CN112921004B - 用于cd3受体激动剂检测的细胞株及其构建方法及cd3受体激动剂检测方法 - Google Patents

用于cd3受体激动剂检测的细胞株及其构建方法及cd3受体激动剂检测方法 Download PDF

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Abstract

本申请涉及生物试剂检测领域，更具体地说，它涉及用于CD3受体激动剂检测的细胞株及其构建方法及CD3受体激动剂检测方法。其中用于CD3受体激动剂检测的细胞株，该细胞株为天然含有TCR‑CD3复合物的永生化T淋巴细胞系，其细胞内包含NFAT报告基因，该NFAT报告基因包含与NFAT结合的结合序列，结合序列连接下游的启动子，该启动子连接一个开放阅读框，该开放阅读框表达一个报告基因蛋白。通过对天然含有TCR‑CD3复合物的永生化T淋巴细胞系引入NFAT报告基因，可以有效实现对CD3受体激动剂的检测，其灵敏度较高，且不依赖于PBMC细胞，具有较好的运用前景。

Description

用于CD3受体激动剂检测的细胞株及其构建方法及CD3受体激 动剂检测方法
技术领域
本申请涉及生物试剂检测领域，更具体地说，它涉及用于CD3受体激动剂检测的细胞株及其构建方法及CD3受体激动剂。
背景技术
T淋巴细胞表面的TCR-CD3复合物在获得性免疫响应过程中起到了关键的作用。当抗原呈递细胞激活T细胞表面的CD3受体（TCR）时，TCR通过CD3抗原将激活细胞传递到T细胞内部，从而可以产生免疫反应。
靶向CD3的激动剂药物可以有效激活人体的T细胞，起到杀灭肿瘤的效果，具有广阔的运用前景。目前，已经有大量靶向CD3的激活剂药物进入临床研发阶段，其中部分也已经批准上市，因此，CD3受体激动剂的顶梁测定方法及CD3受体激动剂的中和抗体测定方法有巨大的市场需求。
现有用于CD3受体激动剂的活性测定方法和CD3受体激动剂的中和抗体测定方法依赖于人的外周血单个核细胞（PBMC）作为关键试剂，通过CD3受体激动剂刺激PBMC，使之对肿瘤细胞产生杀伤，并通过测定肿瘤细胞的存活率以表征CD3受体激动剂的相关活性参数，或通过CD3受体激动剂刺激PBMC，通过酶联免疫吸附剂测定（ELISA）测定PBMC的IFN-γ、IL2等细胞因子的分泌量，以确定CD3受体激动剂的相关活性参数。
但是在上述现有技术需要依赖于PBMC细胞，而PBMC细胞的来源受限，且不同批次免疫学特性差异较大，无法满足药物研发需求。
另一种方法是通过受体结合实验（LBA）进行生物分析，但是由于CD3激动剂，尤其是部分CD3靶向的双特异抗体，与CD3抗原的亲和力在10～100nM，亲和力较弱，因此其检测的灵敏度较低。但在实际使用中，CD3激动剂的给药量通常较低，对灵敏度的要求较高，因此LBA实验的灵敏度通常难以满足实际要求。
发明内容
为了提供一种具有较高灵敏度且不依赖于PBMC细胞的CD3受体激动剂检测方法，本申请提供用于CD3受体激动剂检测的细胞株及其构建方法及CD3受体激动剂和中和抗体检测方法。
第一方面，本申请提供的用于CD3受体激动剂检测的细胞株采用如下的技术方案：
用于CD3受体激动剂检测的细胞株，该细胞株为天然含有TCR-CD3复合物的永生化T淋巴细胞系，其细胞内包含NFAT报告基因，该NFAT报告基因包含与NFAT结合的结合序列，结合序列连接下游的启动子，该启动子连接一个开放阅读框，该开放阅读框表达一个报告基因蛋白。
