CN112980728B - 一株耐盐碱解硅磷钾的内生弯曲芽孢杆菌及其应用 - Google Patents

一株耐盐碱解硅磷钾的内生弯曲芽孢杆菌及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一株耐盐碱解硅磷钾的内生弯曲芽孢杆菌及其应用，所述菌株命名为内生弯曲芽孢杆菌(Bacillus flexus)LXBF.1，于2021年01月22日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.21705，所述菌株的16S rDNA基因序列如SEQ ID NO:1所示。本发明的菌株能够将难溶性的无机磷、硅钾转化成可供植物直接吸收利用的优质磷硅钾元素化合物，提高土壤中难溶性磷、硅钾的生物有效性，提高肥料利用率；具有较强产IAA、嗜铁素的能力，可显著提高作物耐盐能力，在促进根系生长发育，提高作物产量、改善品质方面效果十分显著；在盐碱土耐受性方面优势显著，定殖能力强，是盐碱土改良、作物种植上的一大创新，应用前景广阔。

Description

一株耐盐碱解硅磷钾的内生弯曲芽孢杆菌及其应用
技术领域
本发明涉及微生物肥料及盐碱土农作物逆境保护研究技术领域，尤其是涉及一株耐盐碱解硅磷钾的内生弯曲芽孢杆菌及其应用。
背景技术
盐碱土是指一系列受到盐碱胁迫的土壤，包括各种盐土、碱土及不同程度盐化和碱化的土壤，盐碱土理化性质差，含盐量高，土质胶黏，通透性差，容重大，易板结，空隙小，使得大多数作物的生长受到不同程度的抑制，严重影响其产量及品质。
土壤盐碱化是一种严重的土地退化类型，是世界上许多干旱、半干旱地区农业产量下降的主要原因。我国盐碱土壤的分布范围广、类型多，总面积约1亿hm2，而且盐碱地面积正逐年增加。土壤盐碱化已成为制约我国农作物产量的主要因素之一。如何改善盐碱土壤理化性状，增强农作物的抗盐碱特性，已成为我国农业持续高效发展的重大课题。已有研究表明在盐碱土上应用微生物肥料可降低pH值，増加有机质，提高养分、微生物数量以及酶的活性，减少地表盐分聚集。但往往存在有效活菌在土壤中存活时间短、在作物根系或植株内定殖能力差，而不能充分发挥微生物与植物之间的互作关系的问题。
植物内生菌是指那些将其生活史的一定阶段或全部阶段生活于健康植物各种组织和器官内部，又不会引起植物明显病害的一类微生物。内生菌与植物共生关系对植物的显著影响这一现象引起了国内外学者的广泛关注。对植物内生菌的研究有望为提高植物的抗盐碱特性提供新的思路,内生菌接种植物可以作为缓解盐碱性敏感植物在盐碱胁迫下的一个有利的工具，在盐碱土壤改良与植株恢复中，内生菌具有广阔的应用前景。
盐地碱蓬(Suaeda salsa L.)，普遍生于盐土或盐碱化土壤、湖滨河岸和沿海地带，是典型的盐碱地指示植物。碱蓬体内高盐微环境中的微生物在与其长期共同进化的过程中可能形成某些机制来缓解逆境对植物胁迫。目前有关将盐生植物内生菌应用于盐碱土改良，提高植物抗逆能力、特别是降解土壤不溶性硅磷钾矿物性成分方面鲜有报道。因此从高耐盐碱地的盐地碱蓬植株内发掘微生物种质资源，对于提高盐碱土改良盐生植物、盐碱性敏感经济作物乃至中草药植物的抗盐碱特性，以及盐碱土改良应用推广具有重要意义。
现有技术中有报道花生根际促生菌弯曲芽孢杆菌具有解钾、有机磷能力；补血草内生细菌Bacillus flexus PE4941具有耐盐能力，但是对于同时兼具耐盐碱特性及解硅磷钾能力的盐地碱蓬内生弯曲芽孢杆菌的筛选与研究很少。
有鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的第一目的在于提供一株耐盐碱解硅磷钾的内生弯曲芽孢杆菌，该菌株同时具有耐盐碱特性及解硅磷钾能力。
本发明的第二目的在于提供一种上述耐盐碱解硅磷钾的内生弯曲芽孢杆菌在盐碱土上促进植物生长的应用。
本发明的第三目的在于提供一种上述耐盐碱解硅磷钾的内生弯曲芽孢杆菌的后代、突变体及衍生物。
为解决上述技术问题，本发明提供了一株耐盐碱解硅磷钾的内生弯曲芽孢杆菌，所述菌株命名为内生弯曲芽孢杆菌(Bacillus flexus)LXBF.1，于2021年01月22日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.21705，保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，所述菌株的16S rDNA基因序列如SEQ ID NO:1所示。
