CN112945912B - 一类高亮度、大斯托克斯位移免洗脂滴荧光探针及其合成方法与应用 - Google Patents

一类高亮度、大斯托克斯位移免洗脂滴荧光探针及其合成方法与应用 Download PDF

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Abstract

本发明开发出了一类高亮度、大斯托克斯位移的免洗脂滴探针及其合成方法与应用，结构特点是在萘环上引入羰基及含氮烷基功能团，该类探针合成方法简单，合成原料低廉易得。探针在质子性溶剂如水中荧光量子产率小于0.01，而在非质子性溶剂如二氯甲烷中荧光量子产率可达到0.5。这类探针有高的亮度及较大的斯托克斯位移，并能快速透过细胞膜并富集于脂滴中，实现脂滴的免洗荧光成像，在细胞生物学研究中具有广阔的应用前景。

Description

一类高亮度、大斯托克斯位移免洗脂滴荧光探针及其合成方 法与应用
技术领域
本发明属于荧光探针和成像领域，具体涉及一类高亮度、大斯托克斯位移的免洗脂滴荧光探针的结构、合成方法及其在荧光成像领域中的应用。
背景技术
脂滴是细胞中中性脂的储存场所，脂滴自身及与其他细胞器间的相互作用调控着细胞内脂质合成、脂质代谢等重要的生理过程，与肥胖、糖尿病等疾病密切相关。因此监测其形态及与多种细胞器的相互作用，对深刻理解复杂的细胞生命活动非常必要。荧光探针因其高灵敏度、高选择性的特点，为生命科学研究提供了有力的工具。
斯托克斯位移是荧光光谱中发射波长与激发波长之间的差值，是评价荧光探针性能的重要参数。大多数荧光探针只有较小的斯托克斯位移(50-90nm)，而商业化的脂滴探针，如BODIPY 493的斯托克斯位移仅有十几纳米，这些分子在用于脂滴荧光成像时易受到激发光的干扰，降低了成像的准确性。因此，亟需开发一种高亮度、大斯托克斯位移的探针以满足活细胞脂滴成像的需求。
发明内容
本发明开发出了一类萘衍生的荧光探针，通过在萘环上引入羰基及含氮烷基结构，使探针在质子性溶剂如水中荧光量子产率小于0.01，而在非质子性溶剂如二氯甲烷中荧光量子产率可达到0.5。研究发现这类探针有较高的亮度及较大的斯托克斯位移，保证探针成像时有较高亮度的同时有效地降低了成像时的背景，探针能够快速透过细胞并富集于脂滴中，借助共聚焦荧光显微镜实现了脂滴的荧光成像。
本发明采用的技术方案为：
一种高亮度、大斯托克斯位移的免洗脂滴荧光探针，是以萘为结构单元，其结构式如下所示：
Figure BDA0002310708710000021
Figure BDA0002310708710000022
或
Figure BDA0002310708710000023
Figure BDA0002310708710000024
或
Figure BDA0002310708710000025
其中，n、m为0-3整数。
同时，本发明还提供了所述脂滴探针的一般合成方法，合成步骤如下：
Figure BDA0002310708710000026
Figure BDA0002310708710000027
或
Figure BDA0002310708710000028
Figure BDA0002310708710000029
或
Figure BDA00023107087100000210
其中，n、m为0-3整数。
高亮度、大斯托克斯位移的免洗脂滴荧光探针，具体合成步骤如下：
(1)中间体5-溴-1-萘酯或5-溴-1-萘酰胺衍生物(P-1)的合成
将5-溴-1-萘甲酸溶于氯化亚砜中，升温至70-90℃搅拌反应8-12小时后减压除去溶剂，得到淡黄色固体；将淡黄色固体溶于二氯甲烷中，加入对应的醇或胺，室温反应1-12小时后减压除去溶剂，硅胶色谱柱分离提纯得到中间体P-1；
(2)脂滴探针5-N-取代-1-萘酯或5-N-取代-1-萘酰胺(P-2)的合成
在氮气氛围下，将步骤(1)得到的中间体P-1、三(二亚苄-BASE丙酮) 二钯(0)、3-二环己基磷-2,4,6-三异丙基联苯、碳酸铯溶于干燥的二氧六环中，加入对应的胺，升温至80-110℃搅拌，反应4-12小时后减压除去溶剂，硅胶色谱柱分离提纯得到脂滴探针5-N-取代-1-萘酯或5-N-取代-1-萘酰胺。
