件的PCR扩增片段文库；将获得的线性质粒骨架与随机突变片段文库按照摩尔比1:1的比例，采用重叠延伸PCR技术获得DNA多聚体(DNA multimer)，将其转化到B.subtilis SCK6/amyE超级感受态中。获得的文库突变率为～0.13％。
2)利用支链淀粉/碘筛选***获得正向突变体
包含突变质粒pNWP43N-Bscel5-IA的转化子在LB平板上50℃生长过夜后，覆盖包含0.5％玉米支链淀粉的上层琼脂，然后在50℃孵育5h。由于直链淀粉倾向于形成有规则的螺旋结构，每圈螺旋含6个残基。当与碘形成络合物时，每圈容纳一个碘分子(I2)，6圈即36个葡萄糖残基可产生特征性的蓝色。而支链淀粉中的短串碘分子吸收更短波长的光，因此支链淀粉遇碘呈紫色到***。当支链淀粉中的α-1.6分枝被异淀粉酶水解后，所得产物与碘络合可产生更长串的碘分子，从而产生更强的蓝色，导致在双层板上产生蓝色水解圈。较大的水解圈指示相应的细胞可分泌活性更高或更大量的异淀粉酶。
3)突变体的表征
将筛选得到的正向突变体6-1在SR培养基中以30℃和250rpm培养，间隔一定时间取样，测量OD600，并如实施例2中所描述的测量无细胞上清中的 IA酶活。48h时上清中的IA酶活达到97.4U/mL，分泌水平达到234mg/L。
序列表
<110> 中国科学院天津工业生物技术研究所
<120> 高效分泌异淀粉酶的基因工程菌
<160> 10
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 2151
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 1
atggtgttca gccataaaga tcgtccgctg cgtccgggtg aaccgtatcc gctgggtgca 60
aattgggaag aggaagatga cggcgttaac tttagcattt ttagcgaaaa tgccaccaaa 120
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gcaagccgtc agatgatcga gtatctgaaa gatctgggtg ttaccaccgt tgaaattatg 660
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ggttataatc cgttcaacta cttcagtccg gaatgtcgtt atagcagcag cggttgtatg 780
ggtgaacagg tgaatgaatt taaagaaatg gtgaacgaac tgcacaacgc aggttttgaa 840
gttattatcg atgtggtgta taaccatacc gcagaaggta atcatctggg tccgaccctg 900
agctttcgtg gtattgataa tctggcctat tatatgctgg tgccggataa caaacgttat 960
tatctggatt ttaccggcac cggtaatacc ctgaatctga gccatccgcg tgttctgcag 1020
atggttctgg atagcctgcg ttattgggtt ctggaaatgc atgttgatgg ttttcgtttt 1080
gatctggcaa cagcactggc acgtcagctg tatagcgtta atatgctgag cacctttttt 1140
gttgcaattc agcaggatcc ggttctgagc caggttaaac tgattgcaga accgtgggat 1200
gttggtccgg gtggttatca ggttggtaat tttccgtatc tgtggtcaga atggaatggt 1260
aaatatcgtg ataccattcg tcgtttttgg cgtggtgaag caattccgta tgaagaactg 1320
gcaaatcgtc tgatgggtag tccggatctg tatgcaggta ataacaaaac cccgtttgcc 1380
agcattaact atattaccag ccatgatggt ttcaccctgg aagatctggt tagctataac 1440
cagaaacata atgaagccaa cggcttcaat aaccaggatg gcatgaatga aaactacagc 1500
tggaattgtg gtgttgaagg tgaaaccaat gatgccaatg ttattcagtg tcgcgaaaaa 1560
cagaaacgca actttattat caccctgttt gttagccagg gtgttccgat gattctgggt 1620
ggtgatgaac tgagccgtac ccagcgtggt aataacaatg cattttgtca ggataacgag 1680
attagctggt ttaactggaa tctggatgaa cgtaaacagc gcttccatga ttttgtgcgt 1740
agcatgattt atttctatcg tgcccatccg atttttcgtc gtgaacgtta ttttcagggc 1800
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gcagatgaac agacctggaa aagcccgacc aactttattg catgtattct ggaaggtagc 1920
gtgatcgatg aagttaatga tcgtggtgaa cgtattgccg atgatagctt cctgattatt 1980
ctgagtggta gcccgaataa cattaaattc aaattcccgc agggtaaatg gtcactggtt 2040
gttagcagct atctgcgtga actgcgtgat gatgaacgtg ttgttgatgg tggtaaagaa 2100
ctggaaattg aaggtcgtac cgcaatggtt tatcgtcgca ttgaatatta a 2151
<210> 10
<211> 716
<212> PRT
<213> 人工序列()
<400> 10
Met Val Phe Ser His Asn Asp Arg Pro Leu Arg Pro Gly Glu Pro Tyr
1               5                   10                  15
Pro Leu Gly Ala Asn Trp Glu Glu Glu Asp Asp Gly Val Asn Phe Ser