在上述技术方案中，选用天然含有TCR-CD3复合物的永生化T淋巴细胞系，TCR-CD3结构可以在CD3受体激动剂的刺激下产生特异性的信号，并通过细胞内的NFAT报告基因形成信号通路。在NFAT报告基因内，通过NFAT接受刺激信号后，将刺激信号传递至启动子，启动子控制开放阅读框对报告基因蛋白进行表达，通过测定报告基因蛋白的含量，即可作为CD3受体激动剂的含量和活性的测定标准。
在上述过程中，首先，避免使用了PBMC，永生化的T淋巴细胞系具有较为广泛的来源，且经过永生化后可以进行大量的传代，在传代过程中也具有较好的稳定性，大幅节约了成本。其次，通过对报告基因蛋白进行定量测定以表征CD3受体激动剂的活性，更加直观且定量，相比于LBA法具有更好的精度，且不依赖于外源细胞的活性，同批次之间稳定性更好。
对于上述用于CD3受体激动剂检测的细胞株，可以运用于CD3受体激动剂的生物活性检测和浓度检测，同时也可以用于CD3受体激动剂和拮抗剂的中和抗体检测，具有广阔的运用前景。
优选的，所述天然含有TCR-CD3复合物的永生化T淋巴细胞系的母细胞为Jurkat细胞。
Jurkat细胞是一种天然含有TCR-CD3复合物的永生化T淋巴细胞，其与人体正常的T细胞活动方式相近。以该Jurkat细胞作为母细胞进行扩增，得到的细胞之间性质更加稳定，且来源较为广泛，其性质较为稳定，测定过程中的波动性较小。
优选的，所述开放阅读框为荧光素酶表达基因。
通过启动子刺激荧光素酶表达基因表达荧光素酶，荧光素酶在试剂盒中具有较强的荧光反应，通过荧光测定可以较为精确地测定荧光素酶的含量，测定过程较为简单，且精确度较好，检出限较低，在很低的浓度下即可产生较强的荧光现象，使得该细胞在运用于CD3受体激动剂的测定时具有较好的灵敏度。
优选的，该细胞株为保藏号为CCTCC NO：C2020264，保藏机构为中国典型培养物保藏中心。
第二方面，本申请提供上述用于CD3受体激动剂检测的细胞株的构建方法，采用如下技术方案：
上述用于CD3受体激动剂检测的细胞株的构建方法，包括如下步骤：
A1、向永生化T淋巴细胞系中转染含有NFAT结合的结合序列、启动子和开放阅读框的NFAT报告基因，得到转染后的细胞株；
A2、对步骤A1转染后的细胞株进行转染效率评估和功能评价，并筛选其中信噪比较优的细胞株；
A3、取步骤A2中筛选得到的信噪比较优的细胞株，再次对其进行转染，并进行筛选，得到二次构建后的细胞株；
A4、对步骤A3中得到的二次构建后的细胞株进行TCR-CD3丰度测定和功能评价，筛选其中TCR-CD3较高的细胞株，即得到用于CD3受体激动剂检测的细胞株。
在上述技术方案中，通过转染-筛选-二次构建-二次筛选的步骤，一方面选取其中转染较为充分的细胞株，其可以具有更好的灵敏度和更高的信噪比，另一方面，在经过一次筛选后，可以筛除其中部分本身对转染载体有一定抗性的细胞，挑选其中易于转染的细胞株，并筛除其他细胞，减少了细胞培育和细胞系的构建过程中的工序。
同时，在经过两次筛选的过程中，可以得到高峰度表达TCR-CD3的NFAT报告基因Jurkat细胞株，后续可以通过单克隆的方式对细胞进行扩增，进而使得到的细胞具有更好的均一性和稳定性，在测定过程中不易产生较大的数值波动。
优选的，在步骤A2中，选取信噪比大于5且对于的CD3激动剂有较好剂量曲线的细胞株。
良好的剂量曲线一般为S型曲线，具有明显的上平台、下平台，且具有较好的线性部分，剂量曲线良好的细胞株在绘制标准曲线时具有较好的线性，可以更加精准地对待测样本CD3受体激动剂的浓度进行判定，提高该细胞株在运用于CD3受体激动剂检测时的灵敏度。信噪比大于5的细胞株具有较好的灵敏度，其测定范围更加贴合CD3受体激动剂的实际使用浓度，具有更好的运用前景。
优选的，在步骤A1和步骤A3中，均通过慢病毒转染的方式向待转染的细胞株中转染含有NFAT结合的结合序列、启动子和开放阅读框的NFAT报告基因。
