CN112946262A - 一种pcv3双抗原夹心elisa抗体检测试剂盒及其应用 - Google Patents

一种pcv3双抗原夹心elisa抗体检测试剂盒及其应用 Download PDF

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CN112946262A CN202110104238.9A CN202110104238A CN112946262A CN 112946262 A CN112946262 A CN 112946262A CN 202110104238 A CN202110104238 A CN 202110104238A CN 112946262 A CN112946262 A CN 112946262A
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李静
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谷思颖
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Abstract

本发明旨在于提供一种PCV3双抗原夹心ELISA抗体检测试剂盒及其应用，能够灵敏、快速、准确的检测出PCV3抗体，并且具有特异性强、重复性好、对于不同种类动物均具有较高的检测准确率，检测结果准确可靠的特点，是一种具有广谱性的检测方法，本发明提供的检测方法对于圆环病毒感染防控具有重要意义。

Description

一种PCV3双抗原夹心ELISA抗体检测试剂盒及其应用
技术领域
本发明属于生物检测技术领域，更具体地，本发明涉及一种猪圆PCV3双抗原夹心ELISA抗体检测试剂盒。
背景技术
圆环病毒属于圆环病毒科圆环病毒属，其基因组为一个2kb左右的环状单链DNA。圆环病毒可以感染多种动物，包括猪、牛、犬、鸭、鸡、狐狸和鱼类等多种动物。圆环病毒主要编码两个开放性阅读框(rep和cap)。2015年，美国研究人员通过宏基因组测序，在美国检测到一个新型圆环病毒(PCV3)，该圆环病毒与皮炎肾病综合征、繁殖障碍、心肌炎以及多***炎症相关。目前，猪圆环病毒III型是严重危害我国养猪业的一个猪病，抗体检测是防控的关键。同时，圆环病毒对于其他种类动物的感染也是影响养殖行业的潜在威胁。
然而目前对于PCV3的ELISA抗体检测试剂盒的研究集中于间接ELISA诊断方法。如申请号为：201810004832.9的发明专利《猪圆环病毒3型ELISA抗体检测试剂盒》及申请号为：201710184107.X的发明专利《一种新型猪圆环病毒3型的ELISA抗体检测试剂盒及其应用》中个披露的技术方案，大多建立的血清学检测试剂盒是以PCV3 Cap蛋白为抗原建立的间接ELISA诊断试剂盒，该试剂盒受被检测动物种属的限制。本发明提供一种适用于多种宿主抗体检测的PCV3 Cap蛋白的双抗原夹心ELISA抗体检测试剂盒，能够应用于临床检测多种属的PCV3抗体检测，以期为PCV3流行病学研究、临床疾病检测提供实用手段，对于养殖及疫病检测领域具有广泛的开发价值。
发明内容
为了解决现有技术中对于PCV3抗体检测受被检测动物种属的限制的技术问题，本发明旨在于提供一种PCV3双抗原夹心ELISA抗体检测试剂盒，能够灵敏、快速、准确地检测出PCV3抗体，并且具有特异性强、重复性好，对于不同种类动物均具有较高的检测准确率，检测结果准确可靠的特点，是一种具有广谱性的检测试剂盒，本发明提供的检测试剂盒对于PCV3感染防控具有重要意义。
本发明通过以下技术方案实现：
本发明提供的一种PCV3双抗原夹心ELISA抗体检测试剂盒，采用PCV3Cap40-372重组蛋白作为包被抗原，采用PCV3Cap376-645-HRP作为酶标检测抗原。
本发明提供的一种PCV3双抗原夹心ELISA抗体检测试剂盒，还包含碳酸盐缓冲溶液、PBST、脱脂奶粉、TMB显色液、2MH2SO4终止液。
本发明提供的一种PCV3双抗原夹心ELISA抗体检测试剂盒，在PCV3Cap40-372重组蛋白制备过程中采用的引物序列如SEQ ID NO.1及SEQ ID NO.2所示，PCV3Cap376-645-HRP制备过程中采用的引物序列如SEQ ID NO.3及SEQ ID NO.4所示。