            20                  25                  30
Ile Phe Ser Glu Asn Ala Thr Lys Val Glu Leu Leu Ile Tyr Ser Pro
        35                  40                  45
Thr Asn Gln Lys Tyr Pro Lys Glu Val Ile Glu Val Lys Gln Arg Ser
    50                  55                  60
Gly Asp Ile Trp His Val Phe Val Pro Gly Leu Gly Pro Gly Thr Leu
65                  70                  75                  80
Tyr Ala Tyr Arg Ile Tyr Gly Pro Tyr Lys Pro Asp Gln Gly Leu Arg
                85                  90                  95
Phe Asn Pro Asn Lys Val Leu Ile Asp Pro Tyr Ala Lys Ala Ile Asn
            100                 105                 110
Gly Thr Leu Asn Trp Asn Asp Ala Val Phe Gly Tyr Lys Ile Gly Asp
        115                 120                 125
Ser Asn Gln Asp Leu Ser Phe Asp Asp Arg Pro Asp Asp Glu Phe Ile
    130                 135                 140
Pro Lys Gly Val Val Ile Asn Pro Tyr Phe Glu Trp Asp Asp Asp His
145                 150                 155                 160
Phe Phe Arg Arg Lys Lys Ile Pro Leu Lys Asp Thr Ile Ile Tyr Lys
                165                 170                 175
Val His Val Lys Gly Phe Thr Lys Leu Arg Pro Asp Leu Pro Glu Asn
            180                 185                 190
Ile Arg Gly Thr Tyr Lys Gly Phe Ala Ser Arg Gln Met Ile Glu Tyr
        195                 200                 205
Leu Lys Asp Leu Gly Val Thr Thr Val Glu Ile Met Pro Ala Gln Gln
    210                 215                 220
Phe Val Asp Asp Arg Phe Leu Val Glu Lys Gly Leu Arg Asn Tyr Trp
225                 230                 235                 240
Gly Tyr Asn Pro Phe Asn Tyr Phe Ser Pro Glu Cys Arg Tyr Ser Ser
                245                 250                 255
Ser Gly Cys Met Gly Glu Gln Val Asn Glu Phe Lys Glu Met Val Asn
            260                 265                 270
Glu Leu His Asn Ala Gly Phe Glu Val Ile Ile Asp Val Val Tyr Asn
        275                 280                 285
His Thr Ala Glu Gly Asn His Leu Gly Pro Thr Leu Ser Phe Arg Gly
    290                 295                 300
Ile Asp Asn Leu Ala Tyr Tyr Met Leu Val Pro Asp Asn Lys Arg Tyr
305                 310                 315                 320
Tyr Leu Asp Phe Thr Gly Thr Gly Asn Thr Leu Asn Leu Ser His Pro
                325                 330                 335
Arg Val Leu Gln Met Val Leu Asp Ser Leu Arg Tyr Trp Val Leu Glu
            340                 345                 350
Met His Val Asp Gly Phe Arg Phe Asp Leu Ala Thr Ala Leu Ala Arg
        355                 360                 365
Gln Leu Tyr Ser Val Asn Met Leu Ser Thr Phe Phe Val Ala Ile Gln
    370                 375                 380
Gln Asp Pro Val Leu Ser Gln Val Lys Leu Ile Ala Glu Pro Trp Asp
385                 390                 395                 400
Val Gly Pro Gly Gly Tyr Gln Val Gly Asn Phe Pro Tyr Leu Trp Ser
                405                 410                 415
Glu Trp Asn Gly Lys Tyr Arg Asp Thr Ile Arg Arg Phe Trp Arg Gly
