CN108504778A

CN108504778A - 一种同时检测猪圆环病毒2型和猪伪狂犬病毒的试剂盒及应用

Info

Publication number: CN108504778A
Application number: CN201810357649.7A
Authority: CN
Inventors: 黄超华; 花群义; 曹琛福; 杨俊兴; 阮周曦; 林彦星; 曾少灵; 王潇
Original assignee: Animal and Plant Inspection and Quarantine Technology Center of Shenzhen Entry Exit Inspection and Quarantine Bureau
Current assignee: Shenzhen Customs Animal and Plant Inspection and Quarantine Technology Center
Priority date: 2018-04-20
Filing date: 2018-04-20
Publication date: 2018-09-07
Anticipated expiration: 2038-04-20
Also published as: CN108504778B

Abstract

本发明公开了一种可同时快速检测猪圆环病毒2型和猪伪狂犬病毒的实时荧光RPA引物和探针、包括所述引物和探针的试剂盒及其用途。本发明公开了一种可同时快速检测猪圆环病毒2型和猪伪狂犬病毒的方法所述方法使用所述实时荧光RPA引物和探针和试剂盒。本发明的方法的敏感性为10²拷贝/反应，即每个反应可同时最低检测出10²拷贝的猪圆环病毒2型和10²拷贝的猪伪狂犬病毒。本发明的方法能快捷、高效、灵敏的同时检测猪圆环病毒2型和猪伪狂犬病毒，为两者的混合感染的快速检测提供了有效的技术手段。

Description

一种同时检测猪圆环病毒2型和猪伪狂犬病毒的试剂盒及应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，特别是生物医学的预防兽医学检验领域。本发明涉及一种同时检测猪圆环病毒2型和猪伪狂犬病毒的试剂盒及其应用，特别涉及一种基于RPA技术的用于同时快速检测猪圆环病毒2型和猪伪狂犬病毒的实时荧光RPA试剂盒，还涉及该试剂盒在快速检测猪圆环病毒2型和猪伪狂犬病毒混合感染时的用途。

背景技术

猪圆环病毒2型和猪伪狂犬病毒是影响我国以及全球养猪业的两种重要病原。猪圆环病毒2型具有较强的致病性，多感染5～12周龄仔猪，引发断奶仔猪多***衰竭综合征(PMWS)、猪皮炎和肾病综合征、PCV2相关性肺炎、繁殖障碍和肠炎等，死亡率较高。猪伪狂犬病毒能引起母猪妊娠初期流产，妊娠后期发生死胎、弱胎、木乃伊胎，哺乳仔猪最为敏感，成年猪大多为隐性感染，但长期带毒。两者经常混合感染，相互增强毒力，造成感染猪群免疫抑制，使感染猪场的防控与防治更加复杂与困难，从而严重影响养猪场的生产效率。因此，建立一种同时检测这两种病原的快速检测方法十分必要。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种能快速、简单、特异的并能同时鉴定猪圆环病毒2型和猪伪狂犬病毒的检测方法及试剂盒。为了实现上述目的，本发明人分别针对猪圆环病毒2型和猪伪狂犬病毒设计引物和探针，共设计出多条引物和探针，通过交叉反应，筛选出最佳的引物和探针组合应用于本发明。

因此，本发明在第一方面提供了一种用于同时检测猪圆环病毒2型和猪伪狂犬病毒的引物和探针，所述引物和探针包括：

序列如SEQ ID NO.1所示的第一引物，

序列如SEQ ID NO.2所示的第二引物，

序列如SEQ ID NO.3所示的第一探针，

其中，所述第一引物和所述第二引物组成引物对；

序列如SEQ ID NO.4所示的第三引物，

序列如SEQ ID NO.5所示的第四引物，

序列如SEQ ID NO.6所示的第二探针，

其中，所述第三引物和所述第四引物组成引物对。

在一个实施方案中，所述第一探针的修饰如下：(1)第31位碱基修饰BHQ1-dT；(2)第35位碱基修饰6-FAM-dT；(3)第33位碱基替换为dSpacer；(4)3'端修饰C3Spacer；所述第二探针修饰如下：(1)第27位碱基修饰BHQ1-dT；(2)第30位碱基修饰6-HEX-dT；(3)第28位碱基替换为dSpacer；(4)3'端修饰C3Spacer。