所述胺为伯胺或仲胺。
步骤(1)中：5-溴-1-萘甲酸与氯化亚砜的质量与体积比为1:10-50g/mL； 5-溴-1-萘甲酸与对应的醇或胺的质量比为1:0.2-20；5-溴-1-萘甲酸与二氯甲烷的质量与体积比为1:20-100g/mL。
步骤(2)中：中间体P-1与三(二亚苄-BASE丙酮)二钯(0)、3-二环己基磷-2,4,6-三异丙基联苯、碳酸铯的质量比为1:0.1-1:0.3-1:2-10；中间体P-1与对应胺的质量与体积比为1:1-5g/mL；中间体P-1与二氧六环的质量与体积比为 1:10-100g/mL。
上述探针能够在活细胞内对脂滴进行特异性标记并实现荧光成像。
本发明的优点和有益效果：
这类探针拥有合成原料低价、方法简单且易于衍生等优点。
这类探针在过在萘环上引入羰基及含氮烷基结构，使探针在质子性溶剂如水中荧光量子产率小于0.01，而在非质子性溶剂如二氯甲烷中荧光量子产率可达到0.5。且探针具有较大的斯托克斯位移，避免了成像时激发光的干扰。
该探针可以实现对细胞中脂滴的精准定位，可用于细胞或组织中脂滴及各种脂质的成像、传感、检测等领域的研究。
附图说明
图1：实施例1制备得到的脂滴探针F-1的核磁氢谱；
图2：实施例1制备得到的脂滴探针F-1的核磁碳谱；
图3：实施例3制备得到的脂滴探针F-3在二氯甲烷中归一化荧光激发与发射谱图，横坐标为波长，纵坐标为归一化的荧光强度与吸收强度，荧光探针的浓度为10μM；
图4：实施例5制备得到的脂滴探针F-5的核磁氢谱；
图5：实施例5制备得到的脂滴探针F-5的核磁碳谱；
图6：实施例5制备得到的脂滴探针F-5的高分辨质谱谱图；
图7：实施例6制备得到的脂滴探针F-6的核磁氢谱；
图8：实施例2制备的脂滴探针F-2的HeLa细胞共聚焦荧光显微成像图。
具体实施方式
下面的实施例将对本发明予以进一步的说明，但并不因此而限制本发明。
实施例1.
脂滴探针F-1的合成。
当
Figure BDA0002310708710000041
n＝1时，脂滴探针F-1的合成路线如下。
中间体P-Z-1的合成路线及产物结构如下：
Figure BDA0002310708710000042
称取5-溴-1-萘甲酸(500mg,2mmol)溶于于5mL氯化亚砜中，升温至80℃搅拌反应8h，将反应液冷却至室温，减压蒸馏除去二氯亚砜，得到淡黄色固体。加入3mL二氯甲烷使固体溶解，加入乙醇(9.2g，0.2mol)，室温下反应12小时后减压除去溶剂，残余物经硅胶柱(石油醚/乙酸乙酯＝5/1，V/V)分离得到产物455mg，淡黄色粘稠液体，产率82％。
其高分辨质谱数据如下：
HRMS(ESI)：m/z：[M+H]+：计算值：279.0021，实验值：279.0012。
经检测，其结构如上式P-Z-1所示。
脂滴探针F-1的合成路线及产物结构如下。
Figure BDA0002310708710000051
在氮气氛围下，将中间体P-Z-1(50mg,0.18mmol)、三(二亚苄-BASE丙酮)二钯(0)(16.5mg,0.018mmol)、3-二环己基磷-2,4,6-三异丙基联苯(25.6mg, 0.054mmol)、碳酸铯(176mg,0.54mmol)溶于干燥的二氧六环中，加入0.4M 氨的二氧六环溶液(450μL,1.8mmol)，升温至80℃反应12h后，反应液冷却至室温，减压除去溶剂，残余物经硅胶柱(石油醚/乙酸乙酯＝5/1，V/V)分离得到产物27mg，淡黄色粘稠液体，产率70％。
其核磁谱图氢谱如下图1所示，具体数据如下：
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.28(d,J＝8.7Hz,1H),8.10(d,J＝7.1Hz,1H), 8.04(d,J＝8.5Hz,1H),7.48–7.44(m,1H),7.42–7.38(m,1H),6.84(d,J＝7.4Hz, 1H),4.46(q,J＝7.1Hz,2H),4.14(s,2H),1.45(t,J＝7.1Hz,3H).
