CN112888425A - 真菌桦褐孔菌提取物的新型化妆品和皮肤病学用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及真菌桦褐孔菌提取物用于维持和/或增加皮肤组织的内聚力、用于防止眼周区域中出现黑眼圈和/或眼袋和/或减少眼周区域中的黑眼圈和/或眼袋、用于维持和/或增加皮肤肤色的光泽度和/或均匀性和/或用于维持和/或增加皮肤的屏障功能和/或用于增加皮肤微循环的用途。本发明还涉及所述桦褐孔菌提取物或包含所述桦褐孔菌提取物的皮肤病学组合物，其用于减少泛红和/或用于防止和/或减少由皮肤组织的内聚力的减少产生的病状，尤其是瘙痒和/或红血丝。

Description

真菌桦褐孔菌提取物的新型化妆品和皮肤病学用途

本发明涉及桦褐孔菌(Inonotus obliquus)提取物用于维持和/或增加皮肤组织的内聚力的用途并且涉及其在化妆品和皮肤病学领域中的应用。

皮肤微循环除了构成用于向细胞供应营养物的***之外，还是用于排出细胞毒素的***。当细胞、特别是内皮细胞和淋巴细胞具有良好的内聚力时，这种皮肤微循环是最佳的。在压力或疲劳的条件下或当经受有害的环境条件时，这种皮肤微循环被改变。这通过内皮组织和淋巴组织的内聚力的降低、细胞通透性的增加以及毒素的非最佳排出以及因此毒素的积累来反映。在面部皮肤上可见其后果。由此注意到眼周区域的皮肤(在此区域中皮肤是特别薄的)的暗沉肤色和改变。这可以通过眼睛下面出现眼袋和黑眼圈反映。

尤其内皮细胞的内聚力通过IV型胶原蛋白、VE-钙粘蛋白、CD31或PECAM-1(血小板和内皮细胞粘附分子1)(其是内皮细胞和淋巴细胞的细胞连接的另一种构成蛋白质)来确保。

除了这些表现，在更严重的条件下将注意到面部上出现迹象，如泛红、瘙痒、刺激或甚至红血丝。

在化妆品市场上存在具有减少眼周区域中的黑眼圈和眼袋的效果的活性成分，也存在能够改善肤色光泽度的活性成分。然而，化妆品领域一直在寻找尤其具有这些效果的替代性且新型的成分。

出人意料地，本申请人已经发现，桦褐孔菌提取物具有用于减少眼周区域中的黑眼圈和眼袋以及用于增加皮肤肤色的光泽度和均匀性的能力。还已经证明这种提取物能够显著减少泛红以及还有红血丝。

真菌桦褐孔菌是锈革孔菌科的担子菌真菌，以名称chaga或clinker polypore为人所知。在世界上几个地区中，尤其在俄罗斯、加拿大和东欧，在桦树皮上发现了它。

它是食用真菌，此外其因其药用特性而著称，尤其是用于治疗肠胃失调、心血管疾病和糖尿病。还因抗氧化、抗炎、抗肿瘤和抗高血糖效果而著称。

化妆品组合物中已经描述了桦褐孔菌提取物。

因此，专利申请KR 2004/0102773披露了化妆品组合物，其包含桦褐孔菌提取物(因其自由基清除和增白特性)。在所述专利申请中没有披露或建议所述提取物根据本发明的用于增加皮肤组织的内聚力或用于减少泛红或增加皮肤的明亮外观的用途，并且对于用于减少眼周区域中的黑眼圈或眼袋的用途更是如此。

专利申请KR 2007/0046139披露含有四种不同的真菌提取物(包括桦褐孔菌提取物)的组合的化妆品组合物。然而，所述文献没有披露所述桦褐孔菌提取物根据本发明的用于增加皮肤组织的内聚力、尤其是用于减少特别是皮肤的泛红的效果，并且对于用于增加肤色的光泽度的效果更是如此。

先前引用的文献都没有披露所述桦褐孔菌提取物根据本发明的用于减少眼周区域中的黑眼圈和/或眼袋的特性。这些文献也都没有描述单独的桦褐孔菌提取物用于维持和/或增加皮肤肤色的光泽度的用途。

所述提取物根据本发明的优点在于其是可大量获得的起始材料，可以在工业规模上生产。另一个优点在于这种提取物具有在几种细胞类型中同时刺激几种蛋白质靶的能力。最后，根据具体实施例，根据本发明的提取物在亚临界条件下在水中获得，提取过程不使用任何有机溶剂，而同时允许生产富含微极性化合物的提取物，这些微极性化合物通常在常规的温度和压力条件下是难提取的。

因此，本发明的第一主题是桦褐孔菌提取物用于维持和/或增加皮肤组织的内聚力的化妆品用途。

表述“维持和/或增加皮肤组织的内聚力”在本文中意指维持和/或增加淋巴细胞和/或上皮细胞的内聚力、和/或表皮的内聚力、和/或真皮-表皮连接的内聚力。因此，根据本发明的桦褐孔菌提取物使得可以防止眼周区域中出现黑眼圈和/或眼袋和/或减少眼周区域中的黑眼圈和/或眼袋和/或维持和/或增加皮肤肤色的光泽度和/或均匀性。

此外，本发明的主题是一种美容护理方法，所述美容护理方法包括口服或局部施用桦褐孔菌提取物或包含所述桦褐孔菌提取物的化妆品组合物用于维持和/或增加皮肤组织的内聚力，特别是用于防止眼周区域中出现黑眼圈和/或眼袋和/或减少眼周区域中的黑眼圈和/或眼袋，和/或用于维持和/或增加皮肤肤色的光泽度和/或均匀性和/或用于维持和/或增加屏障功能和/或用于维持和/或增加皮肤微循环。

本发明的第三主题涉及桦褐孔菌提取物或包含其的皮肤病学组合物，其用于防止和/或减少与皮肤组织的内聚力的丧失有关的病状，尤其是瘙痒和/或刺痛和/或刺激和/或烧灼感和/或可见的鳞屑，和/或用于防止和/或减少红血丝和/或泛红。

因此，第一主题涉及桦褐孔菌提取物用于维持和/或增加皮肤组织的内聚力的化妆品用途。

出于本发明的目的，术语“化妆品用途”意指非治疗性用途，即，不要求治疗性处理并且旨在用于健康皮肤和/或黏膜(即，不呈现皮肤病学病状的皮肤，在本发明情况中不具有任何感染、疤痕、疾病或皮肤病(如念珠菌病、脓疱疮、银屑病、湿疹、痤疮或皮炎或红血丝)、或伤口或损伤的皮肤)的用途。

根据本发明的提取物是局部可接受的活性提取物。术语“局部可接受的”在本文中意指适用于局部施用的无毒提取物，所述无毒提取物对皮肤和/或黏膜是无刺激的，不会引起过敏反应，并且不是化学上不稳定的。

根据本发明的提取物的使用可以是通过口服或局部施用。有利地，局部施用提取物。术语“局部”意指将提取物直接局部施用和/或喷涂到皮肤和/或黏膜表面上。

术语“黏膜”意指***黏膜、泌尿生殖道黏膜、***黏膜、鼻黏膜、口腔黏膜、眼黏膜、唇和/或牙龈黏膜，优选唇黏膜。

根据本发明的提取物可以局部施用至面部和/或身体、头皮和/或黏膜的选自以下的全部或一部分：小腿，手，大腿，腹部，胸肩部，颈部，手臂，躯干，背部，面部、尤其是眼周区域，有利地胸肩部和/或面部并且尤其是眼周区域，甚至更有利地眼周区域。出于本发明的目的，眼周区域包括眼睑。

