CN107400171A - 抗菌和促再矿化双效应防龋多肽、其衍生物和盐及应用 - Google Patents
抗菌和促再矿化双效应防龋多肽、其衍生物和盐及应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开一种具有抗致龋菌和促再矿化功能的双效应防龋多肽、多肽衍生物或多肽可药用盐,所述多肽含有氨基酸序列a和氨基酸序列b,氨基酸序列a为Xn,其中X为S、T、Y、K、R、N或Q,n为氨基酸重复次数,是5~8的整数;氨基酸序列b是具有α双螺旋结构、带正电荷、含8~12个氨基酸,且序列中亲疏水性氨基酸交替出现的抗菌肽。本发明的抗致龋菌及促再矿化双效应功能多肽能够抑制变异链球菌生长,抑制变异链球菌生物膜形成,降低已形成的变异链球菌生物膜的代谢能力,杀灭已形成的变异链球菌生物膜中的活菌;在促再矿化方面能够促进脱矿牙釉质再矿化,降低脱矿牙釉质的龋深及矿物丢失;且具有良好的稳定性,无明显细胞毒性。
Description
技术领域
本发明属于生物医药领域,具体涉及一种具有抗致龋菌和促再矿化功能的防龋多肽、多肽衍生物、多肽可药用盐及其应用。
背景技术
龋病是在以细菌为主的多因素作用下,牙体硬组织发生慢性进行性破坏的一种疾病,也是人类最常见的口腔疾病,广泛存在于世界各地,世界卫生组织将其列为危害人类健康的三大疾病之一。大量证据表明,细菌的存在是龋病发生的先决条件,口腔致龋菌代谢碳水化合物产酸,导致牙体硬组织脱矿是龋病发生的直接原因。而龋病的发展是脱矿和再矿化反复交替动态变化的过程,通过人工方法可以促进脱矿牙体硬组织再矿化,恢复其硬度,终止或者消除早期龋损。因此,龋病的早期防治主要有抑制致龋菌和促进牙体硬组织再矿化两个重要方向。
在抑制致龋菌方面,抗微生物制剂如洗必泰、四环素等,可直接作用于细菌而预防龋病,但长期使用易引起口腔菌群失调,使细菌产生耐药性,具有明显的毒副作用。中药如儿茶、大黄、黄芩、蜂房、槟榔、三七、茶多酚等已被证实具有干扰细菌代谢、抑制牙菌斑生物膜形成等作用,但存在药液牙体染色、耐药性等问题。免疫防龋具有一定效果,但存在增强免疫原性及人体应用安全性问题,此外影响口腔菌群生态的问题也亟待解决。
在促进牙体硬组织再矿化方面,不定形磷酸钙、糖的替代品木糖醇及山梨醇、中药五倍子及隔消山、纳米羟磷灰石、酪蛋白磷酸肽、微量元素、橄榄油、树脂等的再矿化作用被先后报道,但由于效果不明显或实验结果不一,目前结论尚未统一。近年,基于釉基质蛋白的生物矿化功能,体外利用釉基质蛋白合成人工羟磷灰石已获得成功。Chen等模拟牙釉质矿化过程,利用釉基质蛋白控制合成了在化学组成上和晶体尺寸上都和自然牙釉质非常相似的纳米棒状羟磷灰石。Yamagish等在牙釉质表面形成了具有釉质结构的氟磷灰石,这些氟磷灰石排列致密,平行排列,垂直于釉质表面。国内学者王志伟等将牙釉质放置在含SD大鼠牙釉基质蛋白的磷酸盐琼脂-醋酸钙溶液体系中7天,结果发现添加釉基质蛋白的牙釉质表面出现晶体带状结构。这些实验结果均提示釉基质蛋白具有诱导牙釉质再矿化的强大潜力,但未成为成熟的产品直接用于防龋。
理想的防龋制剂应同时具有抗致龋菌和促牙体硬组织再矿化的功能,从两方面同时入手提高龋病防治效果。氟是一种常见的“双效应”防龋制剂,其有效降低了龋病的发生率,然而,氟的广泛使用也增加了氟牙症和氟骨症的发生率。因此,寻找安全有效的双效应防龋制剂具有重要意义。
随着分子生物学的发展,多肽可根据需要灵活改造,其安全、有效,成为龋病防治研究的热点。本发明的研发人员在前期对抗菌功能多肽和再矿化功能多肽的深入研究中,已经获得了一定的研究成果,在专利CN201310354537.3和CN201310355804.9中提供了具有诱导釉质再矿化作用的多肽,经试验证实其效果与氟化物相当;同时,在专利申请CN201510207973.7中提供了一种小分子抗菌多肽,结构稳定杀菌效果好,范围广。但是这些多肽都只具有单一的抗致龋菌或促再矿化功能,对有抗菌和再矿化双重需求的患者,需要同时使用两种药物,一方面增加患者用药负担,依从性差,另一方面两种药物之间可能会相互影响,降低各自的疗效。因此,研发同时具有抗菌及促再矿化“双效应”的多肽,从抗致龋菌和促再矿化两个方向同时入手进行龋病防治具有很高的临床实用价值。
发明内容