本发明在第二方面提供了一种用于同时检测猪圆环病毒2型和猪伪狂犬病毒的实时荧光RPA检测试剂盒，所述试剂盒包括四条引物和两条探针，

其中，所述的四条引物和两条探针的序列如下所示：

序列如SEQ ID NO.1所示的第一引物，

序列如SEQ ID NO.2所示的第二引物，

序列如SEQ ID NO.3所示的第一探针，

其中，所述第一引物和所述第二引物组成引物对；

序列如SEQ ID NO.4所示的第三引物，

序列如SEQ ID NO.5所示的第四引物，

序列如SEQ ID NO.6所示的第二探针，

其中，所述第三引物和所述第四引物组成引物对。

在一个实施方案中，在本发明所述的实时荧光RPA检测试剂盒中，还包括水解缓冲液，醋酸镁以及ddH₂O。

在一个实施方案中，试剂盒还包括等温扩增仪。

本发明在第三方面还提供一种可同时快速检测猪圆环病毒2型和猪伪狂犬病毒的方法，所述方法包括：

(1)提取待检测样本的DNA样本；

(2)以所述DNA样本为模板，使用本发明第一方面的引物和探针或者使用本发明第二方面的试剂盒进行双重实时荧光RPA检测：

反应过程中实时检测FAM和HEX的荧光信号；

对扩增结果进行分析，以扩增起始2.5-3.5min内的荧光信号强度的平均值加上3-4倍的标准方差(SD)作为检测阈值，结果判断如下：

(1)若在RPA扩增的15min内，FAM荧光信号值超过阈值且出现拐点，而HEX荧光信号未超过阈值或未出现拐点，则表明扩增结果为猪圆环病毒2型阳性，猪伪狂犬病毒阴性；

(2)若在RPA扩增的15min内，HEX荧光信号值超过阈值且出现拐点，而FAM荧光信号值未超过阈值或未出现拐点，则表明扩增结果为猪伪狂犬病毒阳性，猪圆环病毒2型阴性；

(3)若在RPA扩增的15min内，FAM和HEX荧光信号值均超过阈值且出现拐点，则表明扩增结果为猪圆环病毒2型和猪伪狂犬病毒双阳性；

(4)若在RPA扩增的15min内，FAM和HEX荧光信号值均未超过阈值或未出现拐点，则表明扩增结果为猪圆环病毒2型和猪伪狂犬病毒双阴性。

在一个实施方案中，使用Thermo病毒核酸抽提试剂盒对所述待测样本提取DNA。

在一个实施方案中，使用等温扩增仪T16-ISO自带的软件Desktop扩增结果进行分析。

本发明在第四方面还提供了所述引物和探针或者所述实时荧光RPA检测试剂盒在制备同时检测猪圆环病毒2型和猪伪狂犬病毒的试剂中的用途。

相较于现有技术，本发明具有以下优点：

(1)利用本发明的方法同时快速检测猪圆环病毒2型和猪伪狂犬病毒，可以节约大量检测时间：本发明整个反应时间只需要20min，远远少于实时荧光PCR和普通PCR，检测单种病毒至少需要反应1.5小时，两种病毒则需要3个小时以上才能完成；

(2)利用本发明的方法不需要大型仪器设备：本发明只需要恒温40℃即可完成试验，不需要繁琐的变性复性循环，因此不要昂贵的荧光PCR仪，只需要小型的恒温设备即可。本发明采用的等温扩增仪T16-ISO是体型小，可随身携带，适用于我国基层实验室和养猪场猪圆环病毒2型和猪伪狂犬病毒的快速筛查；

(3)本发明的方法敏感性高：本发明可同时检测圆环病毒2型和猪伪狂犬病毒两种病毒，每个反应可同时最低检测出10²拷贝的猪圆环病毒2型和10²拷贝的猪伪狂犬病毒，其敏感度与实时荧光PCR相当，是普通PCR方法的100倍；

(4)本发明的试剂盒携带方便，操作简单：反应所需的酶和一些其他必要的东西均被冻干保存，可在常温条件下长期存放；操作简单，扩增反应时只需要加入相应的缓冲液、引物和探针、模板以及镁离子等即可反应；

