CN116143924A - 靶向人Claudin18.2蛋白的人源化单克隆抗体及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种靶向人Claudin18.2蛋白的人源化单克隆抗体及其应用;该单克隆抗体包括重链可变区和轻链可变区,且该单克隆抗体重链可变区和轻链可变区的氨基酸序列和核酸序列双链组合使用。该单克隆抗体可以特异性识别人Claudin18.2抗原,不识别人Claudin18.1抗原,并且特异性良好,无脱靶风险;抗体制备的CAR‑T对Claudin18.2阳性靶细胞具有特异性杀伤功能,及抗体在重组构型状态具有良好的靶向性并体具有良好的抗体药(ADC)、多抗药及重组抗体蛋白应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及生物细胞技术领域,特别是涉及一种靶向人Claudin18.2蛋白的人源化单克隆抗体及其应用,如,抗体在制备生物材料及生物制剂方面的应用。
背景技术
Claudins是一个蛋白质家族,其作用是维持控制细胞间分子交换的紧密连接,广泛分布于胃、胰腺和肺组织,可用于疾病诊断和治疗。CLDN18.2(即,Claudin18.2)亚型作为一种胃特异性亚型,自从Sahin发现CLDN18.2是一种高度选择性的分子,并且只在癌细胞中广泛表达,它就成为一种理想的靶点。CLD N18.2通常埋藏在胃粘膜中,正常组织中的单克隆抗体基本上接触不到,恶性肿瘤的发生会导致紧密连接的破坏,使肿瘤细胞表面的CLDN18.2表位暴露出来,成为特定的靶点。因此,CLDN18.2赋予靶向治疗的特异性。最近发现在胰腺癌(50%)、食管癌和肺癌中的表达也显示了诊断和治疗其他肿瘤的潜力。
Claudin-18具有两个剪接变体,分别为Claudin18.1和Claudin18.2,两者序列之间仅有八个氨基酸的差异。Claudin18.1和Claudin18.2的表达分布有所不同,Claudin18.1在正常肺的细胞中选择性表达,Claudin18.2在正常细胞中表达高度受限,但在多种肿瘤(如,胃癌、肺癌和胰腺癌等)中频繁异位激活和过表达。Claudin蛋白结构中包括四个跨膜区域、两个细胞外环,其N末端和C末端在胞浆内,两个细胞外环使其成为理想的抗体靶点。
发明内容
基于此,有必要针对上述问题,本发明所要解决的问题之一是提供一种靶向人Claudin18.2 CAR的人源化单克隆抗体,也可以说是特异性抗体,该抗体特异性可以识别Claudin18.2,但不识别Claudin18.1。
本发明提供的一种靶向人Claudin18.2蛋白的人源化单克隆抗体,其包括重链可变区和轻链可变区;所述重链可变区HCDR1的氨基酸序列分别为GFSLNSYI,所述重链可变区HCDR2的氨基酸序列分别为IWTGGGT,所述重链可变区HCDR3的氨基酸序列分别为ARGAYYGNAMDY;所述轻链可变区LCDR1的氨基酸序列分别为QSLLNSGNQKNY,所述轻链可变区LCDR2的氨基酸序列分别为WAS,所述轻链可变区LCDR3的氨基酸序列分别为QNAYSYPFT。
其中,所述单克隆抗体的重链基于重链可变区链中的氨基酸序列对重链抗体骨架进行人源化改造;改造获得的人源化单克隆抗体重链氨基酸序列如SEQ IDNO:1、SEQ IDNO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:6所示;改造获得的人源化单克隆抗体轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQ IDNO:24或SEQ ID NO:25所示。
较好地,所述人源化单克隆抗体的氨基酸序列选自如SEQ ID NO:1、SEQ IDNO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:6所示中的任一分别与所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ IDNO:23、SEQ ID NO:24或SEQ IDNO:25所示中的任一组合双链使用。
本发明还提供含有上述人源化单克隆抗体的核酸分子以及含有该核酸分子的表达盒、重组载体、重组微生物或重组细胞系等生物制剂,或者含有单克隆抗体的生物制剂;其中,重组载体还包括基因重组表达载体和嵌合抗原受体。
以上所述的生物制剂,包含有检测人Claudin18.2蛋白浓度的试剂、检测人Claudin18.2蛋白在肿瘤细胞表面表达程度的试剂、对人Claudin18.2阳性细胞进行抗体介导的补体依赖或细胞依赖细胞毒反应试剂、抗体偶联毒素对人Claudin18.2阳性细胞进行杀伤、抗体偶联其他抗体制成靶向人Claudin18.2及其他抗原多抗、抗体偶联其他蛋白制成靶向人Claudin18.2的功能重组蛋白、靶向人Claudin18.2阳性细胞的嵌合抗原受体免疫细胞。
本发明提供的人源化单克隆抗体,主要包括如下优点:
1、具有特异性识别人Claudin18.2蛋白,且不识别Claudin18.1的能力;
2、具有良好的组织特异性,仅识别表达Claudin18.2组织,对其他组织器官不识别,且具有良好的检测用途前景;
3、本发明抗体制备的CAR-T对Claudin18.2阳性靶细胞具有特异性杀伤功能,具有良好的细胞免疫疗法应用前景;
4、本发明抗体在天然构型状态及重组构型状态均具有良好的靶向性,具有良好的抗体药(ADC)、多抗药及重组抗体蛋白应用前景;
5、本发明抗体经过全人源化改造,不会引起人体免疫排斥反应。
附图说明
图1a、1b、1c、1d、1e、1f分别表示293T细胞Claudin18.2表达阴性、293T细胞Claudin18.1表达阴性、293T-hClaudin18.1细胞表达hClaudin18.1阳性、293T-hClaudin18.2细胞表达hClaudin18.2阳性、293T-mClaudin18.1细胞表达mClaudin18.1阳性、293T-mClaudin18.2细胞表达mClaudin18.2阳性等图谱;
图2为人源化抗体亲和力检测结果;
图3a、3b、3c、3d、3e分别为人源化抗体种属特异性检测结果;其中,图3a为人源化抗体与293T细胞结合活性曲线图;图3b为人源化抗体与293T-mCl audin18.1细胞结合活性曲线图;图3c为人源化抗体与293T-mClaudin18.2细胞结合活性曲线图;图3d为人源化抗体与293T-hClaudin18.1细胞结合活性曲线图;图3e为人源化抗体与293T-hClaudin18.2细胞结合活性曲线图;
图4为CAR-Claudin18.2结构示意图;
图5为免疫细胞培养扩增曲线图;
图6为CAR的表达情况图谱;
图7a为CAR-T对293T细胞杀伤曲线图;
图7b为CAR-T对293T-Claudin18.2细胞杀伤曲线图。
具体实施方式
本发明中,人源化单克隆抗体(也可以简称单抗),并以此对技术方案进行解说与描述。