表述“维持和/或增加皮肤组织的内聚力”意指通过维持和/或增加选自VE-钙粘蛋白和/或胶原蛋白的存在于细胞中的粘附标记物的基因和/或蛋白质表达、和/或通过维持和/或重建经受应激的内皮细胞的结构来维持和/或增加内皮细胞和/或淋巴细胞的内聚力。

增加内皮细胞和/或淋巴细胞的内聚力使得可以防止眼周区域中出现黑眼圈和/或眼袋和/或减少眼周区域中的黑眼圈和/或眼袋。

因此，表述“减少黑眼圈和/或眼袋”意指增加VE-钙粘蛋白和/或胶原蛋白的蛋白质和/或基因表达，应理解的是增加基因表达被定义为增加相应mRNA的表达。

因此，出于本发明的目的，表述“增加VE-钙粘蛋白的表达”意指与在不存在桦褐孔菌提取物下检测的表达水平相比，在桦褐孔菌提取物的存在下将其基因和/或蛋白质表达增加至少5％、优选至少10％、更优选至少15％。

在本发明的有利实施例中，其是增加VE-钙粘蛋白的蛋白质表达的问题，有利地在内皮细胞中测量，更有利地在根据实例1d)或根据实例1k)制备的桦褐孔菌提取物的存在下，非常有利地在实例2中描述的条件下通过免疫组织化学法测量并通过共聚焦显微镜检测。

表述“重建经受应激的内皮细胞的结构”意指在根据本发明的桦褐孔菌提取物的存在下，重建当经受应激(有利地在TNF-α(肿瘤坏死因子-α)的存在下)时已经凹陷并坍塌的内皮细胞的结构。在本发明的有利实施例中，所述细胞的结构的重建将通过与在TNF-α的存在下应激的重建真皮的模型(对照)相比，在根据本发明的桦褐孔菌提取物的存在下、更优选在根据实例1d)或根据实例1k)制备的桦褐孔菌提取物的存在下的所述模型中标记蛋白质CD31(或PECAM-1)来评估。非常有利地，所述细胞的结构的重建将在实例3中描述的条件下通过免疫组织化学法评估并通过共聚焦显微镜检测。

最后，表述“增加胶原蛋白的表达”意指增加胶原蛋白IV的基因和/或蛋白质表达。这种表达的增加可以在选自角化细胞和/或内皮细胞和/或纤维母细胞的几种细胞类型中测量。

当与不存在任何提取物的情况下检测的表达水平相比，在桦褐孔菌提取物的存在下在内皮细胞中的增加将是至少5％、优选至少15％、更优选至少20％并且非常优选至少40％时，桦褐孔菌提取物将处于有效增加IV型胶原蛋白的基因和/或蛋白质表达的量。有利地，它将是IV型胶原蛋白的蛋白质表达的增加，更有利地在如在实例1d)描述的条件下或根据实例1k)制备的提取物的存在下测量。此增加将优选在实例4c)的条件下通过免疫组织化学法测量。

因此，根据本发明的桦褐孔菌提取物可以用于保护和/或舒缓脆弱和/或薄和/或敏感皮肤和/或黏膜。提取物可用于维持和/或增加皮肤微循环(全身和肺部)，出于本发明的目的应理解的是，皮肤微循环不包括血液循环。

出于本发明的目的，表述“敏感皮肤或黏膜”意指由于外部因素如风、污染、寒冷和炎热而不再耐受或仅非常微弱地耐受它们的环境的皮肤或黏膜。

出于本发明的目的，敏感皮肤和/或黏膜不是特应性皮肤和/或黏膜。因此，在本发明的有利实施例中，桦褐孔菌提取物或包含其的化妆品组合物用于治疗除了特应性皮肤和/或黏膜之外的敏感皮肤和/或黏膜，应理解的是术语“特应性皮肤或黏膜”在本文中意指严重脱水并且导致特应性皮炎或被皮肤科医生称为“特应性”的皮肤病的皮肤或黏膜。

此外，表述“维持和/或增加皮肤组织的内聚力”意指维持和/或增加真皮-表皮连接的内聚力。表述“维持和/或增加真皮-表皮连接的内聚力”意指维持和/或增加在角化细胞和/或纤维母细胞中的HSP70(热休克蛋白70)和/或胶原蛋白、优选IV型胶原蛋白的基因和/或蛋白质表达。

因此，当与不存在任何根据本发明的提取物的情况下检测的表达水平相比，在根据本发明的桦褐孔菌提取物的存在下在角化细胞中的增加将是至少50％、优选至少80％、更优选至少94％、并且非常优选至少130％时，桦褐孔菌提取物将处于有效增加IV型胶原蛋白的基因和/或蛋白质表达的量。有利地，它将是IV型胶原蛋白的蛋白质表达的增加，更有利地在如在实例1d)描述的条件下或根据实例1k)制备的提取物的存在下测量。此增加将优选在实例4a)的条件下通过免疫组织化学法测量。

表述“增加HSP70表达”意指与不存在任何提取物的情况下检测的表达水平相比，在根据本发明的桦褐孔菌提取物的存在下HSP70表达的至少10％、优选至少20％、更优选至少30％的基因和/或蛋白质增加。在有利的实施例中，它将是HSP70的蛋白质表达的增加，更优选在真皮纤维母细胞中测量。优选地，蛋白质表达将通过免疫组织化学法测量并且蛋白质将通过蛋白质印迹法检测(在实例5的条件下)。

增加真皮-表皮连接的内聚力使得可以增加皮肤肤色的光泽度和/或均匀性。因此，本发明的一个主题是桦褐孔菌提取物用于维持和/或增加皮肤肤色的光泽度和/或均匀性的用途。

出于本发明的目的，表述“增加肤色的光泽度”意指增加皮肤的明亮外观和/或改善皮肤的光泽度和/或减少皮肤的暗沉和/或蜡黄肤色。

皮肤肤色的光泽度可以通过比色法或通过图像分析测量。后一种体内测量方法包括在施用测试产品之前和之后拍摄志愿者面部的交叉极化配置的高分辨率照片(以45°拍摄的)。以这些数码照片为基础，图像分析使得能够提取和量化与皮肤的颜色、亮度、均匀性和肌理相关的特定参数(例如：L*、a*、b*、C、h°)。

因此，在具体实施例中，当皮肤的明亮外观的增加在根据本发明的桦褐孔菌提取物的存在下是至少0.5％时，根据本发明的提取物处于有效“增加肤色的光泽度”的量。在本发明的优选实施例中，它是与在相同条件下施用不包含桦褐孔菌提取物的所述配制品相比并且在实例6中描述的条件下，在将包含桦褐孔菌提取物的配制品施用至33名女性群体的面部28天之后测量的参数L*的增加(表4)。更优选地，它将是实例9)中描述的包含如根据实例1c)制备的桦褐孔菌提取物的配制品。

在本发明的有利实施例中，对于其用于维持和/或增加肤色的光泽度和/或均匀性的用途，桦褐孔菌提取物不与枸杞果实的提取物组合使用，尤其是在旨在用于维持和/或增加肤色的光泽度和/或均匀性的化妆品或皮肤病学组合物中。更优选地，根据本发明的桦褐孔菌提取物不与枸杞果实的提取物组合使用，特别是在根据本发明的化妆品或皮肤病学组合物中。