进一步的，所述菌株的16SrDNA基因序列如下所示：
CTGGGCGGGTCTATAATGCAGTCGAGCGAACTGATTAGAAGCTTGCTT CTATGACGTTAGCGGCGGACGGGTGAGTAACACGTGGGCAACCTGCC TGTAAGACTGGGATAACTCCGGGAAACCGGAGCTAATACCGGATAACATTTTTTCTTGCATAAGAGAAAATTGAAAGATGGTTTCGGCTATCACTTA CAGATGGGCCCGCGGTGCATTAGCTAGTTGGTGAGGTAACGGCTCAC CAAGGCAACGATGCATAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTG GGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAA TCTTCCGCAATGGACGAAAGTCTGACGGAGCAACGCCGCGTGAGTGA TGAAGGCTTTCGGGTCGTAAAACTCTGTTGTTAGGGAAGAACAAGTA CAAGAGTAACTGCTTGTACCTTGACGGTACCTAACCAGAAAGCCACG GCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTA TCCGGAATTATTGGGCGTAAAGCGCGCGCAGGCGGTTTCTTAAGTCTG ATGTGAAAGCCCACGGCTCAACCGTGGAGGGTCATTGGAAACTGGGG AACTTGAGTGCAGAAGAGAAAAGCGGAATTCCACGTGTAGCGGTGA AATGCGTAGAGATGTGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGGCTTTTTG GTCTGTAACTGACGCTGAGGCGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGA TTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAGTGCTAAGTGTTA GAGGGTTTCCGCCCTTTAGTGCTGCAGCTAACGCATTAAGCACTCCGC CTGGGGAGTACGGTCGCAAGACTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGG GCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAA GAACCTTACCAGGTCTTGACATCCTCTGACAACTCTAGAGATAGAGCG TTCCCCTTCGGGGGACAGAGTGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAG CTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCT TGATCTTAGTTGCCAGCATTAAGTTGGGCACTCTAAGGTGACTGCCGG TGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCT TATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGATGGTACAAAGGGCTGC AAGACCGCGAGGTCAAGCCAATCCCATAAAACCATTCTCAGTTCGGAT TGTAGGCTGCAACTCGCCTACATGAAGCTGGAATCGCTAGTAATCGCG GATCAGCATGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCC CGTCACACCACGAGAGTTTGTAACACCCGAAGTCGGTGGGGTAACCT TTATGAGCCAGCCGCCTAAAGGTGAGCCAG
进一步的，所述菌株具有下列特性：
a)呈革兰氏阳性、产芽孢的不规则杆状；
b)具有耐盐碱特性；
