ES2573542B1 - Empleo de un nuevo extracto de azafrán para la prevención de trastornos del estado de ánimo relacionados con la depresión - Google Patents

Abstract

Empleo de un nuevo extracto de azafrán para la prevención de trastornos del estado de ánimo relacionados con la depresión.#La presente invención se refiere a una composición en polvo obtenida de un extracto de estigmas de azafrán caracterizada porque comprende entre un 0,03% y un 1% en peso seco de safranal; y al menos 3,48% en peso seco de crocinas mayoritarias que engloba los distintos isómeros de trans-crocin-4 (isómero principal), trans-crocin-3, trans-crocin-2', cis-crocin-4, trans-crocin-2, trans-crocin-1 y cualquiera de sus mezclas.

Description

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EMPLEO DE UN NUEVO EXTRACTO DE AZAFRAN PARA LA PREVENCION DE TRASTORNOS DEL ESTADO DE ANIMO RELACIONADOS CON LA DEPRESION

DESCRIPCION

La presente invention se refiere a la elaboration, uso y composition que comprende un extracto de estigmas de azafran (Crocus sativus L.) obtenido a escala industrial para su uso como medicamento. Espetificamente, se refiere a una composicion eficaz en la prevention de trastornos del estado de animo relacionados con la depresion.

Esta invencion se encuadra en el campo de la industria farmaceutica, concretamente dentro del campo de la prevencion de los trastornos del estado de animo relacionados con la depresion.

El extracto de azafran de la presente invencion esta titulado en safranal y crocinas mediante Cromatografia Liquida de Alta Eficacia (HPLC), que son principios activos relacionados con la inhibition de la recaptacion de neurotransmisores relacionados con el estado de animo. Este extracto se presenta como una alternativa natural para evitar el uso de antidepresivos sinteticos, que tienen multiples contraindicaciones y desventajas asociadas. La presente invencion determina la dosis efectiva y la concentration adecuada de safranal y crocinas en el extracto final analizados mediante HPLC, como condition critica para la eficacia del producto en la prevencion de trastornos del estado de animo relacionados con la depresion, demostrado por un estudio clmico en el que participaron 128 individuos.

SECTOR DE LA INVENCION

La aplicacion de la presente invencion se enmarca dentro de la industria farmaceutica, concretamente dentro del campo de la prevencion de los trastornos del estado de animo relacionados con la depresion.

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ESTADO DE LA TECNICA

Despues de la hipertension, el trastorno depresivo es la condition medica mas comun en pa^ses desarrollados (Akhondzadeh et al., 2008). La Organization Mundial de la Salud (OMS) lo define como el mas comun de los trastornos mentales, que afecta a un alto porcentaje de la poblacion. Los smtomas mas comunes son la perdida de peso, cuadros de ansiedad, hipocondriasis, insomnio, trastornos somaticos y sexuales, sentimientos de culpabilidad, de suicidio, etc. (Hamilton, 1960). Largos periodos de depresion pueden desembocar en la aparicion de patologias cronicas como enfermedades cardiacas, metabolicas como es el caso de la diabetes o trastornos hormonales, entre otras (Moussavi et al., 2007; Bisschop et al., 2004).

Dado que una de las principales causas de la aparicion de la depresion es la disminucion de algunos neurotransmisores relacionados con el estado de animo (Carr et al., 2011; Lopresti y Drummond, 2014), los antidepresivos mas empleados en la actualidad son inhibidores selectivos de la recaptacion de estos neurotransmisores (Serretti et al., 2007). Entre los principales neurotransmisores responsables del estado de animo destacan la serotonina, la norepinefrina (noradrenalina) y la dopamina. Un ejemplo muy conocido es la fluoxetina (Noorbala et al., 2005), que inhibe la recaptacion de neurotransmisores a traves de transportadores presentes en las neuronas presinapticas, lo que lleva a aumentar las concentraciones de neurotransmisores en el espacio extracelular.

Una de las principales desventajas de los tratamientos con farmacos sinteticos es la aparicion de efectos secundarios, que pueden ser desde leves, como la sequedad de la boca, dolor de cabeza, nauseas, diarrea, etc., hasta graves, como taquicardias, disfuncion sexual, hipertension, hipercolesterolemia... etc. (Ferguson, 2001; Vanderkooy, 2002). Ademas, estos tratamientos pueden interaccionar con otros medicamentos, no se pueden abandonar de una forma inmediata, y, en muchos casos, pueden causar adiccion (Haddad, 2005).

Conviene senalar tambien, que aproximadamente entre 29 y 46% de los pacientes que se someten a tratamientos basados en farmacos antidepresivos con dosis y duration adecuadas, no muestran una respuesta favorable al tratamiento (Fava et al., 1996, 2003).

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Debido a las elevadas exigencias en materia de seguridad de los tratamientos con antidepresivos y los efectos secundarios asociados, en los ultimos anos, la investigation ha centrado su atencion en extractos de plantas con posible aplicacion psicofarmacologica. Entre ellos, se encuentran los productos a base de azafran (Crocus sativus L.), cuyo efecto se ha evidenciado cientificamente tanto con estudios in vivo en animales de experimentation, como con estudios clmicos con personas que presentaban patologias relacionadas con la depresion (Akhondzadeh, 2004, 2005, 2008; Basti et al., 2007; Noorbala et al., 2005; Moshiri et al., 2006; Ulbricht et al., 2011; Kashani, 2013; Shahmansouri et al., 2014). Estas investigaciones han puesto de manifiesto que el safranal y las crocinas presentes en los extractos de azafran estudiados son los responsables del aumento de la concentration de neurotransmisores en el tejido encefalico (Karimi et al., 2001; Hosseinzadeh et al., 2004; Noorbala et al., 2005; Ettehadi et al., 2013). Las crocinas actuan via inhibition de la captation de dopamina y norepinefrina, mientras que el safranal actua via inhibicion de la serotonina (Hosseinzadeh et al., 2004), por lo que el tratamiento con extractos de azafran es efectivo, siempre y cuando esten presentes tanto las crocinas como el safranal en las concentraciones adecuadas. El safranal (2,2,6-trimetil-1,3-ciclohexadien-1- carboxaldehido) es el componente principal responsable del aroma del azafran que representa mas del 60% de los compuestos aromaticos totales (Ordundi y Tsimidou, 2004). Las crocinas son esteres glicosilados del carotenoide dicarboxflico crocetina, y estan formadas por varios esteres glicosidicos, principalmente de trans- y cis- crocinas 3 y 4 (Alonso et al., 2001). Se diferencian de los demas carotenoides de origen vegetal por su solubilidad en agua y aportan el color rojo-anaranjado intenso caracteristico del azafran.

Los trastornos de estado de animo relacionados con la depresion suelen estar asociada a un elevado estres oxidativo y, en consecuencia, a un deficit en antioxidantes exogenos (Maes et al., 2011; Maes et al., 2012; Palta et al., 2014). Durante los cuadros de depresion, las concentraciones de enzimas que actuan como antioxidantes endogenos disminuyen, principalmente la superoxido dismutasa, la catalasa y la glutation peroxidasa, mientras que aumentan las concentraciones del malonaldehido, que actua de marcador del estres oxidativo (Lopresti et al., 2014) junto a algunos productos derivados de la

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oxidacion de los acidos grasos poliinsaturados (como los 4-hidroxialquenales). Todo ello promueve respuestas inmunes, inflamatorias y, en algunos casos, neurodegenerativas (Leonard y Maes, 2012). En todos los casos, la presencia de antioxidantes exogenos ayuda a prevenir la aparicion del estres oxidativo (Maes et al., 2011; Maes et al., 2012; Palta et al., 2014), como ocurre en el caso de extractos naturales provenientes del azafran.

Para poder determinar la calidad del azafran, la Organization Internacional de Estandarizacion (ISO) propuso un metodo de analisis ISO3632 (1980, 1993), que permite categorizar de forma rapida y sencilla la calidad de la planta mediante medida es pectrofotometrica.

Se trata del metodo de analisis de los compuestos responsables de la calidad del azafran mediante la Normativa ISO3632, que avala el contenido de estos principios activos en los productos de venta. Es un metodo espectrofotometrico rapido y sencillo, que mide la absorbancia a 257 nm (Amax de Picrocrocina), a 330 nm (Amax de Safranal) y a 440 nm (Amax de Crocinas) de una disolucion de extracto de azafran. Este metodo se emplea para categorizar la calidad de los estigmas de azafran, pero se ha terminado aceptando para el analisis de compuestos bioactivos de los extractos de azafran.