通过慢病毒转染，其转染能力更强，可以更加充分地对细胞株进行转染，进一步提高得到的细胞株在CD3受体激动剂刺激下产生的信号，提高得到的细胞株在测定CD3受体激动剂时的灵敏度。
优选的，在步骤A2中，在测定细胞株的信噪比时，通过将待测的细胞株进行培养后，以PMA和Ionomycin作为刺激剂对上述细胞株进行测定，并检测其报告基因蛋白的表达情况。
PMA和Ionomycin可以在细胞内对NFAT进行激发，并进一步诱导开放阅读框表达报告基因蛋白。上述过程可以减少外源性的影响，从而可以直接确定细胞株中的转染情况，以明确需要转染的NFAT报告基因序列是否确实被转染到了细胞内，可以更加直观地对细胞进行筛选。
第三方面，本申请提供了CD3受体激动剂的检测方法，采用如下技术方案：
CD3受体激动剂检测方法，包括生物学活性检测方法，具体步骤如下：
B1-1、将上述用于CD3受体激动剂检测的细胞株的单克隆与用于刺激该单克隆的刺激细胞的单克隆共同培养，将CD3受体激动剂进行梯度稀释，并分别加入上述共同培养的体系中，得到若干含有梯度浓度的CD3受体激动剂的生物活性检测体系；
B1-2、将上述含有梯度浓度的CD3受体激动剂的生物活性检测体系进行培养，至免疫反应充分发生后，测定报告基因蛋白的生成量，并依照报告基因蛋白的生成量与CD3受体激动剂的浓度形成剂量曲线。
在上述技术方案中，通过设置梯度浓度，可以形成任意一个细胞株对于各种CD3受体激动剂的剂量曲线，由于上述用于CD3受体激动剂检测的细胞株具有较好的选择性，因此其不易受到其他外源物质的干扰，可以得出精确的结果。通过剂量曲线可以得到EC50值和信噪比，可以较好地评判待测CD3受体激动剂的生物学活性，对不同种的CD3受体激动剂也可以通过EC50值进行比较对比，因此具有较好的适用性。
优选的，包括浓度检测方法，包括如下步骤：
B2-1、将上述用于CD3受体激动剂检测的细胞株的单克隆与用于刺激该单克隆的刺激细胞的单克隆共同培养，依照步骤B1-2中得到的剂量曲线，选取其中线性较好的部分，并依照该部分的浓度对CD3受体激动剂进行梯度稀释，分别加入上述共同培养的体系中，得到若干含有梯度浓度的CD3受体激动剂的浓度检测体系；
B2-2、将上述含有梯度浓度的CD3受体激动剂的浓度检测体系进行培养，至免疫反应充分发生后，测定报告基因蛋白的生成量，并依照报告基因蛋白的生成量与CD3受体激动剂的浓度形成标准曲线；
B2-3、对任意待测样品，将其加入到与步骤B1-1中相同的用于CD3受体激动剂检测的细胞株的单克隆与刺激细胞的单克隆的共同培养体系中，并以B1-2中相同的条件进行培养，并测定其报告基因蛋白的生成量，对照标准曲线，判定待测样本中的CD3受体激动剂的含量。
由于本申请中所采用的用于CD3受体激动剂检测的细胞株具有较好的稳定性和灵敏度，且具有较好的剂量曲线，因此通过设置CD3受体激动剂的梯度浓度，并绘制标准曲线后，通过比对待测样本与标准曲线的实际值，可以真实地反应CD3受体受激的情况，进而更加准确地衡量同种CD3受体激动剂的浓度差异和不同种CD3受体激动剂之间的活性差异。且由于在上述实验中，所用的全部细胞均取自同一细胞株，且细胞株的母细胞为永生化的细胞，因此其稳定性较好，不同批次之间也具有较好的同一性，在使用中可以得到更加精准的结果。且永生化的T淋巴细胞作为上述细胞株的母细胞，来源更加广泛，有助于节约CD3受体激动剂的研发成本。
综上所述，本申请具有以下有益效果：
1.在本申请中，提供了一种用于CD3受体激动剂检测的细胞株，通过在天然含有TCR-CD3复合物的永生化T淋巴细胞系中引入含有NFAT结合的结合序列、启动子和开放阅读框的NFAT报告基因序列，可以实现对CD3受体激动剂的检测，具有较好的稳定性和较高的灵敏度，同时也避免使用了PBMC细胞，降低了研发成本的同时，也减少了因细胞批次间差异造成的检测结果波动，提高检测结果的稳定性。