c)具有固氮、溶解无机磷、解硅钾，产IAA、嗜铁素的能力。
进一步的，所述菌株在NaCl含量≤10％的培养体系下正常生长；在NaCl 含量≤5％的培养体系下具有解硅、解钾、解无机磷功能。
进一步的，所述菌株在5.0≤pH≤10.0的培养体系下正常生长；在 5.0≤pH≤9.0的培养体系下具有解硅、解钾、解无机磷功能。
进一步的，所述菌株在Na2CO3含量≤50mmol/L、NaHCO3含量≤250mmol/L、NaNO3含量≤15％的培养体系下正常生长。
除此之外，本发明还提供了上述内生弯曲芽孢杆菌株的分离方法，包括以下步骤：
1)富集培养分离：从盐碱地采集植株样本清洗干净，灭菌后至富集培养基中恒温培养48-72h，取菌液稀释后进行解硅菌株分离，得到具有明显解硅圈的菌株；
2)耐盐解钾性能验证：将步骤1)中得到的具有解硅圈的菌株二次复筛，分别点接于解钾固体培养基上，恒温培养3-7天，得到同时具有解硅、钾圈的菌株；
3)耐盐解无机磷性能验证：将步骤2)中得到的同时具有解硅、钾圈的菌株再次进行复筛，分别点接于解无机磷固体培养基上，恒温培养3-7 天，得到本发明的同时具有解硅圈、解钾圈、解无机磷圈的菌株。
进一步的，所述富集培养基包括蔗糖10.0g，酵母膏0.5g， (NH4)2SO4 1.0g，Na2HPO42.0g，MgSO4·7H2O 0.5g，CaCO3 0.1g，玻璃粉1.0g， NaCl 50g，蒸馏水1000mL；
所述解钾固体培养基包括蔗糖10.0g，酵母膏0.5g，(NH4)2SO4 1.0g， Na2HPO42.0g，MgSO4·7H2O 0.5g，CaCO3 0.1g，钾长石粉1.0g，NaCl 50g，蒸馏水1000mL；
所述解无机磷固体培养基包括(NH4)2SO4 0.5g，MgSO4·7H2O 0.5g，NaCl 50g，Ca3(PO4)2 10.0g，CaCO3 2.5g，葡萄糖2.0g，MnSO4 0.02g，FeSO4 0.02g，琼脂20.0g，蒸馏水1000mL。
进一步的，所述步骤1)中的灭菌过程包括先使用3％浓度的次氯酸钠浸泡植株样本5-10min，再用无菌水冲洗3-5次，然后放入75％酒精浸泡 3-5min，无菌水冲洗3-5次，最后用无菌滤纸吸干植株样品表面。
进一步的，所述步骤1)中的解硅菌株分离过程包括取菌液稀释至10-6、 10-7梯度后，分别采用涂布与划线两种方式进行解硅菌株分离。
除此之外，本发明还提供了上述内生弯曲芽孢杆菌在盐碱土上促进植物生长的应用。
进一步的，所述植物为耐盐植物盐地碱蓬、经济作物燕麦、中草药植物蒲公英。
除此之外，本发明还提供了上述内生弯曲芽孢杆菌的后代、突变体及衍生物。
与现有技术相比，本发明的有益效果在于：
本发明的耐盐碱解硅磷钾的内生弯曲芽孢杆菌株，能够将难溶性的无机磷、硅钾转化成可供植物直接吸收利用的优质磷硅钾元素化合物，提高土壤中难溶性磷、硅钾的生物有效性，提高肥料利用率；具有较强产IAA、嗜铁素的能力，可显著提高作物耐盐能力，在促进根系生长发育，提高作物产量、改善品质方面效果十分显著；在盐碱土耐受性方面优势显著，定殖能力强，是盐碱土改良、作物种植上的一大创新，应用前景广阔。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明基于16S rDNA基因构建的菌株LXBF.1的***发育树；
图2为本发明的菌株LXBF.1在5％NaCl下解硅能力测定结果；
图3为本发明的菌株LXBF.1在5％NaCl下解钾能力测定结果；
图4为本发明的菌株LXBF.1在5％NaCl下解无机磷能力测定结果；
图5为本发明的菌株LXBF.1在不同pH条件下测定结果；
图6为本发明的菌株LXBF.1在不同含量Na2CO3、NaHCO3条件下测定结果；
图7为本发明的菌株LXBF.1在不同含量NaNO3条件下测定结果；
图8为本发明的菌株LXBF.1在不同浓度NaCl条件下测定结果；
图9为本发明的菌株LXBF.1在不同温度条件下测定结果；
图10为接菌与不接菌燕麦在盆栽盐碱土生长状态的比较；
图11为接菌与不接菌燕麦在盆栽盐碱土根系状态的比较；
图12为接菌与不接菌盐地碱蓬在盆栽盐碱土上生长状态的比较；
图13为接菌与不接菌盐地碱蓬在盆栽盐碱土根系状态的比较；
图14为接菌与不接菌蒲公英在盐碱土生长状态的比较；