Existen varios productos en el mercado a base de azafran, sin embargo, a menudo comprenden una proportion de los compuestos activos safranal y crocinas mucho inferior a lo indicado, ya que la composition de estos productos se evalua unicamente mediante la Normativa ISO3632, un metodo espectrofotometrico que no es suficientemente selectivo, objetivo ni preciso para la determination de estos principios activos como ya han senalado varios estudios tras la publication de dicha Normativa (Tarantilis et al., 1995; Orfanou y Tsimidou, 1996). Alonso et al. (2001) encontraron que a las longitudes de onda de 257 y 330 nm, a las que se determinan respectivamente la picrocrocina y el safranal segun la Normativa ISO3632, aparecen interferencias de otros compuestos, principalmente isomeros de las crocinas, que son mayoritarios en el azafran y que producen un valor sobreestimado del contenido del safranal.

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El uso de la metodologia ISO puede ajustar el contenido de principios activos en los extractos de azafran segun su absorbancia, permitiendo que un extracto de azafran que no tenga safranal en su composition emita senal a 330 nm igualmente. Este efecto es debido principalmente a algunos isomeros de crocina, como se ha comentado anteriormente, lo que produce un enmascaramiento de la calidad real del producto. Una formulation de este tipo va en claro detrimento de la calidad de estos productos, lo que puede contribuir de una forma significativa a la perdida de confianza del consumidor. Para evitar este problema, nuestro grupo de investigation ha introducido un paso de separation previa de dichos principios activos para su cuantificacion individualizada por cromatografia en fase liquida de alta eficacia, en modo de fase reversa (RP-HPLC), y asi determinar las concentraciones objetivas de las moleculas que son terapeuticamente activas.

En esta invention se presenta un procedimiento de obtencion y uso terapeutico de un novedoso extracto de azafran, que se diferencia del resto de extractos existentes en el mercado porque esta titulado de forma objetiva en aquellos principios activos que tienen el efecto preventivo frente a los trastornos del estado de animo relacionados con la depresion (safranal y crocinas). Esta composicion garantiza una adecuado equilibrio entre safranal/crocinas en el extracto final, que ademas ha demostrado ser efectivo en un estudio clmico doble ciego realizado con 128 participates a los que se les administro una dosis de 28 mg/dia de extracto durante un mes, observando una mejora significativa en el estado de animo global.

BREVE DESCRIPCION DE LA INVENCION

La presente invencion se refiere a una composicion que comprende un extracto de estigmas de azafran para su uso como medicamento eficaz en la prevention de trastornos del estado de animo relacionados con la depresion. El extracto se presenta como una alternativa natural con el objetivo de mejorar el estado de animo, prevenir trastornos del estado de animo relacionados con la depresion y evitar el tratamiento con antidepresivos sinteticos que presentan multiples contraindicaciones y efectos secundarios.

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Esta invencion describe un procedimiento de obtencion, estandarizacion y empleo de un nuevo extracto de azafran, titulado en los principales compuestos bioactivos safranal y crocinas por HPLC, relacionados con la prevention de los trastornos depresivos, que ademas son los principales responsables de las caracteristicas organolepticas del azafran (aroma y color, respectivamente). El extracto objeto de la presente invencion es una alternativa natural para prevenir trastornos relacionados con la depresion, con el objetivo de evitar el tratamiento con farmacos antidepresivos sinteticos.

La presente invencion presenta las siguientes ventajas:

- El safranal y las crocinas analizadas por HPLC del extracto de la presente invencion se encuentran en una mayor proportion que en otros extractos comerciales de azafran caracterizados por la Normativa ISO3632.

- El extracto de la presente invencion ha demostrado tener efecto funcional en la mejora del estado del animo en personas sanas, concretamente ha demostrado reducir la tension, depresion, ira, fatiga, ansiedad, estres y confusion de los pacientes, aumentando ademas el vigor de los mismos.

- El extracto de la presente invencion puede ser utilizado como complemento alimenticio.

- El extracto de la presente invencion no presenta los efectos secundarios asociados a los antidepresivos y ansiolUicos farmaceuticos comerciales sinteticos.

Un primer aspecto de la presente invencion se refiere a una composition en polvo que comprende un extracto de estigmas de azafran caracterizada mediante HPLC y que comprende:

a) entre un 0,03% y un 1% en peso seco en safranal.

b) al menos 3,48% en peso seco de crocinas, entre las que se encuentran mayoritariamente trans-crocina-4 (isomero principal), trans-crocina-3, trans-crocina-2’, cis- crocina-4, trans-crocina-2, trans-crocina-1 y cualquiera de sus mezclas.

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Un segundo aspecto de la presente invention se refiere al uso de la composition, tal y como se ha descrito anteriormente, para la formulation de un medicamento.

Un tercer aspecto de la presente invencion se refiere al uso de la composicion, tal y como se ha descrito anteriormente para preparar un medicamento para la prevention de trastornos de animo. Por trastornos de animo se entiende trastornos asociados a cuadros de depresion tales como sentimientos de fatiga, estres y ansiedad entre otros.

Un cuarto aspecto de la presente invencion, se refiere al uso de la composicion, tal y como se ha descrito anteriormente, como complemento alimenticio.

Un quinto aspecto de la presente invencion, se refiere a un alimento funcional que comprende la composicion, tal y como se ha descrito anteriormente.

DESCRIPCION DETALLADA DE LA INVENCION

Para la obtencion del extracto de azafran de la invencion en primer lugar se hace una selection estricta de la materia prima, basandose principalmente en la determination de los principios activos safranal y crocinas por HPLC, carga microbiana, etc.

La extraction industrial de los principios activos de los estigmas de azafran seleccionados se lleva a cabo preferentemente con agua o con mezclas hidroalcoholicas siempre y cuando la proportion de etanol no supere el 20 % (v/v). El control de la temperatura durante el proceso de extraccion es critico y ha de limitarse a 70 °C para evitar el deterioro de algunos isomeros de crocinas que pueden afectarse en condiciones de temperaturas superiores. Disolventes organicos como acetato de etilo, hexano, eter de petroleo, acetona, metanol u otros similares no estan permitidos para la obtencion del extracto de azafran objeto de la presente invencion.

El extracto bruto se presenta en forma de liquido denso, de color rojo y aroma intensos caracteristicos del azafran, que se enfria a temperatura ambiente con posterior eliminacion de la humedad, pudiendose emplear para esta etapa distintas tecnicas de secado, siempre y cuando se trabaje a temperatura inferior a los 70 °C.

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El ultimo paso consiste en una adecuacion del tamano de particula mediante molienda del extracto seco en un molino de martillos o cuchillas, siempre controlando que la temperatura de molienda no afecte a los compuestos bioactivos, y un tamizado del molido a traves de un tamiz de luz de malla maxima de 240 ^m. El extracto bruto se mezcla con un excipiente farmaceuticamente aceptable hasta obtener la formula de la presente invencion. Ejemplos no limitantes de excipientes son almidon, lactosa, dextrosa, maltodextrina, sacarosa, manitol, sorbitol, glucosa, celulosa microcristalina, fosfato di- y tricalcico, sulfato de calcio, caolm y cloruro de sodio. Preferiblemente el excipiente se obtiene de entre la dextrina, la maltodextrina o cualquiera de sus mezclas.

Por tanto, un primer aspecto de la presente invencion se refiere a una composicion en polvo de un extracto de estigmas de azafran caracterizado por HPLC y que comprende:

a) Entre un 0,03% y un 1% en peso seco de safranal.

b) Al menos 3,48% en peso seco de crocinas, entre las que se encuentran mayoritariamente trans-crocina-4 (isomero principal), trans-crocina-3, trans-crocina-2’, cis- crocina-4, trans-crocina-2, trans-crocina-1 y cualquiera de sus mezclas.

Preferiblemente la composicion, tal y como se ha descrito anteriormente, comprende:

a) Entre un 0,03% y un 0,50% en peso seco de safranal.

b) Entre un 3,48% y un 8,00% en peso seco de crocinas.

Mas preferiblemente, la composicion, tal y como se ha descrito anteriormente, comprende:

a) Entre un 0,03% y un 0,50% en peso seco de safranal.

b) Entre un 3,48 % y un 7,00% en peso seco de crocinas.

Aun mas preferiblemente la composicion, tal y como se ha descrito anteriormente, comprende:

a) Entre un 0,03% y un 0,35% en peso seco de safranal.

b) Entre un 3,48% y un 6,00% en peso seco de crocinas.

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En otra realization del primer aspecto de la presente invention, dentro de las crocinas comprenden mayoritariamente trans-crocina-4 (isomero principal), trans-crocina-3, trans- crocina-2’, c/s-crocina-4, trans-crocina-2, trans-crocina-1 y cualquiera de sus mezclas.

En otra realizacion del primer aspecto de la presente invencion, la composition tal y como se ha descrito anteriormente, ademas comprende picrocrocina, cuyo contenido en el extracto de la presente invencion analizado por HPLC segun el metodo propuesto por Caballero-Ortega et al., (2007), comprende al menos 2,5% expresado en g de p- nitroanilina por 100g de extracto en base seca.