最后，表述“维持和/或增加皮肤组织的内聚力”意指维持和/或增加表皮的内聚力。

表述“维持和/或增加表皮的内聚力”意指维持和/或增加外皮蛋白的基因和/或蛋白质表达和/或维持和/或增加整联蛋白-β-1和/或闭合蛋白和/或密封蛋白-1的基因和/或蛋白质表达。因此，根据本发明的桦褐孔菌提取物将处于有效增加表皮的内聚力的量，当在桦褐孔菌提取物的存在下外皮蛋白的基因和/或蛋白质表达、优选蛋白质表达的增加将是至少50％、有利地100％、更有利地200％并且非常有利地400％时(与不存在任何提取物的情况下检测的所述蛋白质的表达水平相比)。在有利的实施例中，外皮蛋白的蛋白质表达的增加将在根据实例1d)或根据实例1k)制备的桦褐孔菌提取物的存在下，在“正常”角化细胞(从不呈现任何病状的组织获得的)中测量，并且更有利地，蛋白质表达的增加将在实例7中描述的条件下通过ELISA检测。

此外，增加外皮蛋白的表达使得可以改善皮肤的屏障功能。因此，桦褐孔菌提取物可以用于维持和/或增加皮肤的屏障功能。出于本发明的目的，表述“维持和/或增加屏障功能”意指通过角化细胞到角质层细胞的分化维持和/或增加角质化层的内聚力，并且因此表皮的稳态以及维持表皮的保湿的能力。

此外，表述“维持和/或增加表皮的内聚力”意指维持和/或增加整联蛋白-β-1和/或闭合蛋白和/或密封蛋白-1的基因和/或蛋白质表达。

因此，当与不存在任何提取物的情况下检测的整联蛋白-β-1的表达、优选蛋白质表达水平相比，在桦褐孔菌提取物的存在下此增加是至少50％、有利地至少70％、并且更有利地至少85％时，桦褐孔菌提取物处于有效增加整联蛋白-β-1的基因和/或蛋白质表达、优选蛋白质表达的量。

表述“维持和/或增加闭合蛋白的基因和/或蛋白质表达”还意指与在不存在任何提取物的情况下检测的闭合蛋白的表达、优选蛋白质表达水平相比，在桦褐孔菌提取物的存在下的维持和/或至少20％、优选至少30％并且更优选至少50％的增加、优选蛋白质增加。

表述“维持和/或增加密封蛋白-1的基因和/或蛋白质表达”意指与在不存在任何提取物的情况下检测的密封蛋白-1的表达、优选蛋白质表达水平相比，在桦褐孔菌提取物的存在下的基因和/或蛋白质、有利地蛋白质维持和/或至少10％、有利地至少20％的增加(在密封蛋白-1的蛋白质表达中)。

在有利的实施例中，密封蛋白-1、闭合蛋白和整联蛋白-β-1的蛋白质表达的增加中的每一者将在根据实例1d)或根据实例1k)制备的桦褐孔菌提取物的存在下，在“正常”角化细胞(即，从不呈现任何病状的组织中获得的角化细胞)中测量。更有利地，在实例8中描述的条件下，将通过免疫标记来检测这种蛋白质表达增加。

桦褐孔菌提取物可以从整个真菌或从真菌的一个或多个部分(尤其是选自菌丝或菌核及其混合物)提取。根据本发明的提取物优选地是桦褐孔菌菌核的提取物。

桦褐孔菌提取物可以经由本领域技术人员已知的任何提取方法获得，所述方法选自热煎煮、碾磨(包括超声碾磨，使用混合器)、浸渍，在亚临界条件下在水中提取或使用溶剂提取。有利地，提取将在亚临界条件下在水中进行。

术语在“亚临界条件”下提取意指在水存在下、在高于100℃的温度条件和低于22.1MPa(221巴)的压力条件下提取，使得水依然呈液态，但具有的粘度和表面张力低于在室温下水的粘度和表面张力，增加水的介电常数。

因此，提取压力将在10MPa(100巴)与25MPa(250巴)之间、优选在15与22.1MPa(150与221巴)之间。

提取可以使用干燥或新鲜的物质、有利地干燥的物质进行，其量为相对于所述物质和提取溶剂的总重量按重量计从0.1％至20％、有利地按重量计从1％至10％、非常有利地从5％至10％、甚至更有利地10％。

提取可以在包括室温(即，20℃的温度)的范围从4℃至300℃的温度下进行。在本发明的优选实施例中，提取将在从60℃至90℃的温度下、优选在从70℃至85℃的温度下、更优选在80℃的温度下进行。

在本发明的一个替代性实施例中，提取将在从4℃至25℃、更优选从4℃至20℃的温度下、更有利地在室温(即，20℃)下进行。

在本发明的又另一个替代性实施例中，提取将在范围从100℃至300℃、有利地从120℃至250℃、更有利地在140℃与200℃之间的温度下在亚临界条件下在水中进行。提取可以在单个给定温度或连续升高的温度下进行。在本发明的一个有利实施例中，提取将在160℃的单个温度下进行。在替代性实施例中，它将根据在100℃与200℃之间三个升高的温度的梯度(如120℃、140℃然后160℃，或110℃、130℃然后150℃或者120℃、145℃然后170℃)进行。

提取可以进行从几秒钟至24小时、优选从1分钟至12小时的时间段、更优选从5分钟至5小时的时间段、并且更有利地从15分钟至2小时的时间段。

溶剂可以选自水或溶剂混合物，优选极性质子溶剂，并且有利地水、醇、二醇、多元醇、水/醇、水/二醇或水/多元醇混合物(如乙醇、甘油和/或丁二醇和/或其他二醇(如木糖醇和/或丙二醇等)与水混合)(从99/1至1/99(w/w))，有利地水作为唯一溶剂。

特别地，提取物通过水性提取获得。出于本发明的目的，表述“通过水性提取获得的提取物”意指通过用水溶液提取获得的任何提取物，所述水溶液相对于所述水溶液的总重量含有按重量计大于60％、有利地按重量计至少70％、特别地按重量计至少80％、更特别地按重量计至少90％、特别地按重量计至少95％的水，甚至更有利地不含二醇、并且特别地不含醇、更特别地仅含水。

在一个替代性实施例中，提取物通过在相应的比例(80:20；v/v)的丙二醇和水的混合物中提取来获得。

在本发明的另一个替代性实施例中，提取可以在非离子表面活性剂的存在下进行，所述非离子表面活性剂优选地选自：由巴斯夫公司(BASF)以名称

1200UP出售的月桂基葡糖苷、或者辛酰基/癸酰基葡糖苷(

810 UP)、优选辛酰基/癸酰基葡糖苷(

810 UP)。非离子表面活性剂的重量浓度可以是在0.5％与5％之间，有利地在0.5％与1％之间；更有利地，它将是相对于提取物的总重量按重量计1％。

在本发明的特别有利的实施例中，提取物将通过在亚临界条件下在水中提取获得。在这种情况下，就存在的化合物而言，所述提取物将不同于在常规提取条件下获得的水性提取物(包括在范围最高达80℃的温度下在水中获得的水性提取物)。

在本发明的第一实施例中，桦褐孔菌提取物可以通过将相对于真菌和溶剂总量按重量计10％的量的桦褐孔菌菌丝或菌核溶解在作为唯一溶剂的水中、并在搅拌下在80℃的温度下浸渍1小时的时间段来获得。如此获得的提取物将被倾析并离心，并且上清液将在实例1a)中或在实例1h)中描述的条件下过滤(0.45μm)。提取物是在如以上定义的升高温度下获得的称为水性提取物的液体提取物。

在另一个实施例中，桦褐孔菌提取物将由相对于真菌和溶剂总量按重量计10％的研磨且干燥量的真菌菌丝或菌核(溶解在乙醇/水混合物(70/30；v/v)中)获得。进行的浸渍将在60℃的温度下进行1小时的时间段。将获得的提取物倾析并离心，并将获得的上清液过滤(0.45μm)。在实例1b)中或在实例1i)中描述的条件下，将乙醇蒸发掉，并将提取物再次过滤(0.45μm)。