进一步的，本发明还提供一种PCV3双抗原夹心ELISA抗体检测试剂盒在检测PCV3抗体中的应用。
本发明提供的一种PCV3双抗原夹心ELISA抗体检测试剂盒的在检测PCV3抗体中的应用，其特征在于，所述的应用包括以下步骤：
(1)采用PCV3Cap40-372重组蛋白作为抗原包被酶标板，每孔100μL，包被蛋白用碳酸盐缓冲溶液(pH9.6)，待检血清按照1：(25-200)的倍比稀释，稀释至5.0-0.1μg/mL；包被1-2h或4℃包被过夜，每孔加入250μLPBST洗涤5min，共3次，每次都需拍干酶标板；
(2)将步骤(1)中获得的酶标板每孔加入200μL5％脱脂奶粉封闭，37℃封闭，30-90min，洗涤步骤同步骤(1)；
(3)将步骤(2)中获得的酶标板每孔加样100μL，同时设置阴性对照，37℃作用2h，洗涤步骤同步骤(1)；
(4)在步骤(3)的基础上将酶标抗原PCV3Cap376-645-HRP以1：(500-2000)的进行倍比稀释，每孔加入100μL，37℃孵育30-90min，洗涤步骤同步骤(1)；
(5)将步骤(4)获得酶标板每孔加入100μL的TMB显色液，37℃避光显色10-30min；
(6)将步骤(4)获得酶标板每孔加入100μL 2MH2SO4终止液，酶标仪中450nm处读取OD值；
(7)将步骤(6)中获得的OD值进行结果判断，其中免疫组阳性血清OD450nm值与未免疫阴性血清OD450nm值之比大于2.1，即可判定为阳性。
优选的，抗原浓度稀释至1.0μg/mL，血清稀释度为1：50。
优选的，重组抗原最佳包被条件是4℃包被过夜。
优选的，血清最佳反应时间为60min。
优选的，酶标抗原工作浓度为酶标抗原按照1：500进行稀释，孵育时间为60min。
优选的，底物作用时间为20min。
通过实施本发明具体的发明内容可以达到以下有益效果：
本发明旨在于提供一种PCV3双抗原夹心ELISA抗体检测试剂盒，能够灵敏、快速、准确的检测出PCV3抗体，并且具有特异性强、重复性好、对于不同种类动物均具有较高的检测准确率，检测结果准确可靠的特点，是一种具有广谱性的检测试剂盒，本发明提供的检测试剂盒对于PCV3感染防控具有重要意义，为PCV3血清流行病学监测提供了简单、快速和成本低廉的技术支持具有广泛的应用价值。
附图说明
无
具体实施方式
下面，举实施例说明本发明，但是，本发明并不限于下述的实施例。本发明中涉及的设备和材料：
本发明所用到的试剂：碳酸盐缓冲溶液、PBST、脱脂奶粉、TMB显色液、MH2SO4。
本发明所用到的材料：酶标板、恒温箱、酶标仪、移液枪、吸头、超净工作台。
本发明中选用的所有试剂、仪器、原辅材料都为本领域熟知选用的，但不限制本明的实施，其他本领域熟知的一些试剂和设备都可适用于本发明以下实施方式的实施。
实施例一：一种PCV3双抗原夹心ELISA抗体检测试剂盒
本发明提供的一种PCV3双抗原夹心ELISA抗体检测试剂盒，采用PCV3Cap40-372重组蛋白作为包被抗原，采用PCV3Cap376-645-HRP作为酶标检测抗原，其中还包含碳酸盐缓冲溶液、PBST、脱脂奶粉、TMB显色液、2MH2SO4终止液。
本发明提供的一种PCV3双抗原夹心ELISA抗体检测试剂盒，在PCV3Cap40-372重组蛋白制备过程中采用的引物序列如SEQ ID NO.1及SEQ ID NO.2所示，PCV3Cap376-645-HRP制备过程中采用的引物序列如SEQ ID NO.3及SEQ ID NO.4所示。
进一步的，本发明还提供一种PCV3双抗原夹心ELISA抗体检测试剂盒在检测PCV3抗体中的应用。
本发明提供的一种PCV3双抗原夹心ELISA抗体检测试剂盒的在检测PCV3抗体中的应用，其特征在于，所述的应用包括以下步骤：
(1)采用PCV3Cap40-372重组蛋白作为抗原包被酶标板，每孔100μL，包被蛋白用碳酸盐缓冲溶液(pH9.6)，待检血清按照1：(25-200)的倍比稀释，稀释至5.0-0.1μg/mL；包被1-2h或4℃包被过夜，每孔加入250μLPBST洗涤5min，共3次，每次都需拍干酶标板；