2.在本申请中，提供了上述用于CD3受体激动剂检测的细胞株，通过转染-筛选-二次构建-二次筛选的方式进行，筛选得到具有较好剂量反应曲线和较高灵敏度的细胞株，使该细胞株具有较高的灵敏度和较好的稳定性。
附图说明
图1为本申请实施例1步骤A2中测定得到的细胞株转染效率评估结果。
图2为本申请实施例1步骤A2中测定得到的细胞株功能评价结果。
图3为本申请实施例2步骤A4中二次构建的细胞株的功能评价结果。
图4为本申请实施例2步骤A4中二次构建的细胞株的CD3受体丰度测定结果。
图5是本申请实施例1和实施例2中部分单克隆细胞株对OKT3的剂量曲线。
图6是本申请实施例3中J3-5细胞测定得到的OKT3抗体,Foralumab抗体和Anti-CD3CD19双抗的剂量曲线。
图7是本申请实施例3中DB1-8测定得到的Anti-CD3CD19双抗的标准曲线。
具体实施方式
以下结合附图1～7和实施例对本申请作进一步详细说明。
对以下实施例中，部分物料的来源如表1所示。
表1、物料来源表
物料 来源
NFAT报告基因慢病毒 金唯智定制
Jurkat细胞 ATCC，TIB-152
Ionomycin Cayman 11932
PMA sigma P1-585
Bright-GlotmLuciferase Assay试剂 Promega E2620
Raji细胞 ATCC, CCL-86
OKT3 Thermo Fisher，14-0037-82
PE anti-human CD3 (UCHT1) Biolegend，300408
实施例1
用于CD3受体激动剂检测的细胞株，以天然含有TCR-CD3复合物的永生化T淋巴细胞系为母细胞通过慢病毒转染获得，在本实施例中，选用Jurkat细胞。
该细胞株内含有NFAT报告基因，该NFAT报告基因包含NFAT结合序列，结合序列连接下游的启动子，该启动子连接一个开放阅读框，该开放阅读框表达一个报告基因蛋白。在本实施例中，开放阅读框为荧光素酶表达基因，其表达的报告基因蛋白为荧光素酶，NFAT结合序列连接下游的启动子的序列为SEQ ID NO.: 1，其具体序列为：
GGAGGAAAAACTGTTTCATACAGAAGGCGTGGAGGAAAAACTGTTTCATACAGAAGGCGTGGAGGAAAAACTGTTTCATACAGAAGGCGTAGATCTAGACTCTAGAGGGTATATAATGGAAGCTCGAATTCCAG。
上述用于CD3受体激动剂检测的细胞株通过如下步骤进行培育：
A1、通过慢病毒转染向上述天然含有TCR-CD3复合物的永生化T淋巴细胞系中转染上述NFAT报告基因序列。
步骤A1的具体操作方式如下：将含有上述核苷酸序列的慢病毒以50的感染复数，在24孔板中感染3E4个/孔的Jurkat细胞，总体积为400ul；第二天进行细胞离心换液，去除慢病毒；继续培养至第四天转入T25细胞培养瓶中并且加入含有0.5μg/ml puromycin 的1640培养基中进行加压培养。维持0.5μg/ml puromycin1640培养基生长传代加压后，第10天将细胞以1个/孔铺在96孔板中；第23天将96孔板中观察到的单克隆转移到24孔板，经评价筛选后，依次转移到6孔板，T25细胞培养瓶、T75细胞培养瓶、T175细胞培养瓶培养得到单克隆，得到若干细胞株，依次编号为J1-1、J1-2、j2-2、J2-3、J2-4、J2-5、J3-1、J3-4、J3-5、J3-6、J4-1、J4-2、J4-3、J4-4、J4-5、J4-6、J5-1、J5-3、J5-4、J5-5、J5-6、J6-1、J6-3、J6-4、J6-5、J6-6、J7-1、J7-2、J7-3、J7-4、J7-6、J8-1、J8-2、J8-3、J8-4、J8-5。