(5)本发明的引物和探针特异性强：本发明的试剂盒中使用了探针，与普通PCR方法和LAMP方法相比，增加了检测方法的特异性；

(6)本发明的方法检测结果真实可靠：与现行的实时荧光PCR标准方法的符合度为100％。

附图说明

通过以下附图对本发明进行说明：

图1双重实时荧光RPA检测结果：将猪圆环病毒2型和猪伪狂犬病毒双阳性的DNA作为模板，按照本发明的反应体系，反应温度40℃，在等温扩增仪T16上进行反应20min。此图可以看出本发明可以同时检出猪圆环病毒2型和猪伪狂犬病毒。

图2双重实时荧光RPA敏感性试验结果：(A)为将合成的pMD-PCV-1标准品质粒进行倍比稀释，稀释范围为10⁶-10¹拷贝/反应，随后用本发明建立的实时荧光RPA方法进行敏感性试验。由图可以看出本发明每个反应可检测10⁶-10²个猪圆环病毒2型。其中NC代表阴性对照。(B)为将合成的pMD-PRV-2标准品质粒进行倍比稀释，稀释范围为10⁶-10¹拷贝/反应，随后用本发明建立的实时荧光RPA方法进行敏感性试验。由图可以看出本发明每个反应可检测10⁶-10²个猪伪狂犬病毒。

图3双重实时荧光RPA特异性试验结果：将提取的FMDV、PRRSV、CSFV等病毒RNA，反转录合成cDNA，保存备用。用建立的双重实时荧光RPA检测方法对FMDV、PRRSV、CSFV的cDNA以及PCV1、PPV、PCV2和PRV的DNA样品进行检测，检验双重实时荧光RPA检测方法的特异性。结果如图所示，表明PCV2和PRV可以出现扩增曲线，其他病毒均未出现扩增曲线，说明检测具有很好的特异性。

具体实施方式

本发明所涉及的重组酶聚合酶扩增(RPA)技术是一种核酸恒温扩增技术，能够在15到20分钟内进行常温下(37℃-42℃)的核酸检测。其基本原理是重组酶与引物结合形成蛋白-DNA复合物，与核酸模板上的同源序列结合，同时在单链DNA结合蛋白(SSB)协助下，DNA聚合酶引导产生解链和DNA合成，最终形成新的DNA双链，从而实现扩增。与实时荧光PCR相比，RPA技术不需要繁琐的热循环，无需变性，恒温条件下10～15min即可完成核酸扩增，检测速度非常快，灵敏度高，不需要复杂的样本处理，可以真正实现便携式的快速核酸检测。

本发明提供了一种用于同时检测猪圆环病毒2型和猪伪狂犬病毒的实时荧光RPA检测试剂盒，包括有四条引物和两条探针，

其中，所述的四条引物和两条探针的序列如下所示：

PCV-F:CTACTGTTCC AGTTGCTTGT AGTCGTAGCC(SEQ ID NO.1)，

PCV-R:CATACTCCAG CCCTCTTCCT ACCATGCCCG C(SEQ ID NO.2)，

PCV-P:TGATTGCCTT TGTCGTCTGG TTGGACTTAA TCAATGTTGG AACCGAGGAC(SEQ IDNO.3)，

其中，所述PCV-P探针修饰如下：(1)第31位碱基修饰BHQ1-dT；(2)第35位碱基修饰6-FAM-dT；(3)第33位碱基替换为dSpacer；(4)3'端修饰C3Spacer；

PRV-F：CTCTCTAAGG AGAATCTCGC CCCGTCCAAG(SEQ ID NO.4)，

PRV-R：TCCGCTAAGC GGTCCTTGAT GGCCATGTAC G(SEQ ID NO.5)，

PRV-P：CAAGAGCCAC ATCTCATACA AGAATGTCAT CGTCGTGACC GCATGGT(SEQ IDNO.6)，

其中，所述PCV-P探针修饰如下：(1)第27位碱基修饰BHQ1-dT；(2)第30位碱基修饰6-HEX-dT；(3)第28位碱基替换为dSpacer；(4)3'端修饰C3Spacer。

在本发明所述的实时荧光RPA检测试剂盒中，还包括水解缓冲液，醋酸镁以及ddH₂O。

所使用本发明所述的实时荧光RPA检测试剂盒同时检测猪圆环病毒2型和猪伪狂犬病毒，反应体系如下：29.5μL的水解缓冲液，依次加入1.05μL的10uM引物PCV-F、PCV-R、PRV-F和PRV-R，依次加入0.3L的10uM探针PCV-P和PRV-P，2μL的病毒DNA模板，11.2μL的ddH₂O以及2.5μL的280mM醋酸镁。