其核磁谱图碳谱如下图2所示，具体数据如下：
13C NMR(101MHz,CDCl3)δ168.04,142.46,132.15,129.68,128.36,128.14,125.58,124.24,123.36,116.70,110.36,61.09,14.40.
经检测，其结构如上式F-1所示，能够准确定位活细胞脂滴中进行荧光成像。
实施例2.
脂滴探针F-2的合成。
当
Figure BDA0002310708710000052
时，脂滴探针P-2的合成路线和产物结构如下。
中间体P-Z-1的合成路线及产物结构如下：
Figure BDA0002310708710000061
称取5-溴-1-萘甲酸(500mg,2mmol)溶于于5mL氯化亚砜中，升温至80℃搅拌反应10h，将反应液冷却至室温，减压蒸馏除去二氯亚砜，得到淡黄色固体。加入3mL二氯甲烷使固体溶解，加入乙醇(9.2g，0.2mol)，室温下反应 12小时后减压除去溶剂，残余物经硅胶柱(石油醚/乙酸乙酯＝5/1，V/V)分离得到产物470mg，淡黄色粘稠液体，产率85％。
其高分辨质谱数据如下：
HRMS(ESI)：m/z：[M+H]+：计算值：279.0021，实验值：279.0012。
经检测，其结构如上式P-Z-1所示。
脂滴探针F-2的合成路线及产物结构如下。
Figure BDA0002310708710000062
在氮气氛围下，将中间体P-Z-1(50mg,0.18mmol)、三(二亚苄-BASE丙酮)二钯(0)(16.5mg,0.018mmol)、3-二环己基磷-2,4,6-三异丙基联苯(25.6mg, 0.054mmol)、碳酸铯(176mg,0.54mmol)溶于干燥的二氧六环中，加入氮杂环丁烷(500μL,7.4mmol)，升温至80℃反应4h后，反应液冷却至室温，减压除去溶剂，残余物经硅胶柱(石油醚/乙酸乙酯＝8/1，V/V)分离得到产物40 mg，黄色粘稠液体，产率88％。
其高分辨质谱数据如下：
HRMS(ESI)：m/z：[M+H]+：计算值：256.1338，实验值：256.1374。
经检测，其结构如上式F-2所示，能够准确定位活细胞脂滴中进行荧光成像。
实施例3
脂滴探针F-3的合成。
当
Figure BDA0002310708710000071
时，脂滴探针P-3的合成路线和产物结构如下。
中间体P-Z-2的合成路线及产物结构如下：
Figure BDA0002310708710000072
称取5-溴-1-萘甲酸(500mg,2mmol)溶于于5mL氯化亚砜中，升温至80℃搅拌反应10h，将反应液冷却至室温，减压蒸馏除去二氯亚砜，得到淡黄色固体。加入3mL二氯甲烷使固体溶解，加入甲醇(5.7g，0.2mol)，室温下反应 12小时后减压除去溶剂，残余物经硅胶柱(石油醚/乙酸乙酯＝5/1，V/V)分离得到产物435mg，淡黄色粘稠液体，产率82％。
其高分辨质谱数据如下：
HRMS(ESI)：m/z：[M+H]+：计算值：264.9864，实验值：264.9845。
经检测，其结构如上式P-Z-2所示。
脂滴探针F-2的合成路线及产物结构如下。
Figure BDA0002310708710000081