A2、对步骤A1中得到的细胞株进行转染效率评估和功能评价，选取信噪比较优细胞株。
转染效率评估具体操作如下：步骤A1中得到的转染后的细胞株经0.5μg/mlpuromycin 的1640培养基加压培养一段时间后，取80uL的细胞悬液到白色不底透的96孔板每孔中，细胞的加入量为10000cell/孔，再在每个孔中加入20ul培养基或者20ul工作浓度为300nM的PMA与10uM的Ionomycin，其中，加入培养基的孔作为对照组，混合均匀后，放入37℃5% CO2的培养箱培养孵育5小时。培养完成后，加入100ulBright-Glo™ LuciferaseAssay试剂，室温1000rpm混匀5分钟，放入化学发光检测仪检测，检测结果如图1所示。筛选其中信噪比大于5的细胞株，筛选后保留的细胞株编号为J1-1，J3-5，J4-6。
功能评价具体操作如下：对细胞株J1-1、J3-5和J4-6，以40ul/孔种入白色不底透的96孔板，并将Raji细胞1E5个/每孔，40ul/孔种入白色不底透的96孔板；Raji细胞1E5个/每孔，40ul/孔种入白色不底透的96孔板含Jurkat细胞的孔中；将CD3激动剂OKT3配制成10000ng/ml的培养基溶液，再进行3倍梯度稀释7个点后20ul/孔加入细胞悬液中，混合均匀后，放入37℃5% CO2的培养箱培养孵育5小时。加入100ul Bright-Glo™ LuciferaseAssay试剂，室温1000rpm混匀5分钟，放入化学发光检测仪检测，其结果如图2所示。上述三个单克隆细胞株在CD3激动剂OKT3的刺激下，均有明显的剂量-信号响应曲线。
实施例2
用于CD3受体激动剂检测的细胞株，通过实施例1中得到的J1-1、J3-5和J4-6，经下列步骤进一步处理得到。
A3、对细胞株J1-1、J3-5和J4-6进行二次构建，得到二次构建后的细胞株。
二次构建的具体操作如下：将上述信号较优的细胞株作为母细胞，通过感染复数为50的NFAT报告基因慢病毒和4μg/ml Polybrene在24孔板中感染3E4个/孔的J3-5细胞，总体积为400ul；培养至第四天进行细胞离心换液，去除慢病毒；培养至第六天将细胞以1个/孔铺在96孔板中；第20天将96孔板中观察到的单克隆转移到24孔板，经评价筛选后，依次转移到6孔板，T25培养瓶，T75培养瓶,T175培养瓶中培养得到单克隆，作为二次构建后的细胞株，编号为DA1-1、DA1-3、DA1-4、DA1-6、DA1-8、DA1-10、DA1-14、DA1-15、DA1-16、DA1-18、DA1-20、DA2-1、DA2-2、DA2-3、DA2-10、DA2-13、DA2-15、DA2-20、DA2-21、DA2-22、DA2-23、DB1-1、DB1-2、DB1-3、DB1-4、DB1-5、DB1-6、DB1-8、DB1-10、DB1-11、DB1-13、DB1-14、DB1-15、DB1-16、DB2-1、DB2-2、DB2-3、DB2-4、DB2-5、DB2-6、DB2-7、DB2-9、DB2-10、DB2-12、DB2-15、DB2-18、DB2-19、DB2-21、DB2-23。
A4、对步骤A3中得到的二次构建后的细胞株进行功能评价和CD3受体丰度测定，筛选其中CD3受体丰度较高的细胞株，即得到用于CD3受体激动剂检测的细胞株。