本发明提供了一种靶向人Claudin18.2 CAR的人源化单克隆抗体,其包括重链可变区(HV)和轻链可变区(LV);其中,在重链可变区和轻链可变区各自对应的氨基酸序列和核酸序列中,CDR1、CDR2、CDR3分别为对应的氨基酸序列和核酸序列的三个互补决定区;本发明中,HCDR1、HCDR2和HCDR3表示重链可变区的三个互补决定区;LCDR1、LCDR2和LCDR3表示轻链可变区的三个互补决定区。在单克隆抗体可进行其他动物源性改造时,三个补决定区CDR1、CDR2、CDR3中氨基酸序列和/或核酸序列的改变不超过20%;或者三个补决定区CDR1、CDR2、CDR3中氨基酸序列和/或核酸序列的改变为0。
本发明中,所述重链可变区HCDR1的氨基酸序列分别为GFSLNSYI,所述重链可变区HCDR2的氨基酸序列分别为IWTGGGT,所述重链可变区HCDR3的氨基酸序列分别为ARGAYYGNAMDY;所述轻链可变区LCDR1的氨基酸序列分别为QSLLNSGNQKNY,所述轻链可变区LCDR2的氨基酸序列分别为WAS,所述轻链可变区LCDR3的氨基酸序列分别为QNAYSYPFT。
上述重链可变区的氨基酸序列选自如SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、如SEQ IDNO:3、SEQ ID NO:4所示、SEQ ID NO:5所示、SEQ ID NO:6所示;其中:
如SEQ ID NO:1所示:
QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGFSLNSYIINWVRQPPGKGLEWLGVIWTGGGTNYNSALK SRLTISKDNSKSQVSLKLSSVTAADTAVYYCARGAYYGNAMDYWGQGTTVTVSS;或者
如SEQ ID NO:2所示:
QVQLQQSGPGLVKPSQTLSLTCAVSGFSLNSYIINWVRQSPSKGLEWLGVIWTGGGTNYNSALK SRLTINKDNSKSQVSLQLNSVTPEDTAVYYCARGAYYGNAMDYWGQGTTVTVSS;或者
如SEQ ID NO:3所示:
QVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAVSGFSLNSYIINWVRQAPGKGLEWLGVIWTGGGTNYNSALK SRLTISKDNAKSSVYLQMNSLRAEDTAVYYCARGAYYGNAMDYWGQGTTVTVSS;或者
如SEQ ID NO:4所示:
QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAVSGFSLNSYIINWVRQAPGKGLEWLGVIWTGGGTNYNSALK SRLTISKDNSKSTVYLQMNSLRAEDTAVYYCARGAYYGNAMDYWGQGTTVTVSS;或者
如SEQ ID NO:5所示:
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAVSGFSLNSYIINWVRQAPGKGLVWLGVIWTGGGTNYNSALK SRLTISKDNAKSTVYLQMNSLRAEDTAVYYCARGAYYGNAMDYWGQGTTVTVSS;或者
如SEQ ID NO:6所示:
EVQLVQSGAEVKKPGESLKISCKVSGFSLNSYIINWVRQMPGKGLEWLGVIWTGGGTNYNSALK SQLTISKDNSISTVYLQWSSLKASDTAMYYCARGAYYGNAMDYWGQGTTVTVSS。
相应地,重链可变区的对应核酸序列选自如SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、如SEQ IDNO:9、SEQ ID NO:10所示、SEQ ID NO:11所示、SEQ ID NO:12所示;其中:
如SEQ ID NO:7所示:
CAGGTCCAACTCCAAGAGAGCGGCCCCGGCCTCGTCAAACCCAGCGAAACCCTCAGCCTCACATGCACAGTCTCAGGCTTCAGCCTCAACAGCTACATCATCAACTGGGTCAGACAACCCCCAGGCAAAGGCCTCGAATGGCTGGGCGTCATCTGGACCGGCGGCGGAACCAACTATAACTCCGCACTCAAGTCAAGGCTGACCATCTCCAAGGACAACAGCAAGAGCCAAGTCAGCCTCAAGCTGAGCAGCGTGACCGCCGCTGACACCGCCGTGTATTACTGCGCCAGAGGGGCCTACTACGGCAACGCCATGGACTACTGGGGCCAGGGAACAACAGTGACCGTGTCTAGC;或者
如SEQ ID NO:8所示:
CAGGTCCAACTCCAACAAAGCGGCCCCGGCCTCGTCAAACCCAGCCAAACACTCTCCCTCACCTGCGCCGTCAGCGGATTCTCCCTCAACTCCTACATCATCAACTGGGTCAGACAAAGCCCCAGCAAAGGCCTCGAATGGCTCGGAGTCATCTGGACCGGCGGCGGCACCAACTACAACAGCGCCCTGAAGAGCAGGCTCACCATCAACAAGGACAACAGCAAGAGCCAAGTGTCACTGCAGCTGAACTCCGTGACTCCCGAGGACACCGCCGTGTACTACTGCGCCAGAGGCGCCTACTATGGCAACGCCATGGACTACTGGGGCCAAGGCACCACCGTGACCGTCTCCAGC;或者
如SEQ ID NO:9所示:
CAGGTCCAACTCGTCGAGTCAGGCGGCGGCCTCGTCAAGCCCGGAGGATCACTCAGACTCAGCTGCGCAGTCAGCGGCTTCAGCCTCAACAGCTACATCATCAACTGGGTCAGACAAGCACCCGGCAAAGGGCTGGAGTGGCTGGGGGTGATTTGGACCGGCGGAGGCACAAACTACAACAGCGCCCTGAAGAGTAGGCTGACCATCAGCAAGGACAACGCAAAGAGCAGCGTGTACCTCCAGATGAACAGCCTGAGGGCCGAGGACACCGCCGTGTACTACTGCGCAAGAGGCGCCTACTACGGCAACGCAATGGACTACTGGGGACAGGGAACAACAGTGACCGTGAGTAGC;或者
如SEQ ID NO:10所示:
CAGGTCCAACTCGTCGAGTCAGGCGGCGGCGTCGTTCAGCCAGGAAGATCACTCAGACTCAGCTGCGCAGTCAGCGGCTTCAGCCTCAACAGCTACATAATCAACTGGGTCAGACAAGCCCCCGGCAAAGGCCTGGAGTGGCTGGGAGTGATCTGGACCGGCGGAGGCACCAACTACAACTCTGCCCTGAAAAGTAGGCTGACCATCTCCAAGGACAACAGCAAGAGCACAGTGTACCTCCAGATGAACAGCCTGCGGGCCGAGGACACCGCTGTGTACTACTGCGCCAGAGGCGCCTACTATGGCAACGCCATGGACTACTGGGGCCAGGGAACCACCGTGACCGTGAGTAGC;或者
如SEQ ID NO:11所示:
GAGGTGCAGCTGGTGGAGAGCGGGGGGGGACTGGTGCAGCCAGGAGGAAGCCTGAGACTGAGCTGTGCCGTGAGCGGGTTTTCTCTGAACAGCTACATTATTAATTGGGTGAGACAGGCCCCCGGCAAAGGACTGGTGTGGCTGGGCGTTATTTGGACCGGAGGAGGAACCAACTACAACTCCGCCCTGAAGTCTAGGCTCACCATCTCCAAGGACAACGCCAAGAGTACCGTGTACCTCCAGATGAATAGCCTGAGGGCCGAAGACACCGCCGTGTACTACTGTGCCAGAGGCGCCTACTACGGCAACGCTATGGACTACTGGGGCCAGGGAACCACCGTGACCGTGAGCAGC;或者
如SEQ ID NO:12所示:
GAGGTGCAGCTGGTGCAGAGCGGAGCAGAGGTGAAGAAGCCAGGGGAGAGCCTGAAGATTAGCTGCAAGGTGAGCGGATTTAGCCTGAACAGCTACATTATTAATTGGGTGAGACAGATGCCCGGAAAAGGACTGGAGTGGCTGGGGGTGATATGGACCGGAGGAGGAACCAACTACAACAGTGCACTGAAGAGCCAGCTGACCATAAGCAAGGACAACAGCATCAGTACCGTGTACCTCCAGTGGAGTAGCCTGAAGGCCAGCGACACCGCTATGTATTACTGCGCCAGAGGCGCCTACTACGGCAACGCCATGGACTACTGGGGACAGGGCACCACCGTGACCGTGTCTTCC。
人源化单克隆抗体改造过程中,轻链可变区的氨基酸序列选自如SEQ IDNO:21、SEQ ID NO:22、如SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24所示、SEQ ID NO:25所示;其中:
如SEQ ID NO:21所示:
DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSLLNSGNQKNYLTWYQQKPGQPPKLLIYWASTRESGV PDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQNAYSYPFTFGQGTRLEIK;或者
如SEQ ID NO:22所示:
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKSSQSLLNSGNQKNYLTWYQQKPGKAPKLLIYWASTRESGV PSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQNAYSYPFTFGQGTRLEIK;或者
如SEQ ID NO:23所示:
DIVMTQSPLSLPVTLGQPASISCKSSQSLLNSGNQKNYLTWYQQRPGQPPRLLIYWASTRESGV PDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCQNAYSYPFTFGQGTRLEIK;或者
如SEQ ID NO:24所示:
EIVMTQSPGTLSLSPGERATLSCKSSQSLLNSGNQKNYLTWYQQKPGQAPRLLIYWASTRESGI PDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQNAYSYPFTFGQGTRLEIK;或者
如SEQ ID NO:25所示:
EIVMTQSPATLSVSPGERATLSCKSSQSLLNSGNQKNYLTWYQQKPGQAPRLLIYWASTRESGI PARFSGSGSGTEFTLTISSLQSEDFAVYYCQNAYSYPFTFGQGTRLEIK。
相应地,人源化单克隆抗体改造过程中,轻链可变区的对应核酸序列选自如SEQID NO:26、SEQ ID NO:27、如SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:28所示、SEQ IDNO:30所示;其中:
如SEQ ID NO:26所示:
GACATTGTGATGACCCAGAGCCCCGACTCCCTCGCCGTGAGCCTCGGAGAAAGAGCCACCATAAACTGCAAGAGCAGCCAGAGCCTGCTGAACAGCGGAAACCAAAAAAACTACCTGACATGGTACCAGCAAAAGCCCGGCCAACCCCCCAAACTGCTGATCTACTGGGCATCCACCCGCGAAAGCGGCGTCCCCGACCGATTCTCCGGCAGCGGAAGCGGCACCGACTTCACCCTGACCATCAGCAGCCTCCAAGCCGAAGACGTCGCCGTCTACTACTGCCAGAACGCCTACTCTTACCCCTTCACCTTTGGCCAGGGCACCAGACTGGAAATCAAG;或者
如SEQ ID NO:27所示:
GACATTCAGATGACCCAGAGCCCCAGCAGCCTGAGCGCCAGCGTGGGAGACAGAGTGACCATAACCTGCAAAAGCAGCCAGAGCCTGCTGAACAGCGGAAACCAGAAAAACTACCTGACCTGGTACCAGCAAAAACCCGGCAAGGCCCCCAAACTGCTGATATACTGGGCCAGTACCCGGGAGAGCGGCGTGCCAAGCAGATTCTCCGGCAGCGGAAGCGGCACCGACTTCACCCTGACCATCAGCAGCCTGCAACCCGAAGACTTCGCCACCTACTACTGCCAGAATGCCTACAGCTACCCATTCACCTTCGGCCAGGGCACCAGACTGGAAATCAAA;或者
如SEQ ID NO:28所示:
GACATTGTGATGACCCAGAGCCCCCTGAGCCTCCCCGTGACCCTCGGACAGCCCGCTTCCATAAGCTGCAAAAGCAGCCAGAGCCTGCTGAACTCCGGCAACCAGAAAAACTACCTGACCTGGTATCAGCAAAGACCCGGCCAACCCCCCAGACTGCTCATCTACTGGGCCTCCACCCGCGAAAGCGGCGTGCCAGACAGATTCTCCGGCTCCGGGAGCGGCACAGACTTCACCCTGAAGATCAGCAGAGTGGAAGCCGAAGACGTGGGAGTGTACTACTGCCAGAACGCCTACTCCTACCCATTCACCTTCGGCCAGGGCACCAGACTCGAGATCAAA;或者