在本发明的又另一个实施例中，提取将使用按重量计10％的研磨且干燥量的真菌菌丝或菌核在亚临界条件下在水中进行。提取在160℃的温度下进行。

在实例1c)中或在实例1j)中呈现的条件下，提取物被浓缩并过滤(0.45μm)，并呈水溶液形式。

本发明的另一个替代性实施例将包括在实例1d)或实例1k)中描述的条件下，研磨并干燥在实例1c)或实例1j)的条件下获得的提取物，以获得呈粉末形式的提取物。

在最后的实施例中，在实例1e)或实例1l)的条件下，将以上在实例1d)或实例1k)中描述的条件下获得的提取物溶解在含有按重量计80％的甘油的溶液中。

另外的脱色和/或除臭步骤可以在提取的任何阶段并且根据本领域技术人员已知的技术在提取物上进行。特别地，提取物可以用活性炭脱色。提取物也可以冻干。

根据本发明的提取物可以单独使用或包含在化妆品或皮肤病学组合物中。如果提取物作为化妆品活性成分单独使用，则将其有利地溶解在包含甘油的水溶液中，有利地以相对于包含提取物的水-甘油溶液的总重量按重量计从60％至90％、更有利地从70％至85％的浓度、非常有利地以80％的浓度存在。

在本发明的一个替代性实施例中，将提取物溶解和/或稀释在溶剂、尤其是极性溶剂(如水、醇、多元醇、二元醇(如戊二醇和/或丁二醇和/或己二醇和/或辛二醇)、或其混合物(优选水-二醇混合物，更优选含有选自己二醇、辛二醇及其混合物的二醇)中。有利地，将所获得的提取物稀释和/或溶解在水溶液中，所述水溶液含有己二醇，特别是相对于化妆品成分的总重量，含有按重量计在0.1％与10％之间的己二醇、优选按重量计在0.5％与5％之间的己二醇。有利地，将所获得的提取物稀释和/或溶解在水溶液中，所述水溶液含有辛二醇，特别是相对于包含所述提取物的水溶液的总重量，含有按重量计在0.01％与5％之间的辛二醇、优选按重量计在0.1％与1％之间的辛二醇。

替代性地，提取物可以包含在化妆品组合物中，所述化妆品组合物包含至少一种化妆品上可接受的赋形剂。术语“化妆品上可接受的赋形剂”意指对皮肤无刺激，不引起过敏反应且化学稳定的化妆品赋形剂。

因此，本发明的主题是桦褐孔菌提取物在包含至少一种化妆品上可接受的赋形剂的化妆品组合物中用于维持和/或增加皮肤组织的内聚力、特别是用于防止眼周区域中出现黑眼圈和/或眼袋和/或用于减少眼周区域中的黑眼圈和/或眼袋、和/或用于维持和/或增加皮肤肤色的光泽度和/或均匀性和/或用于维持和/或增加皮肤微循环和/或用于维持和/或增加皮肤的屏障功能的用途。

在本发明的有利实施例中，提取物将以相对于组合物的总重量按重量计在0.0001％与20％之间、优选按重量计在0.001％与5％之间并且更优选按重量计在0.01％与3％之间的浓度存在于化妆品组合物中。

有利地，将化妆品组合物施用至面部和/或身体、头皮和/或黏膜的选自以下的全部或一部分：小腿，手，大腿，腹部，胸肩部，颈部，手臂，躯干，背部，面部、尤其是眼周区域，有利地胸肩部和/或面部并且尤其是眼周区域，甚至更有利地眼周区域。

有利地，化妆品组合物可以用于保护和/或舒缓薄的和/或脆弱的皮肤和/或黏膜，尤其是老年人或婴儿的薄的和/或脆弱的皮肤和/或黏膜。

一种或多种赋形剂可以选自表面活性剂和/或乳化剂、防腐剂、缓冲剂、螯合剂、变性剂、遮光剂、pH调节剂、还原剂、稳定剂、增稠剂、胶凝剂、成膜聚合物、填充剂、消光剂、光泽度剂、颜料、着色剂、香料及其混合物。CTFA(Cosmetic Ingredient Handbook[化妆品成分手册]，第二版(1992))描述了适用于本发明使用的多种化妆品赋形剂。

有利地，所述一种或多种赋形剂选自包括以下的组：聚甘油、酯、纤维素聚合物和衍生物、羊毛脂衍生物、磷脂、乳铁蛋白、乳过氧化物酶、基于蔗糖的稳定剂、维生素E及其衍生物、黄原胶、天然和合成蜡、植物油、甘油三酯、不皂化物、植物甾醇、硅酮、蛋白质水解物、甜菜碱、胺氧化物、植物提取物、蔗糖酯、二氧化钛、甘氨酸和对羟基苯甲酸酯，并且更优选地选自由以下组成的组：硬脂醇聚醚-2、硬脂醇聚醚-21、乙二醇-15硬脂醇醚、鲸蜡硬脂醇、苯氧基乙醇、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸乙酯、对羟基苯甲酸丙酯、对羟基苯甲酸丁酯、丁二醇、辛二醇、天然生育酚、甘油、二羟基鲸蜡基磷酸钠、异丙基羟基鲸蜡基醚、硬脂酸乙二醇酯、三异壬精、椰油酸辛酯、聚丙烯酰胺、异链烷烃、月桂醇聚醚-7、卡波姆、丙二醇、己二醇、甘油、没药醇、二甲聚硅氧烷、氢氧化钠、PEG-30-二聚羟基硬脂酸酯、辛酸/癸酸甘油三酯、辛酸鲸蜡硬脂酯、己二酸二丁酯、葡萄籽油、霍霍巴油、硫酸镁、EDTA、环甲硅油、黄原胶、柠檬酸、月桂基硫酸钠、矿物蜡和油、异硬脂基异硬脂酸酯、丙二醇二壬酸酯、丙二醇异硬脂酸酯、PEG 8、蜂蜡、来自氢化棕榈仁油的甘油酯、羊毛脂油、芝麻油、乳酸鲸蜡酯、羊毛脂醇、蓖麻油、二氧化钛、乳糖、蔗糖、低密度聚乙烯、等渗盐水溶液及其混合物。

化妆品组合物可以选自水性或油性溶液、霜剂或水性凝胶或油性凝胶(尤其是沐浴凝胶)、乳、乳剂、微乳剂或纳米乳剂(尤其是水包油基或油包水基或多基或硅酮基的)、面膜、精华、洗液、液体皂、软膏、泡沫、贴剂、无水产品(优选为液体、糊状或固体，例如呈化妆粉、杆或棒的形式，尤其是呈唇膏的形式)。有利地，它将是霜剂或精华。