(2)将步骤(1)中获得的酶标板每孔加入200μL5％脱脂奶粉封闭，37℃封闭，30-90min，洗涤步骤同步骤(1)；
(3)将步骤(2)中获得的酶标板每孔加样100μL，同时设置阴性对照，37℃作用2h，洗涤步骤同步骤(1)；
(4)在步骤(3)的基础上将酶标抗原PCV3Cap376-645-HRP以1：(500-2000)的进行倍比稀释，每孔加入100μL，37℃孵育30-90min，洗涤步骤同步骤(1)；
(5)将步骤(4)获得酶标板每孔加入100μL的TMB显色液，37℃避光显色10-30min；
(6)将步骤(4)获得酶标板每孔加入100μL 2MH2SO4终止液，酶标仪中450nm处读取OD值；
(7)将步骤(6)中获得的OD值进行结果判断，其中免疫组阳性血清OD450nm值与未免疫阴性血清OD450nm值之比大于2.1，即可判定为阳性。
实施例二：包被抗原及酶标检测抗原的制备
1.构建重组质粒PCV3Cap40-372和PCV3Cap376-645
1.1引物
2对截短PCV3Cap40-372和PCV3Cap376-645基因的特异性引物如下：
PCV3Cap40-372引物序列如下：
SEQ ID NO.1：CGGAATTCATGCGTCGTCGTCGTCGTCATCGTCGTCGTTA
SEQ ID NO.2:CCGCTCGAGTTAATCGTCTTGCAGCCAGGTATTGGTGGTCC
PCV3Cap376-645引物序列如下：
SEQ ID NO.3：CCGGAATTCATGGTACGCAGAAAGCAGCACCCGCAAAG
SEQ ID NO.4：CCGCTCGAGTTACAGAACGCTTTTGTAGCGGATCCAGAC。
1.2PCV3Cap40-372和PCV3Cap376-645基因的扩增
以PCV3 Cap质粒为模板，SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.4为引物PCR扩增PCV3Cap40-372和PCV3Capp376-645基因，反应条件为：94℃5min；94℃30s；62℃30s；72℃40s；35个循环；72℃10min，4℃保存，反应体系如表1。
表1：PCR反应体系
组分 体积
上游引物F 1μL
下游引物R 1μL
模板 1μL
2×TaqDNA聚合酶 10μL
ddH<sub>2</sub>O 7μL
总体系 20μL
1.3目的基因的回收
PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳。
1.4重组质粒T-PCV3Cap40-372和T-PCV3Cap376-645的构建
将上述获得目的片段连接到T载体，25℃连接5min，反应体系如表2。
表2：T载体连接体系
Figure BDA0002917207050000071
Figure BDA0002917207050000081
将5μL的连接产物与50μL DH5α感受态细胞混匀，转化方法同试验一。挑取阳性克隆于5mL含Amp抗性液体培养基中，37℃，200r/rpm，过夜培养。质粒提取具体步骤同上。
1.5重组质粒pET-32a-PCV3Cap40-372和pET-32a-PCV3Cap376-645的构建
使用限制性内切酶EcoR I和Xho I对重组质粒T-PCV3Cap40-372、T-PCV3Cap376-64和pET-32a载体进行双酶切，反应条件为：37℃水浴1.5h，反应体系如表3。
表3：双酶切反应体系
Figure BDA0002917207050000082
酶切产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，电泳结束后使用胶回收法回收纯化酶切产物片段。
PCV3Cap40-372、PCV3Cap376-645基因和pET-32a载体使用T4连接酶，反应条件为：16℃过夜连接，表达载体连接体系如下表4所示。
表4：重组载体连接体系
Figure BDA0002917207050000083
Figure BDA0002917207050000091