En otra realizacion del primer aspecto de la presente invencion, la composicion tal y como se ha descrito anteriormente, ademas comprende una concentration en polifenoles totales analizados mediante el reactivo de Folin-Ciocalteu (Singleton y Rossi, 1965) de al menos un 1,0%, expresado en acido galico por 100 g de extracto en base seca.

En otra realizacion del primer aspecto de la presente invencion, la composicion tal y como se ha descrito anteriormente, comprende:

a) Entre un 0,03% y un 0,35% en peso seco de safranal.

b) Entre un 3,48% y un 6,00% en peso seco de crocinas.

c) Al menos un 2,5% expresado en g de p-nitroanilina por 100 g de extracto en base seca.

d) Al menos un 1,0% de acido galico por 100 g de extracto en base seca.

En otra realizacion del primer aspecto de la presente invencion, la composicion tal y como se ha descrito anteriormente, tiene un tamano de particula inferior a 240 ^m.

En otra realizacion del primer aspecto de la presente invencion, la composicion tal y como se ha descrito anteriormente, ademas comprende al menos un excipiente farmacologicamente aceptado.

El termino “excipiente” hace referencia a una sustancia que ayuda a la absorcion de cualquiera de los componentes del producto de la invencion, estabiliza dichos

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componentes o ayuda a la preparation de la composition farmaceutica. Asi pues, los excipientes pueden tener la funcion de mantener los componentes unidos, como por ejemplo almidones, azucares o celulosas; funcion edulcorante, colorante, de protection del medicamento del medio externo, como por ejemplo para aislarlo del aire y/o la humedad; funcion de relleno de una pastilla, capsula o cualquier otra forma de presentation, como por ejemplo el fosfato de calcio dibasico; funcion desintegradora para facilitar la disolucion de los componentes y su absorcion en el intestino, sin excluir otro tipo de excipientes no mencionados en este parrafo. Por tanto, el termino "excipiente” se define como aquella materia que, incluida en las formas galenicas, se anade a los principios activos o a sus asociaciones para posibilitar su preparacion y estabilidad, modificar sus propiedades organolepticas o determinar las propiedades fisico-quimicas de la composicion farmaceutica y su biodisponibilidad. El excipiente "farmaceuticamente aceptable” no debe interaccionar con la actividad de los compuestos activos de la composicion farmaceutica. Ejemplos de excipientes son aglutinantes, rellenantes, desintegradores, lubricantes, recubridores, edulcorantes, saborizantes y colorantes. Ejemplos mas concretos no limitantes de excipientes aceptables son almidones, azucares, xilitol, sorbitol, fosfato de calcio, grasas esteroides, talco, sflice o glicerina, entre otros.

En una realization preferida del primer aspecto de la presente invention, la composicion es farmaceutica. Esta composicion comprende excipientes farmaceuticamente aceptables. La composicion farmaceutica es la formulation del conjunto de componentes que forman al menos el producto de la invencion (la composicion que comprende un extracto de azafran), que tiene al menos una aplicacion en la mejora del estado fisico, fisiologico y/o psicologico de un sujeto, que implique una mejora general de su estado de salud, asi como un aumento en su calidad de vida.

Un segundo aspecto de la presente invencion se refiere al uso de la composicion, tal y como se ha descrito anteriormente, para preparar un medicamento. El medicamento comprende la composicion en una dosis terapeuticamente efectiva. En el sentido utilizado en esta description, la expresion "dosis terapeuticamente efectiva” se refiere a aquella concentration de los componentes de interes de la composicion farmaceutica, que

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cuando se administra es capaz de producir unos claros efectos preventivos, tal como se define mas adelante, de una enfermedad o condition patologica de estudio.

Un tercer aspecto de la presente invention se refiere al uso de la composition, tal y como se ha descrito anteriormente, para preparar un medicamento para la prevention de trastornos del estado de animo relacionados con la depresion.

En una realization de los aspectos segundo y tercero, la composicion, tal y como se ha descrito anteriormente, se administra oralmente.

En otra realizacion de los aspectos segundo y tercero, la composicion, tal y como se ha descrito anteriormente, se administra en una dosis superior a 15 mgMa, preferiblemente la dosis diaria esta entre 20 y 40 mgMa, mas preferiblemente la dosis diaria esta entre 25 y 28 mgMa.

Para su aplicacion terapeutica, el producto de la invencion se encontrara en una forma farmaceuticamente aceptable o sustancialmente pura, es decir, que tiene un grado de pureza farmaceuticamente aceptable excluyendo los aditivos farmaceuticos habituales como diluyentes y portadores, y no incluyendo material considerado toxico a niveles de dosificacion normales.

Los grados de pureza del extracto de azafran de la presente invencion son superiores al 50%, preferiblemente superior al 70%, y todavia mas preferiblemente superiores al 90%. La "forma galenica o forma farmaceutica” es la disposition a la que se adaptan los principios activos y excipientes para constituir un medicamento. Se define por la combination de la forma en la que la composicion farmaceutica es presentada por el fabricante y la forma en la que es administrada.

La composicion farmaceutica puede comprender un "vehiculo” o portador, que es preferiblemente una sustancia inerte. La funcion del vehiculo es facilitar la incorporation de otros compuestos, permitir una mejor dosificacion y administration o dar consistencia y forma a la composicion farmaceutica. Por tanto, el vehiculo es una sustancia que se emplea para diluir cualquiera de los componentes de la composicion farmaceutica de la

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presente invention hasta una concentration determinada; o bien que aun sin diluir dichos componentes es capaz de permitir una mejor dosificacion y administration, o dar consistencia y forma al medicamento. Por todo ello se consideraria un vehiculo farmaceuticamente aceptable. Cuando la forma de presentation del extracto es Kquida, el vehteulo farmaceuticamente aceptable es el diluyente. Ademas, el excipiente y el vehiculo deben ser farmacologicamente aceptables. La composition farmaceutica de la invencion puede comprender otras sustancias activas. Ademas del requerimiento de la eficacia terapeutica, donde dicha composicion farmaceutica puede necesitar el uso de otros agentes terapeuticos, pueden existir razones fundamentales adicionales que obligan o recomiendan en gran medida el uso de una combination de un compuesto de la invencion y otro agente terapeutico. El termino "principio activo” es toda materia, cualquiera que sea su origen, humano, animal, vegetal, quimico o de otro tipo, a la que se atribuye una actividad concreta para constituir un medicamento.

En cada caso, la forma de presentacion del medicamento se adaptara a la via de administracion elegida. Por ello, la composicion de la presente invencion se puede presentar bajo la forma de soluciones o cualquier otra forma de administracion clmicamente permitida y en una dosis terapeutica efectiva. La composicion farmaceutica de la invencion se puede presentar de forma solida, semisolida, liquida o gaseosa. Como comprimido, capsula, polvo, granulo, unguento, solution, supositorio, inyectable, inhalante, gel, jarabe, nebulizador, microesfera o aerosol. Preferiblemente en forma de comprimido, capsula, polvo, granulo, solucion o jarabe.

En otra realization de los aspectos segundo y tercero, la composicion, tal y como se ha descrito anteriormente, se administra como comprimido, capsula, polvo, granulo o solucion.

Las composiciones anteriormente mencionadas pueden ser preparadas usando metodos convencionales, como los descritos en las Farmacopeas de diferentes paises y en otros textos de referencia. Los compuestos y composiciones de la presente invencion pueden ser administrados junto con otros medicamentos en terapias combinadas.

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Un cuarto aspecto de la presente invencion se refiere al uso de la composition, tal y como se ha descrito anteriormente, como complemento alimenticio. Por complemento alimenticio se entiende los productos comercializados en forma de capsulas, comprimidos, ampollas, tisanas, soluciones bebibles, etc., cuyo fin es completar la dieta habitual y que constituyen una fuente concentrada de nutrientes (vitaminas, minerales, aminoacidos, acidos grasos esenciales, fibras...) u otras sustancias que tienen un efecto nutricional o fisiologico.

Un quinto aspecto de la presente invencion se refiere a un alimento funcional que comprende la composicion, tal y como se ha descrito anteriormente. Un alimento funcional es aquel alimento que, mas alla de satisfacer las necesidades nutricionales, es capaz de producir un efecto espetifico beneficioso para la salud asociado a la prevention o reduction del riesgo de contraer patologias concretas. Este efecto beneficioso se consigue principalmente por adicion, modification o elimination de ciertos componentes presentes en los alimentos.

A lo largo de la description y las reivindicaciones la palabra "comprende" y sus variantes no pretenden excluir otras caracteristicas tecnicas, aditivos, componentes o pasos. Para los expertos en la materia, otros objetos, ventajas y caracteristicas de la invencion se desprenderan en parte de la descripcion y en parte de la practica de la invencion. Los siguientes ejemplos y figuras se proporcionan a modo de ilustracion, y no se pretende que sean limitativos de la presente invencion.

BREVE DESCRIPCION DEL CONTENIDO DE LAS FIGURAS

Fig. 1. Cromatogramas superpuestos de HPLC de los principales componentes del extracto de azafran de la invencion. P: Picrocrocina; t-c-4: trans-Crocina-4; s: Safranal.

