CN112763732B - Pe(16:0/20:2)及其组合物在糖尿病、糖尿病肾病诊断方面的应用 - Google Patents

Pe(16:0/20:2)及其组合物在糖尿病、糖尿病肾病诊断方面的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了PE(16:0/20:2)及其组合物在糖尿病、糖尿病肾病诊断方面的应用。本发明提供的血清脂质PE(16:0/20:2)或PE(16:0/20:2)联合TAG54:2‑FA18:1可以诊断区分健康人和2型糖尿病患者或健康人和早期糖尿病肾病或糖尿病肾病早期和晚期，诊断准确率高，因而具有开发制备成诊断2型糖尿病、早期糖尿病肾病或诊断区分糖尿病肾病早期和晚期的试剂或试剂盒的前景。

Description

PE(16:0/20:2)及其组合物在糖尿病、糖尿病肾病诊断方面的 应用
技术领域
本发明属于生物化学领域，涉及代谢标志物在疾病诊断中的应用，具体涉及PE(16:0/20:2)及其组合物在糖尿病、糖尿病肾病诊断方面的应用。
背景技术
生物标志物可以作为反映生物体结构和功能发生改变的信号指标，用于检测复杂疾病的发生和进展。近年来“组学”领域的生物标志物作为辅助手段用于预先、准确、灵敏地判断出疾病发生情况，取得了较好的效果。多个生物标志物联合诊断可以区分疾病的类型以及疾病所处的阶段，辅助临床治疗。而且以血清标志物为例，该方法具有简便、快速、经济且相对无创的优点而被广泛采用，对患者非常友好。
为了开发糖尿病、糖尿病肾病诊断的血清标志物或其组合物，特提出本发明。
发明内容
本发明目的在于提供PE(16:0/20:2)及其组合物在糖尿病、糖尿病肾病诊断方面的应用。
本发明上述目的通过如下技术方案实现：
血清脂质PE(16:0/20:2)或血清脂质PE(16:0/20:2)联合TAG54:2-FA18:1在制备诊断2型糖尿病的试剂、试剂盒中的应用。
血清脂质PE(16:0/20:2)或血清脂质PE(16:0/20:2)联合TAG54:2-FA18:1在制备诊断早期糖尿病肾病的试剂、试剂盒中的应用。
血清脂质PE(16:0/20:2)或血清脂质PE(16:0/20:2)联合TAG54:2-FA18:1在制备诊断区分糖尿病肾病早期和晚期的试剂、试剂盒中的应用。
一种诊断2型糖尿病的试剂盒，含有用于检测血清脂质PE(16:0/20:2)的检测试剂，或含有用于检测血清脂质PE(16:0/20:2)和TAG54:2-FA18:1的检测试剂。
一种诊断早期糖尿病肾病的试剂盒，含有用于检测血清脂质PE(16:0/20:2)的检测试剂，或含有用于检测血清脂质PE(16:0/20:2)和TAG54:2-FA18:1的检测试剂。
一种诊断区分糖尿病肾病早期和晚期的试剂盒，含有用于检测血清脂质PE(16:0/20:2)的检测试剂，或含有用于检测血清脂质PE(16:0/20:2)和TAG54:2-FA18:1的检测试剂。
有益效果：
1、本发明提供的诊断指标为血清脂质，只需要采取少量血液即可检测，基本无创；
2、本发明提供的血清脂质PE(16:0/20:2)或PE(16:0/20:2)联合TAG54:2-FA18:1可以诊断区分健康人和2型糖尿病患者或健康人和早期糖尿病肾病或糖尿病肾病早期和晚期，诊断准确率高，因而具有开发制备成诊断2型糖尿病、早期糖尿病肾病或诊断区分糖尿病肾病早期和晚期的试剂或试剂盒的前景。
附图说明
图1为脂质PE(16:0/20:2)、TAG54:2-FA18:1在HCs和2-DM患者血清中的含量水平；
图2为脂质PE(16:0/20:2)、TAG54:2-FA18:1在HCs和DKDE患者血清中的含量水平；