连接产物转化到DH5α感受态细胞，提取重组质粒，进行PCR、双酶切、测序鉴定。
2.重组蛋白表达及鉴定
挑选测序正确的重组质粒pET-32a-PCV3Cap40-372和pET-32a-PCV3Cap376-645转化BL21表达感受态细胞，阳性克隆37℃振荡培养至菌液OD600nm达到0.5-0.7左右时，加入终浓度为0.5mmol/L的IPTG，诱导6h。通过SDS-PAGE和Westernblot鉴定重组蛋白。
3.重组蛋白的纯化
诱导表达5mL菌液，离心收集菌体，PBS将沉淀悬起，加入5×SDS-PAGE上样缓冲液，100℃水浴10min。制作SDS-PAGE浓缩胶时，不插上样梳，常规方法进行SDS-PAGE。电泳结束后，取出凝胶，0.3mol/L的KCl染色5min，能清晰看见白色条带后，将目的条带切下，PBS洗3次，加500μL PBS将凝胶完全碾碎后，12000r/rpm离心2min，取上清测定蛋白浓度及SDS-PAGE鉴定蛋白纯度。
4.HRP标记重组蛋白
测定PCV3Cap376-645重组蛋白的浓度，将其调整在0.5-2.0mg/mL，标记反应最小体积为100μL。将重组蛋白与HRP激活液按照10：1的比例轻轻混合，室温(20-25℃)下孵育1h或4℃下轻轻搅拌过夜。加入10μL还原剂NaCNBH3，室温下孵育15min。加入与反应体积等量的HRP存储缓冲液(2X)，在室温下孵化15min，4℃保存备用。
实施例三：一种PCV3双抗原夹心ELISA抗体检测试剂盒
采用PCV3Cap40-372重组蛋白作为抗原包被酶标板，每孔100μL，包被蛋白用碳酸盐缓冲溶液(pH9.6)，待检血清按照1：25的倍比稀释，稀释至5.0μg/mL；包被1h，每孔加入250μL PBST洗涤5min，共3次，每次都需拍干酶标板；每孔加入200μL5％脱脂奶粉封闭，37℃封闭，30min，洗涤步骤同上；每孔加样100μL，同时设置阴性对照，37℃作用2h，洗涤步骤同上；将酶标抗原PCV3Cap376-645-HRP以1：500的进行倍比稀释，每孔加入100μL，37℃孵育30min，洗涤步骤同上；每孔加入100μL的TMB显色液，37℃避光显色10min；每孔加入100μL 2MH2SO4终止液，酶标仪中450nm处读取OD值；将获得的OD值进行结果判断，其中免疫组阳性血清OD450nm值与未免疫阴性血清OD450nm值之比大于2.1，即可判定为阳性。
实施例四：一种PCV3双抗原夹心ELISA抗体检测试剂盒
采用PCV3Cap340-372重组蛋白作为抗原包被酶标板，每孔100μL，包被蛋白用碳酸盐缓冲溶液(pH9.6)，待检血清按照1：50的倍比稀释，稀释至2.50μg/mL；包被2h，每孔加入250μLPBST洗涤5min，共3次，每次都需拍干酶标板；每孔加入200μL5％脱脂奶粉封闭，37℃封闭，45min，洗涤步骤同上；每孔加样100μL，同时设置阴性对照，37℃作用2h，洗涤步骤同上；将酶标抗原PCV3Cap376-645-HRP以1：500的进行倍比稀释，每孔加入100μL，37℃孵育30-90min，洗涤步骤同上；每孔加入100μL的TMB显色液，37℃避光显色15min；每孔加入100μL2MH2SO4终止液，酶标仪中450nm处读取OD值；将获得的OD值进行结果判断，其中免疫组阳性血清OD450nm值与未免疫阴性血清OD450nm值之比大于2.1，即可判定为阳性。
实施例五：一种PCV3双抗原夹心ELISA抗体检测试剂盒
采用PCV3Cap40-372重组蛋白作为抗原包被酶标板，每孔100μL，包被蛋白用碳酸盐缓冲溶液(pH9.6)，待检血清按照1：50的倍比稀释，稀释至1.0μg/mL；4℃包被过夜，每孔加入250μLPBST洗涤5min，共3次，每次都需拍干酶标板；每孔加入200μL5％脱脂奶粉封闭，37℃封闭，60min，洗涤步骤同上；每孔加样100μL，同时设置阴性对照，37℃作用2h，洗涤步骤同上；将酶标抗原PCV3Cap376-645-HRP以1：500的进行倍比稀释，每孔加入100μL，37℃孵育60min，洗涤步骤同上；每孔加入100μL的TMB显色液，37℃避光显色20min；每孔加入100μL2MH2SO4终止液，酶标仪中450nm处读取OD值；将获得的OD值进行结果判断，其中免疫组阳性血清OD450nm值与未免疫阴性血清OD450nm值之比大于2.1，即可判定为阳性。