Fig. 2. Cambios en los valores medios de POMS que muestran cinco subescalas negativas (T: tension; D: depresion; A: ira; F: fatiga; C: confusion) y una positiva (V: vigor). POMS MCS: del ingles POMS Mean Change Score, puntuaciones de cambio medio en la escala POMS; Plb: Placebo.

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Fig. 3. Cambios en los valores de POMS que muestran los valores del analisis "Total Mood Disturbance”, TMD MCS: del ingles Total Mood Disturbance Mean Change Score, puntuaciones de cambio medio del parametro TMD; Plb: Placebo.

Fig. 4. Cambios en los valores medios de PANAS para la evaluation de Afecto Positivo (Positive Affect) y Afecto Negativo (Negative Affect). PANAS MCS: del ingles PANAS Mean Change Score, puntuaciones de cambio medio en la escala PANAS; Plb: Placebo; PA: Positive Affect; NA: Negative Affect.

Fig. 5. Cambios en los valores medios de DASS para la evaluacion de depresion (D), ansiedad (Ax) y estres (S). DASS MCS: del ingles DASS Mean Change Score, puntuaciones de cambio medio en la escala DASS; Plb: placebo.

EJEMPLOS

A continuation se ilustrara la invention mediante unos ensayos realizados por los inventores, que pone de manifiesto la composition y la actividad de la composition de la invencion.

Ejemplo 1 - Determination de la concentration de los compuestos bioactivos en la composicion de la invencion

En primer lugar se seleccionaron los estigmas de azafran en base a su calidad y se maceraron en agua a una temperatura inferior a 70°C y con agitation. Posteriormente se llevo a cabo una concentracion mas exhaustiva sin sobrepasar los 70°C de temperatura, y se obtuvo un extracto bruto seco, que fue posteriormente diluido con dextrina hasta conseguir una concentracion minima en safranal y crocinas de 0,03% y 3,48% en base seca respectivamente.

El analisis HPLC del extracto de azafran asi obtenido se llevo a cabo en un equipo HPLC 1260 Infinity Series (Agilent Technologies, Palo Alto, CA, USA). Para la separation cromatografica se empleo una columna C18 (250 mm/4,6 mm/5 ^m; ACE-5 PFP, Escocia) a 25°C y un flujo de la fase movil de 1 mL/min. La fase movil estaba compuesta

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por un componente A) agua:acetonitrilo (85:15, v/v) y componente B) metanol, con un gradiente lineal de 10 a 100% de metanol en 60 min. Tanto las muestras del extracto de la presente invention como los patrones de referencia fueron diluidos en una solution de metanol:agua (50:50, v/v). La elucion de la picrocrocina, el safranal y las crocinas fue monitorizada a las absorbancias de 250, 310 y 440 nm, respectivamente (Caballero- Ortega et al., 2007). La cuantificacion de estos compuestos se llevo a cabo mediante rectas de calibrado externas de p-nitroanilina (Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA) para cuantificar la picrocrocina, el safranal (Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA) para cuantificar el propio safranal, y el isomero trans-crocina-4 (Phytolab, Hamburg, Germany) para cuantificar los distintos isomeros de crocinas.

En la Fig. 1 se muestra el cromatograma superpuesto, adquirido a las longitudes de onda 250, 310 y 440 nm del extracto de azafran de la invencion, en las condiciones cromatograficas anteriormente descritas. A 250 nm se observa un pico con tiempo de retention (tr) de 7,6 min, que corresponde a la picrocrocina, mientras que a 310 nm se ve otro pico con tr de 33,9 min, que corresponde con el safranal. En el cromatograma registrado a 440 nm, ya en el espectro visible, aparecen los distintos isomeros de crocinas, siendo el pico mayoritario el correspondiente al isomero trans-crocina-4 (minuto 22,3).

Para confirmar la identidad de cada pico se llevo a cabo tambien un analisis de las masas de cada molecula encontrada en el extracto de la presente invencion. Para ello se utilizo un equipo Agilent, serie 1100 (Palo Alto, California, EEUU) acoplado a un detector de espectrometria de masas quadrupolo (Hewlett-Packard, serie 1100 MSD) con una fuente de ionization electrospray (ESI), que trabajaba tanto en modo positivo como negativo. El rango de masas fue de 50 a 1500 umas, drying gas flow 10 L/min, drying gas temperature 340 °C, nebulizer pressure 40 psig, vaporizer temperature 150°C, capillary voltaje 2000V, charging voltaje 2000V.

En la siguiente Tabla 1 se muestra el analisis individual de los principales isomeros de crocinas, encontrados en el extracto de azafran de la presente invencion a 440 nm, junto a los principales compuestos bioactivos encontrados a 250 nm (picrocrocina y kaempferol diglucosido), y 310 nm (safranal). Todos los espectros UV-VIS de los isomeros de

crocinas tuvieron en comun maximos aproximados a 250, 310 y 440 nm, y los principales quasi-iones y fragmentos analizados se corresponden con los encontrados por Lech et al., (2009) en hebras de azafran, donde el modo ESI+ fue el mas eficaz a la hora de determinar cada uno de estos carotenoides. La picrocrocina muestra un maximo a 251 5 nm, el safranal tambien muestra un solo maximo a 313 nm, mientras que el kaempferol diglucosido presenta un espectro caracteristico de este flavonoide con maximos a 265 y 346 nm. El resto de isomeros de crocinas encontrados en el extracto de azafran de la presente invencion mostraron el mismo espectro caracteristico de este carotenoide, como se muestra en la Tabla 1, con maximos en torno a 257, 330 y 440 nm.

10 Para la identification de la trans-crocina-4 y el safranal se utilizaron ademas los patrones de referencia disponibles comercialmente, de los que se prepararon disoluciones que se sometieron en las mismas condiciones de analisis que las utilizadas para el extracto titulado por HPLC objeto de la presente invencion.

Tabla 1. Compuestos identificados en el cromatograma de la Figura 1 con detection ESI- MS en modo ion positivo (ESI+) y negativo (ESI-).

TR (minutos)

Compuesto Maximos UV-Vis (nm) ESI + (m/z) ESI - (m/z)

511,2; 365,1; 353,2;

7,6

Picrocrocina 251 337,1; 329,1; 159,9; 151,1; 81,3 185,1; 1480,8; 667,2; 517,1; 123,0; 385,0; 181,2; 153,1

11,5

Kaempferol diglucosido 266; 347 633,2; 347,1 609,0; 284,0

16,7

262; 325; 442; 467

17,8

223; 270; 429; 438

18,0

223; 270; 327; 419; 440

19,3

261; 441; 465

22,1

trans-crocina-4 261; 323; 441; 464 999,4; 675,2; 347.1 511,2; 1336,2; 651,2; 326,8; 283,1

22,7

261; 440

23,8

261; 323; 439; 462 999,2; 742,8; 510,9; 347,0 717,0;

24,2

260; 439; 461

26,0

262; 323; 440; 463

26,7

trans-crocina-3 261; 323; 440; 463 837,4

27,9

261; 438; 462

29,8

260; 437; 462

675,2; 593,0; 513,2;

30,7

trans-crocina-2' 261; 328; 440; 464 351,1; 130,1; 102,2;

74,1

31,2

460

32,3

243; 305; 420; 441

32,6

243; 305; 420; 441

33,9

Safranal 313

36,2

c/s-crocina-4 225; 262; 325; 433; 999,4; 821,3; 668,3; 456 611,0; 391,0; 347,0 651,2

37,6

trans-crocina-2 260; 322; 433; 458 675,2; 541,1 651,2; 327,1; 311,1; 283,1

38,7

224; 262; 225; 432; 455

41,1

trans-crocina-1 224; 259; 318; 433; 768,8; 748,8; 575,2; 458 513,2; 473,2; 351,1

Los fragmentos en estilo tipografico "negrita” corresponden a iones quasi-moleculares (999,4; 837,4; 675,2; 633,2; 609,0; 513,2; 511,2; 353,2 m/z) o fragmentos ionicos (151,1; 123,0 m/z) coincidentes con el trabajo realizado por Lech et al., (2009).

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Debido a que el safranal y las crocinas son los principios activos relacionados con la mejora del estado de animo, estos se cuantificaron de forma conjunta como la suma de las concentraciones de safranal y los distintos isomeros de crocinas en g/100 g de materia seca (%), segun los cromatogramas obtenidos del analisis por HPLC previamente 10 descrito. Para su cuantificacion se emplearon rectas de calibrado representando unidades de area frente a la concentracion (mg/L), obtenidas mediante el analisis de las sustancias de referencia comerciales safranal y el isomero de trans-crocina-4 a 310 y 440 nm respectivamente. La concentracion de estos compuestos en el extracto de azafran de la presente invention se calculo mediante la formula (1), teniendo en cuenta la humedad de 15 dicho extracto y la pureza de las sustancias de referencia empleadas.