化妆品组合物还可以包含用于增强皮肤和/或黏膜的屏障功能，诱导与根据本发明的提取物的互补或协同作用的活性成分，这些活性成分选自增强屏障功能并减少经表皮的水分丧失的那些和/或增加皮肤和/或黏膜的水分含量和/或刺激水通道蛋白合成以便改善细胞中水的循环的那些。将提及丝氨酸、脲及其衍生物，产品如海洋胶原蛋白和作为糖胺聚糖的硫酸软骨素的微球，包含透明质酸盐、脲、海藻糖、三乙酸甘油酯和聚季铵盐-51的配制品，分别以名称Marine Filling Spheres^TM和Advanced Moisturizing Complex^TM出售；透明质酸微球，以名称Hyaluronic Filling Spheres^TM出售；红藻提取物或***树胶多糖、海藻酸盐和丝氨酸的混合物，分别以名称Osmogelline^TM和Micropatch^TM丝氨酸出售；或普鲁兰多糖、透明质酸或其盐或衍生物、和海藻酸或其盐或衍生物的组合，以名称PatcH20^TM出售。可以使用其他化合物，如烷基纤维素，卵磷脂，基于鞘氨醇的化合物，神经酰胺，磷脂，胆固醇及其衍生物，鞘糖脂，植物甾醇(豆甾醇和β-谷甾醇，菜油甾醇)，必需脂肪酸，1,2-二酰基甘油，4-苯并二氢吡喃酮，五环三萜如熊果酸，凡士林，羊毛脂，糖特别是海藻糖及其衍生物，鼠李糖，果糖，麦芽糖，乳糖，赤藓糖醇，甘露醇，D-木糖和葡萄糖，腺苷及其衍生物，山梨糖醇，多元醇，其有利地是C₂-C₆，并且更有利地是C₃-C₆，如甘油，丙二醇，1,3-丁二醇，二丙二醇，二甘油，聚甘油及其混合物，甘油及其衍生物，聚丙烯酸甘油酯，乳酸钠，戊二醇，丝氨酸，乳酸，AHA，BHA，吡酮酸钠，木糖醇，乳酸钠，依克多因及其衍生物，壳聚糖及其衍生物，胶原蛋白，浮游生物，类固醇衍生物(包括DHEA，其7-氧化和/或17-烷基化衍生物和皂角苷配基)，二氢茉莉酮酸甲酯，维生素D及其衍生物，欧锦葵提取物或积雪草提取物，丙烯酸均聚物，β-葡聚糖并且特别是羧甲基β-葡聚糖钠，C-糖苷衍生物(如专利申请WO 02/051828中所述的那些)，麝香玫瑰油，由温森斯公司(Vincience)以名称Algualane Zinc^TM出售的富含锌的微藻紫球藻(Prophyridium cruentum)的提取物，精氨酸，由Lipotech公司以名称Diffuporine^TM出售的乙酰基六肽，由茜莱博公司(Silab)以名称Aquaphyline^TM出售的三色堇(Viola tricolor)的水解物或由本申请人以名称Hyalurosmooth^TM出售的从狭叶番泻(Cassia angustifolia)籽中提取的多糖，以名称Relipidium^TM出售的酿酒酵母的发酵水解物，或者由本申请人以名称Melhydran^TM出售的一种或多种天然保湿因子的化合物或蜂蜜的天然提取物。

组合物中可以存在其他类型的活性剂，如抗老化成分和/或增白活性剂，抗污染成分和/或提升皮肤的光泽度的成分。

这些试剂可以是例如以名称DN-Age^TM出售的有翅决明(Cassia alata)的叶提取物和/或以名称Litchiderm^TM出售的荔枝提取物作为抗氧化剂活性剂，以名称CollRepair^TM出售的丹参(Salvia miltiorhizza)提取物和烟酰胺的组合作为脱糖剂，以名称Lox-Age^TM出售的抗皱的菊苣提取物，以名称Neurobiox^TM出售的西洋蓍草(Achillea millefolium)提取物，以名称Perlaura^TM出售的拳参(Polygonum bistorta)提取物，以名称Hyalufix^TM出售的南姜提取物，以名称Deliner^TM出售的玉米提取物或由本申请人以名称Epigenist^TM出售的地下沃安齐贾(Voandzeia subterranea)提取物或者还有提升皮肤紧致的活性剂，如以名称Dermican^TM出售的合成四肽，以名称Linefactor^TM出售的黄葵(Hibiscus abelmoschus)提取物，以名称Proteasyl^TM出售的纯化的豌豆提取物，以名称Elestan^TM出售的Manilkaramultinervis提取物或由本申请人以名称Argassential^TM出售的摩洛哥坚果的果肉提取物。还可以将以名称Dermagenist^TM出售的马郁兰(Origanum majorana)植物的提取物和/或以名称

18出售的非洲楝(Khaya senegalensis)提取物添加到化妆品组合物中。

作为抗污染剂和/或提升皮肤的光泽度的试剂，将提及以名称Arganyl^TM出售的摩洛哥坚果油提取物和由本申请人以名称Purisoft^TM出售的辣木(Moringa oleifera)的种子提取物。

有利地，它将不是枸杞果实的提取物。

本发明的另一个主题涉及一种美容护理方法，所述美容护理方法包括局部或口服施用，优选局部施用桦褐孔菌提取物或包含所述桦褐孔菌提取物的化妆品组合物，用于维持和/或增加皮肤组织的内聚力，特别是用于维持和/或增加内皮细胞和/或淋巴细胞的内聚力，和/或表皮的内聚力，和/或真皮-表皮连接的内聚力。

因此，所述方法使得可以防止眼周区域中出现黑眼圈和/或眼袋和/或减少眼周区域中的黑眼圈和/或眼袋。此外，所述美容护理方法使得可以维持和/或增加皮肤肤色的光泽度和/或均匀性。在这种情况下，桦褐孔菌提取物不与枸杞果实的提取物组合使用。所述方法还使得可以维持和/或增加皮肤的屏障功能和/或皮肤微循环。

在本发明的一个实施例中，所述方法包括将根据本发明的提取物或包含其的化妆品组合物局部施用至面部、头皮和/或黏膜和/或身体的选自以下的全部或一部分：小腿，手，大腿，腹部，胸肩部，颈部，手臂，躯干，背部，面部、尤其是眼周区域，有利地胸肩部和/或面部并且尤其是眼周区域，甚至更有利地眼周区域。

最后的主题涉及桦褐孔菌提取物或包含其的皮肤病学组合物，其用于有利地通过增加血管结构和/或表皮的内聚力来防止和/或减少泛红(所述提取物不与枸杞果实的提取物组合使用)和/或由皮肤组织内聚力的降低产生的病状，特别是瘙痒和/或刺痛和/或刺激和/或烧灼感和/或可见的鳞屑和/或红血丝。

因此，桦褐孔菌提取物或包含其的皮肤病学组合物可以用于处理不耐受和/或反应性皮肤和/或黏膜。

不耐受和/或反应性皮肤或黏膜是呈现出瘙痒、刺痛、刺激、主观烧灼感、可见的鳞屑和/或泛红的皮肤或黏膜，但不是如先前定义的特应性皮肤或黏膜。

在本发明的一个有利实施例中，将桦褐孔菌提取物或包含其的皮肤病学组合物局部施用至面部和/或头皮和/或黏膜和/或身体的选自以下的全部或一部分：小腿，手，大腿，腹部，胸肩部，颈部，手臂，躯干，背部，面部、尤其是眼周区域，有利地胸肩部和/或面部并且尤其是眼周区域。

在本发明的特别有利的实施例中，当与对应于不存在任何提取物的相同配制品的对照相比，将包含桦褐孔菌提取物的配制品施用至33名女性的人群的面部7或28天之后，泛红的减少是至少0.5％、优选至少1％时，桦褐孔菌提取物将处于有效“减少泛红”的量。

可以在体内通过比色法或图像分析测量泛红的减少。因此，皮肤、尤其是面部颜色的评估可以通过测量参数a*来进行。

在本发明的优选实施例中，它是在呈现出泛红的面部上、更优选在实例6的条件下施用如在实例9)中描述的包含根据实例1c)制备的桦褐孔菌提取物的配制品之后测量的参数a*的减少(表4)。

有利地，用于防止和/或减少泛红的桦褐孔菌提取物不与枸杞果实的提取物组合使用。更有利地，所述提取物在亚临界条件下在水中获得。替代性地，包含根据本发明的用于防止和/或减少泛红的桦褐孔菌提取物的皮肤病学组合物不包含任何枸杞果实的提取物。