实施例六：一种PCV3双抗原夹心ELISA抗体检测试剂盒
采用PCV3Cap40-372重组蛋白作为抗原包被酶标板，每孔100μL，包被蛋白用碳酸盐缓冲溶液(pH9.6)，待检血清按照1：100的倍比稀释，稀释至0.5μg/mL；4℃包被过夜，每孔加入250μL PBST洗涤5min，共3次，每次都需拍干酶标板；每孔加入200μL5％脱脂奶粉封闭，37℃封闭，90min，洗涤步骤同上；每孔加样100μL，同时设置阴性对照，37℃作用2h，洗涤步骤同上；将酶标抗原PCV3Cap376-645-HRP以1：1000的进行倍比稀释，每孔加入100μL，37℃孵育90min，洗涤步骤同上；每孔加入100μL的TMB显色液，37℃避光显色30min；每孔加入100μL2MH2SO4终止液，酶标仪中450nm处读取OD值；将获得的OD值进行结果判断，其中免疫组阳性血清OD450nm值与未免疫阴性血清OD450nm值之比大于2.1，即可判定为阳性。
实施例七：一种PCV3双抗原夹心ELISA抗体检测试剂盒
采用PCV3Cap40-372重组蛋白作为抗原包被酶标板，每孔100μL，包被蛋白用碳酸盐缓冲溶液(pH9.6)，待检血清按照1：200)的倍比稀释，稀释至0.1μg/mL；4℃包被过夜，每孔加入250μL PBST洗涤5min，共3次，每次都需拍干酶标板；每孔加入200μL5％脱脂奶粉封闭，37℃封闭，90min，洗涤步骤同上；每孔加样100μL，同时设置阴性对照，37℃作用2h，洗涤步骤同上；将酶标抗原PCV3Cap376-645-HRP以1：2000的进行倍比稀释，每孔加入100μL，37℃孵育90min，洗涤步骤同上；每孔加入100μL的TMB显色液，37℃避光显色30min；每孔加入100μL2MH2SO4终止液，酶标仪中450nm处读取OD值；将获得的OD值进行结果判断，其中免疫组阳性血清OD450nm值与未免疫阴性血清OD450nm值之比大于2.1，即可判定为阳性。
实施例八：抗原最佳包被浓度和血清最佳稀释度优化
基于上述实施例三至实施例七，利用方阵滴定法将纯化后的PCV3Cap40-372重组蛋白溶液用包被液(碳酸盐缓冲溶液，pH9.6)按照以5.0μL/mL、2.50μg/、1.0μg/mL、0.5μg/mL、0.1μg/mL的梯度，100μL/孔进行包被，每孔加入200μL5％脱脂奶粉的封闭液，37℃封闭2h，每孔加入250μLPBST洗涤5min，共3次，每次都需拍干酶标板。将阴、阳血清用稀释液按照1：25，1：50，1：100，1：200的倍比稀释，以100μL/孔纵向铺板，每个浓度一行，37℃温箱中孵育1h；洗板同上，用稀释液将HRP标记的重组PCV3Cap376-645(PCV3Cap376-645-HRP)以1：500倍稀释，以100μL/孔加入酶标板，37℃温箱中孵育1h；洗板同上，将TMB以100μL/孔加入酶标板，置于暗室中反应20min；将终止液以50μL/孔加入，立即用酶标仪测定OD450nm值。ELISA最佳工作条件的标准为阳性/阴性OD450nm值(P/N)比值最大。测定结果如表5所示：
表5：抗原最佳包被浓度和血清最佳稀释度优化
Figure BDA0002917207050000131
Figure BDA0002917207050000141
注：每个数据均为2个平行对照的平均值
根据上述检测结果可知，将PCV3 Cap40-372蛋白浓度设置5个稀释梯度，血清稀释梯度从1：25开始设置4个梯度，其他条件一致，进行双抗原夹心ELISA检测结果见表1，结果显示抗原浓度稀释至1.0μg/mL，血清稀释度为1：50时，P/N值最大。
实施例九：重组抗原最佳包被时间的优化
基于上述实施例三至实施例八重组PCV3Cap40-372蛋白包被条件设置为3组；1h、2h、4℃过夜，用已知的PCV3阴、阳血清进行ELISA检测，每个条件1个平行对照，其他条件不变，读取OD450nm值，以阴性血清OD450nm值为N，阳性血清OD450nm值为P，比较各组阴、阳性血清的OD450nm值和P/N值，优化抗原最佳包被条件。设置三组不同的包被条件，其他为最优条件，进行双抗原夹心ELISA检测结果如表6所示。