(A310nm — a310nm)/m310nm + (£A440nm — a440nm)/ m440nm

(%)=-----------------------------------------------------

C

x 100 (1)

donde:

En el extracto de azafran de la presente invencion:

A3i0nm es el area del pico del safranal a 310 nm.

IA440nm es la suma de las areas de los picos correspondientes a los distintos isomeros de crocina a 440 nm.

5 C es la concentration del extracto (mg/L)

En las sustancias de referencia:

a3i0nm es la ordenada en el origen de la recta de calibrado del patron de safranal a440nm es la ordenada en el origen de la recta de calibrado del patron de trans-crocina-4 m310nm es la pendiente de la recta de calibrado del patron de safranal 10 m440nm es la pendiente de la recta de calibrado del patron de trans-crocina-4

Entre los principios activos cuantificados en la formula (1) anterior, las crocinas son los compuestos mayoritarios. El safranal se encuentra en menor proportion, pero su presencia es imprescindible en el extracto de azafran para obtener el efecto deseado en 15 la prevention de los trastornos del estado de animo relacionados con la depresion.

Ejemplo 2 - Analisis HPLC de extractos comerciales de azafran titulados en safranal segun la Normativa ISO3632

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Se analizaron 5 extractos comerciales de azafran mediante HPLC. Todas las muestras indicaban contener un 2% en peso de safranal mediante la metodologia usada segun la Normativa ISO3632. El analisis por HPLC se efectuo de la misma manera que el realizado en el ejemplo 1 para los extractos de azafran de la invencion (Tabla 2).

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Tabla 2. Analisis HPLC segun el metodo descrito en el Ejemplo 1 de distintas muestras comerciales (A-E) de extractos de azafran titulados al 2% en safranal segun la Normativa ISO3632.

Muestras Comerciales 2% safranal (ISO3632)

Analisis HPLC

Safranal

(%)

Crocinas

(%)

I* (%)

A

0,007 0,619 0,626

B

0,006 0,384 0,390

C

0,000 1,929 1,929

19

5

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15

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30

D 0,007 2,450 2,457

__________E_____________0,006_______0,443 0,450

*Suma de Safranal y Crocinas analizadas por HPLC segun formula (1)

En la Tabla 2 se observa que todas las muestras estan tituladas al 2% en peso seco de safranal mediante la normativa ISO3632, pero sin embargo el analisis cromatografico demuestra que el contenido en safranal esta bastante por debajo de dicha cantidad, incluso este principio activo esta totalmente ausente en una de los extractos analizados (Muestra C). Ademas, la concentration en crocinas presenta grandes variaciones, a pesar de que todas las muestras estaban tituladas al 2% en safranal mediante la Normativa ISO3632.

Estos datos ponen de manifiesto la necesidad efectuar otros analisis cuantitativos espetificos como la metodologia HPLC descrita anteriormente para la evaluation de principios activos en extractos de azafran.

Ejemplo 3 - Estudio clmico

En otra modalidad preferida se llevo a cabo un estudio clmico doble ciego, paralelo y controlado con placebo en participates sanos, con el objetivo de determinar la dosis efectiva de los principios activos presentes en el extracto de la presente invention, que tienen efecto en la prevention de los trastornos del estado de animo relacionados con la depresion.

Metodologia

En el siguiente ejemplo se describe la composition de los comprimidos que recibieron los participates incluidos en el ensayo clmico. Como se puede observar en la Tabla 3, el nuevo extracto de azafran se vehiculo en dos dosis, una de 28 mg/dia y otra de 22 mgMa, divididas en dos tomas diarias, que junto al grupo placebo, conformaron los tres grupos de tratamiento estudiados.

Tabla 3. Composition del extracto de azafran objeto de la presente invention y de placebo, presente en los comprimidos empleados en el ensayo clmico.

Formula ofrecida en el estudio clmico

Dosis Diaria (en comprimidos)

2x14 mg

2x11 mg Placebo 2x0mg

Extracto de la invencion

14,0 11,0 0,0

Excipientes

Oxido de hierro rojo

0,0 0,0 0,1

Celulosa-microcristalina

187,0 190,0 176,9

Hidrogenofosfato de calcio

144,0 144,0 144,0

Extracto de zanahoria

0,0 0,0 22,0

Povidona

5,0 5,0 5,0

Croscarmelosa de sodio

9,0 9,0 9,0

Silice coloidal anhidra

3,0 3,0 4,0

Estearato de magnesio

3,0 3,0 4,0

Cubierta

Hipromelosa

9,0 9,0 9,0

Macrogol 8000

3,7 3,7 3,7

Oxido de hierro rojo

2,3 2,3 2,3

Cera de carnauba

q.s. q.s. q.s.

q.s.: quantum sufficit

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En este estudio se investigo la eficacia del extracto de azafran objeto de la presente invencion para mejorar el estado de animo general, reduciendo sentimientos de estres, ansiedad, fatiga, y aumentando el vigor y la calidad del sueno en adultos sanos.

En el ensayo clmico participaron 128 individuos (mujeres y hombres sanos con edades 10 comprendidas entre 18 y 77 anos, auto-diagnosticados, con posterior confirmation por parte de facultativos, con bajo estado de animo, pero sin depresion), para estudiar el efecto del nuevo extracto de azafran durante un mes de tratamiento. Los participates fueron divididos en tres grupos a los que se les suministro el extracto de azafran de la presente invencion en forma de comprimidos con dosis de 28 mgMa, 22 mgMa, o un 15 tratamiento de placebo, respectivamente, tal y como se observa en la Tabla 4. Cada

sujeto recibio instrucciones precisas por parte de los facultativos, de tomar dos comprimidos al d^a durante cuatro semanas (un comprimido con la comida y otro con la cena).

5 Tabla 4. Datos demograficos de los participates al principio del estudio clmico.

Grupos de tratamiento

Datos demograficos

Total (n = 121) 28 mg/dia (n = 41) 22 mg/dia (n = 42) Placebo (n = 38)

Edad Media (SD) Intervalo de variacion

39,1 (13,77) 18-77 40,4 (12,71) 21-68 36,7 (14,59) 18-77 40,38 (13,97) 23-68

Genero (Numero, %) Mujeres Hombres

75 (62,0%) 46 (38,0%) 26 (63,4%) 15 (36,6%) 26 (61,9%) 16 (38,1%) 23 (60,5%) 15 (39,5%)

Estado (Numero, %) Con pareja Sin pareja

74 (61,2%) 47 (38,8%) 25 (61,0%) 16 (39,0%) 27 (64,3%) 15 (35,7%) 22 (57,9%) 16 (42,1%)

Trabajo (Numero, %) Empleado/estudiante Desempleado/jubilado

103 (85,1%) 18 (14,9%) 34 (82,9%) 7 (17,1%) 37 (88,1%) 5 (11,9%) 32 (84,2%) 6 (15,8%)

Peso Media kg (SD)

76,34 (17,22) 75,89 (16,48) 77,54 (18,20) 75,56 (17,39)

tadice Masa Corporal Media (SD)

26,42 (6,33) 26,74 (5,90) 27,01 (7,91) 25,38 (4,77)

Fumador/a (Numero, %) Si No

17 (14,0%) 104 (86,0%) 8 (19,5%) 33 (80,5%) 6 (14,3%) 36 (85,7%) 3 (7,9%) 35 (92,1%)

Alcohol (Numero, %) Menos de 3 por semana Mas de 3 por semana

44 (36,4%) 77 (63,6%) 14 (36,1%) 27 (65,9%) 12 (28,6%) 30 (71,4%) 18 (47,4%) 20 (52,6%)

Ejercicio cada semana Si (Numero, %) No (Numero, %)

85 (70,2%) 36 (29,8%) 29 (70,7%) 12 (29,3%) 27 (64,3%) 15 (35,7%) 29 (76,3%) 9 (23,7%)

No se observaron diferencias significativas entre grupos al comienzo del tratamiento (p >

0,01, dos colas).

SD: Desviacion estandar

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El estudio fue revisado y aprobado por el Comite de Etica de Investigation Clmica Queensland y recogido en el “Australian New Zealand Clinical Trials Registry” (numero de aprobacion HREC2014002), amparado bajo la legislation vigente, en el NHMRC (National Health and Medical Research Council; Australia). Los participates fueron evaluados mediante facultativos siguiendo los criterios de inclusion y exclusion aprobados por el Comite de Etica del presente ensayo clmico.