优选的，扩增反应在等温扩增仪T16-ISO中进行，扩增温度设定为40℃，反应5min，随后快速离心混匀，继续反应15min，并实时监测FAM和HEX通道的荧光，结束后通过T16-ISODesktop分析结果。

本发明实施例中使用的所有引物和探针都由生工生物(上海)公司合成。

1、毒株：

猪圆环病毒2型(PCV 2)、猪伪狂犬病毒(PRV)、猪圆环病毒1型(PCV1)、猪细小病毒(PPV)、***病毒(FMDV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪瘟病毒(CSFV)等灭活抗原均由深圳出入境检验检疫局动植物检验检疫技术中心提供和保存。

2、RPA引物及探针设计合成及筛选：

参考TwistDx公司RPA引物设计筛选指南设计指引，分别以NCBI GenBank中公布的猪基因组序列以及猪相关的病毒基因序列，所述猪相关病毒特别是猪圆环病毒2型(PCV2)、猪伪狂犬病毒(PRV)、猪圆环病毒1型(PCV1)、猪细小病毒(PPV)、***病毒(FMDV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪瘟病毒(CSFV)，设计出多条特异性引物和探针，其中PCV2探针的荧光基团为通过交叉试验分别筛选两套分别检测PCV2和PRV的最佳引物和探针组合。所述两套引物分别扩增出SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8的片段。

SEQ ID NO.7:

ATGACGTATCCACGAAGGCGTTACCGGAGAAGAAGACACCGCCCCCGCAGCCATCTTGGCCAGATCCTCCGCCGCCGCCCCTGGCTCGTCCACCCCCGCCACCGTTACCGCTGGAGAAGGAAAAATGGCATCTTCAACACCCGCCTCTCCCGCACCTTCGGATATACTGTCAAGCGAACCACAGTCAAAACGCCCTCCTGGGCGGTGGACATGATGAGATTCAATATTAATGACTTTCTTCCCCCAGGAGGGGGCTCAAACCCCCGCTCTGTGCCCTTTGAATACTACAGAATTAGAAAGGTTAAGGTTGAATTCTGGCCCTGCTCCCCGATCACCCAGGGTGACAGGGGAGTGGGCTCCAGTGCTGTTATTCTAGATGATAACTTTGTAACAAAGGCCACAGCCCTCACCTATGACCCCTATGTAAACTACTCCTCCCGCCATACCATACTCCAGCCCTCTTCCTACCATGCCCGCTACTTTACCCCCAAACCTGTCCTCGGTTCCAACATTGATTAAGTCCAACCAGACGACAAAGGCAATCAGCTGTGGCTACGACTACAAGCAACTGGAACAGTAGACCACGTAGGCCTCGGCACTGCGTTCGAAAACAGTATATACGACCAGGAATACAATATCCGTGTAACCATGTATGTACAATTCAGAGAATTTAATCTTAAAGACCCCCCACTTCACCCTTAA。

SEQ ID NO.8:

GTGCTCTCTAAGGAGAATCTCGCCCCGTCCAAGTTCAAGAGCCACATCTCATACAAGAATGTCATCGTCGTGACCGCATGGTCCGGGAGCATCCGCTAAGCGGTCCTTGATGGCCATGTACGCCGCGTGCCCGTCCCCGTGCAGGAGATCACGGACGTTATCGACCGCCGCGGCAAGTGCGTCTCCAAGGCCGAGTACGTGCGCAACAACCACAAGGTGACCGCCTTCG。

表1双重实时荧光RPA方法最佳引物及探针核苷酸序列

其中PCV-P探针修饰如下：(1)第31位碱基修饰BHQ1-dT，(2)第35位碱基修饰6-FAM-dT；(3)第33位碱基替换为dSpacer；(4)3'端修饰C3Spacer；