在氮气氛围下，将中间体P-Z-2(50mg,0.19mmol)、三(二亚苄-BASE丙酮)二钯(0)(16.5mg,0.018mmol)、3-二环己基磷-2,4,6-三异丙基联苯(25.6mg, 0.054mmol)、碳酸铯(176mg,0.54mmol)溶于干燥的二氧六环中，加入哌啶 (197μL,2mmol)，升温至80℃反应4h后，反应液冷却至室温，减压除去溶剂，残余物经硅胶柱(石油醚/乙酸乙酯＝8/1，V/V)分离得到产物31.7mg，黄色粘稠液体，产率62％。
其高分辨质谱数据如下：
HRMS(ESI)：m/z：[M+H]+：计算值：270.1494；实验值：270.1491。
经检测，其结构如上式F-3所示，能够准确定位活细胞脂滴中进行荧光成像。
将待测探针溶解于二甲基亚砜溶液中，配制成2mM母液，根据需要制配成不同浓度测试溶液，对其光谱及细胞成像进行检测。
F-3在二氯甲烷中的光谱测试。取20μLF-3母液，加入4mL二氯甲烷中，配制成10μM的荧光探针测试液，并进行紫外吸收光谱和荧光发射光谱的测试。
F-3在二氯甲烷中的归一化紫外吸收光谱和荧光发射光谱如图4所示，其中荧光探针浓度为10μM，F-3在二氯甲烷中量子产率达到0.5，具有较高的亮度。
F-3在二氯甲烷中的最大吸收波长为350nm，最大荧光发射波长为541nm，斯托克斯位移为191nm，探针有较大的斯托克斯位移。
实施例4.
脂滴探针的F-4合成。
当
Figure BDA0002310708710000091
时，脂滴探针F-4的合成路线及产物结构如下。
中间体P-NH-1的合成路线及产物结构如下：
Figure BDA0002310708710000092
称取5-溴-1-萘甲酸(500mg,2mmol)溶于于3mL氯化亚砜中，升温至80℃搅拌反应10h，将反应液冷却至室温，减压蒸馏除去二氯亚砜，得到淡黄色固体。加入8mL二氯甲烷使固体溶解，加入甲胺(70mg，2mmol)，室温下反应 1小时后减压除去溶剂，残余物经硅胶柱(石油醚/乙酸乙酯＝1/1，V/V)分离得到产物498mg，为白色固体粉末，产率87％。
其高分辨质谱数据如下：
HRMS(ESI)：m/z：[M+H]+：计算值：264.0024，实验值：264.0056。
经检测，其结构如上式P-NH-1所示。
脂滴探针F-4的合成路线及产物结构如下。
Figure BDA0002310708710000093
在氮气氛围下，将中间体P-NH-1(50mg,0.18mmol)、三(二亚苄-BASE 丙酮)二钯(0)(165mg,0.18mmol)、3-二环己基磷-2,4,6-三异丙基联苯(256mg, 0.54mmol)、碳酸铯(586mg,1.8mmol)溶于干燥的二氧六环中，加入丙胺(250 μL,3mmol)，升温至110℃反应8h后，反应液冷却至室温，减压除去溶剂，残余物经硅胶柱(石油醚/乙酸乙酯＝8/1，V/V)分离得到产物34mg，为淡黄色固体，产率78％。
其高分辨质谱数据如下：
HRMS(ESI)：m/z：[M+H]+：计算值：243.1497，实验值：243.1416。
经检测，其结构如上式F-4所示，能够定位于活细胞的脂滴中进行荧光成像。
实施例5.