本发明的发明目的之一在于:针对上述研究背景,总结现有研究成果,通过严密的科学推理,创新性的提出利用蛋白拼接的思想,构建了一种同时具有抗致龋菌和促再矿化功能的双功能防龋多肽、多肽衍生物或多肽可药用盐,所述多肽一方面能降低致龋菌,减少龋病发生,一方面能促进脱矿牙釉质(早期龋)再矿化,治疗早期龋,从而产生更好的龋病防治效果。
本发明的目的之二在于提供一种含有上述抗菌和促再矿化双效应防龋多肽、多肽衍生物或多肽可药用盐的药物组合物及其制剂。
本发明的目的之三在于提供上述抗菌和促再矿化双效应防龋多肽、多肽衍生物或多肽可药用盐在制备防龋药物中的应用。
本发明的上述目的是通过以下技术方案实现的:
一种抗菌和促再矿化双效应防龋多肽、多肽衍生物或多肽可药用盐,所述多肽含有氨基酸序列a:Xn,其中X为S、T、Y、K、R、N或Q,n为氨基酸重复次数,选自5~8的整数;和
氨基酸序列b:b是具有α双螺旋结构、带正电荷、含8~12个氨基酸,且序列中亲疏水性氨基酸交替出现的抗菌肽。
优选氨基酸序列a位于多肽的N端,根据本发明人的研究,当顺序相反时,多肽的抗菌活性显著下降。
根据本发明的一些实施例,上述抗菌和促再矿化双效应防龋多肽、多肽衍生物或多肽可药用盐,所述氨基酸序列a为Xn,其中X为S或T,n为5或6。
根据本发明的一些实施例,上述抗菌和促再矿化双效应防龋多肽、多肽衍生物或多肽可药用盐,所述氨基酸序列a为SSSSSS、SSSSS或TTTTTT。
根据本发明的一些实施例,上述抗菌和促再矿化双效应防龋多肽、多肽衍生物或多肽可药用盐,所述氨基酸序列b为GLLWHLLHHLLH、LLRRLLRRLLRR或LLKKLLKKLLKK,或者与它们具有80%以上同一性的多肽。
根据本发明的一些实施例,上述抗菌和促再矿化双效应防龋多肽、多肽衍生物或多肽可药用盐,所述多肽含有以下氨基酸序列的其中之一,优选含有SEQ ID NO.1:
SEQ ID NO.1:SSSSSSGLLWHLLHHLLH;
SEQ ID NO.2:SSSSSSLLRRLLRRLLRR;
SEQ ID NO.3:SSSSSSLLKKLLKKLLKK;
SEQ ID NO.4:SSSSSGLLWHLLHHLLH;
SEQ ID NO.5:SSSSSLLRRLLRRLLRR;
SEQ ID NO.6:SSSSSLLKKLLKKLLKK;
SEQ ID NO.7:TTTTTTGLLWHLLHHLLH;
SEQ ID NO.8:TTTTTTLLRRLLRRLLRR;
SEQ ID NO.9:TTTTTTLLKKLLKKLLKK。
根据本发明的一些实施例,上述抗菌和促再矿化双效应防龋多肽、多肽衍生物或多肽可药用盐,所述多肽衍生物是多肽C端酰胺化的修饰物,例如SEQ ID NO.1~9的C端酰胺化物。
根据本发明的一些实施例,上述抗菌和促再矿化双效应防龋多肽、多肽衍生物或多肽可药用盐,所述盐包括但不限于盐酸盐、硫酸盐、乙酸盐、甲磺酸盐、琥珀酸盐、富马酸盐、柠檬酸盐、苹果酸盐、有机胺盐等。
本发明所述的抗菌和促再矿化双效应防龋多肽、多肽衍生物或多肽可药用盐可以参照专利CN201310354537.3和CN201310355804.9进行制备,也可以根据本发明的实施例制备。
根据本发明实施例的制备方法,包括以下步骤:
1、选用Rink-Amide-Am Resin作为树脂(载体);
2、用DCM将树脂充分溶胀;
3、用适当浓度的DBLK(六氢吡啶+DMF),将Fmoc-保护基团脱出;
4、用DMF清洗数遍,洗去DBLK;
5、称取适合的缩合剂和活化剂(HBTU,NMM)以及C端第一个Fmoc-保护氨基酸(Fomc-His(trt)-OH)进行缩合;
6、茚三酮检测法进行检测确保连接比较完全;
7、用DMF清洗几遍,洗去残留的各种残基和活化剂缩合剂;
8、按多肽的氨基酸序列进行缩合,方法参照步骤3-7;
9、将所有的氨基酸连接结束后采用步骤3,4方法脱去最后的Fmoc-保护基团;
10、用TFA切割液裂解,去除树脂和氨基酸保护基团,得到粗品;
11、送质谱确认产品正确(分子量符合理论值);
12、粗品送纯化分离,提高纯度。
本发明还提供了一种药物组合物,所述组合物含有前述的抗菌和促再矿化双效应防龋多肽、多肽衍生物或多肽可药用盐,以及药学上可接受的载体和/或辅料。
药学上可接受的载体包括但不限于无菌液体,如水、或者动物、植物或人工合成的油或其混合物,药用辅料包括但不限于淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明胶、麦芽糖、白垩、硅胶、硬脂酸钠、单硬脂酸甘油酯、滑石、氯化钠、脱脂奶粉、甘油、丙二醇、水、乙醇、湿润剂、乳化剂或pH缓冲剂、甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、纤维素、碳酸镁等。