PRV-P探针修饰如下：(1)第27位碱基修饰BHQ1-dT，(2)第30位碱基修饰6-HEX-dT；(3)第28位碱基替换为dSpacer；(4)3'端修饰C3Spacer。

dSpacer即四氢呋喃，作为核酸内切酶识别位点。C3间臂(C3spacer)为封闭基团，用于阻止探针自连后的扩增。C3间臂主要用于模仿核糖的3'和5'羟基间的三碳间隔，或“替代”一个序列中未知的碱基。3'-C3间臂用于引进一个3'间臂从而阻止3'端外切酶和3'端聚合酶发挥作用，由序列合成公司提供。BHQ1-dT(叔丁基对丙二酚1-脱氧胸苷)为一种荧光淬灭基团。6-FAM-dT(6-羧基荧光素-脱氧胸苷)为荧光报告基团，发绿色荧光；6-HEX-dT(六氯-6-甲基荧光素-脱氧胸苷)为荧光报告基团，发粉色荧光。

3、病毒基因组提取：

使用Thermo病毒核酸抽提试剂盒(MagMAXTM-96Viral RNA Isolation Kit,AM1836)在磁珠提取纯化***上分别提取猪圆环病毒2型(PCV 2)、猪伪狂犬病毒(PRV)、猪圆环病毒1型(PCV1)、猪细小病毒(PPV)、***病毒(FMDV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪瘟病毒(CSFV)等病毒核酸。并通过超微量核酸蛋白浓度分析仪测定提取的各种病毒核酸的浓度。

4、质粒DNA标准品：

生工生物(上海)公司合成基因片段SEQ ID NO.7(702bp)和基因片段SEQ ID NO.8(229bp)，并分别克隆到pMD载体，分别命名为pMD-PCV-1和pMD-PRV-2。用质粒小提试剂盒提取pMD-PCV-1和pMD-PRV-2质粒。用超微量核酸蛋白浓度分析仪测定提取的质粒浓度，计算出质粒拷贝数。将质粒稀释成拷贝数浓度分别为10⁶copy/μL、10⁵copy/μL、10⁴copy/μL、10³copy/μL、10²copy/μL、10¹copy/μL，作为标准质粒。

实施例1猪圆环病毒2型和猪伪狂犬病毒双重RPA检测方法的建立。

以上述3中提取的猪圆环病毒2型和猪伪狂犬病毒双阳性的病毒DNA混合为模板，进行双重实时荧光RPA检测。具体步骤如下：

双重实时荧光RPA反应体系为50μL，将Rehydration Buffer 29.5μL，四条引物(PCV-F、PCV-R、PRV-F和PRV-R)(10uM)各1.05μL，两条探针(PCV-P和PRV-P)(10uM)各0.3μL，DEPC水11.2μL，核酸模板2μL混合均匀后加入到RPA冻干酶粉反应管中，混匀离心，最后加入MgAc溶液(2.5μL)，充分混匀。反应条件：等温扩增仪T16-ISO，40℃反应5分钟，取出混合，再继续反应15分钟，反应过程中实时检测FAM(羧基荧光素)和HEX(甲基荧光素)通道的荧光信号。

等温扩增仪T16-ISO自带的软件Desktop对扩增结果进行分析，以扩增起始3min内的荧光信号强度的平均值加上3.5倍的标准方差(SD)作为检测阈值，结果判断如下：

(1)若在RPA扩增的15min内，FAM通道荧光信号值超过阈值且出现拐点，而HEX通道荧光信号未超过阈值或未出现拐点，则表明扩增结果为猪圆环病毒2型阳性，猪伪狂犬病毒阴性；

(2)若在RPA扩增的15min内，HEX通道荧光信号值超过阈值且出现拐点，而FAM通道荧光信号值未超过阈值或未出现拐点，则表明扩增结果为猪伪狂犬病毒阳性，猪圆环病毒2型阴性；