表6：最佳包被时间的优化
Figure BDA0002917207050000142
注：每个数据均为2个平行对照的平均值
根据标测定结果所示，最佳包被条件是4℃包被过夜，P/N值最大。
实施例十：血清最佳反应时间的优化
基于上述实施例三至实施例九，将血清按照已经优化的最佳比例稀释，血清孵育时间设置为4组：30min，45min，60min，90min其他条件均按照已经优化的条件进行ELISA检测，酶标仪上读取OD450nm值，比较各组阴、阳性血清的OD450nm值，优化最佳血清作用时间。比较各组阴、阳性血清的OD450nm值和P/N值，优化最适封闭液及封闭时间。设置四组不同的封闭条件，其他为最优条件，进行双抗原夹心ELISA检测结果见表7，
表7：血清最佳反应时间的优化
Figure BDA0002917207050000151
注：每个数据均为2个平行对照的平均值
如表7所示，当封闭时间为1h时，P/N值最大。
实施例十一：酶标抗原最佳工作浓度及作用时间的优化
基于上述实施例三至实施例十，将酶标抗原PCV3Cap376-645-HRP以1:500、1:1000、1：2000的进行倍比稀释，孵育时间设置4组：30min、45min、60min、90min进行ELISA检测读取OD450nm值，比较各组阴、阳性血清的OD450nm值，比较各组阴、阳性血清的OD450nm值，优化最佳酶标抗原稀释浓度和孵育时间。其他为最优条件，进行双抗原夹心ELISA检测结果见表8。
表8：酶标抗原最佳工作浓度及作用时间的优化
Figure BDA0002917207050000161
注：每个数据均为2个平行对照的平均值
根据测定结果表8所示，当酶标抗原稀释度为1：500，作用时间为60min时，P/N值最大。
实施例十二：底物最佳作用时间的优化
基于上述实施例三至实施例十一，将4块酶标板按照已经优化的ELISA条件进行检测，加入底物缓冲液TMB，置于暗室作用时间设置4组：10min，15min，20min，30min，加终止液后比较各组阴、阳性血清的OD450nm值，优化最佳底物作用时间。设置4组不同的底物作用时间，其他为最优条件，进行双抗原夹心ELISA检测结果见表9。
表9：底物最佳作用时间的优化
Figure BDA0002917207050000171
注：每个数据均为2个平行对照的平均值
如表9检测结果所示，底物作用时间为20min时，P/N值最大。
实施例十三：判定临界值
基于上述实施例三至实施例十二，根据优化好的发明条件检测PCV3阴性血清，记录样品的OD450nm值，并计算平均值(X)和标准差(SD)；待检血清OD450nm值≥X+3SD时判断为PCV3阳性，待检血清OD450nm值≤X+2SD时判断为PCV3阴性，介于两者之间为可疑。已知20份阴性猪血清，按照以上最佳条件建立的双抗原夹心ELISA试剂盒进行检测，计算出20份血清OD4500nm平均值为0.155，标准差为0.035，待检血清OD450nm值≥X+3SD＝0.26时判断为PCV3阳性，待检血清OD450nm值≤X+2SD＝0.225时判断为PCV3阴性。
实施例十四：特异性发明
基于上述实施例三至实施例十三，按照最佳条件建立的双抗原夹心ELISA试剂盒对PCV2、PRRSV、CSFV、PRV阳性血清，作用结果显示均为阴性，表明建立的ELISA试剂盒具有良好的特异性，结果见表10。
表10：特异性发明
Figure BDA0002917207050000172
Figure BDA0002917207050000181
实施例十五：重复性发明
批内重复发明：以同一批次所纯化的蛋白包被酶标板，检测4份血清样品，进行检测，每份重复5组，按照同样的条件进行双抗原夹心ELISA试剂盒测定，统计分析重复变异系数。
批间重复发明：以5组不同批次纯化的蛋白包被酶标板，检测4份血清样品，进行检测，按照同样的条件进行双抗原夹心ELISA试剂盒测定，统计分析重复变异系数。批内重复测定结果如表11所示。采用建立的双抗原夹心ELISA试剂盒对5组不同批次的蛋白，检测的4份血清样品，批间重复结果如表12所示。