本发明进一步提供了含有上述药物组合物的制剂,所述制剂包括液体制剂、固体制剂和半固体制剂,所述液体制剂包括但不限于溶液剂、注射剂,所述固体制剂包括但不限于片剂、胶囊剂,所述半固体制剂包括但不限于软膏剂、凝胶剂。
本发明更进一步地提供了上述抗菌和促再矿化双效应防龋多肽、多肽衍生物或多肽可药用盐在制备防龋药物中的应用。
本发明的有益效果:
本发明所述抗致龋菌及促再矿化“双效应”防龋功能多肽具有:①抗菌作用,可在较低浓度杀灭口腔内常见致病菌,②可靠的促再矿化作用,能促进早期人工龋再矿化,③对体外人口腔上皮细胞几乎无毒性,④分子量小,结构稳定。该“双效应”防龋功能多肽在龋病防治领域有巨大潜力。
附图说明:
图1为实施例4中多肽对影响变异链球菌生物膜形成的吸光度图;
图2为实施例5中影响已形成的变异链球菌生物膜代谢能力的吸光度图;
图3为实施例6中pH循环后釉质样本表面显微硬度检测结果图;
图4为实施例6中pH循环后釉质样本横断显微放射照相图;
图5为实施例6中pH循环后釉质样本横断显微放射照相显示的龋损处理前后各组矿物丢失量的结果图;
图6为实施例6中pH循环后釉质样本横断显微放射照相显示的循环处理前后各组龋损深度的结果图;
图7为实施例6中pH循环后釉质样本横断显微放射照相显示的循环处理前后不同龋损深度矿物质含量的结果图;
图8为实施例7中多肽在唾液中稳定性研究的多肽保留率图;
图9为实施例8中多肽体外细胞毒性研究的吸光度图。
具体实施方式
本发明具有抗致龋菌和促再矿化功能的双效应防龋多肽、多肽衍生物或多肽可药用盐,其多肽含有氨基酸序列a和氨基酸序列b,氨基酸序列a为Xn,其中X为S、T、Y、K、R、N或Q,n为氨基酸重复次数,选自5~8的整数;氨基酸序列b是具有α双螺旋结构、带负电荷、含8~12个氨基酸,且序列中亲疏水性氨基酸交替出现的抗菌肽。
在下述一些优选的实施例中,氨基酸序列a:Xn,其中X为S或T,n为5或6。
在下述一些优选的实施例中,所述氨基酸序列a为SSSSSS、SSSSS或TTTTTT,更优选的氨基酸序列a为SSSSSS。
在下述一些优选的实施例中,氨基酸序列b为GLLWHLLHHLLH、LLRRLLRRLLRR或LLKKLLKKLLKK,或者与它们具有80%以上同一性的多肽。
本发明的防龋多肽、多肽衍生物或多肽可药用盐,所述多肽含有以下氨基酸序列的其中之一,优选含有SEQ ID NO.1:
SEQ ID NO.1:SSSSSSGLLWHLLHHLLH;
SEQ ID NO.2:SSSSSSLLRRLLRRLLRR;
SEQ ID NO.3:SSSSSSLLKKLLKKLLKK;
SEQ ID NO.4:SSSSSGLLWHLLHHLLH;
SEQ ID NO.5:SSSSSLLRRLLRRLLRR;
SEQ ID NO.6:SSSSSLLKKLLKKLLKK;
SEQ ID NO.7:TTTTTTGLLWHLLHHLLH;
SEQ ID NO.8:TTTTTTLLRRLLRRLLRR;
SEQ ID NO.9:TTTTTTLLKKLLKKLLKK。
本发明所述的多肽衍生物是多肽C端酰胺化的修饰物,例如SEQ ID NO.1~9的C端酰胺化物,C端酰胺化后更有利于多肽的稳定性。
本发明多肽的氨基酸序列b,分子量小,具有α螺旋结构,能作用于细菌细胞壁,造成细胞壁穿孔,细菌死亡,从而起到抗菌作用。
发明人拟通过蛋白拼接原理,在抗菌肽上连接一个矿化多肽,以获得同时具有抗致龋菌和促再矿化双功能的防龋多肽。根据研究发现,抗菌功能多肽的C端对发挥其抗菌性具有重要作用,因而矿化片段连接在多肽的N端,当二者顺序调换时,抗菌效果显著降低或者消失。
进一步地,本发明的发明人经研究总结发现,矿化片段的基团-COOH、-CONH2、-OH、-NH2能吸附钙磷离子,进而促进牙体硬组织矿化。上述基团吸附钙磷离子能力强弱顺序如下:-COOH>-CONH2≈-OH>-NH2。但是,抗菌功能多肽带正电,带负电的基团-COOH会影响其抗菌功能,因而优选非-COOH基团。进一步的,含有-CONH2基团的氨基酸有天冬酰胺和谷氨酰胺,含有-OH基团的氨基酸有丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸,含有-NH2基团的氨基酸有赖氨酸和精氨酸,经过研究对比上述几种氨基酸,丝氨酸钙磷吸附能力较强且侧链基团小,是更优的选择。研究还发现,矿化片段的矿化能力随着氨基酸的个数增多而增强,但氨基酸数的增多又会影响抗菌功能多肽的抗菌作用,最后,经发明人研究得出,当矿化片段的氨基酸个数为5~8,特别是5或6时,能获得较好的矿化能力和抗菌能力。