如SEQ ID NO:29所示:
GAGATTGTGATGACACAGAGCCCCGGCACACTGAGTCTGAGTCCCGGCGAAAGAGCAACACTGAGTTGTAAGAGCAGCCAGAGCCTGCTGAACAGCGGCAACCAGAAGAACTACCTGACCTGGTATCAGCAGAAACCCGGCCAAGCCCCCAGACTCCTGATCTACTGGGCAAGCACCCGGGAGAGCGGAATCCCCGACAGATTCTCCGGCAGCGGAAGCGGCACCGACTTCACCCTGACTATCAGCAGACTGGAGCCCGAGGACTTCGCCGTCTACTACTGCCAGAATGCCTACAGCTACCCCTTTACCTTTGGACAGGGCACCAGGCTGGAGATCAAA;或者
如SEQ ID NO:30所示:
GAGATTGTGATGACACAGAGCCCCGCCACACTGAGCGTTAGCCCCGGCGAGAGAGCCACACTGAGTTGTAAAAGCAGCCAGAGCCTGCTGAACAGCGGCAACCAGAAGAACTATCTGACCTGGTACCAGCAGAAACCAGGCCAGGCCCCCAGACTGCTGATATATTGGGCATCCACCAGAGAGAGCGGAATACCCGCCAGATTCTCCGGCAGCGGAAGCGGAACAGAGTTCACCCTGACCATCAGCAGCCTGCAAAGTGAAGACTTCGCCGTCTACTACTGCCAGAACGCCTACAGCTACCCCTTCACCTTCGGACAGGGTACAAGACTGGAGATTAAA。
本发明的人源化单克隆抗体改造时,氨基酸序列选自如下单链使用或单双链组合使用:
1).重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ IDNO:4、SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:6所示中的任一分别与所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24或SEQ ID NO:25所示中的任一组合双链使用;或者
2).重链可变区的氨基酸序列为如SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQID NO:4、SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:6所示中的任一单链使用;或者
3).轻链可变区的氨基酸序列为如SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24或SEQ ID NO:25所示中的任一单链使用。
具体地,对于氨基酸双链组合使用,如,当重链可变区的氨基酸序列为如SEQ IDNO:1所示时,轻链可变区的氨基酸序列则为如SEQ ID NO:21所示;或者,当重链可变区的氨基酸序列为如SEQ ID NO:1所示时,轻链可变区LV的氨基酸序列则为序列如SEQ ID NO:22所示等多种组合双链使用。
相应地,单克隆抗体的核酸序列在使用时进行如下相应组合选择:
重链可变区的核酸序列如SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12所示中的任一分别与轻链可变区的核酸序列如SEQ IDNO:26、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO 30所示中的任一组合双链使用;或
重链可变区的核酸序列如SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12所示中的任一单链使用;或者
轻链可变区的核酸序列如SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQ IDNO:29、SEQ ID NO 30所示中的任一单链使用。
对于核酸双链组合使用,如,当重链可变区的核酸序列为如SEQ ID NO:7所示时,轻链可变区的核酸序列为如SEQ ID NO:26所示,或者轻链可变区LV的核酸序列为如SEQ IDNO:27所示等多种组合双链使用。
本发明中,具体描述,如,将单克隆抗体中的轻、重链可变区中的氨基酸序列配对使用,并表达为人源化抗体,优选表达配对为:
1).重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示,与轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:21所示配对时,表达纯化人源化抗体命名为scFv01;
2).重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示,与轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:22所示配对时,表达纯化人源化抗体命名为scFv02;
3).重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示,与轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:23所示配对时,表达纯化人源化抗体命名为scFv03;
4).重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示,与轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:24所示配对时,表达纯化人源化抗体命名为scFv04;
5).重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示,与轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:22所示配对时,表达纯化人源化抗体命名为scFv05;
6).重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示,与轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:24所示配对时,表达纯化人源化抗体命名为scFv06;
7).重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示,与轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:25所示配对时,表达纯化人源化抗体命名为scFv07;