图15为接菌与不接菌蒲公英在盐碱土根系状态的比较。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
实施例1
1)富集培养分离：
植株样本采集自河北省唐山市曹妃甸湿地的盐碱地，植株采集带回实验室后于24小时内完成菌株分离。植株先用自来水冲洗干净，去除表明泥土和附着物，然后将植物样品剪成2cm×2cm大小，在无菌超净工作台中用 3％浓度的次氯酸钠浸泡样本5-10min，无菌水冲洗3-5次，然后放入75％酒精浸泡3-5min，无菌水冲洗3-5次，无菌滤纸吸干样品表面，于无菌研钵内将植物充分磨碎，转移至富集培养基中(蔗糖10.0g，酵母膏0.5g， (NH4)2SO41.0g，Na2HPO4 2.0g，MgSO4·7H2O 0.5g，CaCO3 0.1g，玻璃粉1.0g， NaCl 50g，蒸馏水1000mL)，于30℃、180r/min富集振荡培养48-72h。取富集后的菌液稀释至10-6、10-7梯度后，分别采用涂布与划线两种方式进行解硅菌株分离(蔗糖10.0g，酵母膏0.5g，(NH4)2SO41.0g，Na2HPO4 2.0g， MgSO4·7H2O 0.5g，CaCO30.1g，玻璃粉1.0g，NaCl 50g，琼脂粉20g，蒸馏水1000mL)，30℃培养3-7天，挑取具有明显解硅圈的菌株。
2)耐盐解钾性能验证：
将上述挑取的具有明显解硅圈的菌株二次复筛，分别点接于解钾固体培养基上(蔗糖10.0g，酵母膏0.5g，(NH4)2SO4 1.0g，Na2HPO4 2.0g， MgSO4·7H2O 0.5g，CaCO3 0.1g，钾长石粉1.0g，NaCl 50g，蒸馏水1000mL； )，30℃培养3-7天，挑取具有明显解钾圈的菌株。
3)耐盐解无机磷性能验证
将上述挑取的具有明显解钾菌的菌株再次复筛，分别点接于解无机磷固定培养基上((NH4)2SO4 0.5g，MgSO4·7H2O 0.5g，NaCl 50g， Ca3(PO4)2 10.0g，CaCO3 2.5g，葡萄糖2.0g，MnSO4 0.02g，FeSO4 0.02g，琼脂20.0g，蒸馏水1000mL)，30℃培养3-7天，得到本发明的同时具有解硅圈、解钾圈、解无机磷圈的菌株。
4)纯化
挑取上述步骤中得到的同时具有解硅圈、解钾圈、解无机磷圈的菌株，接到由5g/L牛肉膏、10g/L蛋白胨、50g/L氯化钠，20g/L琼脂组成的固体培养基上，待单菌落长出至2mm时，挑取单菌落备用。
5)菌株鉴定
采用革兰氏染色、光学显微镜下观察菌体形态对分离菌株进行鉴定，其结果如下：
菌株LXBF.1的形态与生理生化特征：该菌株呈革兰氏阳性、产芽孢的不规则杆状。菌株在胰蛋白胨-酵母膏培养基(LB培养基)、牛肉膏蛋白胨营养琼脂培养基(NA)等多种培养基上生长良好，在NA固体平板生长 24-48h后，菌落为圆形、较湿润、直径2-3mm，近乳白色，不透明。能耐受最高浓度为10％的NaCl，最适生长温度20℃-40℃。接触酶阳性，硝酸盐还原阳性，产生精氨酸水解酶、脲酶和蛋白酶。
分子生物学鉴定(16S rDNA基因PCR扩增):
按常规细菌DNA提取方法提取制备样品总DNA。采用细菌通用引物 27f：5’-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3’和1492r： 5’-TACGGYTACCTTGTTACGACT T-3’进行16S rDNA基因PCR扩增。PCR 反应体系为：DNA模板1μl，2×MastarMix 10μl，27f 0.4μl，1492r 0.4μl，超纯水补足至20μl。扩增产物经0.8％琼脂糖凝胶电泳检测后送至北京新时代众合科技有限公司测序。测序结果在NCBI以及EzBio Cloud网站上对序列进行比对，然后采用Mega 6.0软件进行比对于分析，最后采用邻接法 (Neighbor-Joining，NJ)构建***发育树并进行***发育树分析，序列比对结果发现该菌株与芽孢杆菌的有效种序列相似性最高，与弯曲芽孢杆菌 (Bacillus flexus)的相似性为99％(如图1所示)。因此，将菌株LXBF.1 命名为弯曲芽孢杆菌(Bacillus flexus)LXBF.1。
实施例2
菌株LXBF.1抗逆性试验：