因此,本发明的一些优选实施例,选取GLLWHLLHHLLH作为抗致龋菌片段,在此基础上N端增加促矿化片段SSSSSS,并将多肽的C端酰胺化构建抗致龋菌及促再矿化双效应多肽,从而产生更好的龋病防治效果。
本发明的防龋多肽或衍生物,可以视需要,例如为了方便制备制剂,进一步制备成药用盐,这些是药物制造领域常用的方法。
本发明的防龋多肽或衍生物可以采用现有技术中已知的合成多肽的方法进行制备,本发明也在实施例中提供了一种具体的合成方法。
以下通过具体实例对本发明的内容作进一步的说明和解释,以明确本发明的技术方案和有益效果。但本领域技术人员应该理解,这些实例仅是本发明的一些较佳选择,而不是对本发明上述主题的保护范围的限制。在不脱离本发明的精神和原则之内做的任何修改,以及根据本领域普通技术知识和惯用手段做出的等同替换或者改进,均应包括在本发明的保护范围内。
实施例1:
本发明的防龋多肽,氨基酸序列如SEQ ID NO.1~9。
按照以下方法制备:
1、选用Fmoc-His(Trt)-Wang Resin作为树脂(载体);
2、用DCM将树脂充分溶胀;
3、用适当浓度的DBLK(六氢吡啶+DMF),将Fmoc-保护基团脱出;
4、用DMF清洗数遍,洗去DBLK;
5、称取适合的缩合剂和活化剂(HBTU,NMM)以及C端第二个Fmoc-保护氨基酸(Fomc-Leu-OH)进行偶联;
6、茚三酮检测法进行检测确保连接比较完全;
7、用DMF清洗几遍,洗去残留的各种残基和活化剂缩合剂;
8、按多肽的氨基酸序列进行偶联,方法参照步骤3-7;
9、将所有的氨基酸连接结束后采用步骤3,4方法脱去最后的Fmoc-保护基团;
10、用TFA切割液裂解,去除树脂和氨基酸保护基团,得到粗品;
11、送质谱确认产品正确(分子量符合理论值);
12、粗品送纯化分离,提高纯度。
实施例2
C端酰胺化衍生物的制备:
参照实施例1所述方法进行制备,区别仅在于:选用Rink-Amide-Am Resin作为树脂(载体)。
实施例3“双效应”多肽最小抑菌浓度(MIC)和最小杀菌浓度(MBC)测定
最小抑菌浓度MIC(Minimal inhibitory concentration)是指在体外试验中,抗菌药物能抑制培养基中细菌生长的最低浓度。最小杀菌浓度MBC(Minimal bactericidalconcentration)指在体外试验中,抗菌药物能杀灭培养基中活菌的最小浓度。MIC与MBC是药物抗菌活性的指标,显示出药物抑杀病原微生物的能力。实验采用细菌为主要的口腔致龋菌:变异链球菌(Streptococcus mutans UA159),由口腔疾病研究国家重点实验室提供。测试多肽为SEQ ID NO.1的C末端酰胺化物(以下简称SH18)。
MIC、MBC测定实验步骤如下:
1、挑取单菌落于10mL BHI液体培养基中37℃恒温厌氧培养罐(80%N2、10%H2、10%CO2)过夜培养。
2、吸取100μL菌液于10mL BHI液体培养基中置于恒温厌氧培养罐(80%N2、10%H2、10%CO2)培养6小时,将菌液稀释至2×106CFU/mL备用。、
3、多肽采用2倍稀释法加入U形96孔板,每孔20μL。
4、每孔加入80μL BHI培养基、100μL备用菌液,使多肽最终浓度为512μM~1μM。
5、96孔板置于37℃恒温厌氧培养罐(80%N2、10%H2、10%CO2)培养24h。
6、MIC为孔板内澄清的最低多肽浓度。
7、吸取澄清孔内100μL菌液涂布于BHI平板,37℃恒温厌氧培养罐(80%N2、10%H2、10%CO2)过夜培养24h。
8、MBC为平板上无菌落生长的最低多肽浓度。
9、实验至少重复3次。
结果:SH18具有抗菌作用,其MIC为64μM,MBC为128μM。
实施例4“双效应”多肽对变异链球菌生物膜形成的影响