8).重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示,与轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:22所示配对时,表达纯化人源化抗体命名为scFv08;
9).重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示,与轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:24所示配对时,表达纯化人源化抗体命名为scFv09。
本发明中,对于人源化抗体的基因构建质粒表达框后,表达框是通过递送***转入293T细胞进行抗体表达;其中,递送***可以是慢病毒、逆转录病毒、普通质粒载体、附加体载体、纳米递送***、电转导及转座子中的一种。
本发明中,可以将发酵纯化的人源化抗体与Claudin18.1及Claudin18.2阳性细胞共孵育,以验证人源化抗体的亲和力及特异性;或者,将发酵纯化的人源化抗体与组织切片和正常组织芯片进行免疫组化检测,以验证人源化抗体组织交叉反应特异性。
本发明中,可以将人源化抗体轻、重链可变区串联成为scFv序列,构建靶向人Claudin18.2的嵌合抗原受体;该嵌合抗原受体包括细胞外结构域、跨膜结构域和细胞内结构域;其中:
1)、嵌合抗原受体的胞外结构域包括抗原结合结构域;该抗原结合结构域包括scFv,且scFv为scFv01~09的轻重链可变区;
2)、嵌合抗原受体的跨膜结构域包括CD28的铰链区和CD28的跨膜结构域、CD8的铰链区和4-1BB的跨膜结构域、CD8铰链区和ICOS的跨膜结构域等;其中,嵌合抗原受体的跨膜结构域为CD28的铰链区和CD28的跨膜结构域、CD8的铰链区和4-1BB的跨膜结构域或4-1BB或者ICOS的共刺激结构域;
3)、嵌合抗原受体的细胞内结构域包括共刺激信号传导区、细胞因子受体胞内区和CD3ζ链部分;其中,共刺激信号传导区指包括共刺激分子的细胞内结构域的一部分;共刺激分子为淋巴细胞对抗原的有效应答所需要的细胞表面分子;细胞内结构域可以为CD28、4-1BB、ICOS的共刺激结构域中的任一个与胞内激活信号CD3ζ的组合。
本发明中,免疫细胞可以是包括T细胞、NK细胞、NKT细胞、巨噬细胞、gamma-deltaT细胞、TIL细胞、TCR-T细胞中的任一种细胞。
本发明上述任一项的靶向人Claudin18.2单克隆抗体,可制成药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂,均具有较好的成形效果,同时保持良好的药效。如,应用于生物材料和/或生物制剂中。
单克隆抗体应用于生物材料中时,该生物材料包含有由核酸序列或氨基酸序列构建的表达盒、重组载体、重组蛋白、重组微生物或重组细胞系,且这些核酸序列或氨基酸序列来源于上述单克隆抗体;其中,重组载体包括基因重组表达载体和嵌合抗原受体。
单克隆抗体应用于生物制剂中时,是作为生物制剂配置组份存在的,且该述生物制剂组份中还包含有检测人Claudin18.2蛋白浓度的试剂、检测人Clau din18.2蛋白在肿瘤细胞表面表达程度的试剂、对人Claudin18.2阳性细胞进行抗体介导的补体依赖或细胞依赖细胞毒反应试剂、抗体偶联毒素对人Claudin18.2阳性细胞进行杀伤、抗体偶联其他抗体制成靶向人Claudin18.2及其他抗原多抗、抗体偶联其他蛋白制成靶向人Claudin18.2的功能重组蛋白。
总之,相对于现有技术而言,本发明抗体具有如下优点:
1、具有特异性识别靶向人Claudin18.2蛋白,但不具有识别Claudin18.1的能力;
2、具有良好的组织特异性,仅识别表达Claudin18.2组织,对其他组织器官不识别,说明本发明中抗体具有良好的检测用途前景;
3、本发明抗体制备的CAR-T对Claudin18.2阳性靶细胞具有特异性杀伤功能,说明抗体本身具有良好的细胞免疫疗法应用前景;
4、本发明抗体在天然构型状态及重组构型状态均具有良好的靶向性,证明抗体具有良好的抗体药(ADC)、多抗药及重组抗体蛋白应用前景;
5、本发明抗体经过全人源化改造,不会引起人体免疫排斥反应。
下面以CAR-T细胞为例,代表性地对本发明的抗体拓展应用进行详细说明。
本发明的抗体拓展应用不限于上下文所述的CAR-T细胞,免疫细胞具有与上下文所述的CAR-T细胞相同或类似的技术特征和有益效果。具体地,当免疫细胞表达嵌合抗原受体CAR时,NK细胞、NKT细胞、TIL、gamma-delta T细胞等同于T细胞(或T细胞可替换NK细胞)。
本发明的嵌合抗原受体(CAR)包括细胞外结构域、跨膜结构域和细胞内结构域。其中,胞外结构域包括抗原结合结构域,细胞内结构域包括共刺激信号传导区、细胞因子受体胞内区和CD3ζ链部分,共刺激信号传导区指包括共刺激分子的细胞内结构域的一部分,共刺激分子为淋巴细胞对抗原的有效应答所需要的细胞表面分子。
在一个较佳的实施方案中,本发明提供的CAR的胞外结构域包括靶向Claudin18.2的人源化抗体轻重链可变区抗原结合结构域。本发明的CAR在T细胞中表达时,能够基于抗原结合特异性或者蛋白受体结合进行抗原识别。抗原结合结构域优选与来自共刺激分子和CD3ζ链的细胞内结构域融合。优选地,抗原结合结构域分别与CD28、4-1BB、ICOS信号传导结构域及CD3ζ信号结构域组合的细胞内结构域融合。
本发明的CAR中,胞内结构域包括CD28、4-1BB、ICOS的信号传导结构域及CD3ζ的信号传导结构域。
表达框的载体选自:DNA、RNA、质粒、慢病毒载体、腺病毒载体、逆转录病毒载体、转座子、其他基因转移***中的一种或两种以上。优选地,载体为病毒载体。
载体编码期望分子的核酸序列可利用在本领域中已知的重组方法获得,诸如例如通过从表达基因的细胞中筛选文库,通过从已知包括该基因的载体中得到该基因,或通过利用标准的技术,从包含该基因的细胞和组织中直接分离。可选地,感兴趣的基因可被合成生产。
本发明也提供了***表达框的载体,源于逆转录病毒,诸如慢病毒的载体,其特点是长期、稳定的整合目的基因至细胞中;可转导非增殖的细胞,诸如肝细胞;低免疫原性;安全性高。典型的克隆载体包含可用于调节期望核酸序列表达的转录和翻译终止子、初始序列和启动子。
表达载体可以以病毒载体形式提供给细胞。可用作载体的病毒包括但不限于逆转录病毒、腺病毒、腺伴随病毒、疱疹病毒和慢病毒。通常,合适的载体包含在至少一种有机体中起作用的复制起点、启动子序列、方便的限制酶位点和一个或多个可选择的标记。例如,逆转录病毒提供了用于基因传递***的方便的平台。可利用在本领域中已知的技术将选择的基因***载体并包装入逆转录病毒颗粒。该重组病毒可随后被分离和传递至体内或离体的对象细胞。在一个实施方案中,使用慢病毒载体。