脂滴探针的F-5合成。
当
Figure BDA0002310708710000101
R2＝，n＝1，m＝1时，脂滴探针F-5的合成路线及产物结构如下。
中间体P-NN-1的合成路线及产物结构如下：
Figure BDA0002310708710000102
称取5-溴-1-萘甲酸(500mg,2mmol)溶于于5mL氯化亚砜中，升温至90℃搅拌反应6h，将反应液冷却至室温，减压蒸馏除去二氯亚砜，得到淡黄色固体。加入8mL二氯甲烷使固体溶解，加入二乙胺(1.46g，20mmol)，室温下反应 3小时后减压除去溶剂，残余物经硅胶柱(石油醚/乙酸乙酯＝1/2，V/V)分离得到产物452mg，为白色固体粉末，产率74％。
其高分辨质谱数据如下：
HRMS(ESI)：m/z：[M+H]+：计算值：306.0494，实验值：306.0488。
经检测，其结构如上式P-NN-1所示。
脂滴探针F-5的合成路线及产物结构如下。
Figure BDA0002310708710000111
在氮气氛围下，将中间体P-NN-1(50mg,0.18mmol)、三(二亚苄-BASE 丙酮)二钯(0)(83mg,0.09mmol)、3-二环己基磷-2,4,6-三异丙基联苯(142mg, 0.3mmol)、碳酸铯(293mg,0.9mmol)溶于干燥的二氧六环中，加入0.4M氨的二氧六环溶液(450μL,1.8mmol)，升温至110℃反应12h后，反应液冷却至室温，减压除去溶剂，残余物经硅胶柱(石油醚/乙酸乙酯＝8/1，V/V)分离得到产物30mg，为淡黄色固体，产率69％。
其核磁谱图氢谱如下图4所示，具体数据如下：
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.74(d,J＝8.4Hz,1H),7.36–7.31(m,1H), 7.28(dd,J＝6.9,1.0Hz,1H),7.21(dd,J＝13.2,5.9Hz,1H),7.15(d,J＝8.3Hz, 1H),6.70(dd,J＝7.2,0.8Hz,1H),4.18–4.05(m,2H),3.79(td,J＝13.9,7.0Hz, 1H),3.42(dq,J＝13.8,7.0Hz,1H),3.05–2.93(m,2H),1.28(t,J＝7.1Hz,3H), 0.90(t,J＝7.1Hz,3H).
其核磁谱图碳谱如下图5所示，具体数据如下：
13C NMR(101MHz,CDCl3)δ170.57,142.50,135.69,130.48,127.38,124.03,123.66,123.23,121.59,115.54,110.19,43.05,38.97,14.24,13.04.
其高分辨质谱如下图6所示，具体数据如下：
HRMS(ESI)：m/z：[M+H]+：计算值：243.1497，实验值：243.1469。
经检测，其结构如上式F-5所示，能够定位于活细胞的脂滴中进行荧光成像。
实施例6
脂滴探针的F-6合成。
当
Figure BDA0002310708710000121
时，脂滴探针F-6的合成路线及产物结构如下。
中间体P-NH-2的合成路线及产物结构如下：
Figure BDA0002310708710000122
称取5-溴-1-萘甲酸(500mg,2mmol)溶于于3mL氯化亚砜中，升温至80℃搅拌反应10h，将反应液冷却至室温，减压蒸馏除去二氯亚砜，得到淡黄色固体。加入8mL二氯甲烷使固体溶解，加入乙胺(90mg，2mmol)，室温下反应 1小时后减压除去溶剂，残余物经硅胶柱(石油醚/乙酸乙酯＝1/1，V/V)分离得到产物515mg，为白色固体粉末，产率91％。
其高分辨质谱数据如下：
HRMS(ESI)：m/z：[M+H]+：计算值：278.0181，实验值：278.0193。
经检测，其结构如上式P-NH-2所示。
脂滴探针F-6的合成路线及产物结构如下。
Figure BDA0002310708710000123
在氮气氛围下，将中间体P-NH-2(50mg,0.18mmol)、三(二亚苄-BASE 丙酮)二钯(0)(165mg,0.18mmol)、3-二环己基磷-2,4,6-三异丙基联苯(256mg, 0.54mmol)、碳酸铯(586mg,1.8mmol)溶于干燥的二氧六环中，加入氮杂环丁烷(500μL,7.4mmol)，升温至110℃反应8h后，反应液冷却至室温，减压除去溶剂，残余物经硅胶柱(石油醚/乙酸乙酯＝8/1，V/V)分离得到产物30mg，为淡黄色固体，产率72％。
其核磁谱图氢谱如下图7所示，具体数据如下：
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.92(d,J＝8.6Hz,1H),7.60(d,J＝8.4Hz,1H), 7.40(d,J＝6.9Hz,1H),7.30(t,J＝8.0Hz,1H),7.23(t,J＝7.8Hz,1H),6.49(d,J＝ 7.6Hz,1H),5.99(s,1H),4.03(t,J＝7.2Hz,4H),3.48–3.39(m,2H),2.35–2.25 (m,2H),1.16(t,J＝7.2Hz,3H).