在另一个实施例中，优选在亚临界条件下在水中获得的桦褐孔菌提取物，或包含其的皮肤病学组合物用于防止和/或减少红血丝。

因此，在本发明的有利实施例中，桦褐孔菌提取物将以相对于组合物的总重量按重量计在0.0001％与20％之间、优选按重量计在0.001％与5％之间并且更优选按重量计在0.01％与3％之间的浓度包含在包含至少一种皮肤病学上可接受的赋形剂的皮肤病学组合物中。

在本发明的非常有利的实施例中，所述提取物不与任何药用拟层孔菌(Fomitopsis officinalis)提取物和/或任何姬松茸多糖(Agaricus blazei)提取物，有利地不与姬松茸(A.blazei Muriill)和/或任何猴头菇(Hericium erinaceum)提取物组合用于防止和/或减少刺激和/或瘙痒。更有利地，根据本发明的含有桦褐孔菌提取物的组合物不含有任何药用拟层孔菌提取物和/或任何姬松茸多糖提取物，和/或任何猴头菇提取物。根据更有利的实施例，根据本发明的组合物不含有任何药用拟层孔菌提取物或任何姬松茸多糖提取物或任何猴头菇提取物。

下面呈现了参考本发明的描述的实例。这些实例出于说明性目的给出，并且决不应该限制本发明的范围。每个实例具有一般范围。实例形成本发明的组成部分，并且从以其整体(包括实例)考虑的说明书来看，相对于任何现有技术显得新颖的任一特征形成本发明的组成部分。

除非另外指出，否则百分比基于重量/重量表示。

附图说明：

-图1：在根据本发明的提取物的存在下，内皮细胞中VE-钙粘蛋白的蛋白质表达的增加(A：对照和B：桦褐孔菌提取物(0.001％w/v培养基))

-图2.经受应激的重建真皮的模型中桦褐孔菌提取物对内皮结构凹陷的影响(标记物CD31)(A：对照，B：应激(TNF-α)，和C：TNF-α+桦褐孔菌提取物)。

-图3：在根据本发明的提取物的存在下，纤维母细胞中IV型胶原蛋白的蛋白质表达的增加(A：对照和B：桦褐孔菌提取物(0.001％w/v培养基))

-图4：在根据本发明的提取物的存在下，内皮细胞中IV型胶原蛋白的蛋白质表达的增加(A：对照和B：桦褐孔菌提取物(0.001％w/v培养基))

实例：

实例1：用于获得桦褐孔菌提取物的方法

实例1a)：将相对于真菌和溶剂的总量(重量)按重量计10％的量的真菌桦褐孔菌的菌丝溶解在作为唯一溶剂的水中，并在80℃的温度下在搅拌下浸渍1小时的时间段。然后将提取物倾析并离心，并将上清液过滤(0.45μm)。因此，获得的提取物呈液体形式。

实例1b)：将相对于真菌和溶剂的总量(重量)按重量计10％的量的研磨且干燥的真菌桦褐孔菌的菌丝溶解在乙醇/水混合物(70/30；v/v)中，并然后在60℃的温度下在搅拌下浸渍1小时的时间段。将获得的提取物倾析并离心，并将获得的上清液过滤(0.45μm)。将乙醇蒸发掉，并将提取物再次过滤(0.45μm)。因此，获得的提取物呈液体形式。

实例1c)：将相对于真菌和溶剂的总量(重量)按重量计10％的量的研磨且干燥的真菌桦褐孔菌的菌丝在160℃的温度下在提取柱中在亚临界条件下提取到水中。然后将提取物浓缩并过滤(0.45μm)。因此，获得的提取物呈液体形式。

实例1d)：将相对于真菌和溶剂的总量(重量)按重量计10％的量的研磨且干燥的真菌桦褐孔菌的菌丝在160℃的温度下在提取柱中在亚临界条件下提取到水中。然后将提取物浓缩并过滤(0.45μm)，并然后干燥并研磨。所述提取物呈粉末形式。

实例1e)：将如在实例1c)中描述的获得的提取物在甘油中稀释以获得含有按重量计80％的甘油的水-甘油溶液。

实例1f)：将如在实例1a)中描述的获得的液体提取物冻干。

实例1g)：将如在实例1b)中描述的获得的液体提取物冻干。

实例1h)：将相对于真菌和溶剂的总量(重量)按重量计10％的量的真菌桦褐孔菌的菌核溶解在作为唯一溶剂的水中，并在80℃的温度下在搅拌下浸渍1小时的时间段。然后将提取物倾析并离心，并将上清液过滤(0.45μm)。因此，获得的提取物呈液体形式。

实例1i)：将相对于真菌和溶剂的总量(重量)按重量计10％的量的研磨且干燥的真菌桦褐孔菌的菌核溶解在乙醇/水混合物(70/30；v/v)中，并然后在60℃的温度下在搅拌下浸渍1小时的时间段。将获得的提取物倾析并离心，并将获得的上清液过滤(0.45μm)。将乙醇蒸发掉，并将提取物再次过滤(0.45μm)。因此，获得的提取物呈液体形式。

实例1j)：将相对于真菌和溶剂的总量(重量)按重量计10％的量的研磨且干燥的真菌桦褐孔菌的菌核在160℃的温度下在提取柱中在亚临界条件下提取到水中。然后将提取物浓缩并过滤(0.45μm)。因此，获得的提取物呈液体形式。

实例1k)：将相对于真菌和溶剂的总量(重量)按重量计10％的量的研磨且干燥的真菌桦褐孔菌的菌核在160℃的温度下在提取柱中在亚临界条件下提取到水中。然后将提取物浓缩并过滤(0.45μm)，并然后干燥并研磨。所述提取物呈粉末形式。

实例1l)：将如在实例1j)中描述的获得的提取物在甘油中稀释以获得含有按重量计80％的甘油的水-甘油溶液。

实例1m)：将如在实例1h)中描述的获得的液体提取物冻干。

实例1n)：将如在实例1i)中描述的获得的液体提取物冻干。

实例2：在桦褐孔菌提取物的存在下内皮细胞中VE-钙粘蛋白的表达的增加

方案：将正常内皮细胞(不是源自病理组织)在含有FBS(胎牛血清)的培养基中培养3天。将生长培养基用不含生长因子的内皮细胞的培养基代替，并然后将细胞在TNF-α(肿瘤坏死因子-α)的存在下(阳性对照)或在补充有根据实例1d)制备的桦褐孔菌提取物的TNF-α存在或不存在任何提取物(对照)的情况下培育3天。

处理之后，在-20℃下将细胞用丙酮固定10分钟。用PBS缓冲液(磷酸盐盐水)洗涤后，将切片放置在血清溶液中持续30分钟。将抗VE-钙粘蛋白一抗在4℃下培育过夜。用PBS洗涤后，在室温(20℃)下且在黑暗中，施用偶联至荧光染料Alexa 488的二抗持续45分钟。在室温下洗涤几次持续5分钟后，施用复染剂伊文思蓝。使用共聚焦显微镜(TCS-SP2，徕卡公司(Leica))进行观察。然后使用获得的图像进行微血管的光的平均面积的测量。通过Mann-Whitney检验进行统计检验。

结果与结论：结果整理在下表1和图1中。

表1

相对于TNF-α存在下的情况，桦褐孔菌提取物使得可以恢复和显著增加微血管的光的平均面积。图1示出了与对照相比，在根据本发明的桦褐孔菌提取物的存在下通过增加VE-钙粘蛋白的蛋白质表达而增加的内皮细胞的内聚力。因此，桦褐孔菌提取物使得可以维持和/或增加皮肤微循环。