Tras una primera entrevista con el facultativo, fueron excluidas aquellas personas diagnosticadas con un trastorno del estado de animo como MDD (Trastorno Depresivo Mayor), trastorno bipolar o cualquier otro tipo de trastorno que hubiera dado resultado positivo para la depresion en el Inventario de Depresion de Beck (Beck et al., 1988). Se excluyeron tambien aquellas personas que sufriesen de insomnio o teman empleo en turno de noche y fueron incapaces de tener una noche de sueno normal, o que sufriesen de smdrome premenstrual severo con cambios en el estado de animo y/o dolor que pudiese enmascarar resultados durante el periodo de estudio, asi como personas que padeciesen de cualquier trastorno neurologico o que estuviesen tomando suplementos dieteticos nutricionales, incluidas las hierbas, que pudieran afectar el estado de animo, como por ejemplo la hierba de San Juan, triptofano, S-adenosil metionina, 5- hidroxitriptofano, melatonina y acido Y-aminobutmco. Tambien quedaron excluidas las personas que estaban tomando un suplemento de azafran o no podian excluir el azafran o los alimentos que lo contuviesen en su dieta. Ademas, se excluyeron aquellos candidatos que pudieran presentar algun tipo de hipersensibilidad conocida a medicamentos o suplementos nutricionales, alimentos o si estaban recibiendo medication de tipo heparina, warfarina, dalteparina, enoxaparina u otro tratamiento anticoagulante similar, que hubieran sido diagnosticados con hipertension o estuviesen siendo tratados con medicamentos antihipertensivos, con insuficiencia renal o hepatica, o cualquier otro tipo de enfermedad, problemas de alcoholismo o consumo de drogas. Tambien quedaron excluidos aquellos individuos que estuviesen participando o que hubiesen participado en otro ensayo clmico en los ultimos 30 dias.

Despues de analizar 137 potenciales participates bajo los criterios de exclusion, 128 adultos sanos de 18-77 anos fueron asignados al azar en tres grupos. Siete participates

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abandonaron el estudio, llegando al final de la etapa experimental con 121 participates activos, (28 mg / dia (n = 41), 22 mg / dia (n = 42), y el placebo (n = 38).

El efecto del extracto de azafran de la invencion en el estado de animo se evaluo empleando los siguientes indicadores, ampliamente descritos en la literatura medica y psicologia clmica: POMS (Profile of Mood States), PANAS (The Possitive and Negative Affect Schedule) y DASS (Depression Anxiety Stress States). El sueno se controlo mediante el mdice PSQI (Pittburgh Sleep Quality Index).

El analisis POMS (Profile of Mood States. McNair et al., 1971), empleado en el estudio clmico para evaluar el estado de animo inicial, consta de 65 items, con adjetivos que descritan una emotion (por ejemplo, triste, enfadado, alegre), en una escala de cinco puntos para cada uno, donde 0 = nada en absoluto; 1 = un poco; 2 = moderadamente; 3 = mucho; y 4 = extremadamente (excepto los items de relajacion y eficiencia, que fueron contabilizados de forma inversa). A los participantes se les pregunto como se sentian en ese momento, y las respuestas se agruparon en seis subescalas; 5 negativos (tension, depresion, ira, fatiga y confusion) y 1 positivo (Vigor). Para cada participate se calculo el "Trastorno del Estado de Animo” (TMD, que incluye Tension + Depresion + Ira + Fatiga + Confusion - Vigor) que proyecta una vision general del estado de animo del individuo. La variation de las puntuaciones desde el inicio (baseline) hasta la semana 4 del estudio se calcularon para cada subescala, con objeto de reducir la varianza dentro de los grupos (Davidson et al., 2002; Edwards y Haythornthwaite, 2004). Las variaciones de puntuacion durante el tratamiento con respecto al TMD fueron desde -232 a 200 (un resultado positivo indicaba un aumento de la depresion, mientras que uno con valor negativo indicaba una disminucion de la depresion).

Como metodo secundario se empleo el PANAS (Watson y Clark, 1994) un indicador que consta de 20 items; 10 palabras positivas (por ejemplo, emocionado, orgulloso, alerta...) y 10 palabras negativas (por ejemplo, hostil, irritable, miedo...), puntuando en una escala de 5 puntos al igual que el POMS. A los participantes se les pregunto como se sentian con respecto a la semana anterior y las respuestas se agruparon en dos subescalas (Afecto Positivo, PA, y el afecto negativo, NA). El intervalo de variaciones de puntuacion para el PA y NA fueron de -40 a 40.

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Otro metodo de analisis secundario empleado fue el correspondiente a las Escalas de Depresion, Ansiedad y Estres o DASS-21 (Lovibond y Lovibond, 1995), que consta de 21 items divididos en tres subescalas correspondientes a la depresion, ansiedad y estres (cada una con 7 items de auto-informe). A los participates se les pregunto como se sentian durante la semana pasada y se puntuo cada item de 0 a 3, donde 0 = nunca; 1 = veces; 2 = frecuencia; y 3 = casi siempre.

El mdice PSQI o Pittsburgh Sleep Quality (Buysse et al., 1989), esta disenado para medir la calidad del sueno mediante 19 preguntas de auto-clasificacion y cinco preguntas propuestas por personas que tuviesen contacto frecuente y directo con el participate de estudio, siempre que fuese posible.

Los analisis estadisticos se llevaron a cabo mediante el programa SPSS 23.0 con nivel de signification a<0,05. Las distintas variaciones de puntuacion de cada uno de los parametros estudiados, relacionados con el estadio de animo y el sueno, fueron calculados para cada uno de los participates incluidos en el ensayo clmico (Davidson et al., 2002; Edwards y Haythornthwaite, 2004).

RESULTADOS

POMS

En la Fig. 2 se representan los resultados obtenidos para cada una de las emociones analizadas durante el periodo de tratamiento en los tres grupos de estudio (tratamiento con extracto de azafran en dosis de 28 mg/dia o de 22 mgMa, y placebo). El Test post hoc de Gabriel mostro en todas las subescalas de POMS una mejora significativa del tratamiento con el extracto de azafran en las puntuaciones de cambio para el grupo tratado con 28 mgMa del extracto de azafran de la presente invention.

Para el caso de la "Tension” se observo una mejora significativa al finalizar el periodo de tratamiento, F (2,113) = 3,82; p = 0,025. El Test post hoc de Gabriel revelo que el grupo intervenido con 28 mgMa del extracto de azafran, se encontraba 4 veces menos tenso que el grupo placebo (mejoria de -1,06 a -4,00, Fig. 2). Igualmente sucedio para la subescala "Depresion” con una F (2,113) = 9,46, p < 0,001, w = 0,36 (gran efecto); el grupo tratado con 28 mgMa del extracto de azafran mejoro significativamente,

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encontrandose 6 veces menos deprimido al final del tratamiento en comparacion con el grupo placebo, como se puede observar en la Fig. 2 (mejoria de -1,33 a -8,43).

La misma tendencia fue observada para las subescalas "Ira”, con valores de F (2,112) = 4,39, p = 0,010, q = 0,26 (efecto intermedio); "Fatiga”, con F (2,113) = 4,92, p = 0,009, q = 0,25 (efecto intermedio) y "Confusion”, con F (2,113) = 7,81, p = 0,001, q = 0,32 (efecto intermedio). El tratamiento con 28 mgMa del extracto de azafran redujo significativamente en 5 veces, en comparacion con el grupo placebo, el estado de ira (de -1,14 a -5,05), fatiga (de -1,11 a -5,00) y confusion (de -0,83 a -4,35; Fig. 2).

Para la subescala POMS "vigor” se observo una mejora significativa en escala inversa, con un valor de F (2,112) = 5,25, p = 0,007, q = 0,26 (efecto intermedio). El grupo tratado con 28 mgMa del extracto de azafran experimento un aumento significativo del "vigor” al final del tratamiento, mejorando en 10 veces la escala de vigor en comparacion con el grupo placebo (de -0,39 a +4,00; Fig. 2).

En la Fig. 3 se representa la variation media correspondiente al analisis del "Total Mood Disturbance” (TMD) o Perturbaciones Totales del Estado de Animo para cada uno de los grupos de estudio durante el mes de tratamiento con el extracto de azafran de la presente invention F (2,111) = 9,94, p < 0,001, q = 0,37 (gran efecto). En concreto, el grupo tratado con 28 mgMa del extracto de azafran disminuyo su nivel TMD de manera significativa aproximadamente 6 veces en comparacion con el grupo placebo (de -5,37 a - 30,83; Fig. 3).

PANAS

En la Fig. 4 se muestran los valores de cambio medios para el analisis PANAS, que aunque no llegan a ser significativos, muestran una tendencia clara para el "Afecto Positivo” (Positive Affect o Positive Mood) y "Afecto Negativo” (Negative Affect o Negative Mood), indicando una mejora en el estado de animo en los grupos tratados tanto a dosis de 22 mgMa como de 28 mgMa con el extracto de azafran de la presente invencion, con respecto al grupo placebo, tras un mes de tratamiento.