功能评价具体步骤如下：将步骤A3中得到的二次构建后的细胞株转移至24孔板中，培养至密度较高后，将细胞以1E5个/每孔,40ul/孔种入白色不底透的96孔板，并将Raji细胞以1E5个/每孔，40ul/孔种入上述白色不透明96孔板中，在各孔内分别加入20ul工作浓度为1000ng/ml的CD3激动剂OKT3或者20ul的培养基（对照组），混合均匀后，放入37℃5%CO2的培养箱培养孵育5小时。加入100ul Bright-Glo™ Luciferase Assay试剂，室温1000rpm混匀5分钟，放入化学发光检测仪检测，上述细胞株的测定结果如图3所示，选取OKT3 /培养基信噪比较优的克隆DA1-15，DB1-8，DB1-13，DB1-15，DB2-23，DC1-19，DC1-20，DC2-22，DB2-3，进行进一步扩增培养和评价。
CD3受体丰度测定具体步骤如下：将经过上述步骤筛选得到的单克隆细胞株进一步扩增并配制成100μL、1000000cell/管的细胞悬液，同时以100μL、1000000cell/管的Jurkat母细胞细胞悬液作为对照组，加入5μL浓度为10μg/mL的PE anti-human CD3，在4℃下孵育半小时后用PBS洗第三遍后使用流式细胞仪进行测定，测定结果如图4所示，对各单克隆细胞株得到的信号值具体如表2所示。
表2、CD3受体丰度测定结果表
单克隆细胞株编号 信号值（Mean PE-A）
DA1-15 13860
DB1-8 31031
DB1-13 35987
DB1-15 9262
DB2-23 11097
DC1-19 7204
DC1-20 11021
DC2-22 12259
DB2-3 31207
J3-5 13578
Jurkat母细胞 40485
J3-5（未染色） 229
筛选并保留其中信号值高于30000的细胞株，且通过表2和图4可知，编号为DB1-8，DB1-13，DB2-3的单克隆细胞株所展示的，保留并作为用于CD3受体激动剂检测的细胞株。其中，对编号为DB1-8的细胞进行保藏，保藏号为No：C2020264，保藏单位为中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国武汉，分类命名为NFAT报告基因Jurkat稳转细胞株DB8-1，保藏日期为2020年12月22日。
在实施例1和实施例2中，选用了Jurkat细胞作为初始的母细胞。Jurkat细胞天然含有CD3受体，通过慢病毒转染的方式将含有NFAT结合序列、启动子和开放阅读框的NFAT报告基因转染至Jurkat细胞内，由于慢病毒具有较强的转染能力，可以更加有效地对Jurkat细胞进行转染，使其充分接收上述NFAT报告基因，进而可以对CD3受体激动剂进行响应。
在步骤A2中，通过NFAT报告基因转染丰度评价和转染后的细胞功能评价，选取接收上述NFAT报告基因量较大的Jurkat的细胞，在功能评价中则进一步筛选在接收NFAT报告基因后可以充分表达报告基因蛋白的Jurkat细胞，通过上述过程筛选得到的细胞具有良好的剂量-信号曲线。有较好剂量-信号曲线的细胞株可以在实际测定中更加准确地对待测样本中的CD3受体激动剂的含量进行测定。
在NFAT报告基因转染丰度评价中，采用的是PMA和Ionomycin两种试剂共同刺激，PMA和Ionomycin均可以进入到细胞内，可以在细胞内激活NFAT，因此丰度评价可以直接测定出细胞中转染上述NFAT报告基因序列的程度，进而筛选被充分转染的细胞。而在功能评价中，则是通过Raji辅助刺激，以OKT3作为激动剂，模拟实际情况，在细胞内已经转染了NFAT报告基因序列的情况下，通过外界的刺激，表面带有TRC-CD3的细胞可以对OKT3产生响应，并表达荧光素蛋白酶。在对CD3受体丰度进行检验的过程中，则是通过添加PE anti-human CD3，对细胞表面的CD3受体产生刺激，从而筛选出表面CD3受体较多的细胞株。