            420                 425                 430
Glu Ala Ile Pro Tyr Glu Glu Leu Ala Asn Arg Leu Met Gly Ser Pro
        435                 440                 445
Asp Leu Tyr Ala Gly Asn Asn Lys Thr Pro Phe Ala Ser Ile Asn Tyr
    450                 455                 460
Ile Thr Ser His Asp Gly Phe Thr Leu Glu Asp Leu Val Ser Tyr Asn
465                 470                 475                 480
Gln Lys His Asn Glu Ala Asn Gly Phe Asn Asn Gln Asp Gly Met Asn
                485                 490                 495
Glu Asn Tyr Ser Trp Asn Cys Gly Val Glu Gly Glu Thr Asn Asp Ala
            500                 505                 510
Asn Val Ile Gln Cys Arg Glu Lys Gln Lys Arg Asn Phe Ile Ile Thr
        515                 520                 525
Leu Phe Val Ser Gln Gly Val Pro Met Ile Leu Gly Gly Asp Glu Leu
    530                 535                 540
Ser Arg Thr Gln Arg Gly Asn Asn Asn Ala Phe Cys Gln Asp Asn Glu
545                 550                 555                 560
Ile Ser Trp Phe Asn Trp Asn Leu Asp Glu Arg Lys Gln Arg Phe His
                565                 570                 575
Asp Phe Val Arg Ser Met Ile Tyr Phe Tyr Arg Ala His Pro Ile Phe
            580                 585                 590
Arg Arg Glu Arg Tyr Phe Gln Gly Lys Lys Leu His Gly Met Pro Leu
        595                 600                 605
Lys Asp Val Thr Phe Leu Lys Pro Asp Gly Asn Glu Ala Asp Glu Gln
    610                 615                 620
Thr Trp Lys Ser Pro Thr Asn Phe Ile Ala Cys Ile Leu Glu Gly Ser
625                 630                 635                 640
Val Ile Asp Glu Val Asn Asp Arg Gly Glu Arg Ile Ala Asp Asp Ser
                645                 650                 655
Phe Leu Ile Ile Leu Ser Gly Ser Pro Asn Asn Ile Lys Phe Lys Phe
            660                 665                 670
Pro Gln Gly Lys Trp Ser Leu Val Val Ser Ser Tyr Leu Arg Glu Leu
        675                 680                 685
Arg Asp Asp Glu Arg Val Val Asp Gly Gly Lys Glu Leu Glu Ile Glu
    690                 695                 700
Gly Arg Thr Ala Met Val Tyr Arg Arg Ile Glu Tyr
705                 710                 715

Claims (4)

1.一种高效分泌异淀粉酶的基因工程菌，其特征在于：所述基因工程菌以枯草芽孢杆菌为宿主，敲除α淀粉酶的编码基因并分泌表达异淀粉酶，其中来源于枯草芽孢杆菌的糖苷水解酶家族5葡聚糖内切酶(B .subtilis native glycoside hydrolase family 5endoglucanase，BsCel5)融合在异淀粉酶的N端，作为增强子促进异淀粉酶的分泌。
2.根据权利要求1所述的基因工程菌，其特征在于：所述异淀粉酶为来源于硫化叶菌的天然异淀粉酶或其突变体，包含选自SEQ ID NO .2、SEQ ID NO .4、SEQ ID NO .6、SEQ IDNO .8和SEQ ID NO .10的氨基酸序列。
3.用于在权利要求1或2所述的基因工程菌中表达异淀粉酶的质粒，其特征在于：所述质粒包含启动子、核糖体结合位点、信号肽编码序列、BsCel5的编码基因、异淀粉酶编码基因和终止序列，其中信号肽编码序列、BsCel5的编码基因和异淀粉酶编码基因以所述顺序融合在一个开放读码框中，并且与启动子序列操作性连接。
4.用于构建权利要求1-3中任一项的基因工程菌的方法，其特征在于：包括：
(1)敲除枯草芽孢杆菌宿主中的α淀粉酶编码基因amyE；
(2)构建权利要求3的重组质粒，并将其转入步骤(1)中所获得的菌株中；
(3)根据载体上的标记基因筛选正确的转化子。
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异淀粉酶产生菌的分离鉴定及异淀粉酶基因的克隆表达;赵淑琴;;食品工业科技(17);第122-127页 *

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