使用根据实例1k)的提取物获得了相同的结果。

实例3：在重建的真皮的模型中标记物CD31的蛋白质表达的增加

方案：由纤维母细胞构成的真皮通过接种、并在补充有10％血清和维生素C的DMEM(杜尔贝科改良伊格尔培养基(Dulbecco’s Modified Eagle Medium))中浸入式培育21天获得。添加内皮细胞和淋巴细胞，并将其在10％血清和EGF(表皮生长因子)存在下培育。将片层叠加并培育。用TNF-α(肿瘤坏死因子-α)(阳性对照)或用补充有根据实例1d)获得的桦褐孔菌提取物(0.001％w/v)的TNF-α的处理进行7天(n＝4)。制成重建的真皮的石蜡切片，并然后对其进行标记。将切片脱蜡并再水合，并然后在柠檬酸盐缓冲液中回收。通过用2％牛血清白蛋白(BSA)培育使切片饱和。然后将切片用抗CD31一抗培育过夜。5次洗涤后，在黑暗中施用偶联至荧光染料Alexa 488的二抗持续45分钟。使用共聚焦显微镜(蔡司公司(Zeiss)，LSM 700)进行观察。然后使用获得的图像进行微血管的光的平均面积的测量。通过Mann-Whitney检验进行统计检验。

结果与结论：结果整理在下表2和图2中。

TNF-α用于在体外模拟应激的影响，并已知改变皮肤微血管结构的组织和功能。这通过坍塌的结构的存在反映。它们被称为凹陷结构。

在根据实例1d)制备的桦褐孔菌提取物的存在下，重建了皮肤的微血管结构(与对照相同)。因此，根据本发明的提取物使得可以修正应激对皮肤微血管结构的影响。因此，桦褐孔菌提取物使得可以维持和/或增加皮肤微循环。

使用根据实例1k)的提取物获得了相同的结果。

实例4：在桦褐孔菌提取物存在下IV型胶原蛋白合成的增加

实例4a)角化细胞

方案：将不呈现出任何病状的角化细胞在KSFM特定培养基(5％CO₂；95％相对湿度)中在37℃下培养直至达到汇合，并然后在存在根据实例1d)制备的桦褐孔菌提取物的情况下或不存在所述桦褐孔菌提取物的情况下培育48小时的时间段。移除培养基，并用基于氢氧化铵的裂解溶液裂解细胞。将细胞用BSA(牛血清白蛋白)溶液饱和30分钟，并然后用抗胶原蛋白IV抗体培育1小时。洗涤后，将细胞用兔(山羊抗兔)二抗培育1小时。移除培养基，并用荧光显示溶液代替。在340exc/615em nm处记录荧光。

胶原蛋白IV的浓度是从商业胶原蛋白IV标准曲线推导出来的。将结果相对于细胞中包含的DNA量进行归一化(Picogreen试剂盒)。

结果：

表1

	平均值(％)	SD
			对照	100	6
桦褐孔菌提取物实例1d)1x10<sup>-4</sup>(w/v)	241	12
			桦褐孔菌提取物实例1d)1x10<sup>-4</sup>(w/v)	226	16

结论：桦褐孔菌提取物使角化细胞中胶原蛋白IV的表达增加了至少100％，示出其增加表皮连接的内聚力的能力。因此，此提取物使得可以增加肤色的光泽度。

使用根据实例1k)的提取物获得了相同的结果。

实例4b)纤维母细胞

方案：接种正常(非病理性)纤维母细胞，将其在特定培养基(正常人真皮纤维母细胞，Promocell公司)中培养两天，并然后在存在或不存在根据实例1d)制备的桦褐孔菌提取物的情况下培育48小时的时间段。培养后，将细胞在-20℃下用丙酮固定10分钟，用磷酸盐缓冲盐水(PBS)缓冲液洗涤，并然后在血清溶液中培育30分钟。将抗胶原蛋白IV一抗在室温(20℃)下培育2小时。用PBS洗涤后，在室温(20℃)下且在黑暗中，施用偶联至Alexa 488的二抗持续45分钟。在室温(20℃)下洗涤几次持续5分钟后，施用复染剂伊文思蓝。使用共聚焦显微镜(TCS-SP2，徕卡公司(Leica))进行观察。

结果与结论：图3。

桦褐孔菌提取物使纤维母细胞中胶原蛋白IV的蛋白质表达增加，示出其增加表皮连接的内聚力的能力。因此，根据本发明的提取物增加了皮肤肤色的光泽度。

使用根据实例1k)的提取物获得了相同的结果。

实例4c)内皮细胞

方案：在37℃下(5％CO₂)在对内皮细胞具有特异性的培养基中，培养正常的内皮细胞(不是源自病理组织)直到达到汇合。在存在或不存在根据实例1d)制备的桦褐孔菌提取物的情况下，将细胞培育48小时。处理之后，在-20℃下将细胞用丙酮固定10分钟。用PBS缓冲液洗涤后，将切片放置在血清溶液中持续30分钟。将抗胶原蛋白IV一抗在室温(20℃)下培育2小时。用PBS洗涤后，在室温下且在黑暗中，施用偶联至Alexa 488的二抗持续45分钟。在室温下洗涤几次持续5分钟后，施用复染剂伊文思蓝。使用共聚焦显微镜(TCS-SP2，徕卡公司(Leica))进行观察。

结果与结论：图4。

这些结果示出桦褐孔菌提取物增加内皮细胞中IV型胶原蛋白的蛋白质表达并且因此增加内皮细胞的内聚力的能力。因此，根据本发明的桦褐孔菌提取物使得可以防止眼周区域中出现眼袋和/或黑眼圈和/或减少眼周区域中的眼袋和/或黑眼圈。

使用根据实例1k)的提取物获得了相同的结果。

实例5：在根据本发明的提取物的存在下标记物HSP70的蛋白质表达的增加

方案：将纤维母细胞在37℃的温度下、在5％CO₂和95％相对湿度下在FGM(纤维母细胞生长培养基)培养基中培养，直到达到汇合。将细胞在存在或不存在根据实例1d)制备的桦褐孔菌提取物的情况下培育48小时的时间段。将细胞用PBS(磷酸盐缓冲盐水)缓冲液冲洗并然后裂解。将裂解物收集并用兔抗-HSP70一抗随后用二抗培育30分钟的时间段。将样品洗脱40分钟以使得能够通过自动蛋白质印迹法根据其分子量来分离蛋白质。在通过化学发光法显示后进行蛋白质HSP70的检测。使用商业的BCA(二喹啉甲酸测定)试剂盒量化在细胞裂解物中包含的蛋白质的量。将这些结果相对于蛋白质的量合理化，并以百分比表示。

结果：

表2

	平均值(％)	SD
			对照	100.0	5.8
桦褐孔菌提取物实例1d)0.002％(w/v)	133.8	7.7

结论：桦褐孔菌提取物示出其对于增加标记物HSP70的蛋白质表达的有效性，并因此其在增加真皮-表皮连接的内聚力的有效性，并且因此使得可以保持和/或增加皮肤肤色的光泽度。

使用根据实例1k)的提取物获得了相同的结果。

实例6：在桦褐孔菌提取物的存在下肤色的光泽度的增加和泛红的减少的体内测量

方案：临床测试在从35岁至58岁的33名女性群体上进行，这些女性呈现出面部泛红。将在实例9中描述的含有相对于组合物的总重量按重量计0.2％的根据实例1c)制备的桦褐孔菌提取物的组合物施用至所述关注的群体的面部的一半，一天二次持续7和28天。将不具有桦褐孔菌提取物(用水代替)的组合物作为对照施用至所述群体的面部的另一半。

使用色度计通过测量参数a*和L*在时间0(在第一次施用之前)、T7和T28(分别是7和28天)测量皮肤的泛红的强度和明亮外观。参数a*的减少反映了泛红的强度的降低。参数L*的增加反映了皮肤的明亮外观的增加。

结果：

表3：体内泛红结果(参数a*)