本发明提供了含有如上所述的靶向Claudin18.2抗体的CAR-T细胞以及药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。
在一个实施方案中,所述制剂为液态制剂。优选地,所述制剂为注射剂。优选地,所述制剂中所述CAR-T细胞的浓度为1×103~1×108个/ml,更优地,CAR-T细胞的浓度为1×104~1×107个/ml。在一个实施方案中,所述制剂可包括缓冲液诸如中性缓冲盐水、硫酸盐缓冲盐水等等;碳水化合物诸如葡萄糖、甘露糖、蔗糖或葡聚糖、甘露醇;蛋白质;多肽或氨基酸诸如甘氨酸;抗氧化剂;螯合剂诸如EDTA或谷胱甘肽;佐剂(例如,氢氧化铝);和防腐剂。本发明的制剂优选配制用于静脉内施用。
在一个实施方案中,本发明的免疫细胞可经历稳固的体内T细胞扩展并可持续延长的时间量。另外,CAR介导的免疫应答可为过继免疫疗法步骤的一部分,其中CAR-修饰T细胞诱导对CAR中的抗原结合结构域特异性的免疫应答。例如,Claudin18.2 CAR-T细胞引起抗表达Claudin18.2的细胞的特异性免疫应答。
可治疗的症状包括Claudin18.2阳性表达的肿瘤细胞。肿瘤细胞可能造成的症状包括但不限于癌、胚细胞瘤和肉瘤等。
以下为通过具体实施例进行详细说明。
实施例1人源化单克隆抗体的制备
抗体的制备步骤如下:
S10:人源化抗体序列获取
以鼠源抗人Claudin18.2抗体1B8鼠单抗为模板,保留其轻重链可变区CD R区部分,对抗体骨架进行人源化改造,获得重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:1、SEQ IDNO:2、如SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4所示、SEQ ID NO:5所示、SEQ ID NO:6所示,以及轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、如SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24所示、SEQ ID NO:25所示的人源化抗体序列,将轻链及重链按scFv01~09的组合方案进行组合,轻/重链之间以linker(linker的氨基酸序列如SEQ ID NO:31所示)进行连接,并连接HumanIgG1(IgG1的氨基酸序列如SEQ ID NO:32所示)构建为重组抗体蛋白进行抗体发酵及功能评价,对最终筛选到的人源化抗体序列组合构建CAR质粒。其中:
如SEQ ID NO:31所示:GGGGSGGGGSGGGGS;
如SEQ ID NO:32所示:EPKSADKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVT CVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKAL PAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPP VLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK。
S20:人源化抗体发酵纯化
将构建好的抗体轻重链表达质粒,使用PEI试剂作为转染试剂,同时将表达质粒瞬时转染293T细胞进行抗体蛋白发酵,并收集培养液。使用0.22μm无菌滤膜过滤培养液,得培养上清后进行亲和色谱纯化。
纯化方法为:(1)20mM PB,pH7.0平衡1ml-Protein A亲和柱,1.0ml/mi n;(2)上样培养液50ml,1ml/min,使用平衡液平衡;(3)0.1M甘氨酸-HCl,pH2.7洗脱,1ml/min,收集280nm吸收峰;(4)20-50mM PB,150mM NaCl,pH6.7平衡Superdex 200Increase 10/300GL柱,1ml/min;(5)上样,收集280nm吸收峰2ml。
对纯化样品进行HPLC分析,对接收峰进行检测,检测纯化接出峰浓度,并计算蛋白量。
实施例2细胞系培养
不表达Claudin18.1及Claudin18.2的细胞系:293T(人胚肾细胞系),购自ATCC。
表达人Claudin18.1的细胞系:293T-hClaudin18.1,自产慢病毒侵染构建。
表达人Claudin18.2的细胞系:293T-hClaudin18.2,自产慢病毒侵染构建。
表达鼠Claudin18.1的细胞:293T-mClaudin18.1,自产慢病毒侵染构建。
表达鼠Claudin18.2的细胞:293T-mClaudin18.2,自产慢病毒侵染构建。
包装用细胞:293T(人胚肾细胞系),购自ATCC。
过表达人/鼠Claudin18.1及Claudin18.2的细胞系的建立:将表达h/mClaudin18.1及h/mClaudin18.2的碱基序列克隆至PHBLV慢病毒载体骨架中,置于EF1α(EF-1α)的启动子下,形成PHBLV-EF1α-h/mClaudin18.1及PHBLV-EF1α-h/mClaudin18.2,将PHBLV-EF1α-h/mClaudin18.1及PHBLV-EF1α-h/mCla udin18.2、慢病毒包膜质粒pMD2.G(Addgene,Plasmid#12259)和慢病毒包装质粒psPAX2(Addgene Plasmid#12260)三个质粒使用Lipofectamine3000转入293T中制备慢病毒完整表达载体;在48h和72h收集病毒上清,超离进行浓缩(Me rck Millipore);浓缩后的病毒即可用于感染293T,最终得到单克隆过表达hC laudin18.1或hClaudin18.2的293T细胞系,命名为293T-hClaudin18.1和293T-hClaudin18.2,过表达mClaudin18.1或mClaudin18.2的293T细胞系,命名为293T-mClaudin18.1和293T-mClaudin18.2,293T-mClaudin18.1和293T-mClaudin18.2细胞系未挑选单克隆。
上述所有细胞培养基培养:使用DMEM培养基培养。所有培养基均添加10%(v/v)胎牛血清。
图1a、1b、1c、1d、1e、1f分别为293T、293T-hClaudin18.1、293T-hCl audin18.2、293T-mClaudin18.1和293T-mClaudin18.2细胞表达Claudin18.1、Claudin18.2的检测图。
图1a中为293T细胞使用Claudin18.2抗体检测结果,图中峰型位置在竖线左侧,表示检测结果为Claudin18.2阴性。
图1b中为293T细胞使用Claudin18.1抗体检测结果,图中峰型位置在竖线左侧,表示检测结果为Claudin18.1阴性;图1a和图1b两图检测结果表明,293T细胞表明无Claudin18.1和Claudin18.2表达。
图1c中为293T-hClaudin18.1细胞使用hClaudin18.1抗体检测结果,图中峰型位置在竖线右侧,表示检测结果为hClaudin18.1阳性。