经检测，其结构如上式F-6所示，能够定位于活细胞的脂滴中进行荧光成像。
实施例7.
F-2对活细胞染色后的荧光成像显微成像实验。将待测探针溶解于二甲基亚砜溶液中，配制成2mM母液。取1μL F-2母液溶于1mL细胞培养液中，37℃， 5％CO2下孵育15分钟后进行共聚焦荧光显微成像。
F-2终浓度为2μM的细胞培养液孵育HeLa细胞15分钟后荧光显微成像图，如图8所示，HeLa细胞内圆型的脂滴清晰可见。

Claims (7)

1.一类高亮度、大斯托克斯位移的免洗脂滴探针，其特征在于，其结构如下：
Figure DEST_PATH_IMAGE002
，
R1为
Figure DEST_PATH_IMAGE004
、
Figure DEST_PATH_IMAGE006
；
R2为
Figure DEST_PATH_IMAGE008
或
Figure DEST_PATH_IMAGE010
；
其中，n、m为0-3整数。
2.根据权利要求1所述的高亮度、大斯托克斯位移的免洗脂滴探针，其特征在于，该脂滴探针通过在萘环上引入羰基及含氮烷基功能团得到。
3.一种如权利要求1所述的高亮度、大斯托克斯位移的免洗脂滴探针的合成方法，其特征在于，具体步骤如下：
（1）中间体5-溴-1-萘酯或5-溴-1-萘酰胺衍生物（P-1）的合成
将5-溴-1-萘甲酸溶于氯化亚砜中，升温至70-90 oC搅拌反应8-12小时后减压除去溶剂，得到淡黄色固体；将淡黄色固体溶于二氯甲烷中，加入对应的醇或胺，室温反应1-12小时后减压除去溶剂，硅胶色谱柱分离提纯得到中间体P-1；
（2）脂滴探针5-N-取代-1-萘酯或5-N-取代-1-萘酰胺（P-2）的合成
在氮气氛围下，将步骤（1）得到的中间体P-1、三（二亚苄-BASE丙酮）二钯(0)、3-二环己基磷-2,4,6-三异丙基联苯、碳酸铯溶于干燥的二氧六环中，加入对应的胺，升温至80-110 oC搅拌，反应4-12小时后减压除去溶剂，硅胶色谱柱分离提纯得到脂滴探针5-N-取代-1-萘酯或5-N-取代-1-萘酰胺。
4.如权利要求3中所述的合成方法，其特征在于，所述胺为伯胺或仲胺。
5.如权利要求3中所述的合成方法，其特征在于，步骤（1）中：5-溴-1-萘甲酸与氯化亚砜的质量与体积比为1:10-50 g / mL；5-溴-1-萘甲酸与对应的醇或胺的质量比为1:0.2-20；5-溴-1-萘甲酸与二氯甲烷的质量与体积比为1:20-100 g / mL。
6.如权利要求3中所述的合成方法，其特征在于，步骤（2）中：中间体P-1与三（二亚苄-BASE丙酮）二钯(0)、3-二环己基磷-2,4,6-三异丙基联苯、碳酸铯的质量比为1:0.1-1:0.3-1:2-10；中间体P-1与对应胺的质量与体积比为1: 1-5 g / mL；中间体P-1与二氧六环的质量与体积比为1:10-100 g / mL。
7.一种如权利要求1所述的高亮度、大斯托克斯位移的免洗脂滴探针在荧光成像、荧光传感或生化检测领域的应用。
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