(3)若在RPA扩增的15min内，FAM通道和HEX通道荧光信号值均超过阈值且出现拐点，则表明扩增结果为猪圆环病毒2型和猪伪狂犬病毒双阳性；

(4)若在RPA扩增的15min内，FAM通道和HEX通道荧光信号值均未超过阈值或未出现拐点，则表明扩增结果为猪圆环病毒2型和猪伪狂犬病毒双阴性。

实施例2双重实时荧光RPA试剂盒和实时荧光PCR的灵敏性比较。

1、双重实时荧光RPA试剂盒检测猪圆环病毒2型与实时荧光PCR的灵敏性比较。以之前制备倍比稀释的标准质粒pMD-PCV-1为模板(模板量分别为10⁶copy/反应、10⁵copy/反应、10⁴copy/反应、10³copy/反应、10²copy/反应、10¹copy/反应)，按照实施例1的双重实时荧光RPA方法进行灵敏性试验。同时以同样倍比稀释的标准质粒为模板，采样猪圆环病毒2型实时荧光PCR标准方法(于SN/T2708-2010猪圆环病毒病检疫规范公开)进行灵敏性比较。其中PCV2实时荧光PCR方法：上游引物：5’–CGCTGGAGAAGGAAAAATGG-3’(SEQ ID NO.9)；下游引物：5’-CTTGACAGTATATCCGAAGGT-3’(SEQ ID NO.10)探针：FAM-5’-TTCAACACCCGCCTCTCCCG-3’-TAMRA(SEQ ID NO.11)(FAM为6-羧基荧光素，作为荧光报告基团；TAMRA为荧光淬灭基团)。反应体系：上下游引物(10uM)各0.5μL，Real-time PCR Premix12.5μL，探针0.5μL，DNA模板1μL，加入10μL的无菌去离子水，混匀。将反应体系置于荧光PCR仪中(ABI7500Fast)进行反应。反应条件：预变性94℃/30s；扩增94℃/30s，60℃/30s，40个循环。实时荧光PCR判断依据为：在阴性对照和阳性对照均成立的前提下，待测样本的CP≦35可判为阳性。

双重实时荧光RPA灵敏性试验结果如图2A所示。两种检测方法的灵敏性比较结果如表2所示。由此可见，双重实时荧光RPA试剂盒检测猪圆环病毒2型的灵敏度与实时荧光PCR相当，均为10²copy/反应。

表2双重实时荧光RPA和实时荧光PCR对猪圆环病毒2型核酸检测灵敏度的比较结果

2、双重实时荧光RPA试剂盒检测猪伪狂犬病毒与实时荧光PCR的灵敏性比较。以之前制备倍比稀释的标准质粒pMD-PRV-2为模板(模板量分别为10⁶copy/反应、10⁵copy/反应、10⁴copy/反应、10³copy/反应、10²copy/反应、10¹copy/反应)，按照实施例1的双重实时荧光RPA方法进行灵敏性试验。同时以同样倍比稀释的标准质粒为模板，采用猪伪狂犬病毒SYBRGreenI实时荧光定量PCR方法(参考：高嘉聪等.猪源伪狂犬病病毒gB基因SYBR GreenI实时荧光定量PCR检测方法的建立[J].中国兽医科学，2015，45(11)：1166-1170)进行灵敏性比较。其中PRVSYBR GreenI实时荧光PCR方法：

上游引物：5’-GTCACCTTGTGGTTGTTG-3’(SEQ ID NO.12)；

下游引物：5’-CCACATCTACTACAAGAACG-3’(SEQ ID NO.13)，

反应体系：上下游引物(10uM)各0.5μL，SYBR GreenI染料12.5μL，DNA模板1μL，加入10.5μL的无菌去离子水，混匀。将反应体系置于荧光PCR仪中(ABI7500Fast)进行反应。反应条件：预变性95℃/30s；扩增95℃/10s，60℃/20s，40个循环。

双重实时荧光RPA灵敏性试验结果如图2B所示。两种检测方法的灵敏性比较结果如表2所示。由此可见，双重实时荧光RPA试剂盒检测猪伪狂犬病毒的灵敏度与实时荧光PCR相当，均为10²copy/反应。

表3双重实时荧光RPA和实时荧光PCR对猪伪狂犬病毒核酸检测灵敏度的比较结果

实施例3双重实时荧光RPA试剂盒的特异性试验。

将提取的FMDV、PRRSV、CSFV等病毒RNA，反转录合成cDNA，保存备用。用本发明的双重实时荧光RPA试剂盒对FMDV、PRRSV、CSFV的cDNA以及PCV1、PPV、PCV2和PRV的DNA样品进行检测，检验双重实时荧光RPA试剂盒的特异性。