将筛选得到的菌株LXBF.1，制备种子液，按照5％接种量分别接种到不同pH条件(pH3、pH4、pH5、pH6、pH7、pH8、pH9、pH10)、NaCl 含量(0.5％、5％、10％)、Na2CO3含量(0mmol/L、50mmol/L、100mmol/L、 150mmol/L、200mmol/L、250mmol/L)、NaHCO3含量(0mmol/L、50mmol/L、 100mmol/L、150mmol/L、200mmol/L、250mmol/L)、NaNO3含量(5％、 10％、15％、20％、30％)的NA液体培养液中，于30℃、180r/min振荡培养24h，测定菌液pH、OD600。同时将菌株接入NA液体培养液后于不同温度条件下(10℃、15℃、20℃、30℃、40℃)培养24h后测定pH、OD600。测定结果该菌株LXBF.1可在pH5-pH10条件下正常生长，最适合pH9(如图5所示)，可在50mmol/LNa2CO3、250mmol/LNaHCO3、15％NaNO3条件下正常生长(如图6、图7所示)，可耐受10％NaCl、低温10℃(如图 8、图9所示)，说明菌株LXBF.1对逆境条件耐受能力强，具有高耐盐碱性、耐低温等特性。
实施例3
菌株LXBF.1逆境下对硅、磷、钾的溶解能力：
将筛选得到的菌株LXBF.1分别点接于不同pH条件(pH5、pH7、pH9)、NaCl 含量(0.5％、5％、10％)、不同盐碱度(5％NaCl+pH7、10％NaCl+pH7、5％NaCl+pH9)的测定硅、钾、无机磷溶解能力的固体培养基上，观察是否正常生长，是否具有溶解能力，计算方法为：溶解能力＝溶解圈直径D/ 菌落直径d。测定结果见表1-3：
表1逆境条件下解硅能力
Figure RE-GDA0003060457580000111
表2逆境条件下解钾能力
Figure RE-GDA0003060457580000112
表3逆境条件下解无机磷能力
Figure RE-GDA0003060457580000113
测定结果表明：菌株LXBF.1在酸性、碱性、高盐及盐碱条件下均具有解硅、解钾、解无机磷能力。
实施例4
菌株LXBF.1的促生性能：
实验表明该菌株可以在含盐量10％的NA平板上生长。测试本发明菌株LXBF.1的产IAA、嗜铁素以及固氮活性、解硅、钾、无机磷的能力。
产嗜铁素检测：
将菌株LXBF.1划线接种到CAS检测培养基上，35℃培养6d，若出现黄绿色晕圈，则说明产嗜铁素。
固氮活性检测：
将菌株LXBF.1划线接种到阿须贝无氮培养基上，30℃培养3d，观察菌落生长情况。菌株能够生长，则说明具有固氮功能。阿须贝无氮培养基： K2H2PO4 0.2g、MgSO4·7H2O0.2g、NaCl 0.2g、碳酸钙5.0g、甘露醇10.0g、硫酸钙0.1g、蒸馏水1L、琼脂15g，pH7.0；
分泌IAA性能测试：
以Salkowski法测定产吲哚乙酸的能力。将活化菌株接种于含500 mg/L色氨酸的King’s B液体培养基培养3d后，取2mL菌悬液以 10000r/min离心15min，每1mL上清液加2mLSalkowski试剂，室温条件下暗处显色30min，测定OD530值。以空白培养基作对照，并以纯IAA 对应的OD530值作标准曲线，计算培养液中的IAA含量(mg/L)。
溶磷性能测定：
采用钼锑抗比色法进行菌株水溶性磷含量的测定。将活化菌株LXBF.1 接种于NA液体培养基中，于30℃、180r/min培养至对数期，按1％的接种量接种到100mL已灭菌的蒙金娜无机磷液体培养基中(葡萄糖10g/L， (NH4)2SO4 0.5g/L，MgSO4·7H2O 0.3g/L，NaCl0.3g/L，KCl 0.3g/L， FeSO4·7H2O 0.03g/L，MnSO4·4H2O 0.03g/L，Ca3(PO4)2 10.0g/L，pH7.0-7.5)，于28℃、180r/min振荡培养6h。取5mL培养液于12000r/min、 4℃离心5min，取上清液0.1mL并定容至5ml，取定容后的溶液1mL加入 10mL比色管中，加入钼锑抗显色剂2ml，以水定容至刻度，在室温高于 25℃处放置30min后，于700nm波长比色，测吸光度；同时以不接种的空白无机磷培养基为对照。
标准曲线的绘制：吸取磷标准溶液〔ρ(P)＝5mg/mL〕0，0.50，1.00，1.50，2.00，2.50，3.00mL于10mL比色管中，加入钼锑抗显色剂2mL，加水定容至刻度，在室温高于25℃处放置30min后，于700nm波长比色测吸光度，以吸光度为横坐标，磷浓度为纵坐标绘制标准曲线。