El analisis de la varianza (ANOVA) mostro una diferencia significativa del tratamiento, entre los grupos de estudio en las puntuaciones referentes a "Afecto Negativo”, F (2,111)

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= 6,97, p = 0,001, a = 0,31 (efecto intermedio). La variation en el valor del "Afecto Negativo” en el grupo tratado con 28 mgMa del extracto de azafran, mejoro de forma significativa en 3 veces en comparacion con el grupo placebo (de -2,40 a -6,63), p = 0,001, d = -0,42 (efecto intermedio, de acuerdo con las convenciones de Cohen).

DASS

Tambien se realizo el tratamiento ANOVA con la prueba DASS para analizar las variaciones observadas en las subescalas: depresion, ansiedad y estres entre los distintos grupos de tratamiento.

Para las puntuaciones de cambio en el caso concreto de la subescala de depresion DASS se observo un efecto significativo con F (2,118) = 12,96, p <0,001, a = 0,41 (gran efecto). Como se puede observar en la Fig. 5, el grupo tratado con 28 mgMa con el extracto de azafran de la presente invention mejoro significativamente con respecto al grupo placebo, reduciendo en 4 veces los smtomas relacionados con un cuadro depresivo (valores de -1,42 a -5,61). Asimismo, se observo un efecto dosis dependiente obteniendo una mejoria significativa en los participates tratados con 28 mgMa con respecto a los tratados con 22 mgMa del extracto de azafran, que redujo a la mitad los smtomas relacionados con la depresion (valores de -2,87 a -5,61).

Para la subescala de ansiedad, el tratamiento mostro tambien una mejora significativa, F (2,118) = 4,33, p = 0,01, a = 0,23 (efecto intermedio). Segun el Test post hoc de Gabriel se produjo una disminucion significativa de la ansiedad de casi 3 veces en el grupo tratado con 28 mgMa del extracto de azafran en comparacion con el grupo placebo, tras un mes de tratamiento (mejora de -1,23 a -3,22; Fig. 5).

En el caso de la subescala DASS Estres, tambien se observo un cambio significativo tras el tratamiento con el extracto de azafran, F (2,118) = 14,29, p <0,001, a = 0,42 (gran efecto). El grupo tratado con 28 mgMa del presente extracto mejoro significativamente el cuadro de estres con respecto al resto de los grupos de estudio. Concretamente, se redujeron a 2 y 4 veces los signos de estres al final del tratamiento, en comparacion con el grupo tratado con 22 mgMa (reduction de -3,11 a -6,12) y con el grupo placebo (reduction de -1,49 a -6,12), respectivamente.

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Al igual que en el efecto del tratamiento sobre la componente “Estado de animo”, el efecto del extracto de azafran de la presente invencion tambien fue destacable en el componente correspondiente a la calidad del “Sueno”, evaluada mediante el mdice de Pittsburgh (PSQI). Tras realizar el analisis estadistico ANOVA sobre variaciones de puntuacion en el PSQI global, se observo una mejora significativa en el sueno del grupo tratado con 28 mg/dia en la puntuacion de cambio global del PSQI, F (2,106) = 4,27, p = 0,016, en comparacion con el grupo placebo.

CONCLUSION

Los resultados obtenidos en el estudio clmico amplian la literatura cientifica ya que es el primer ensayo de este tipo que se ha realizado con personas sanas. Ademas, demuestra que el extracto de azafran de la invencion obtenido a escala industrial, analizado mediante HPLC, no ejerce ningun efecto secundario o no deseado en el organismo, pero si que se observan efectos positivos significativos en todos los estudios psicologicos llevados a cabo para analizar el estado de animo al final del tratamiento (POMS-TMD, PANAS, DASS y PSQI).

En cuanto a la dosis, se pudo observar una relation dosis-dependiente clara entre las dos concentraciones estudiadas, por lo que este estudio se configura como uno de los primeros en identificar un esquema de dosificacion clmicamente apropiado y empmcamente justificado. Los efectos del extracto de azafran objeto de la presente memoria de patente sobre el estado de animo fueron consistentes en ambos sexos, y se han logrado sin efectos adversos sobre los parametros de rendimiento o seguridad.

REFERENCIAS

Alonso, GL., Salinas, MR., Garuo, J., Sanchez-Fernandez, MA. (2001). Composition of crocins and picrocrocin from Spanish Saffron (Crocus sativus L.). Journal of Food Quality, 24, 219-233.

Akhondzadeh, S., Fallah-Pour, H., Afkham, K., Jamshidi, AH., Khalighi-Cigaroudi, F. (2004). Comparison of Crocus sativus L, and imipramine in the treatment of mild to moderate depression: A pilot double-blind randomized trial. BMC Complementary and Alternative Medicine 4, 12.

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Akhondzadeh, S., Tahmacebi-Pour, N., Noorbala, AA., Amini, H., Fallah-Pour, H., Jamshidi, AH., Khani, M. (2005). Crocus sativus L, in the Treatment of Mild to Moderate Depression: A Double-blind, Randomized and Placebo-controlled Trial. Phytotherapy Research, 19, 148-151.

Akhondzadeh BA., Ghoreishi SA., Noorbala AA., Akhondzadeh, SH., Rezazadeh SH. (2008). Petal and Stigma of Crocus sativus L. in the Treatment of Depression: A Pilot Double - blind Randomized Trial. Journal of Medicinal Plants, 7, 29-36.

Basti, AA., Moshiri, E., Noorbala, AA., Jamshidi, AH., Abbasi, SH., Akhondzadeh, S. (2007), Comparison of petal of Crocus sativus L, and fluoxetine in the treatment of depressed outpatients: A pilot double-blind randomized trial. Progress in NeuroPsychopharmacology & Biological Psychiatry, 31,439-442.

Beck, AT., Steer, RA., Garbin, MG. (1988). Psychometric properties of the Beck Depression Inventory: Twenty-five years of evaluation. Clinical Psychology Review, 8, 77100.

Bisschop, MI., Kriegsmana, DMW., Beekman, ATF., Deeg, DJH. (2004). Chronic diseases and depression: the modifying role of psychosocial resources. Social Science & Medicine, 59, 721-733.

Buysse, DJ., Reynolds, CF., Monk, TH., Berman, SR., Kupfer, DJ. (1989). The Pittsburgh Sleep Quality Index: A new instrument for psychiatric practice and research. Psychiatry Research 28, 193-213.

Caballero-Ortega, H., Pereda-Miranda, R., Abdullaev, FI. (2007). HPLC quantification of major active components from 11 different saffron (Crocus sativus L,) sources. Food Chemistry 100, 1126-1131.

Carr, GV., Schechter, LE., Lucki, I. (2011). Antidepressant and anxiolytic effects of selective 5-HT6 receptor agonists in rats. Psychopharmacology, 213, 499-507.

Davidson, RJ., Sherer, KR. y Goldsmith, HH. (2002). Handbook of Affective Sciences (1st ed,), USA: Oxford University Press.

Edwards, RR., Haythornthwaite, J. (2004). Mood swings: Variability in the use of the Profile of Mood States, J Pain Symptom Manage 28, 534.

Ettehadi, H., Mojabi, SN., Ranjbaran, M., Shams, J., Sahraei, H., Hedayati, M., Asefi, F. (2013). Aqueous Extract of Saffron (Crocus sativus) Increases Brain Dopamine and Glutamate Concentrations in Rats. Journal of Behavioral and Brain Science, 3, 315-319.

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30

Fava, M., Katharine, MD., Davidson, G. (1996). Definition and epidemiology of treatment- resistant depression, Psychiatric Clinics of North America, 19, 179-200.

Fava, M. (2003). Diagnosis and definition of treatment-resistant depression. Biological Psychiatry, 53, 649-659.

Ferguson, JM. (2001). SSRI Antidepressant Medications: Adverse Effects and Tolerability. Primary Care Companion - Journal of Clinical Psychiatry, 3, 22-27.

Haddad, PM. (2005). Do antidepressants cause dependence? Epidemiologia e Psichiatria Sociale, 14, 2.

Hamilton, M. (1960). A rating scale for depression. Journal of Neurology, Neurosurgery and Psychiatry, 23, 56-62.

Hosseinzadeh, H., Karimi, G., Niapoor, M. (2004). Antidepressant effect of Crocus sativus l, stigma extracts and their constituents, crocin and Safranal, in mice, Acta Horticulturae, 650, 435-45.

International Standard, Saffron specification, ISO-3632-1980(E). International Organization for Standardization, Geneva. International Standard, Saffron specification, ISO 3632-1 and ISO 3632-2: 1993(E). International Organization for Standardization, Geneva, 1993.

Karimi, GHR., Hosseinzadeh, H., Khalegh Panah, P. (2001). Study of antidepressant effect of aqueous and ethanolic extract of Crocus sativus in mice. Iranian journal of basic medical sciences, 4, 11-15.

Kashani, L., Raisi, F., Saroukhani, S., Sohrabi, H., Modabbernia, A., Nasehi, AA., Jamshidi, A., Ashrafi, M., Mansouri, P., Ghaeli, P., Akhondzadeh, S. (2013). Saffron for treatment of fluoxetine-induced sexual dysfunction in women: randomized double-blind placebo-controlled study. Human Psychopharmacology Clinical and Experimental Journal, 28, 54-60.