结果如图3所示。试验结果表明本发明可同时检测猪圆环病毒2型和猪伪狂犬病毒，其他病毒核酸无扩增曲线，说明本发明的双重实时荧光RPA试剂盒具有很好的特异性。

实施例4本发明的试剂盒的临床应用。

用本发明的试剂盒检测疑似猪圆环病毒2型和猪伪狂犬病毒的临床样品28份(编号为1～28)以及阴性对照样品2份(29，30)，临床样品为猪的口咽鼻液、淋巴组织等，阴性对照样品为健康未感染猪的口咽鼻液。使用Thermo病毒核酸抽提试剂盒(MagMAXTM-96ViralRNA Isolation Kit,AM1836)在磁珠提取纯化***上分别提取DNA。用本发明的双重实时荧光RPA试剂盒对所述DNA样品进行检测，将结果与实时荧光PCR的检测结果相比较，结果见表4。结果表明：28份临床样品中，猪圆环病毒2型和猪伪狂犬病毒双阳性9份，单独的猪圆环病毒2型阳性13份，单独的猪伪狂犬病毒4份，两种病毒双阴性1份；阴性对照检测结果均为阴性。由此可见，本发明建立的双重实时荧光RPA试剂盒与实时荧光PCR的符合率为100％。

表4 PCV2、PRV双重实时荧光RPA与实时荧光PCR临床检测结果比较

对本发明的实时荧光RPA试剂盒的检测灵敏度及特异性进行了实验。灵敏度试验结果表明，使用该试剂盒可同时检测猪圆环病毒2型和猪伪狂犬病毒，两者的灵敏性均为10²拷贝/反应，并且检测范围较广，每个反应可检测10⁶-10²拷贝的病毒样品。特异性试验结果表明，该试剂盒具有很好的特异性，可同时检测出猪圆环病毒2型和猪伪狂犬病毒，其他病毒如猪细小病毒、猪圆环病毒2型、猪繁殖与呼吸综合症病毒、猪瘟病毒以及***病毒均不会出现扩增曲线。本发明人用建立的实时荧光RPA方法检测收集的疑似猪圆环病毒2型和猪伪狂犬病毒的临床样品(28份)，并将检测结果与实时荧光PCR标准方法的检测加过相比较，结果表明本发明的检测结果与实时荧光PCR完全一致，即具有100％的符合度。

序列表

<110> 深圳出入境检验检疫局动植物检验检疫技术中心

<120> 一种同时检测猪圆环病毒2型和猪伪狂犬病毒的试剂盒及应用

<130> CF180123S

<160> 13

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Synthetic sequence)

<400> 1

ctactgttcc agttgcttgt agtcgtagcc 30

<210> 2

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列(Synthetic sequence)

<400> 2

catactccag ccctcttcct accatgcccg c 31

<210> 3

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列(Synthetic sequence)

<400> 3

tgattgcctt tgtcgtctgg ttggacttaa tcaatgttgg aaccgaggac 50

<210> 4

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Synthetic sequence)

<400> 4

ctctctaagg agaatctcgc cccgtccaag 30

<210> 5

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列(Synthetic sequence)

<400> 5

tccgctaagc ggtccttgat ggccatgtac g 31

<210> 6

<211> 47

<212> DNA

<213> 人工序列(Synthetic sequence)

<400> 6

caagagccac atctcataca agaatgtcat cgtcgtgacc gcatggt 47

<210> 7

<211> 702

<212> DNA

<213> 人工序列(Synthetic sequence)

<400> 7

atgacgtatc cacgaaggcg ttaccggaga agaagacacc gcccccgcag ccatcttggc 60

cagatcctcc gccgccgccc ctggctcgtc cacccccgcc accgttaccg ctggagaagg 120

aaaaatggca tcttcaacac ccgcctctcc cgcaccttcg gatatactgt caagcgaacc 180

acagtcaaaa cgccctcctg ggcggtggac atgatgagat tcaatattaa tgactttctt 240

cccccaggag ggggctcaaa cccccgctct gtgccctttg aatactacag aattagaaag 300

gttaaggttg aattctggcc ctgctccccg atcacccagg gtgacagggg agtgggctcc 360

agtgctgtta ttctagatga taactttgta acaaaggcca cagccctcac ctatgacccc 420

tatgtaaact actcctcccg ccataccata ctccagccct cttcctacca tgcccgctac 480

tttaccccca aacctgtcct cggttccaac attgattaag tccaaccaga cgacaaaggc 540

aatcagctgt ggctacgact acaagcaact ggaacagtag accacgtagg cctcggcact 600

gcgttcgaaa acagtatata cgaccaggaa tacaatatcc gtgtaaccat gtatgtacaa 660

ttcagagaat ttaatcttaa agacccccca cttcaccctt aa 702

<210> 8

<211> 229

<212> DNA

<213> 人工序列(Synthetic sequence)