解钾性能测定：
在250mL三角瓶中加入100mL解钾培养基(蔗糖10g/L，Na2HPO41.0 g/L，(NH4)2SO40.5g/L，MgSO4·7H2O 1.0g/L，酵母粉0.2g/L，FeCl3微量，钾长石粉2.5g/L)，于121℃30min灭菌处理。接入对数生长期的菌株 LXBF.1菌液2mL，并设置空白对照(加无菌水)，于28℃180r/min摇床培养，在7d取菌液各20mL，6000r/min离心20min，利用原子吸收分光光度法测定上清液中的水溶性钾含量。
解硅能力测定：
在250mL三角瓶中加入100mL解硅培养基(蔗糖10g/L，Na2HPO41.0 g/L，(NH4)2SO40.5g/L，MgSO4·7H2O 1.0g/L，酵母粉0.2g/L，FeCl3微量，玻璃粉5g/L)，于121℃30min灭菌处理。接入对数生长期的菌株LXBF.1 菌液2mL，并设置空白对照(加无菌水)，于28℃180r/min摇床培养，在 10d取样测定溶液中硅含量。菌液处理:取10d菌液各20mL，6000r/min 离心20min，取上清液待用。利用硅钼蓝比色法分别测定上清液中水溶性硅含量。
实验结果表明，该菌株具有较强的固氮、解硅、解钾和无机磷能力，且具有产IAA、嗜铁素的能力，结果分别为IAA产生量152.03mg/L，解硅量40.10mg/L，溶解无机磷104.22mg/L，溶解钾210.64mg/L。因此，内生菌LXBF.1具有较强的促进植物生长的能力。各种促进植物生长物质能力比较见表4所示：
表4产各种促进植物生长物质能力比较
Figure RE-GDA0003060457580000141
注：+表示菌株生长；++表示颜色较深。
实施例5
溶血性检测：
参照《微生物肥料生物安全通用技术准则》(NY1109-2006)进行菌株 LXBF.1的溶血试验测定。结果表明本发明菌株LXBF.1未出现溶血环，说明该菌株无溶血反应。
实施例6
在盆栽盐碱土燕麦上的应用：
以曹妃甸湿地盐碱土(有机质13.5g/kg、有效磷71.7mg/kg、速效钾 478mg/kg、水解性氮44mg/kg、水溶性盐16.3g/kg、pH8.37)为基质，每盆 1.3kg盐碱土加入0.2kg蛭石混合均匀，选取大小均匀一致的燕麦种子，每盆栽种10粒，每个处理3个重复；待燕麦出苗后，浇灌LXBF.1菌液(NA 液体培养液培养48h)100倍稀释液，整个生长期浇灌2次，对照浇灌清水。生长2个月后对盆栽各处理植株进行拍照、测量并采用WinRHIZO植物根系分析***对根系进行分析，结果如图10所示，在盐碱土盆栽条件下接种本发明LXBF.1的燕麦植株长势更高、更健壮，效果差异显著；通过根系分析***对根系进行分析，如图11所示，接种弯曲芽孢杆菌LXBF.1的燕麦根系更发达，特别是在促进毛细根生长方面，效果尤为明显。分析结果见表5-6：
表5接种弯曲芽孢杆菌LXBF.1对燕麦植株生长的影响
试验组 株高cm 叶长cm 地上鲜重g/棵 根鲜重g/棵 叶绿素
对照 36.36b 21.95b 1.08b 0.36b 32.3a
LXBF.1 50.62a 29.48a 2.12a 1.28a 35.8a
表6接种弯曲芽孢杆菌LXBF.1对燕麦根系生长的影响
Figure RE-GDA0003060457580000151
实施例7
在盆栽盐碱土盐地碱蓬上的应用：
以曹妃甸湿地盐碱土(有机质13.5g/kg、有效磷71.7mg/kg、速效钾 478mg/kg、水解性氮44mg/kg、水溶性盐16.3g/kg、pH8.37)为基质，每盆 0.9kg盐碱土加入0.1kg蛭石混合均匀，称取1g/盆盐地碱蓬种子均匀撒播到土壤表面，种子表面撒一层蛭石，每个处理3个重复；待盐地碱蓬出苗后，浇灌LXBF.1菌液(NA液体培养液培养48h)100倍稀释液，整个生长期浇灌2次，对照浇灌清水。生长2个月后对盆栽各处理植株进行拍照、测量并采用WinRHIZO植物根系分析***对根系进行分析。结果如图12，在盐碱土盆栽条件下接种弯曲芽孢杆菌LXBF.1的盐地碱蓬长势较好，明显优于对照组；通过根系分析***对根系进行分析，如图13所示，接种弯曲芽孢杆菌LXBF.1的盐地碱蓬根系较为发达，特别是在根面积、根高及根长方面差异显著。分析结果见表7-8：
