KR101150226B1 - 차가버섯 가수분해 효소 추출물을 함유하는 항산화 조성물 - Google Patents
차가버섯 가수분해 효소 추출물을 함유하는 항산화 조성물 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 차가버섯(Inonotus Obliquus) 가수분해 효소 추출물을 함유하는 항산화 조성물에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 차가버섯에 효소를 처리함으로써 단백질 또는 당 가수분해 효소반응을 통해 제조한 차가버섯 가수분해 효소 추출물과, 이를 유효성분으로 함유하는 항산화 조성물 및 상기 차가버섯 가수분해 효소 추출물을 제조하는 방법에 관한 것이다.
본 발명에 따른 항산화 조성물은 천연물 유래의 물질로, 독성 및 부작용이 없으며, 탁월한 항산화 효과를 나타내므로 활성산소에 의해 생성되는 산화물들이 기인하는 노화 및 각종 질환의 억제 또는 치료에 안전하고 효과적으로 이용될 수 있다.
본 발명에 따른 항산화 조성물은 천연물 유래의 물질로, 독성 및 부작용이 없으며, 탁월한 항산화 효과를 나타내므로 활성산소에 의해 생성되는 산화물들이 기인하는 노화 및 각종 질환의 억제 또는 치료에 안전하고 효과적으로 이용될 수 있다.
Description
본 발명은 차가버섯(Inonotus Obliquus) 가수분해 효소 추출물을 함유하는 항산화 조성물에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 차가버섯에 효소를 처리함으로써 단백질 또는 당 가수분해 효소반응을 통해 제조한 차가버섯 가수분해 효소 추출물과, 이를 유효성분으로 함유하는 항산화 조성물 및 상기 차가버섯 가수분해 효소 추출물을 제조하는 방법에 관한 것이다.
산소는 지구상에서 가장 많은 원소로서(53.8%) 건조대기 중의 21%를 차지하고 있으며, 모든 생물체들은 산소를 이용하여 생명 유지에 필요한 에너지를 발생하게 된다. 그러나, 이와 같이 생명 유지에 절대적으로 필요한 산소이지만 안정한 분자상태인 기저삼중항산소(ground state triplet oxygen)가 체내 효소계, 환원대사, 화학약품, 공해물질, 광화학반응 등의 각종 물리적, 화학적, 환경적 요인 등에 의하여 수퍼옥사이드 라디칼(superoxide radical, O2?), 하이드록실 라디칼(hydroxyl radical, HO?), 과산화수소(hydrogen peroxide, H2O2), 일중항산소(singlet oxygen, HO?)와 같은 반응성이 매우 큰 활성산소(active oxygen)로 전환되면 생체에 치명적인 산소 독성을 일으키는 양면성을 지니고 있다. 즉, 이들 활성산소는 세포구성 성분들인 지질, 단백질, 당, DNA 등에 대하여 비선택적, 비가역적인 파괴 작용을 함으로써 노화는 물론 암을 비롯하여 뇌졸중, 파킨슨병 등의 뇌혈관 심장질환, 허혈, 동맥경화, 피부질환, 소화기질환, 염증, 류마티스, 자기면역질환 등의 각종 질병을 일으키는 것으로 알려져 있다(Halliwell B. 1991. Drug antioxidant effects. Drugs 42: 596-605). 또한, 이들 활성산소에 의한 지질과산화 결과 생성되는 지질과산화물을 비롯하여 여러 가지 체내 과산화물도 세포에 대한 산화적 파괴로 인한 각종 기능장애를 야기함으로써 노화와 질병의 원인이 되기도 한다.
한편, 정상적인 세포에서도 대사과정 중 어느 정도의 자유 라디칼(free radical)과 기타 활성산소 및 과산화물이 생성되고 있으나, 생체내에는 이들에 대한 방어기구로서 SOD(superoxide dismutase), 퍼옥시다제(peroxidase), 카탈레이즈(catalase) 등의 항산화효소와 함께 비타민 E, 비타민 C, 글루타티온(glutathione), 유비퀴논(ubiquinone, 코엠자임 Q10), 요산 등과 같은 항산화물질이 존재하여 스스로를 보호하고 있다. 그러나 이와 같은 생체방어기구에 이상이 초래되거나 각종 물리적, 화학적 요인들에 의하여 활성산소의 생성이 생체방어계의 용량을 초과하게 될 경우 산화적 스트레스가 야기된다. 따라서, 이와 같은 자유 라디칼을 소거할 수 있는 화합물 또는 과산화물 생성 억제물질과 같은 항산화제들은 이들 산화물들에 기인하는 노화 및 각종 질환의 억제 또는 치료제로서 기대된다.