图3为脂质PE(16:0/20:2)、TAG54:2-FA18:1在DKDA和DKDE患者血清中的含量水平；
图4为PE(16:0/20:2)独立诊断2-DM vs HCs的ROC曲线；
图5为PE(16:0/20:2)联合TAG54:2-FA18:1诊断2-DM vs HCs的ROC曲线；
图6为PE(16:0/20:2)独立诊断DKDE vs HCs的ROC曲线；
图7为PE(16:0/20:2)联合TAG54:2-FA18:1诊断DKDE vs HCs的ROC曲线；
图8为PE(16:0/20:2)独立诊断DKDAvs DKDE的ROC曲线；
图9为PE(16:0/20:2)联合TAG54:2-FA18:1诊断DKDAvs DKDE的ROC曲线。
具体实施方式
下面结合附图和实施例具体介绍本发明实质性内容，但并不以此限定本发明的保护范围。
实施例1：血清脂质对糖尿病、糖尿病肾病的诊断效能
一、实验样本和试剂
收集江苏省中医院169例健康受试者(HCs)、170例2型糖尿病患者(2-DM)、238例2型糖尿病并发糖尿病肾病患者(其中124例早期DKDE，114例晚期DKDA)。健康受试者为体检健康的正常人，2型糖尿病、2型糖尿病并发糖尿病肾病根据《2015美国糖尿病指南》和肾脏病理确诊。各组患者的年龄、性别和体重指数匹配，无显著性差异。按表1将各组受试者或患者随机分为训练集样本和验证集样本。
表1训练集样本和验证集样本样本数量
Figure BDA0002949472990000021
排除标准：①明确诊断的原发性肾脏疾病；②可引起脂质尿的其他***性疾病；③近1个月内有糖尿病急性并发症及***；④合并有心脑血管、肝、肾脏和造血***等严重原发性疾病；⑤患有精神疾病不能合作者；⑥妊娠或哺乳期妇女，或准备妊娠者；⑦近1个月内参加其它临床试验者；⑧不愿接受本研究者。
主要实验试剂：甲醇，MTBE，异丙醇，乙腈，醋酸铵，氢氧化铵。
二、实验方法
1、血清样本的采集及储存
采集患者清晨空腹外周血并将其置于不含抗凝剂的试管内，在室温下自然凝集30-60min，待血液凝固，以2000rpm速度离心10min，小心吸取上层清亮血清液体于无菌冻干管中，标记后放入-80℃冰箱储存备用。
2、UHPLC技术测定血清中目标脂质的含量水平
检测仪器：UHPLC system(Shimazu Nexera X2 LC-30AD,Japan)，ESI-triplequadrupole mass spectrometer(SCIEX Triple Quad 5500+,Singapore)；
色谱条件：Waters ACQUITY UPLC BEH HILIC(100mm×2.1mm I.D.,1.7μm；Waters,Milford,MA,USA)。柱温为35℃，流速为500μl/min。注射体积为5μl。流动相的组成有两个溶剂:A相含10mM醋酸铵(NH4OAc)的水:乙腈(5:95,v/v)溶液，B相含10mM醋酸铵(NH4OAc)的水:乙腈(50:50,v/v,氢氧化铵调整pH 8.2)。梯度洗脱：0-10.0min，0.1％-20％B；10.0-11.0min，20％-98％B；11.0-13.0min，98％B；13.0-13.1min，98％-0.1％B；13.1-16.0min，0.1％B；
质谱条件：该质谱仪在电喷雾电压(毛细管电压)为4500/-4500V的正负电离模式下工作。典型源条件如下:幕气设置为35。离子源温度调至500℃。离子气源1(GS1)和离子气源2(GS2)均设置为50和60。减垢电位设置为80/-80伏。在正、负模式下，碰撞出口电位设置为9/-11v；