针对实施例1和实施例2，选取编号为J3-5，DB1-8，DB1-13，DB2-3的细胞株，进行如下比对实验：
将上述细胞株以1E5个/每孔，40ul/孔种入白色不底透的96孔板，Raji细胞1E5个/每孔，40ul/孔种入白色不底透的96孔板含Jurkat细胞的孔中；将OKT3抗体梯度稀释，OKT3抗体的初始工作浓度为5000ng/ml, 2倍梯度稀释共12个点，20ul/孔加入有稳转细胞株克隆的孔中，混合均匀；96孔板放入37℃ 5% CO2的培养箱培养孵育5小时，加入100ulBright-Glo™ Luciferase Assay试剂，室温1000rpm混匀5分钟，放入化学发光检测仪检测，得到的发光强度-剂量曲线如图5所示。
通过图5中的结果可知，J3-5，DB1-8，DB1-13，DB2-3四个单克隆细胞株在对于OKT3，均有较好的剂量曲线，且对于J3-5，经二次构建后的单克隆细胞株DB1-8，DB1-13，DB2-3的信号强度和信噪比有较为明显的优势。
实施例3
CD3受体激动剂检测方法，包括生物学活性测定方法和浓度测定方法。其中，生物学活性测定方法包括如下步骤：
B1-1、将编号J3-5的单克隆细胞株以1E5个/孔、40μ/L每孔的量植入白色不透底96孔板中，并加入Raji细胞1E5个/每孔，40ul/孔作为刺激该单克隆的刺激细胞，共同培养，培养体系分为三组，将OKT3抗体, Foralumab抗体和Anti-CD3CD19双抗分别进行梯度稀释，并以20ul/孔的加入量分别加入到三组体系中，其中OKT3抗体和Foralumab抗体的初始工作浓度为5000ng/ml, Anti-CD3CD19抗体的初始工作浓度为1500ng/ml，三者均2倍梯度稀释共8个点，加药完成后，得到若干含有梯度浓度CD3受体激动剂的生物学活性检测体系。
B1-2、将上述含有梯度浓度的CD3受体激动剂的生物学活性检测体系放入37℃ 5%CO2的培养箱培养孵育5小时，加入100ul Bright-Glo™ Luciferase Assay试剂，室温1000rpm混匀5分钟，放入化学发光检测仪检测，以加入试剂浓度为横坐标，以发光强度为纵坐标，得到OKT3抗体,Foralumab抗体和Anti-CD3CD19双抗量曲线，如图6所示。
图6显示，编号为J3-5的单克隆细胞株在用于CD3受体激动剂的检测时，对OKT3和Anti-CD3CD19双特异抗体，均具有较好的剂量曲线，且通过剂量曲线可以计算得到，而对于非激动型CD3结合抗体Foralumab无剂量曲线，证明了上述方案能够较好地用于CD3激动剂的活性测定，且能够区分激动刑CD3抗体和非激动型CD3抗体。
浓度检测方法具体包括如下步骤：
B2-1、将保藏号为No：C2020264、保藏中心为中国典型保藏中心的细胞株以1E5个/孔、40μ/L每孔的量植入白色不透底96孔板中，并加入Raji细胞1E5个/每孔，40ul/孔作为刺激该单克隆的刺激细胞，共同培养，将anti-CD3 CD19双特异抗体以1000pg/ml的初始工作浓度2倍梯度稀释8个点，并以20μL/孔的量加入到上述体系中，混合均匀，得到含有梯度浓度CD3受体激动剂的浓度检测体系。
B2-2、将上述含有梯度浓度CD3受体激动剂的细胞培养体系37℃ 5% CO2的培养箱培养培养5小时，直到免疫反应充分发生，随后加入100ul/孔 Bright-Glo™ LuciferaseAssay试剂，室温1000rpm混匀5分钟，将96孔板放入化学发光检测仪检测，检测其发光强度，并以发光强度和OKT3的浓度绘制标准曲线，标准曲线绘制如图7所示。