图1d中为293T-hClaudin18.2细胞使用hClaudin18.2抗体检测结果,图中峰型位置在竖线右侧,表示检测结果为hClaudin18.2阳性。
图1e中为293T-mClaudin18.1细胞使用hClaudin18.1抗体检测结果;由于mClaudin18.1和hClaudin18.1在该抗体检测位点序列完全一致,可使用hC laudin18.1抗体进行mClaudin18.1检测,另293T-mClaudin18.1细胞为未挑选单克隆细胞,其表达并非完全阳性,图中峰型位置在竖线右侧为mClaudin18.1阳性,在竖线左侧为mClaudin18.1阴性,检测结果表明为293T-mClaudin18.1细胞阳性率为81.9%。
图1f中为293T-mClaudin18.2细胞使用hClaudin18.2抗体检测结果,由于mClaudin18.2和hClaudin18.2在该抗体检测位点序列完全一致,可使用hC laudin18.2抗体进行mClaudin18.2检测,另293T-mClaudin18.2细胞为未挑选单克隆细胞,其表达并非完全阳性,图中峰型位置在竖线右侧为mClaudin18.2阳性,在竖线左侧为mClaudin18.2阴性,检测结果表明为293T-mClaudin18.2细胞阳性率为72.75%。
实施例3人源化抗体亲和力、种属特异性评价
本实施例中,使用实施例2中的细胞对实施例1中的单克隆抗体亲和力及种属特异性评价。
使用实施例2中的293T-hClaudin18.2细胞作为阳性细胞,1B8抗体作为阳性对照,检测Claudin18.2人源化抗体scFv01~09的EC50亲和力,结果见图2。结果显示scFv01~09的EC50亲和力均接近或高于对照抗体1B8。
使用实施例2中的293T、293T-hClaudin18.1、293T-hClaudin18.2、293T-mClaudin18.1、293T-mClaudin18.2细胞作为靶细胞,检测Claudin18.2人源化抗体scFv01~09的种属特异性,结果见图3a、3b、3c、3d、3e。
图3a中,人源化抗体scFv01~09分别与293T细胞结合峰型均在竖线左侧,表明其结合为阴性;图3b中1B8、1B10、1A6、2B5与293T-mClaudin18.1细胞结合峰型均在竖线左侧,表明其结合为阴性;图3c中与293T-mClaudin18.2细胞结合峰型在竖线左侧,表明其结合为阴性,scFv01~09与293T-mClaudin18.2细胞结合峰型部分在竖线左侧表示结合阴性,部分在竖线右侧表示结合阳性,其阳性率与293T-mClaudin18.2细胞阳性率相符,且经检测scFv01~09结合细胞确为293T-mClaudin18.2细胞阳性细胞,表明scFv01~09抗体可与mClaudin18.2结合;图3d中scFv01~09与293T-hClaudin18.1细胞结合峰型均在竖线左侧,表明其结合为阴性;图3e中与293T-hClaudin18.1细胞结合峰型在竖线左侧,表明其结合为阴性,人源化抗体scFv01~09与293T-hClaudin18.2细胞结合峰型均在竖线右侧表示结合阳性,表明scFv01~09抗体可与hClaudin18.2结合。
以上结果表明,人源化抗体scFv01~09抗体可特异性结合人和鼠Claudin18.2,并且不结合Claudin18.1。抗体具有人鼠两种种属特异性,可在后续实验中在小鼠动物实验中初步评价病理毒理特性。
实施例4人源化抗体组织特异性检测评价
使用8226细胞(骨髓瘤)、Daudi细胞(淋巴瘤)、K562细胞(髓系白血病)、Nalm6细胞(淋系白血病)、U266细胞(骨髓瘤)、293T细胞(肾)、A549细胞(肺)、HepG2细胞(肝)、HGC27细胞(胃)、Huh7细胞(肝)及正常人PBMC验证抗体结合特异性。检测结果见表1,结果表明:人源化抗体与各阴性细胞系均不结合,证明其组织特异性良好。
实施例5外周血PBMC的分离和T细胞的培养。
从供体外周血中分离单核细胞,使用ficol进行密度梯度离心,并用T细胞分选试剂盒富集T细胞(CD3 MicroBeads,human-lyophilized,130-097-043),使用偶联anti-CD3/anti-CD28的磁珠激活培养和扩增T细胞;培养基使用TexMACS GMP Medium(MiltenyiBiotec,170-076-309),含10%FBS,2mM L-glutamine,100IU/ml rhIL2,所有细胞均置于37℃,5%CO2恒温培养箱中培养,获得T细胞。
实施例6CAR结构设计与慢病毒包装。
Claudin18.2-CAR结构,即靶向Claudin18.2的CAR结构:
本实施例中,将scFv01~09靶向Claudin18.2人源化抗体轻重链可变区sc Fv序列分别构建到第二代CAR的一个表达框上。CAR的核心结构包括分泌信号肽序列;CD8跨膜区;胞内段刺激信号4-1BB-CD3ζ,分别命名为CAR-scFv01~09,以对照靶向Claudin18.2抗体的轻重链可变区scFv构建CAR的表达框作为对照,命名为CAR-1B8,如图4所示,标识号1#、2#、3#、4#、5#、6#、7#、8#、9#、10#分别表示10种Claudin18.2-CAR结构示意图。
如图4所示,Claudin18.2 scFv/TM/4-1BB/CD3ζ表示免疫细胞的细胞膜上表达的嵌合抗原受体。
将表达框克隆至PHBLV慢病毒载体骨架中,置于EF1α(EF-1α)的启动子下,形成PHBLV-EF1α-CAR-1B8、PHBLV-EF1α-CAR-scFv01~09,将PHBLV-EF1α-CAR-1B8、PHBLV-EF1α-CAR-scFv01~09、慢病毒包膜质粒pMD2.G(Addgene,Plas mid#12259)和慢病毒包装质粒psPAX2(Addgene Plasmid#12260)三个质粒使用Lipofectamine3000转入293T中制备慢病毒完整表达载体;在细胞培养到48h和72h后,转入离心管中离心处理,离心停止后收集病毒上清液,对上清液进行超速离心浓缩(Merck Millipore);浓缩后的病毒即可用于感染T细胞。
实施例7CAR-T细胞制备
1、慢病毒感染
将实施例5分离纯化的原代T细胞再激活1天后,利用步骤实施例6包装的5种慢病毒(Lv-CAR-1B8、Lv-scFv01~09),按MOI(1-10)进行慢病毒载体感染,并将感染病毒的T细胞转移至细胞培养瓶,置于37℃,5%CO2恒温培养箱中培养。
2、细胞增殖及CAR阳性率检测
T细胞感染后第6、9、11、13天,每天取样检测细胞数量,第6天分别检测T细胞的CAR阳性率,每隔1-2天传代补加培养基。
利用实施例6的10种慢病毒载体,成功构建了10种CAR-T细胞,分别命名为CAR-1B8、CAR-scFv01~09,以不感染慢病毒的T细胞为对照(NT)。