样本处理：将40μl血清与225μl冰甲醇混合。然后将每个样品涡旋10秒后加入750μl的冷MTBE，将混合物涡流10秒，在4℃轨道混合器中振荡10分钟。加入室温LC/MS级水188μl，涡旋20秒后4℃，14000rcf离心2min。上层液体被转移到干净管子,然后SpeedVac样本集中器中45℃挥干2h。用100μl的异丙醇/乙腈/水(30:65:5,v/v/v)混合物溶解干油脂,样本涡旋10秒钟,然后4℃，14000rcf离心10分钟。
以各样本中各目标脂质的检测峰面积表示其含量水平。
3、数据处理方法
训练集中，运用Logistic回归建立单个或多个目标血清脂质含量水平的回归方程，产生新变量logit[P]，对该新变量进行ROC曲线分析，并根据ROC曲线得到最佳cut-off值；验证集中，根据SPSS 25.0软件给出的预测概率计算目标血清脂质的诊断准确率。
三、实验结果
1、目标血清脂质在不同临床样本中含量水平的差异
(1)PE(16:0/20:2)、TAG54:2-FA18:1在2-DM、HCs血清中含量水平的差异
训练集中，脂质PE(16:0/20:2)、TAG54:2-FA18:1在HCs和2-DM患者血清中的含量水平存在明显差异，如图1所示。
(2)PE(16:0/20:2)、TAG54:2-FA18:1在DKDE、HCs血清中含量水平的差异
训练集中，脂质PE(16:0/20:2)、TAG54:2-FA18:1在HCs和DKDE患者血清中的含量水平存在明显差异，如图2所示。
(3)PE(16:0/20:2)、TAG54:2-FA18:1在DKDA、DKDE血清中含量水平的差异
训练集中，脂质PE(16:0/20:2)、TAG54:2-FA18:1在DKDA、DKDE患者血清中的含量水平存在明显差异，如图3所示。
2、目标血清脂质对不同临床样本的诊断区分效能
2.1训练集构建逻辑回归方程
(1)PE(16:0/20:2)独立诊断2-DM vs HCs
在训练集中，以各样本的血清脂质PE(16:0/20:2)含量水平为自变量，以组别(2-DM、HCs)为应变量，构建得到回归方程logit[p]＝0.281+2.174X1，其中：X1为PE(16:0/20:2)含量水平。
(2)PE(16:0/20:2)联合TAG54:2-FA18:1诊断2-DM vs HCs
在训练集中，以各样本的血清脂质PE(16:0/20:2)、TAG54:2-FA18:1含量水平为自变量，以组别(2-DM、HCs)为应变量，构建得到回归方程logit[p]＝0.450+2.275X1+1.828X2，其中：X1为PE(16:0/20:2)含量水平，X2为TAG54:2-FA18:1含量水平。
(3)PE(16:0/20:2)独立诊断DKDE vs HCs
在训练集中，以各样本的血清脂质PE(16:0/20:2)含量水平为自变量，以组别(DKDE、HCs)为应变量，构建得到回归方程logit[p]＝-0.347+2.533X1，其中：X1为PE(16:0/20:2)含量水平。
(4)PE(16:0/20:2)联合TAG54:2-FA18:1诊断DKDE vs HCs
在训练集中，以各样本的血清脂质PE(16:0/20:2)、TAG54:2-FA18:1含量水平为自变量，以组别(DKDE、HCs)为应变量，构建得到回归方程logit[p]＝-0.233+3.247X1+3.206X2，其中：X1为PE(16:0/20:2)含量水平，X2为TAG54:2-FA18:1含量水平。
(5)PE(16:0/20:2)独立诊断DKDAvs DKDE
在训练集中，以各样本的血清脂质PE(16:0/20:2)含量水平为自变量，以组别(DKDA、DKDE)为应变量，构建得到回归方程logit[p]＝-0.654+1.715X1，其中：X1为PE(16:0/20:2)含量水平。