表7接种弯曲芽孢杆菌LXBF.1对盐地碱蓬植株生长的影响
试验组 株高cm 地上鲜重g/棵 根鲜重g/棵
对照 6.18b 0.24b 0.06a
LXBF.1 8.45a 0.48a 0.1a
表8接种弯曲芽孢杆菌LXBF.1对盐地碱蓬根系生长的影响
试验组 根面积cm<sup>2</sup> 根宽cm 根高cm 根长cm 表面积cm<sup>2</sup>
对照 11.27b 2.30a 4.47b 10.90b 1.18b
LXBF.1 15.48a 2.97a 4.92a 21.59a 2.31a
实施例8
在盐碱土蒲公英上的应用：
试验地为河北唐山市曹妃甸湿地大棚有机质11.3g/kg、有效磷 52.3mg/kg、速效钾234mg/kg、水解性氮35mg/kg、水溶性盐6.3g/kg、pH8.51)，于9月份移栽蒲公英苗(两片真叶)，试验小区面积长10m×宽1.5m，待缓苗1周后浇灌浇灌LXBF.1菌液(NA液体培养液培养48h)100倍稀释液，整个生长期浇灌2次，对照浇灌清水。生长1个月后进行蒲公英地上指标及根系调查。结果如图14、15所示，蒲公英在植株长势及根系方面都要显著优于对照处理，特别是在株高、根长、叶面积等方面差异显著。分析结果见表9-10所示：
表9接种弯曲芽孢杆菌LXBF.1对蒲公英植株生长的影响
Figure RE-GDA0003060457580000161
Figure RE-GDA0003060457580000171
表10接种弯曲芽孢杆菌LXBF.1对蒲公英根系生长的影响
试验组 根面积cm<sup>2</sup> 根宽cm 根高cm 根长cm 表面积cm<sup>2</sup> 根体积cm<sup>3</sup>
对照 278.65b 17.38a 16.04b 263.08b 127.47b 4.92b
LXBF.1 365.76a 17.49a 20.91a 704.31a 319.87a 11.56a
综上所述，本发明的盐地碱蓬内生弯曲芽孢杆菌株LXBF.1生存力强、适应性广，可在pH5-pH10(最适pH9)、50mmol/LNa2CO3、 250mmol/LNaHCO3、15％NaNO3条件下正常生长；对逆境条件耐受性强，可耐受10％NaCl、低温10℃；具有在盐碱条件下解硅钾、解无机磷能力；具有较强产IAA、嗜铁素的能力，应用在燕麦、盐地碱蓬及蒲公英上可显著提高作物耐盐能力，促进根系生长发育，提高作物产量，是盐碱土改良、作物种植上的一大创新，应用前景广阔。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明。
序列表
<110> 领先生物农业股份有限公司
<120> 一株耐盐碱解硅磷钾的内生弯曲芽孢杆菌及其应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1450
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ctgggcgggt ctataatgca gtcgagcgaa ctgattagaa gcttgcttct atgacgttag 60
cggcggacgg gtgagtaaca cgtgggcaac ctgcctgtaa gactgggata actccgggaa 120
accggagcta ataccggata acattttttc ttgcataaga gaaaattgaa agatggtttc 180
ggctatcact tacagatggg cccgcggtgc attagctagt tggtgaggta acggctcacc 240
aaggcaacga tgcatagccg acctgagagg gtgatcggcc acactgggac tgagacacgg 300
cccagactcc tacgggaggc agcagtaggg aatcttccgc aatggacgaa agtctgacgg 360
agcaacgccg cgtgagtgat gaaggctttc gggtcgtaaa actctgttgt tagggaagaa 420
caagtacaag agtaactgct tgtaccttga cggtacctaa ccagaaagcc acggctaact 480