最小抑生物膜浓度MBIC(Minimal biofilm inhibitory concentration)是反映药物抗生物膜形成能力的指标。其中MBIC50是指在体外试验中,抗菌药物能抑制培养基中50%以上的生物膜形成的最低浓度。实验采用变异链球菌(Streptococcus mutansUA159)。测试多肽为SH18。无菌去离子水作为阴性对照。
实验步骤如下:
1、挑取单菌落于10mL BHI液体培养基中37℃恒温厌氧培养罐(80%N2、10%H2、10%CO2)过夜培养。
2、吸取100μL菌液于10mL BHI液体培养基中置于恒温厌氧培养罐(80%N2、10%H2、10%CO2)培养6小时,将菌液稀释至2×106CFU/mL备用。
3、多肽采用2倍稀释法加入96孔板,每孔20μL。
4、每孔加入80μL BHIS(BHI加2%蔗糖)培养基、100μL备用菌液,使多肽最终浓度为512μM~1μM,无菌去离子水作为阴性对照。
5、96孔板置于37℃恒温厌氧培养罐(80%N2、10%H2、10%CO2)培养24h。
6、吸走培养液,检测形成的生物膜的量:用PBS洗两次,甲醇固定15min,0.1%结晶紫染色5min,95%乙醇脱色30min,测量595nm下的吸光度。
7、MBIC50为吸光度较阴性对照组减少50%以上的最低多肽浓度。
8、实验至少重复3次。
结果如图1所示,横坐标表示多肽浓度,纵坐标表示吸光度,吸光度反映生物膜量,吸光度越高,生物膜量越多。从图1中可见,SH18浓度在16-512μM时形成的生物膜量较阴性对照组(多肽浓度为0μM)明显减少,差异有统计学意义(P<0.05)。图1中虚线表示形成生物膜量为阴性对照组的50%,可见SH18的MBIC50为16μM。
实施例5“双效应”多肽对已形成的变异链球菌生物膜代谢能力的影响
SMIC(Sessile minimal inhibitory concentration)是反映药物对已形成生物膜代谢能力的影响的指标。其中SMIC50是指在体外试验中,抗菌药物能降低生物膜50%以上代谢能力的最低浓度。实验采用变异链球菌(Streptococcus mutans UA159)。测试多肽为SH18。无菌去离子水作为阴性对照。
实验步骤如下:
1、挑取变异链球菌单菌落于10mL BHI液体培养基中37℃恒温厌氧培养罐(80%N2、10%H2、10%CO2)过夜培养。
2、吸取100μL菌液于10mL BHI液体培养基中置于恒温厌氧培养罐(80%N2、10%H2、10%CO2)培养6小时,将菌液稀释至1×106CFU/mL,加入96孔板,37℃恒温厌氧培养24小时。
3、弃上清,PBS洗生物膜3次,多肽采用2倍稀释法加入96孔板,每孔20μL。
4、每孔加入180μL BHI培养基,使多肽最终浓度为512μM~1μM,无菌去离子水作为阴性对照。
5、96孔板置于37℃恒温厌氧培养罐(80%N2、10%H2、10%CO2)培养24h。
6、吸走培养液,检测生物膜的代谢能力:MTT孵育2h,DMSO脱色30min,测量540nm下的吸光度。
7、MBIC50为抑制生物膜50%以上代谢能力的最低多肽浓度。
8、实验至少重复3次。
结果如图2所示,横坐标表示多肽浓度,纵坐标表示吸光度,吸光度反映生物膜代谢能力,吸光度越高,代谢能力强。从图2中可见,SH18浓度在128-512μM时生物膜的代谢能力较阴性对照组(多肽浓度为0μM)降低,差异有统计学意义(P<0.05)。图2中虚线表示生物膜代谢能力为阴性对照组的50%,可见SH18的SMIC50为128μM。
实施例6“双效应”多肽对脱矿牙釉质再矿化的影响
本实施例通过体外经典的pH循环观察“双效应”多肽对早期人工釉质龋的再矿化作用。
实验步骤如下:
1、釉质样本的制备:选择新鲜拔除的牛切牙,制备牛牙釉质样本。流动水下,使用三氧化二铝糊剂去除釉质表层染色、牙石以及不规则形态表面,去离子水超声荡洗20分钟后贮存于含有0.05%麝香草酚的PBS中,置于4℃冰箱中备用。分离冠根,将冠部牙体组织超声清洗20分钟,自然干燥,选取表面平整光滑、无氟斑、无色素、无裂痕的牙冠组织进行下一步操作。使用硬组织高速切割机将牙冠部分切成规格近约5×5×2mm大小的釉质块,使用抛光机并依次使用800#-1200#-2400#碳化硅水磨砂纸在流水下对唇面釉质进行磨平、抛光,去除约100μm表层釉质,以消除表面有机污染物以及不规则釉质型态。超声荡洗20分钟后自然干燥,使用环氧树脂将牙齿包埋,在釉质块唇面中央通过使用封口膜保留4mm×4mm的开窗区,开窗区之外的部位使用抗酸指甲油遮盖,抗酸指甲油分两次均匀涂布。通过表面显微硬度基线(即SHM0)筛选出90个硬度值范围为340--380KHN的釉质块进入下一步实验。