表11：批内重复性发明
Figure BDA0002917207050000182
根据表11所示检测结果，采用建立的双抗原夹心ELISA试剂盒对同一批次的蛋白，检测的4份血清样品，结果显示变异系数分别为3.628％、2.633％、4.346％、3.787％，表明该试剂盒具有较好的重复性。
表12：批间重复性发明
Figure BDA0002917207050000191
根据表12中检测结果，显示变异系数分别为5.491％、3.398％、5.296％、8.735％，表明该试剂盒具有较好的重复性。
实施例十六：敏感性发明
利用建立的双抗原夹心ELISA试剂盒检测以1:40，1:80，1:160，1:320，1:640，1:1280，1:2560进行倍比稀释的阳性血清，以检测该试剂盒的敏感性。阳性血清以1:40，1:80，1:160，1:320，1:640，1:1280，1:2560进行倍比稀释，检测结果如表13所示。，
表13：敏感性发明结果
血清稀释倍数 1:40 1:80 1:160 1:320 1:640 1:1280 1:2560
OD值 0.831 0.776 0.592 0.473 0.358 0.274 0.168
判定结果 + + + + + + -
如表10测定结果所示，阳性血清稀释度为1:1280时，判定结果仍为阳性，表明该双抗原夹心ELISA检测试剂盒灵敏度高。
实施例十七：双抗原夹心法与间接法检测结果比较
利用本发明建立的双抗原夹心ELISA试剂盒与实验室已建立的猪源、牛源PCV3间接ELISA试剂盒对96份牛源、猪源血清进行检测，对于不一致的血清样品，再采用这两种试剂盒进行复测，以此评估PCV3双抗原夹心ELISA结果的符合率。本发明建立的双抗原夹心ELISA试剂盒和牛源、猪源PCV3间接ELISA试剂盒对96份牛源和猪源血清分别进行检测结果如表14、15所示。
表14：牛血清样品检测结果
双抗原夹心法 间接法 检测数量 检测结果
+ + 58 阳性
- - 33 阴性
- + 2 不优化
+ - 3 不优化
表15：猪血清样品检测结果
双抗原夹心法 间接法 检测数量 检测结果
+ + 54 阳性
- - 39 阴性
- + 1 不优化
+ - 2 不优化
根据表14、表15检测结果表明牛源血清双抗原夹心法检测出61份阳性，35份阴性，阳性率为63.54％(61/96)，间接ELISA试剂盒检测出60份阳性，36份阴性，阳性率为62.50％(60/96)，符合率为94.79％(91/96)；猪源血清双抗原夹心法检测出56份阳性，40份阴性，阳性率为58.33％(56/96)，间接ELISA试剂盒检测出55份阳性，41份阴性，阳性率为57.29％(55/96)，符合率为95.83％(92/96)。
实施例十八：临床血清检测结果
利用本发明建立的双抗原夹心ELISA试剂盒对新疆地区某猪场的96份血清样品进行检测，以此评估不同生长阶段猪群中PCV3抗体阳性情况。利用本发明构建的双抗原夹心ELISA检测PCV3抗体的试剂盒，检测的96份血清中PCV3阳性血清共56份，结果如表16所示。
表16：临床血清检测结果
Figure BDA0002917207050000211
根据表16检测结果所示，该血清样品的抗体阳性率为58.33％(56/96)，不同生长阶段的猪群检测结果发现，公猪血清样品阳性率最高90％(9/10)，仔猪血清样品阳性率最低14.28％(2/14)。
如上所述，即可较好地实现本发明，上述的实施例仅仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案作出的各种变形和改进，均应落入本发明优化的保护范围内。
序列表
<110> 石河子大学
<120> 一种PCV3双抗原夹心ELISA抗体检测试剂盒及其应用
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 40
<212> DNA
<213> 猪圆环病毒3型(Porcine circovirus 3)
<400> 1
cggaattcat gcgtcgtcgt cgtcgtcatc gtcgtcgtta 40