acgtgccagc agccgcggta atacgtaggt ggcaagcgtt atccggaatt attgggcgta 540
aagcgcgcgc aggcggtttc ttaagtctga tgtgaaagcc cacggctcaa ccgtggaggg 600
tcattggaaa ctggggaact tgagtgcaga agagaaaagc ggaattccac gtgtagcggt 660
gaaatgcgta gagatgtgga ggaacaccag tggcgaaggc ggctttttgg tctgtaactg 720
acgctgaggc gcgaaagcgt ggggagcaaa caggattaga taccctggta gtccacgccg 780
taaacgatga gtgctaagtg ttagagggtt tccgcccttt agtgctgcag ctaacgcatt 840
aagcactccg cctggggagt acggtcgcaa gactgaaact caaaggaatt gacgggggcc 900
cgcacaagcg gtggagcatg tggtttaatt cgaagcaacg cgaagaacct taccaggtct 960
tgacatcctc tgacaactct agagatagag cgttcccctt cgggggacag agtgacaggt 1020
ggtgcatggt tgtcgtcagc tcgtgtcgtg agatgttggg ttaagtcccg caacgagcgc 1080
aacccttgat cttagttgcc agcattaagt tgggcactct aaggtgactg ccggtgacaa 1140
accggaggaa ggtggggatg acgtcaaatc atcatgcccc ttatgacctg ggctacacac 1200
gtgctacaat ggatggtaca aagggctgca agaccgcgag gtcaagccaa tcccataaaa 1260
ccattctcag ttcggattgt aggctgcaac tcgcctacat gaagctggaa tcgctagtaa 1320
tcgcggatca gcatgccgcg gtgaatacgt tcccgggcct tgtacacacc gcccgtcaca 1380
ccacgagagt ttgtaacacc cgaagtcggt ggggtaacct ttatgagcca gccgcctaaa 1440
ggtgagccag 1450

Claims (7)

1.一株耐盐碱解硅磷钾的内生弯曲芽孢杆菌，其特征在于，所述菌株命名为内生弯曲芽孢杆菌(Bacillus flexus)LXBF.1，于2021年01月22日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.21705，所述菌株的16S rDNA基因序列如SEQID NO:1所示。
2.根据权利要求1所述的内生弯曲芽孢杆菌，其特征在于，所述菌株具有下列特性：
a)呈革兰氏阳性、产芽孢的不规则杆状；
b)具有耐盐碱特性；
c)具有固氮、溶解无机磷、解硅钾，产IAA、嗜铁素的能力。
3.根据权利要求2所述的内生弯曲芽孢杆菌，其特征在于，所述菌株在NaCl含量≤10％的培养体系下正常生长；在NaCl含量≤5％的培养体系下具有解硅、解钾、解无机磷功能。
4.根据权利要求2所述的内生弯曲芽孢杆菌，其特征在于，所述菌株在5.0≤pH≤10.0的培养体系下正常生长；在5.0≤pH≤9.0的培养体系下具有解硅、解钾、解无机磷功能。
5.根据权利要求2所述的内生弯曲芽孢杆菌，其特征在于，所述菌株在Na2CO3含量≤50mmol/L、NaHCO3含量≤250mmol/L、NaNO3含量≤15％的培养体系下正常生长。
6.一种如权利要求1-5任一项所述的内生弯曲芽孢杆菌在盐碱土上促进植物生长的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述植物为耐盐植物盐地碱蓬、经济作物燕麦、中草药植物蒲公英。
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