2、人工早期釉质龋的制备:将牛牙釉质样本按釉质开窗区表面面积与溶液比率为2mm2/1ml在特定体积的脱矿液中脱矿(脱矿液:2.2mM Ca(NO3)2、2.2mM KH2PO4、50mM aceticacid、5.0mM NaN3、0.5ppm NaF,pH 4.5)。磁力搅拌仪搅拌(100转/分),37℃下脱矿72小时,在牛牙釉质样本开窗区形成脱矿早期釉质龋
3、早期釉质龋显微硬度测定:对形成早期龋的釉质样本再次进行表面显微硬度值测定,记作SMH1,筛选出30个表面显微硬度值范围为140-220KHN的釉质块进入下一步的再矿化循环实验。将每个样本开窗区的一侧用4×2mm封口膜覆盖,并涂布抗酸指甲油封闭,以此作为再矿化循环前的早期釉质龋形态学对照。
4、再矿化循环实验:将筛选出的30个形成了早期龋的釉质样本随机分为3组,每组10个标本,按处理不同分为:实验组:SH18多肽组;阴性对照组:DDW组。体外pH循环条件下循环12天,每天体外pH循环包括2小时的脱矿(脱矿液:2.2mM Ca(NO3)2、2.2mM KH2PO4、50mMacetic acid、1.0mM NaN3,pH 4.5)4次5分钟的实验处理时间,其余时间浸泡在再矿化溶液中(再矿化液:1.5mM CaCl2、0.9mM KH2PO4、130mM KCl、1.0mM NaN3、20mM HEPES,pH 7.0),约22小时/天,在37℃密闭恒温箱内,使用磁力搅拌仪搅拌,100转/分。
5、结果检测指标
5.1表面显微硬度
表面显微硬度仪各参数设置同前,再次测定体外pH循环后的釉质样本开窗区表面显微硬度,每个釉质样本测定五个点,其平均值即该样本经pH循环循环处理后的表面显微硬度值,记作SMH2。对三次不同阶段即分别为:正常牛牙釉质、经脱矿形成早期釉质龋、体外pH循环处理后的釉质样本进行比较,可计算得出每个样本最终的表面显微硬度恢复的百分比(SMHR%):SMHR%=(SMH2-SMH1)/(SMH1-SMH0)x 100%。
5.2横断显微放射摄影
样本经循环处理后取出,去离子水冲洗,超声震荡20分钟,自然干燥,使用硬组织切割机垂直于开窗区对釉质样本进行表面切片处理,每个切片包含体外pH循环前后即早期人工龋部分和再矿化循环处理后两部分,切片约厚250μm,进而使用进口打磨砂纸在抛光机流水下将切片打磨成约100μm厚的薄片,最后将使用去离子水清洗后的磨片在CuK X-ray,20kV,20mA的条件下曝光25s,呈像后采用Transversal Microradiography Software 2006(Inspektor Research Systems BV,荷兰)对图像进行分析,得到样本龋深,矿物含量的变化。
结果:循环后表面显微硬度检测结果如图3所示,实验组表面显微硬度值恢复百分比显著高于阴性对照(P<0.05)。横断显微放射照相结果如图4-7所示,①体外pH循环前后,阴性对照组即DDW组的釉质龋损表层无明显变化,龋损深度也无明显改变,而实验组SH18釉质龋损表层明显增厚,且龋损深度变浅,具体检测结果见图4;②体外pH循环前后,DDW组釉质样本的矿物丢失量无明显变化,而多肽SH18组釉质标本的矿物丢失量明显减少,且较体外pH循环处理前有统计学差异(P<0.05),见图5;③体外pH循环前后,DDW组釉质样本的龋损深度无明显变化,而SH18组釉质标本的龋损深度明显变浅,且较体外pH循环处理前有统计学差异(P<0.05),见图6;④对经体外pH循环处理后各组釉质样本的不同龋损深度的矿物含量分析表明,在龋损表层30μm处SH18组与DDW组釉质样本矿物含量无明显差异,在龋损30-100μm处,SH18组釉质样本的矿物质含量明显高于DDW组,且差异有统计学意义(P<0.05)。综上,体外pH循环结果证实,双效应多肽SH18具有促进脱矿牙釉质再矿化的功能。
实施例7“双效应”多肽在唾液中稳定性研究
目前针对研究蛋白多肽类药物的众多研究表明,蛋白多肽类药物的结构稳定性对其功能发挥以及远期的临床研究应用具有重要意义,且由于本发明所设计合成的功能多肽针对的是口腔龋病研究领域,因此对前述设计合成的唾液蛋白仿生防龋功能多肽进行结构稳定性检测尤为必要,因而我们通过反相高效液相色谱观察多肽SH18在唾液中的保留率测定多肽的稳定性。
实验步骤如下:
1、在四川大学医学伦理学会审批后,收集健康患者晨起饭前唾液,12000rpm,4℃条件下离心20min。
2、使用0.45μm滤芯滤菌,37℃下静置1h。
3、唾液中加入512μM的多肽,37℃下孵育。在0min,15min,30min时使用反相高效液相色谱进行多肽含量的检测。
结果如图8所示,多肽在唾液中孵育半小时保留率仍在94%以上。
实施例8“双效应”的细胞毒性研究
通过观察多肽对人口腔上皮细胞(Human oral keratinocytes,HOK)活力的影响,观察多肽是否具有细胞毒性。HOK的活力通过Cell Counting Kit-8(CCK-8,中国)进行测定,测试多肽为SH18。.
具体步骤如下:
1、HOKs接种96孔板中,每孔2×103个细胞,培养覆盖面积大约为50%。使用20%胎牛血清(FBS)DMEM培养基培养。
2、将含有浓度为MBC,2MBC或4MBC的多肽的培养液加入细胞中,将多肽处理过的和未处理(阴性对照)的细胞在CO2培养箱中(5%CO2,37℃恒温)培养0.5,1,2,4,6和24h。无菌去离子水为阴性对照。
3、按照Am-blue试剂盒指导手册对于每个时间点的细胞进行操作。
4、使用酶标仪在450nm处读取数值。
实验结果如图9所示,所得数据为每孔内液体吸光度,吸光度越高,说明细胞活性越好,在多肽处理浓度为MBC、2MBC、4MBC,处理时间24h时,多肽处理对细胞增殖几乎没有影响。使用方差分析计算后,P值均大于0.05,均无统计学意义,说明多肽处理后对细胞活力无明显影响。
综上所述,本发明的抗致龋菌及促再矿化“双效应”防龋功能多肽在抗致龋菌方面具有显著的抗菌效果,能够抑制变异链球菌生长,抑制变异链球菌生物膜形成,降低已形成的变异链球菌生物膜的代谢能力;在促再矿化方面能够促进脱矿牙釉质再矿化,降低脱矿牙釉质的龋深及矿物丢失;同时,该多肽具有良好的稳定性,且无明显细胞毒性。该多肽在龋病防治领域十分具有研究价值。
以上所述仅为本发明的优选实施例,对本发明而言仅是说明性的,而非限制性的;本领域普通技术人员理解,在本发明权利要求所限定的精神和范围内可对其进行许多改变,修改,甚至等效变更,但都将落入本发明的保护范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 四川大学
<120> 抗菌和促再矿化双效应防龋多肽、其衍生物和盐及应用
<130> 2017801
<160> 9
<170> PatentIn version 3.5
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1 5 10 15
Leu His
<210> 2
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> PEPTIDE
<222> (1)..(18)
<400> 2
Ser Ser Ser Ser Ser Ser Leu Leu Arg Arg Leu Leu Arg Arg Leu Leu
1 5 10 15
Arg Arg
<210> 3
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> PEPTIDE
<222> (1)..(18)
<400> 3
Ser Ser Ser Ser Ser Ser Leu Leu Lys Lys Leu Leu Lys Lys Leu Leu
1 5 10 15
Lys Lys
<210> 4
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> PEPTIDE
<222> (1)..(17)
<400> 4
Ser Ser Ser Ser Ser Gly Leu Leu Trp His Leu Leu His His Leu Leu
1 5 10 15
His
<210> 5
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> PEPTIDE
<222> (1)..(7)
<400> 5
Ser Ser Ser Ser Ser Leu Leu Arg Arg Leu Leu Arg Arg Leu Leu Arg
1 5 10 15
Arg
<210> 6
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> PEPTIDE