Lech, K., Witowska-Jarosz, J., Jarosz, M. (2009). Saffron yellow: characterization of carotenoids by high performance liquid chromatography with electrospray mass spectrometric detection. Journal of Mass Spectrometry, 44, 1661-1667.

Leonard, B. y Maes, M. (2012). Mechanistic explanations how cell-mediated immune activation, inflammation and oxidative and nitrosative stress pathways and their sequels and concomitants play a role in the pathophysiology of unipolar depression. Neuroscience & Biobehavioral Reviews, 36, 764-785.

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15

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30

Lopresti, AL. y Drummond, PD. (2014). Saffron (Crocus sativus) for depression: a systematic review of clinical studies and examination of underlying antidepressant mechanisms of action. Human Psychopharmacology: Clinical and Experimental, 29, 517527.

Lovibond, S, H., y Lovibond, PF. (1995). The structure of negative emotional states: comparison of the depression anxiety stress scales (DASS) with the beck depression and anxiety inventories. Behaviour research and therapy, 33, 335-343.

Maes, M., Galecki, P., Chang, YS., Berk, M. (2011). A review on the oxidative and nitrosative stress (O&NS) pathways in major depression and their possible contribution to the (neuro) degenerative processes in that illness. Progress in NeuroPsychopharmacology & Biological Psychiatry 35, 676-692.

Maes, M., Fisar, Z., Medina, M., Scapagnini, G., Nowak, M., Berk, M. (2012). New drug targets in depression: inflammatory, cell-mediated immune, oxidative and nitrosative stress, mitochondrial, antioxidant, and neuroprogressive pathways, and new drug candidates—Nrf2 activators and GSK-3 inhibitors, Inflammation In Acute And Chronic Neurological And Psychiatric Diseases. Inflammopharmacology, 20, 127-150.

McNair, DM., Lorr, M. y Droppleman, LF. (1971). Manual: Profile of Mood States, San Diego, CA: Educational and Industrial Testing Service.

Moshiri, E., Basti, AA., Noorbala, AA., Jamshidi, AH., Abbasi, SH., Akhondzadeh, S. (2006). Crocus sativus L, (petal) in the treatment of mild-to-moderate depression: A double-blind, randomized and placebo-controlled trial. Phytomedicine, 13, 607-611. Moussavi, S., Chatterji, S., Verdes, E., Tandon, A., Patel, V., Ustun, B. (2007). Depression, chronic diseases, and decrements in health: results from the World Health Surveys, Lancet, 370, 851-858.

Noorbala, AA., Akhondzadeha, S., Tahmacebi-Pour, N., Jamshidi, AH. (2005). Hydroalcoholic extract of Crocus sativus L, versus fluoxetine in the treatment of mild to moderate depression: a double-blind, randomized pilot trial. Journal of Ethnopharmacology 97, 281-284.

Ordundi, SA. y Tsimidou, MZ. (2004), Saffron quality: effect of agricultural practices, processing and storage, Production Practices and Quality Assessment of Food Crops, 1, 209-260.

Orfanou, O. y Tsimidou, MZ. (1996). Evaluation of the colouring strength of saffron spice by UV—Vis spectrometry. Food Chemistry, 57, 463-469.

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15

20

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30

Palta, P., Samuel, LJ., Miller, ER., Szanton, SL. (2014). Depression and Oxidative Stress: Results from a meta-analysis of observational studies. Psychosomatic Medicine, 76, 1219.

Shahmansouri, N., Farokhnia, M., Abbasi, SH., Kassaian, SE., Noorbala, SA., Gougol, A., Yekehtaz, H., Forghani, S., Mahmoodian, M., Saroukhani, S., Arjmandi-Beglar, A., Akhondzadeh, S. (2014). A randomized, double-blind, clinical trial comparing the efficacy and safety of Crocus sativus L, with fluoxetine for improving mild to moderate depression in post percutaneous coronary intervention patients. Journal of Affective Disorders, 155, 216-222.

Serretti, A., Kato, M., Ronchi, D., Kinoshita, T. (2007). Meta-analysis of serotonin transporter gene promoter polymorphism (5-HTTLPR) association with selective serotonin reuptake inhibitor efficacy in depressed patients. Molecular Psychiatry, 12, 247-257. Singleton, VL. y Rossi, JA. (1965), Colorimetry of total phenolics with phosphomolybdic- phosphotungstic acid reagents. American Journal of Enology and Viticulture, 16, 144-158. Tarantilis, PA., Tsoupras, G., Polisiou, M. (1995). Determination of saffron (Crocus sativus L.) components in crude plant extract using high-performance liquid chromatography-UV- visible photodiode-array detection-mass spectrometry. Journal of Chromatography A, 699, 107-118.

Ulbricht, C., Conquer, J., Costa, D., Hollands, W., lannuzzi, C., Isaac, R., Jordan, JK., Ledesma, N., Ostroff, C., Serrano, JMG., Shafferh, MD., Varghese, M. (2011). An Evidence-Based Systematic Review of Saffron (Crocus sativus ) by the Natural Standard Research Collaboration. Journal of Dietary Supplements, 8, 58-114.

Vanderkooy, JD., Kennedy, SH., Bagby, RM. (2002). Antidepressant side effects in depression patients treated in a naturalistic setting: a study of bupropion, moclobemide, paroxetine, sertraline, and venlafaxine. Canadian Journal of Psychiatry, Revue Canadienne de Psychiatrie, 47, 174-180.

Watson, D. y Clark, LA. (1994). The PANAS-X Manual for the Positive and Negative Affect Schedule - Expanded Form, Unsure, 277, 1-27.

Claims (17)

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   REIVINDICACIONES

   1. Composition pulverulenta comprendida por un extracto de estigmas de azafran caracterizada por HPLC por una composicion que comprende:

   a) Entre un 0,03% y un 1% en peso seco de safranal.

   b) Al menos 3,48 % en peso seco de crocinas mayoritarias que engloba los distintos isomeros de trans-crocin-4 (isomero principal), trans-crocin-3, trans-crocin-2’, c/s-crocin-4, trans-crocin-2, trans-crocin-1 y/o cualquiera de sus mezclas.
2. 2. Composicion segun la revindication anterior que comprende:

   a) Entre un 0,03% y un 0,50% en peso seco de safranal.

   b) Entre un 3,48% y un 8,00% en peso seco de crocinas.
3. 3. Composicion segun cualquiera de las reivindicaciones anteriores que comprende:

   a) Entre un 0,03% y un 0,50% en peso seco de safranal.

   b) Entre un 3,48 % y un 7,00% en peso seco de crocinas.
4. 4. Composicion segun cualquiera de las reivindicaciones anteriores que comprende:

   a) Entre un 0,03% y un 0,35% en peso seco de safranal.

   b) Entre un 3,48% y un 6,00% en peso seco de Crocinas.
5. 5. Composicion segun cualquiera de las reivindicaciones anteriores caracterizada por que las crocinas mayoritarias comprenden trans-crocin-4, trans-crocin-3, trans-crocin-2’, c/s- crocin-4, trans-crocin-2 y trans-crocin-1 y/o cualquiera de sus mezclas.
6. 6. Composicion segun cualquiera de las reivindicaciones anteriores caracterizado por que ademas la composicion comprende picrocrocina cuya composicion en el extracto de la presente invention analizado por HPLC comprende al menos 2,5% expresado en g de p- nitroanilina por 100g de extracto en base seca.
7. 7. Composicion segun cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde ademas comprende polifenoles en al menos un 1,0% expresado en g de acido galico por 100 g de extracto seco mediante el metodo de Folin Ciocalteu.

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8. 8. Composition segun cualquiera de las reivindicaciones anteriores caracterizado por tener un tamano de particula inferior a 240 ^m.
9. 9. Composicion segun cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado por que ademas comprende al menos un excipiente farmaceuticamente aceptable.
10. 10. Uso de la composicion segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 para preparar un medicamento.
11. 11. Uso de la composicion segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 para preparar un medicamento para la prevention de trastornos del estado de animo relacionados con la depresion.
12. 12. Uso de la composicion segun la revindication 10 o 11, donde la composicion se administra oralmente.
13. 13. Uso de la composicion segun cualquiera de las reivindicaciones 10 a 12, donde la composicion se administra en una dosis superior a 15 mg/dia.
14. 14. Uso de la composicion segun cualquiera de las reivindicaciones 10 a 13, donde la composicion se administra en una dosis diaria entre 20 y 40 mg/dia.
15. 15. Uso de la composicion segun cualquiera de las reivindicaciones 10 a 14, donde la composicion se administra como comprimido, capsula, polvo, granulo o solution.
16. 16. Uso de la composicion segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 como complemento alimenticio.
17. 17. Alimento funcional que comprende la composicion segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8.