<210> 2
<211> 41
<212> DNA
<213> 猪圆环病毒3型(Porcine circovirus 3)
<400> 2
ccgctcgagt taatcgtctt gcagccaggt attggtggtc c 41
<210> 3
<211> 38
<212> DNA
<213> 猪圆环病毒3型(Porcine circovirus 3)
<400> 3
ccggaattca tggtacgcag aaagcagcac ccgcaaag 38
<210> 4
<211> 39
<212> DNA
<213> 猪圆环病毒3型(Porcine circovirus 3)
<400> 4
ccgctcgagt tacagaacgc ttttgtagcg gatccagac 39

Claims (10)

1.一种PCV3双抗原夹心ELISA抗体检测试剂盒，其特征在于，包含PCV3Cap40-372重组蛋白为包被抗原及PCV3Cap376-645-HRP为酶标检测抗原。
2.如权利要求1所述的一种PCV3双抗原夹心ELISA抗体检测试剂盒，其特征在于，还包含碳酸盐缓冲溶液、PBST、脱脂奶粉、TMB显色液、2MH2SO4终止液。
3.如权利要求1所述的一种PCV3双抗原夹心ELISA抗体检测试剂盒，其特征在于，PCV3Cap40-372重组蛋白制备过程中采用的引物序列如SEQ ID NO.1及SEQ ID NO.2所示，PCV3Cap376-645-HRP制备过程中采用的引物序列如SEQ ID NO.3及SEQ ID NO.4所示。
4.如权利要求1-3任一项所述的一种PCV3双抗原夹心ELISA抗体检测试剂盒在检测PCV3抗体中的应用。
5.如权利要求4所述的一种PCV3双抗原夹心ELISA抗体检测试剂盒的在检测PCV3抗体中的应用，其特征在于，所述的应用包括以下步骤：
(1)采用PCV3Cap40-372重组蛋白作为抗原包被酶标板，每孔100μL，包被蛋白用碳酸盐缓冲溶液(pH9.6)，待检血清按照1：(25-200)的倍比稀释，稀释至5.0-0.1μg/mL；包被1-2h或4℃包被过夜，每孔加入250μLPBST洗涤5min，共3次，每次都需拍干酶标板；
(2)将步骤(1)中获得的酶标板每孔加入200μL5％脱脂奶粉封闭，37℃封闭，30-90min，洗涤步骤同步骤(1)；
(3)将步骤(2)中获得的酶标板每孔加样100μL，同时设置阴性对照，37℃作用2h，洗涤步骤同步骤(1)；
(4)在步骤(3)的基础上将酶标抗原PCV3Cap376-645-HRP以1：(500-2000)的进行倍比稀释，每孔加入100μL，37℃孵育30-90min，洗涤步骤同步骤(1)；
(5)将步骤(4)获得酶标板每孔加入100μL的TMB显色液，37℃避光显色10-30min；
(6)将步骤(4)获得酶标板每孔加入100μL 2MH2SO4终止液，酶标仪中450nm处读取OD值；
(7)将步骤(6)中获得的OD值进行结果判断，其中免疫组阳性血清OD450nm值与未免疫阴性血清OD450nm值之比大于2.1，即可判定为阳性。
6.如权利要求1所述的一种PCV3双抗原夹心ELISA抗体检测试剂盒在检测PCV3抗体中的应用，其特征在于，抗原浓度稀释至1.0μg/mL，血清稀释度为1：50。
7.如权利要求1所所述的一种PCV3双抗原夹心ELISA抗体检测试剂盒在检测PCV3抗体中的应用，其特征在于，重组抗原最佳包被条件是4℃包被过夜。
8.如权利要求1所所述的一种PCV3双抗原夹心ELISA抗体检测试剂盒在检测PCV3抗体中的应用，其特征在于，血清最佳反应时间为60min。
9.如权利要求1所所述的一种PCV3双抗原夹心ELISA抗体检测试剂盒在检测PCV3抗体中的应用，其特征在于，酶标抗原工作浓度为酶标抗原按照1：500进行稀释，孵育时间为60min。
10.如权利要求1所所述的一种PCV3双抗原夹心ELISA抗体检测试剂盒在检测PCV3抗体中的应用，其特征在于，底物作用时间为20min。
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