B2-3、将编号DB1-8的细胞株以1E5个/孔、40μ/L每孔的量植入白色不透底96孔板中，并加入Raji细胞1E5个/每孔，40ul/孔作为刺激该单克隆的刺激细胞，共同培养，将anti-CD3 CD19双特异抗体以1000pg/ml的初始工作浓度2倍梯度稀释8个点，并以20μL/孔的量加入到上述体系中，混合均匀，96孔板放入37℃ 5% CO2的培养箱培养孵育5小时，加入100ul Bright-Glo™ Luciferase Assay试剂，室温1000rpm混匀5分钟，放入化学发光检测仪检测，测定结果与标准曲线进行比对，结果如表3所示。
表3、回测结果与标准曲线比对偏差表
anti-CD3 CD19双特异抗体浓度（pg/ml） RUL信号值 回测结果 偏差%
1000.000 7487 1014.425 1.44
500.000 6351 488.097 -2.38
250.000 5092 254.179 1.67
125.000 3689 123.539 -1.17
62.500 2645 64.315 2.90
31.250 1837 30.887 -1.16
15.625 1343 14.279 -8.50
7.813 1112 7.417 -5.07
其中，偏差=（回测结果- anti-CD3 CD19双特异抗体理论浓度）/ anti-CD3 CD19双特异抗体理论浓度*100%
通过上述数据可知，采用DB1-8单克隆细胞对CD3受体激动剂进行浓度测定，结果准确，偏差较小，且灵敏度极佳，能达到7.813pg/mL，相较于采用PBMC进行细胞学活性检测和采用LBA法进行测定，其灵敏度和精确度优势明显。
另外，采用实施例1和实施例2中得到的细胞株，同样可以进行对CD3受体激动剂或拮抗剂中和抗体进行检测，具有广泛的运用前景。
本具体实施例仅仅是对本申请的解释，其并不是对本申请的限制，本领域技术人员在阅读完本说明书后可以根据需要对本实施例做出没有创造性贡献的修改，但只要在本申请的权利要求范围内都受到专利法的保护。
序列表
<110> 宁波熙宁检测技术有限公司
<120> 用于CD3受体激动剂检测的细胞株及其构建方法及CD3受体激动剂检测方法
<130> WZF006PTA01F1906704
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 134
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 1
ggaggaaaaa ctgtttcata cagaaggcgt ggaggaaaaa ctgtttcata cagaaggcgt 60
ggaggaaaaa ctgtttcata cagaaggcgt agatctagac tctagagggt atataatgga 120
agctcgaatt ccag 134

Claims (1)

1.用于CD3受体激动剂检测的细胞株，其特征在于，该细胞株为天然含有TCR-CD3复合物的永生化T淋巴细胞系，其细胞内包含NFAT报告基因，该NFAT报告基因包含与NFAT结合的结合序列，结合序列连接下游的启动子，该启动子连接一个开放阅读框，该开放阅读框表达一个报告基因蛋白；该细胞株为保藏号为CCTCC NO：C2020264，保藏机构为中国典型培养物保藏中心。
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