<400> 8

gtgctctcta aggagaatct cgccccgtcc aagttcaaga gccacatctc atacaagaat 60

gtcatcgtcg tgaccgcatg gtccgggagc atccgctaag cggtccttga tggccatgta 120

cgccgcgtgc ccgtccccgt gcaggagatc acggacgtta tcgaccgccg cggcaagtgc 180

gtctccaagg ccgagtacgt gcgcaacaac cacaaggtga ccgccttcg 229

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Synthetic sequence)

<400> 9

cgctggagaa ggaaaaatgg 20

<210> 10

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Synthetic sequence)

<400> 10

cttgacagta tatccgaagg t 21

<210> 11

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Synthetic sequence)

<400> 11

ttcaacaccc gcctctcccg 20

<210> 12

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Synthetic sequence)

<400> 12

gtcaccttgt ggttgttg 18

<210> 13

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Synthetic sequence)

<400> 13

ccacatctac tacaagaacg 20

Claims

1.一种用于同时检测猪圆环病毒2型和猪伪狂犬病毒的引物和探针，所述引物和探针包括：

序列如SEQ ID NO.1所示的第一引物，

序列如SEQ ID NO.2所示的第二引物，

序列如SEQ ID NO.3所示的第一探针，

其中，所述第一引物和所述第二引物组成引物对；

序列如SEQ ID NO.4所示的第三引物，

序列如SEQ ID NO.5所示的第四引物，

序列如SEQ ID NO.6所示的第二探针，

其中，所述第三引物和所述第四引物组成引物对。

2.根据权利要求1所述的引物和探针，所述第一探针的修饰如下：(1)第31位碱基修饰BHQ1-dT；(2)第35位碱基修饰6-FAM-dT；(3)第33位碱基替换为dSpacer；(4)3'端修饰C3Spacer；所述第二探针修饰如下：(1)第27位碱基修饰BHQ1-dT；(2)第30位碱基修饰6-HEX-dT；(3)第28位碱基替换为dSpacer；(4)3'端修饰C3Spacer。

3.一种用于同时检测猪圆环病毒2型和猪伪狂犬病毒的实时荧光RPA检测试剂盒，所述试剂盒包括如权利要求1所述的引物和探针。

4.根据权利要求3所述的试剂盒，所述试剂盒还包括水解缓冲液，醋酸镁以及ddH₂O。

5.根据权利要求3或4所述的试剂盒，所述试剂盒还包括等温扩增仪。

6.一种用于非疾病诊断目的的可同时快速检测猪圆环病毒2型和猪伪狂犬病毒的方法，所述方法包括

(1)提取待测样本的DNA；

(2)以所述DNA为模板，使用如权利要求1或2所述的引物和探针或者使用如权利要求3-5所述的试剂盒进行双重实时荧光RPA检测：

反应过程中实时检测FAM和HEX的荧光信号；

(a)若在RPA扩增的15min内，FAM荧光信号值超过阈值且出现拐点，而HEX荧光信号未超过阈值或未出现拐点，则表明扩增结果为猪圆环病毒2型阳性，猪伪狂犬病毒阴性；

(b)若在RPA扩增的15min内，HEX荧光信号值超过阈值且出现拐点，而FAM荧光信号值未超过阈值或未出现拐点，则表明扩增结果为猪伪狂犬病毒阳性，猪圆环病毒2型阴性；

(c)若在RPA扩增的15min内，FAM和HEX荧光信号值均超过阈值且出现拐点，则表明扩增结果为猪圆环病毒2型和猪伪狂犬病毒双阳性；

(d)若在RPA扩增的15min内，FAM和HEX荧光信号值均未超过阈值或未出现拐点，则表明扩增结果为猪圆环病毒2型和猪伪狂犬病毒双阴性。

7.根据权利要求6的方法，使用Thermo病毒核酸抽提试剂盒对所述待测样本提取DNA。

8.根据权利要求6或7的方法，使用等温扩增仪T16-ISO自带的软件Desktop扩增结果进行分析。

9.根据权利要求1或2所述引物和探针以及根据权利要求3-5所述试剂盒在制备同时检测猪圆环病毒2型和猪伪狂犬病毒试剂中的用途。