CN104911169A

CN104911169A - 一种培制蛹虫草菌丝体和纤溶酶的方法

Info

Publication number: CN104911169A
Application number: CN201510159992.7A
Authority: CN
Inventors: 刘晓兰; 郑喜群; 邓永平; 王玉
Original assignee: Qiqihar University
Current assignee: Qiqihar University
Priority date: 2015-04-07
Filing date: 2015-04-07
Publication date: 2015-09-16
Anticipated expiration: 2035-04-07
Also published as: CN104911169B

Abstract

本发明公开了一种同时生产蛹虫草菌丝体和纤溶酶的培制方法，使用的菌种蛹虫草菌株C.LSG-1，已由申请人于2008年7月4日向中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心提供了菌种保藏，保藏号为CGMCC No.2577，其分类学命名为蛹虫草Cordyceps militaris。所述培制方法的具体步骤包括菌种活化、种子培养液制备、固体发酵，固体发酵基质中富含蛹虫草菌丝体和纤溶酶，其中纤溶酶活力达到927.77U/g。该方法使用大米和麸皮为培养基质培养蛹虫草菌同时生产蛹虫草菌丝体和纤溶酶，菌种及生产原料均安全可靠，原料价廉易得，生产周期较传统栽培技术生产周期缩短了5/6，操作简便，易于实现。本发明为防治血栓栓塞症的保健食品的研发提供了新的思路和研究基础，为蛹虫草菌丝体的生产提供了一种新的途径。

Description

一种培制蛹虫草菌丝体和纤溶酶的方法

技术领域

本发明涉及共同培制一种蛹虫草菌丝体和纤溶酶的方法，属于食品科学技术领域。

背景技术

生物溶栓法目前是治疗和预防血栓性疾病的主要手段，研制高效、快速、防止再栓塞并能降低出血等不良反应的新型溶栓药物是现代医学的迫切需要。蛹虫草是一种珍贵的中药和高级滋补品，能够提高免疫功能，具有护肝清肺、止咳化痰、抗疲劳、抗缺氧、抗病毒等功效。近十余年的时间里，本申请人一直在探讨蛹虫草在现代生物溶栓剂制备中的应用潜力，并于 2008年成功地筛选到了一株具有优良溶栓性能的蛹虫草菌株C.LSG-1，该菌株已由本申请人于2008年7月4日向中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心提供了菌种保藏，保藏号为CGMCC N _O .2577，其分类学命名为Cordyceps militaris。利用该菌株本申请人培制出了两种具有良好溶栓性能的纤溶酶，并于2008年11月12日和2010年6月4日向国家知识产权局提交了申请号为200810137564.4和201010204473.5的发明专利申请。以上两项发明均是采用液体发酵的方式制备纤溶酶一种产物，且经过色谱技术对纤溶酶进行了分离纯化，生产成本相对较高，发明人期望将其用于新型溶栓药物开发。蛹虫草的生理功效是众所周知的，野生虫草资源匮乏，虽然已经实现人工栽培，但是生产周期长，菌种子实体的形成对生长环境要求较高，占地广，导致成本高，产值低。本申请人多年来一直渴望获得一种成本低廉、安全易得、可同时生产蛹虫草菌丝体和溶栓酶且无需提取纤溶酶的方法，将其用于保健食品的研发，本发明内容就是基于这个目的进行的研究。

发明内容

本发明的发明目的在于提供一种固体发酵同时生产蛹虫草菌丝体和纤溶酶的方法。采用本发明既可得到较高纤溶活性的纤溶酶又可得到蛹虫草菌丝体，且生产方法具有操作简单，成本低，生产周期短和易于实现的优点。本发明为防治血栓栓塞症的保健食品的研发提供了新的思路和研究基础，为蛹虫草菌丝体的生产提供了一种新的途径。

为了实现以上目的，本发明所采用的技术方案是提供一种同时生产蛹虫草菌丝体和纤溶酶的方法，所述蛹虫草为蛹虫草(Cordyceps militaris)C.LSG-1，已由申请人于2008年7月4日向中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心提供了菌种保藏，保藏号为CGMCC N _O .2577，其分类学命名为蛹虫草Cordyceps militaris。

本发明使用大米和麸皮为培养基固体培养蛹虫草菌株C.LSG-1，能够同时生产蛹虫草菌丝体和具有纤溶活力的纤溶酶。本发明中固体培养物含纤溶酶活性可达927.77U/g。

本发明是以保藏号为CGMCC NO.2577，其分类学命名为Cordyceps militaris的蛹虫草菌株C.LSG-1为菌种，依次经过斜面培养基活化、平板培养、液体种子培养、固体发酵培养，最后培制出本发明的产品。包括以下具体步骤：

1、斜面培养

将保存的蛹虫草菌株C.LSG-1接入斜面培养基，斜面培养基组成包括20%马铃薯汁、2.5%琼脂、1%葡萄糖、0.5%蛋白胨、0.1%磷酸二氢钾、0.05%硫酸镁、pH自然，在23℃培养15~20d获得斜面培养物。