<222> (1)..(17)
<400> 6
Ser Ser Ser Ser Ser Leu Leu Lys Lys Leu Leu Lys Lys Leu Leu Lys
1 5 10 15
Lys
<210> 7
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 7
Thr Thr Thr Thr Thr Thr Gly Leu Leu Trp His Leu Leu His His Leu
1 5 10 15
Leu His
<210> 8
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> PEPTIDE
<222> (1)..(18)
<400> 8
Thr Thr Thr Thr Thr Thr Leu Leu Arg Arg Leu Leu Arg Arg Leu Leu
1 5 10 15
Arg Arg
<210> 9
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> PEPTIDE
<222> (1)..(18)
<400> 9
Thr Thr Thr Thr Thr Thr Leu Leu Lys Lys Leu Leu Lys Lys Leu Leu
1 5 10 15
Lys Lys
Claims (10)
1.一种抗菌和促再矿化双效应防龋多肽、多肽衍生物或多肽可药用盐,所述多肽含有氨基酸序列a:Xn,其中X为S、T、Y、K、R、N或Q,n为氨基酸重复次数,选自5~8的整数;和
氨基酸序列b:b是具有α双螺旋结构、带正电荷、含8~12个氨基酸,且序列中亲疏水性氨基酸交替出现的抗菌肽。
2.根据权利要求1所述的抗菌和促再矿化双效应防龋多肽、多肽衍生物或多肽可药用盐,其特征在于,所述氨基酸序列a为Xn,其中X为S或T,n为5或6。
3.根据权利要求1所述的抗菌和促再矿化双效应防龋多肽、多肽衍生物或多肽可药用盐,其特征在于,所述氨基酸序列a为SSSSSS、SSSSS或TTTTTT。
4.根据权利要求1所述的抗菌和促再矿化双效应防龋多肽、多肽衍生物或多肽可药用盐,其特征在于,所述氨基酸序列b为GLLWHLLHHLLH、LLRRLLRRLLRR或LLKKLLKKLLKK,或者与它们具有80%以上同一性的多肽。
5.根据权利要求1所述的抗菌和促再矿化双效应防龋多肽、多肽衍生物或多肽可药用盐,其特征在于,所述多肽含有以下氨基酸序列的其中之一,优选含有SEQ ID NO.1:
SEQ ID NO.1:SSSSSSGLLWHLLHHLLH;
SEQ ID NO.2:SSSSSSLLRRLLRRLLRR;
SEQ ID NO.3:SSSSSSLLKKLLKKLLKK;
SEQ ID NO.4:SSSSSGLLWHLLHHLLH;
SEQ ID NO.5:SSSSSLLRRLLRRLLRR;
SEQ ID NO.6:SSSSSLLKKLLKKLLKK;
SEQ ID NO.7:TTTTTTGLLWHLLHHLLH;
SEQ ID NO.8:TTTTTTLLRRLLRRLLRR;
SEQ ID NO.9:TTTTTTLLKKLLKKLLKK。
6.根据权利要求1所述的抗菌和促再矿化双效应防龋多肽、多肽衍生物或多肽可药用盐,其特征在于,所述多肽衍生物是多肽C端酰胺化的修饰物。
7.根据权利要求6所述的抗菌和促再矿化双效应防龋多肽、多肽衍生物或多肽可药用盐,其特征在于,所述多肽衍生物是SEQ ID NO.1~9的C端酰胺化物,优选为SEQ ID NO.1的C端酰胺化物:SSSSSSGLLWHLLHHLLH-NH2。
8.根据权利要求1所述的抗菌和促再矿化双效应防龋多肽、多肽衍生物或多肽可药用盐,其特征在于,所述盐是盐酸盐、硫酸盐、乙酸盐、甲磺酸盐、琥珀酸盐、富马酸盐、柠檬酸盐、苹果酸盐或有机胺盐。
9.一种药物组合物,其特征在于,所述组合物含有权利要求1~8任意一项所述的抗菌和促再矿化双效应防龋多肽、多肽衍生物或多肽可药用盐,以及药学上可接受的载体和/或辅料。
10.如权利要求1~8任意一项所述的抗菌和促再矿化双效应防龋多肽、多肽衍生物或多肽可药用盐在制备防龋药物中的应用。
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