(6)PE(16:0/20:2)联合TAG54:2-FA18:1诊断DKDAvs DKDE
在训练集中，以各样本的血清脂质PE(16:0/20:2)、TAG54:2-FA18:1含量水平为自变量，以组别(DKDA、DKDE)为应变量，构建得到回归方程logit[p]＝-0.654+1.715X1，其中：X1为PE(16:0/20:2)含量水平。
2.2训练集确定最佳鉴别阈值
(1)PE(16:0/20:2)独立诊断2-DM vs HCs
在训练集中，将各样本的血清脂质PE(16:0/20:2)含量水平代入上述回归方程，即可得到训练集中各个样本的回归值logit[p]，以可能的回归值作为诊断点，计算灵敏度和特异性，据此绘制ROC曲线(如图4所示)，AUC可达0.753，具有较高的准确性。根据ROC曲线得到诊断区分2-DM vs HCs的最佳cut-off值0.549。
(2)PE(16:0/20:2)联合TAG54:2-FA18:1诊断2-DM vs HCs
在训练集中，将各样本的血清脂质PE(16:0/20:2)、TAG54:2-FA18:1含量水平代入上述回归方程，即可得到训练集中各个样本的回归值logit[p]，以可能的回归值作为诊断点，计算灵敏度和特异性，据此绘制ROC曲线(如图5所示)，AUC可达0.803，具有较高的准确性。根据ROC曲线得到诊断区分2-DM vs HCs的最佳cut-off值0.457。
(3)PE(16:0/20:2)独立诊断DKDE vs HCs
在训练集中，将各样本的血清脂质PE(16:0/20:2)含量水平代入上述回归方程，即可得到训练集中各个样本的回归值logit[p]，以可能的回归值作为诊断点，计算灵敏度和特异性，据此绘制ROC曲线(如图6所示)，AUC可达0.790，具有较高的准确性。根据ROC曲线得到诊断区分DKDE vs HCs的最佳cut-off值0.386。
(4)PE(16:0/20:2)联合TAG54:2-FA18:1诊断DKDE vs HCs
在训练集中，将各样本的血清脂质PE(16:0/20:2)、TAG54:2-FA18:1含量水平代入上述回归方程，即可得到训练集中各个样本的回归值logit[p]，以可能的回归值作为诊断点，计算灵敏度和特异性，据此绘制ROC曲线(如图7所示)，AUC可达0.878，具有较高的准确性。根据ROC曲线得到诊断区分DKDE vs HCs的最佳cut-off值0.314。
(5)PE(16:0/20:2)独立诊断DKDAvs DKDE
在训练集中，将各样本的血清脂质PE(16:0/20:2)含量水平代入上述回归方程，即可得到训练集中各个样本的回归值logit[p]，以可能的回归值作为诊断点，计算灵敏度和特异性，据此绘制ROC曲线(如图8所示)，AUC可达0.698，具有较高的准确性。根据ROC曲线得到诊断区分DKDAvs DKDE的最佳cut-off值0.480。
(6)PE(16:0/20:2)联合TAG54:2-FA18:1诊断DKDAvs DKDE
在训练集中，将各样本的血清脂质PE(16:0/20:2)、TAG54:2-FA18:1含量水平代入上述回归方程，即可得到训练集中各个样本的回归值logit[p]，以可能的回归值作为诊断点，计算灵敏度和特异性，据此绘制ROC曲线(如图9所示)，AUC可达0.698，具有较高的准确性。根据ROC曲线得到诊断区分DKDAvs DKDE的最佳cut-off值0.480。
2.3验证集验证诊断准确率
(1)PE(16:0/20:2)独立诊断2-DM vs HCs
在验证集中，将各样本的血清脂质PE(16:0/20:2)含量水平数据导入SPSS 25.0软件，即可得到验证集中各个样本的回归值logit[p]，并获得预测概率，以预测正确的样本数除以总样本数即为目标脂质区分2-DM vs HCs的准确率73.9％(88/119)。