、平板培养

将斜面培养基培养的蛹虫草菌株C.LSG-1接入平板培养基，平板培养基组成包括20%马铃薯汁、2.5%琼脂、1%葡萄糖、0.5%蛋白胨、0.1%磷酸二氢钾、0.05%硫酸镁、pH自然，在23℃培养15~20d获得平板培养物。

、液体种子培养

液体种子培养基组分包括20%马铃薯汁、1～2%葡萄糖、0.5%蛋白胨、0.1%磷酸二氢钾、0.05%硫酸镁、pH自然。

挑选菌丝洁白、生长健壮、浓密、无污染的蛹虫草平板培养物作为菌种。在无菌条件下，用打孔器在平板上打直接约为10mm的菌片，将菌片接入到液体种子培养基中，在23℃，180r/min回旋式恒温调速摇瓶柜中培养4d。

、发酵培养基

固体发酵培养基组分包含大米和麸皮，比例为1:1，培养基加水量70-80%(v/w)，初始pH自然；接种蛹虫草液体种子量为培养基干重的25%（v/w），23℃培养5d。

本发明的优点：本发明所用菌株是经过严格筛选得到的高产纤溶酶蛹虫草C.LSG-1菌种，生长条件比较粗放，产酶周期短，在产酶同时能收获大量蛹虫草菌丝体，是一株生产性能优良的菌种。采用本发明既可得到较高纤溶活性的纤溶酶又可得到蛹虫草菌丝体，且生产方法具有操作简单、成本低、生产周期较传统蛹虫草固体培养基栽培周期短5/6、无环境污染、便于规模化生产等优点。由于本发明产品是以来源广泛的大米和麸皮为主要培养基，不仅原料成本低廉，而且也为这些原有资源的开发利用提供了新的途径。本发明为防治血栓栓塞症的保健食品的研发提供了新的思路和研究基础，为蛹虫草菌丝体的生产提供了一种新的途径。

附图说明

图1为利用血纤维蛋白蛋白平板法证实本发明产品纤溶酶溶纤作用的图片

图中a、b、c为纤溶酶在血纤维蛋白平板上由于溶解了血纤维蛋白而形成的透明圈，d为生理盐水样品，由于生理盐水不能溶解血纤维蛋白所以不能形成的透明圈。

本发明所使用的蛹虫草菌株C.LSG-1已由本申请人于2008年7月4日向中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心提供了菌种保藏，保藏号为CGMCC N _O .2577，其分类学命名为Cordyceps militaris，保藏单位地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。

具体实施例

以下结合实施例对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。

实施例1：

1、菌种：蛹虫草菌株C.LSG-1，保藏号为CGMCC N _O .2577。

　2、培养基及培养条件：

（1）斜面培养基：20%马铃薯汁，2.5%琼脂，1%葡萄糖，0.5%蛋白胨，0.1%磷酸二氢钾，0.05%硫酸镁，pH自然。

培养条件：23℃恒温培养15~20d。

（2）平板培养基：20%马铃薯汁，2.5%琼脂，1%葡萄糖，0.5%蛋白胨，0.1%磷酸二氢钾，0.05%硫酸镁，pH自然。

培养条件：23℃恒温培养15~20d。

（3）液体种子培养基：20%马铃薯汁，1%葡萄糖，0.5%蛋白胨，pH自然。

培养条件：23℃，150r/min培养3d。

（4）固体发酵培养基：由大米和麸皮组成，比例为3:5，培养基加水量70-80%(v/w)，培养基初始pH自然；接种蛹虫草液体种子量为培养基干重的10%（v/w）。

培养条件：23℃恒温恒湿培养时间4d。

实施例2

1、菌种：同实施例1。

、培养基及培养条件：

（1）斜面培养同实施例1。

（2）平板培养同实施例1。

（3）液体种子培养基：20%马铃薯汁，1～2%葡萄糖，0.5%蛋白胨，0.1%磷酸二氢钾，0.05%硫酸镁，pH自然。

培养条件：23℃，150r/min培养3d。

培养条件：23℃恒温恒湿培养时间4d。

实施例3

1、菌种：同实施例1。

、培养基及培养条件：

（1）斜面培养同实施例1。

（2）平板培养同实施例1。

（3）液体种子培养基：20%马铃薯汁，2%葡萄糖，0.5%蛋白胨，0.1%磷酸二氢钾，0.05%硫酸镁，pH自然，接菌量为直径10mm的菌苔圆片一片。

培养条件：23℃，180r/min培养4d。

培养条件：23℃恒温恒湿培养时间4d。

实施例4

1、菌种：同实施例1。

、培养基及培养条件：

（1）斜面培养同实施例1。

（2）平板培养同实施例1。

（3）液体种子培养同实施例3。

（4）固体发酵培养基：由大米和麸皮组成，比例为1:1，培养基加水量70-80%(v/w)，培养基初始pH自然；接种蛹虫草液体种子量为培养基干重的10%（v/w）。