	平均值a*
		对照T0	15.9
对照T7	15.4
		对照T28	16
桦褐孔菌提取物0.01％(w/v组合物)T0	15.9
		桦褐孔菌提取物0.01％(w/v组合物)T7	14.9*
桦褐孔菌提取物0.01％(w/v组合物)T28	14.9**

*P<0.05；**P<0.001(学生检验)

结论：与对照相比，施用包含桦褐孔菌提取物的组合物7和28天之后测得一半面部的泛红强度的显著降低，反映了桦褐孔菌提取物用于防止和减少皮肤的泛红的能力。

表4：皮肤的明亮外观(参数L*)的体内结果

使用根据实例1k)的提取物获得了相同的结果。

	平均值L*
		对照T0	59.7
对照T28	59.5
		桦褐孔菌提取物0.01％(w/v组合物)T0	59.7
桦褐孔菌提取物0.01％(w/v组合物)T28	60.1*

*P<0.001(学生检验)

结论：与对照相比，施用包含桦褐孔菌提取物的组合物28天之后测得参数L*并且因此皮肤的明亮外观的显著增加。因此，桦褐孔菌提取物有效增加皮肤肤色的光泽度。

使用根据实例1k)的提取物获得了相同的结果。

实例7：在桦褐孔菌提取物的存在下增加外皮蛋白的表达

方案：将正常(非病理性)人角化细胞在2％胎牛血清和0.03mM钙存在下在37℃(5％CO₂)下培养3天的时间段，并然后在存在两种增加浓度的桦褐孔菌提取物的情况下或不存在所述提取物的情况下培育另外三天(如实例1d)中制备的桦褐孔菌提取物)。提取蛋白质外皮蛋白并通过ELISA技术测量其量。结果表示为相对于对照(不添加提取物的情况下的培养)的平均百分比(n＝3)。

结果：

表5：外皮蛋白

	外皮蛋白平均值(％)
		对照	100
桦褐孔菌提取物实例1d)0.003％(w/v)	207*
		桦褐孔菌提取物实例1d)0.01％(w/v)	486*

*P<0.05(学生检验)

结论：所述提取物示出其对于增加人角化细胞中外皮蛋白的蛋白质表达以及对于将其分化为角质层细胞的有效性，使得可以改善表皮的内聚力，还能够改善皮肤的屏障功能。

使用根据实例1k)的提取物获得了相同的结果。

实例8：在桦褐孔菌提取物存在下的表皮的内聚力的增强

方案：将从健康的59岁供体获得的“正常”人角化细胞(即，不呈现出任何病状的角化细胞)在存在或不存在(对照)两种不同的最终浓度的根据实例1d)制备的桦褐孔菌提取物的情况下培养48小时的时间段，并然后移除细胞培养基。收获细胞，并然后用特定的裂解缓冲液(CellLytic，西格玛公司(Sigma))裂解，以便进行免疫定位(蛋白质印迹法)。通过BCA法确定蛋白质浓度。蛋白质通过毛细管电泳使用抗整联蛋白β-1、抗密封蛋白-1和抗闭合蛋白一抗进行鉴定，并然后使用过氧化物酶偶联的缀合二抗进行免疫定位。相对于未处理的对照量化并表示结果。

结果：

表6：整联蛋白β-1

	平均值
		对照	100
桦褐孔菌提取物实例1d)0.01％(w/v)	189*

*P<0.01(学生检验)

表7：密封蛋白-1(C)和闭合蛋白(O)

	平均值C	平均值O
			对照	100	100
桦褐孔菌提取物实例1d)0.001％(w/v)	116*	133**
			桦褐孔菌提取物实例1d)0.01％(w/v)	120**	162**

*P<0.01；**P<0.001(学生检验)

结论：桦褐孔菌提取物示出其刺激皮肤角化细胞中整联蛋白β-1、密封蛋白-1和闭合蛋白合成的能力。因此，所述提取物有效增加表皮的内聚力，并且可以用于保护和舒缓敏感和/或不耐受和/或反应性皮肤。

使用根据实例1k)的提取物获得了相同的结果。

实例9)用于面部的配制品

配制品9a)

配制品9b)

水	Qs 100.00
		椰油酰基辛酸酯/癸酸酯	7.50
鲸蜡硬脂醇	4.00
		辛酸丙基庚基酯	2.50
丙二醇、苯氧基乙醇、氯苯甘醚、对羟基苯甲酸甲酯	2.50
		碳酸二丙基庚基酯	2.00
甘油	1.50
		蔗糖聚硬脂酸酯、棕榈酸鲸蜡酯	1.00
桦褐孔菌提取物(实例1j)	0.20
		氢氧化钠	0.32
卡波姆	0.20

Claims (11)

1.桦褐孔菌提取物用于防止眼周区域中出现黑眼圈和/或眼袋和/或减少眼周区域中的黑眼圈和/或眼袋、和/或用于维持和/或增加皮肤微循环的旨在用于健康皮肤和/或黏膜的非治疗性化妆品用途。

2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述提取物通过在亚临界条件下提取到水中而获得。

3.根据权利要求1和2中任一项所述的用途，其用于保护和/或舒缓脆弱和/或薄的皮肤和/或黏膜和/或敏感黏膜。

4.根据权利要求1至3中任一项所述的用途，其特征在于，所述提取物以相对于包含至少一种化妆品上可接受的赋形剂的化妆品组合物的总重量按重量计在0.0001％与20％之间、优选按重量计在0.001％与5％之间的浓度包含在所述组合物中。

5.一种美容护理方法，所述美容护理方法旨在用于健康皮肤和/或黏膜，包括口服和/或局部、优选局部施用桦褐孔菌提取物或包含所述桦褐孔菌提取物的化妆品组合物，用于防止眼周区域中出现黑眼圈和/或眼袋和/或减少眼周区域中的黑眼圈和/或眼袋和/或用于维持和/或增加皮肤微循环。

6.根据权利要求5所述的美容护理方法，其特征在于，将所述桦褐孔菌提取物或所述包含所述桦褐孔菌提取物的化妆品组合物施用至面部、头皮和/或黏膜和/或身体的选自以下的全部或一部分：小腿，手，大腿，腹部，胸肩部，颈部，手臂，躯干，背部，面部、尤其是眼周区域，有利地所述胸肩部和/或所述面部并且尤其是所述眼周区域，甚至更有利地所述眼周区域。

7.一种桦褐孔菌提取物或包含所述桦褐孔菌提取物的皮肤病学组合物，其用于防止和/或减少由皮肤组织的内聚力的减少产生的选自刺痛和/或红血丝的病状。

8.根据权利要求7所述的桦褐孔菌提取物或包含所述桦褐孔菌提取物的皮肤病学组合物，其用于处理不耐受和/或反应性皮肤和/或黏膜。

9.根据权利要求7和8中任一项所述的桦褐孔菌提取物，其特征在于，所述桦褐孔菌提取物是如在权利要求2中所定义的。

10.根据权利要求7至9中任一项所述的桦褐孔菌提取物，其特征在于，所述桦褐孔菌提取物以相对于皮肤病学组合物的总重量按重量计在0.0001％与20％之间、优选按重量计在0.001％与5％之间的浓度包含在所述组合物中。

11.根据权利要求7至10中任一项所述的桦褐孔菌提取物或包含所述桦褐孔菌提取物的皮肤病学组合物，其用于局部用于面部和/或头皮和/或黏膜和/或身体的选自以下的全部或一部分上：小腿，手，大腿，腹部，胸肩部，颈部，手臂，躯干，背部，面部、尤其是眼周区域，有利地所述胸肩部和/或所述面部并且尤其是所述眼周区域，甚至更有利地所述眼周区域。

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