如图5所示,10种细胞的增殖速率,由图可知在相同培养条件的情况下10种细胞的增殖速率无明显差异。
如图6所示,分别表示NT细胞、CAR-1B8、CAR-01~09等10中细胞第6天测试的CAR的表达情况图谱;图6中所示竖线右侧为CAR阳性比例,由图6可见不同scFv对CAR阳性率无显著影响。
实施例8CAR-T对293T-hClaudin18.2细胞杀伤
对实施例7获得的10种CAR-T细胞进行体外杀伤实验,采用RTCA设备检测CAR-T细胞的杀伤效应,靶细胞与效应细胞共孵育24h,杀伤效率明显,结果如图7a、7b及表2所示;表2测试数据与图7a相一致。
表2 10种CAR-T细胞对293T细胞的杀伤效果
E∶T | 0∶1 | 1∶1 | 2∶1 | 5∶1 | 10∶1 |
NT | 0.00% | 0% | 4% | 5% | 6% |
CAR-T-1B8 | 0.00% | -1% | 1% | 4% | 6% |
CAR-T-scFv01 | 0.00% | 1% | 1% | 5% | 3% |
CAR-T-scFv02 | 0.00% | 2% | 3% | 2% | 0% |
CAR-T-scFv03 | 0.00% | 3% | 2% | 3% | 5% |
CAR-T-s cFv04 | 0.00% | 2% | 2% | 0% | 2% |
CAR-T-scFv05 | 0.00% | 0% | 1% | 2% | 2% |
CAR-T-scFv06 | 0.00% | 1% | 2% | 2% | 1% |
CAR-T-scFv07 | 0.00% | 3% | 2% | 3% | 1% |
CAR-T-scFv08 | 0.00% | 1% | 3% | 1% | 1% |
CAR-T-scFv09 | 0.00% | 2% | 2% | 0% | 1% |
图7a和表2中显示,10中CAR-T细胞CAR-1B8、CAR-01~09均对293T细胞无杀伤效果,表示其对非靶向细胞无杀伤活性;图7b中显示,与对照CAR-1B8相比,CAR-01~09均具有对293T-hClaudin18.2细胞基本相当或更优的杀伤效果。
以上所述实施例仅表达了本发明的一种实施方式,其描述较为具体和详细,但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是,对于本领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明构思的前提下,还可以做出若干变形和改进,这些都属于本发明的保护范围。因此,本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
Claims (11)
1.一种靶向人Claudin18.2蛋白的人源化单克隆抗体,其特征在于,所述人源化单克隆抗体包括重链可变区和轻链可变区;其中,所述重链可变区HCDR1的氨基酸序列分别为GFSLNSYI,所述重链可变区HCDR2的氨基酸序列分别为IWTGGGT,所述重链可变区HCDR3的氨基酸序列分别为ARGAYYGNAMDY;所述轻链可变区LCDR1的氨基酸序列分别为QSLLNSGNQKNY,所述轻链可变区LCDR2的氨基酸序列分别为WAS,所述轻链可变区LCDR3的氨基酸序列分别为QNAYSYPFT。
2.根据权利要求1所述的人源化单克隆抗体,其特征在于,所述重链可变区的氨基酸序列为如SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:6所示;所述轻链可变区的氨基酸序列为如SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24或SEQ ID NO:25所示。
3.根据权利要求2所述的人源化单克隆抗体,其特征在于,所述人源化单克隆抗体改造时,氨基酸序列使用选自:
所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ IDNO:4、SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:6所示中的任一分别与所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24或SEQ ID NO:25所示中的任一组合双链使用。
4.一种核酸分子,其特征在于,所述核酸分子编码为权利要求1至3任一所述的单克隆抗体。
5.一种表达盒,其特征在于,所述表达盒含有权利要求4所述的核酸分子。
6.一种重组载体,其特征在于,所述重组载体含有权要求4所述的核酸分子。
7.根据权利要求6所述的重组载体,其特征在于,所述重组载体包括基因重组表达载体。
8.一种重组微生物,其特征在于,所述重组微生物含有权利要求4所述的核酸分子。
9.一种重组细胞系,其特征在于,所述重组细胞系含有权利要求4所述的核酸分子。
10.一种生物制剂,其特征在于,所述生物制剂含有权利要求1至3任一所述的单克隆抗体。
11.根据权利要求10所述的生物制剂,其特征在于,所述生物制剂为检测人Claudin18.2蛋白浓度的试剂、或检测人Claudin18.2蛋白在肿瘤细胞表面表达程度的试剂、或对人Claudin18.2阳性细胞进行抗体介导的补体依赖或细胞依赖细胞毒反应试剂。
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Patent Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2022111633A1 (en) * | 2020-11-27 | 2022-06-02 | Sunshine Lake Pharma Co., Ltd. | Cldn18.2 antibody and use thereof |
CN112940124A (zh) * | 2021-04-14 | 2021-06-11 | 南京凯地医疗技术有限公司 | 靶向Claudin18.2的人源化单克隆抗体及其制备方法和应用 |
CN113788894A (zh) * | 2021-09-03 | 2021-12-14 | 深圳市先康达生命科学有限公司 | 靶向人Claudin18.2蛋白的单克隆抗体及其应用 |
CN114751984A (zh) * | 2021-09-03 | 2022-07-15 | 深圳市先康达生命科学有限公司 | 靶向人Claudin18.2蛋白的单克隆抗体及其应用 |
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
曹云新等: "Claudin 18在胰腺癌细胞中的表达", 细胞与分子免疫学杂志, vol. 25, no. 12, pages 1202 - 1203 * |
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