(2)PE(16:0/20:2)联合TAG54:2-FA18:1诊断2-DM vs HCs
在验证集中，将各样本的血清脂质PE(16:0/20:2)、TAG54:2-FA18:1含量水平数据导入SPSS 25.0软件，即可得到验证集中各个样本的回归值logit[p]，并获得预测概率，以预测正确的样本数除以总样本数即为目标脂质区分2-DM vs HCs的准确率73.9％(88/119)。
(3)PE(16:0/20:2)独立诊断DKDE vs HCs
在验证集中，将各样本的血清脂质PE(16:0/20:2)含量水平数据导入SPSS 25.0软件，即可得到验证集中各个样本的回归值logit[p]，并获得预测概率，以预测正确的样本数除以总样本数即为目标脂质区分DKDE vs HCs的准确率75.6％(93/123)。
(4)PE(16:0/20:2)联合TAG54:2-FA18:1诊断DKDE vs HCs
在验证集中，将各样本的血清脂质PE(16:0/20:2)、TAG54:2-FA18:1含量水平数据导入SPSS 25.0软件，即可得到验证集中各个样本的回归值logit[p]，并获得预测概率，以预测正确的样本数除以总样本数即为目标脂质区分DKDE vs HCs的准确率84.6％(104/123)。
(5)PE(16:0/20:2)独立诊断DKDAvs DKDE
在验证集中，将各样本的血清脂质PE(16:0/20:2)含量水平数据导入SPSS 25.0软件，即可得到验证集中各个样本的回归值logit[p]，并获得预测概率，以预测正确的样本数除以总样本数即为目标脂质区分DKDAvs DKDE的准确率75％(96/128)。
(6)PE(16:0/20:2)联合TAG54:2-FA18:1诊断DKDAvs DKDE
在验证集中，将各样本的血清脂质PE(16:0/20:2)、TAG54:2-FA18:1含量水平数据导入SPSS 25.0软件，即可得到验证集中各个样本的回归值logit[p]，并获得预测概率，以预测正确的样本数除以总样本数即为目标脂质区分DKDAvs DKDE的准确率78.9％(101/128)。
实施例2：诊断试剂盒
一种诊断2型糖尿病的试剂盒，含有用于检测血清脂质PE(16:0/20:2)的检测试剂，或含有用于检测血清脂质PE(16:0/20:2)和TAG54:2-FA18:1的检测试剂。
一种诊断早期糖尿病肾病的试剂盒，含有用于检测血清脂质PE(16:0/20:2)的检测试剂，或含有用于检测血清脂质PE(16:0/20:2)和TAG54:2-FA18:1的检测试剂。
一种诊断区分糖尿病肾病早期和晚期的试剂盒，含有用于检测血清脂质PE(16:0/20:2)的检测试剂，或含有用于检测血清脂质PE(16:0/20:2)和TAG54:2-FA18:1的检测试剂。
上述实施例的作用在于具体介绍本发明的实质性内容，但本领域技术人员应当知道，不应将本发明的保护范围局限于该具体实施例。

Claims (3)

1.检测血清PE(16:0/20:2)的检测试剂联合检测血清TAG54:2-FA18:1的检测试剂在制备诊断2型糖尿病的试剂盒中的应用。
2.检测血清PE(16:0/20:2)的检测试剂联合检测血清TAG54:2-FA18:1的检测试剂在制备诊断早期糖尿病肾病的试剂盒中的应用，所述糖尿病肾病为2型糖尿病并发糖尿病肾病。
3.检测血清PE(16:0/20:2)的检测试剂在制备诊断区分糖尿病肾病早期和晚期的试剂盒中的应用，所述糖尿病肾病为2型糖尿病并发糖尿病肾病。
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