培养条件：23℃恒温恒湿培养时间4d。

实施例5

1、菌种：同实施例1。

、培养基及培养条件：

（1）斜面培养同实施例1。

（2）平板培养同实施例1。

（3）液体种子培养同实施例3。

（4）固体发酵培养基：由大米和麸皮组成，比例为1:1，培养基加水量70-80%(v/w)，培养基初始pH自然；接种蛹虫草液体种子量为培养基的25%（v/w）。

培养条件：23℃恒温恒湿培养时间5d。

实施例6

1、菌种：同实施例1。

、培养基及培养条件：

（1）斜面培养同实施例1。

（2）平板培养同实施例1。

（3）液体种子培养同实施例3。

（4）固体发酵培养同实施例5。

（5）蛹虫草纤溶酶纤溶活性证明：

　 采用血纤维蛋白平板法检验此酶对血纤维蛋白的溶解性。

血纤维蛋白平板含有血纤维蛋白原（市售的血纤维蛋白原中可能含有纤维蛋白）和凝血酶，可溶性纤维蛋白原在凝血酶作用形成纤维蛋白单体，血纤维蛋白单体自发缔结，多聚化形成可见的血纤维蛋白凝胶，将纤溶酶液加到此平板凝胶表面，经过短时间培养后该酶即将血纤维蛋白溶解，在平板凝胶表面形成肉眼可见的透明圈。

纤维蛋白平板的配制：以配制10个平板为例，将0.25 g琼脂糖溶于50 mL生理盐水中，置于45 oC水浴保温25 min后，再加入200 U的凝血酶混匀；0.2 g牛血纤维蛋白原溶于巴比妥钠缓冲液 (pH 7.8)，置于45 oC水浴中保温5min。分别取5 mL纤维蛋白原溶液和5 mL凝血酶溶液混合倒入平板 (直径为9 cm)中，待凝固后放入4℃保存备用。

纤溶酶酶活标准曲线制备：用尿激酶作为标准品，将50000U/支的尿激酶用生理盐水分别稀释成30、25、20、15、10、5、1U/mL备用。取10 μL不同浓度的尿激酶标准品点在制备好的血纤维蛋白平板。每个浓度做3个平行，盖上后于37 oC培养箱中保温6h，量溶圈直径取平均值。以溶圈直径为x（cm），酶活性为y（U/mL）所得回归方程为，R2=0.978。

纤溶酶粗酶液的制备：用100mL生理盐水浸泡培养结束后的发酵产物，室温浸提纤溶酶4h。在4℃、4500r/min条件下离心15min，收集上清液，即为粗酶液。

发酵液酶活测定：用微量移液器取粗酶液10μL点接于血纤维蛋白平板表面，重复点样三次，37℃保温6h后测定平板表面形成的透明溶圈直径，以生理盐水做对照，将直径平均值带入上述公式即可求得酶的活力。

Claims

1.一种固体培养蛹虫草菌同时生产蛹虫草菌丝体和纤溶酶的方法，其特征在于，所述蛹虫草为蛹虫草C.LSG-1，分类学命名为蛹虫草Cordyceps militaris，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号：CGMCC N_O.2577，保藏日期：2008年7月4日。

2.使用如权利要求1所述蛹虫草菌固体发酵联产蛹虫草菌丝体和纤溶酶的方法，其特征在于，是以微生物蛹虫草菌株C.LSG-1为菌种，依次经斜面培养基活化、平板培养、液体种子制备、固体发酵同时生产蛹虫草菌丝体和纤溶酶。

3.一种如权利要求2所述的蛹虫草菌斜面培养基活化方法，其特征在于，培养基组成包括20%马铃薯汁、2.5%琼脂、1%葡萄糖、0.5%蛋白胨、0.1%磷酸二氢钾、0.05%硫酸镁、pH自然，培养基灭菌、冷却后接种蛹虫草菌株C.LSG-1，在23℃培养15~20d。

4.一种如权利要求2所述的蛹虫草菌平板培养方法，其特征在于，培养基组成包括20%马铃薯汁、2.5%琼脂、1%葡萄糖、0.5%蛋白胨、0.1%磷酸二氢钾、0.05%硫酸镁、pH自然，培养基灭菌、冷却后接种斜面培养的蛹虫草菌株C.LSG-1，在23℃培养15~20d。

5.一种如权利要求2所述的蛹虫草菌种子液制备方法，其特征在于，种子培养基包括20%马铃薯汁、2%葡萄糖、0.5%蛋白胨、0.1%磷酸二氢钾、0.05%硫酸镁、pH自然，培养基灭菌、冷却后接入直径约为10mm的平板培养的菌苔圆片一片，在23℃，170-180r/min条件下培养4d。

6.一种如权利要求2所述的蛹虫草菌固体发酵同时生产蛹虫草菌丝体和纤溶酶的方法，其特征在于，固体发酵培养基由大米和麸皮组成，比例为1:1，培养基加水量70-80%(v/w)，培养基初始pH自然；接种蛹虫草液体种子量为培养基干重的25%（v/w），23℃培养5d。