항산화제에 대한 연구는 1969년 McCord와 Fridovich가 수퍼옥사이드 라디칼을 소거하는 효소인 SOD를 발견한 것을 계기로 본격적으로 진행되었으며, 최근에는 노화나 성인병 등의 질환이 활성산소의 존재에 의한 것으로 알려져, 활성산소를 조절할 수 있는 항산화제에 관한 연구가 활발히 진행되고 있다. 항산화제로는 효소계인 SOD, 카탈레이즈 외에 BHT(tert-butylhydroxytoluene), BHA(tert-butylhydroxyanisol) 등과 같은 합성 항산화제 및 토코페롤(tocopherol), 아스코르브산(ascorbic acid), 탄닌, 카로테노이드(carotenoids), 플라보노이드(flavonoids) 등과 같은 일부 천연 항산화제가 있으며, 그 외에도 다양한 종류의 항산화제 개발이 이루어지고 있다(Kitahara K., Matsumoto Y., Ueda H.A. and Ueoka R. 1992. Chem. Pharm. Bull. 40: 2208-2209; Hatano T. 1995. Natural Medicines 49: 357-363).
그러나, 이들 항산화제는 독성, 낮은 활성 및 용도의 한계성 등의 여러 가지 문제로 인하여 사용에 제한을 받고 있다.
이에 본 발명자들은 독성 및 부작용이 거의 없는 천연물 유래의 항산화제를 개발하기 위하여 예의 노력한 결과, 차가버섯(Inonotus Obliquus)의 가수분해 효소추출물이 자유라디칼 소거 효능을 측정하여 우수한 항산화 효과를 갖는 것을 확인하고 본 발명을 완성하였다.
결국, 본 발명의 주된 목적은 차가버섯에 효소를 처리함으로써 단백질 또는 당 가수분해 효소 반응을 통해 제조한 차가버섯 가수분해 효소 추출물과, 이를 유효성분으로 함유하는 항산화 조성물 및 상기 차가버섯 가수분해 효소 추출물을 제조하는 방법을 제공하는데 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 차가버섯(Inonotus Obliquus)에 효소를 처리함으로써 단백질 또는 당 가수분해 효소 반응을 통해 제조한 차가버섯 가수분해 효소 추출물을 제공한다.
본 발명에서, 상기 차가버섯 가수분해 효소 추출물은 차가버섯을 pH 2.0 내지 8.0의 완충액 중에서 단백질 또는 당 가수분해 효소를 처리하여 제조되는 것을 특징으로 한다.
또한, 본 발명은 상기 차가버섯 가수분해 효소 추출물을 유효성분으로 함유하는 항산화 조성물을 제공한다.
상기 항산화 조성물은 자유라디칼 소거 효능을 가지므로 활성산소에 의해 생성되는 산화물들에 기인하는 노화 및 각종 질환의 치료 및 예방에 우수한 효과를 나타내며, 특히, 노화, 만성알콜중독, 죽상동맥경화증, 암, 관상심장질환, 백내장, 당뇨병, 다운증후군, 간염, 허혈이나 재관류성 손상, 류마티스성 관절염, 관절염, 신부전증, 염증반응, 각종 퇴행성 신경질환, 뇌졸중 발작 및 심근경색 등의 이상을 개선함으로써 상기 질환의 치료 및 예방이 가능하다.
또한, 본 발명은 상기 차가버섯 가수분해 효소 추출물을 제공하는 방법을 제공한다.
본 발명의 차가버섯(Inonotus Obliquus) 가수분해 효소 추출물은 자유 라디칼 소거능이 우수하여 탁월한 항산화 효과를 나타내므로, 본 발명에 따른 추출물을 포함하는 조성물은 활성산소에 의해 생성되는 산화물들에 기인하는 노화 및 각족 질환의 억제 또는 치료에 효과적이다.
또한 본 발명의 차가버섯 가수분해 효소 추출물은 천연물에서 유래한 물질로써 독성 및 부작용 없이 안전하게 사용될 수 있다.
도 1은 본 발명의 차가버섯(Inonotus Obliquus) 가수분해 효소 추출물의 제조 공정을 나타낸 모식도이다.
도 2는 본 발명의 차가버섯 펩신(Pepsin) 가수분해 효소 추출물의 활성산소종 생성 억제능을 나타낸 것이다.
도 3은 본 발명의 차가버섯 가수분해 효소 추출물의 산화적 스트레스로 인한 DNA 손실에 대한 DNA 보호능력을 측정한 전기영동 사진이다.
도 2는 본 발명의 차가버섯 펩신(Pepsin) 가수분해 효소 추출물의 활성산소종 생성 억제능을 나타낸 것이다.
도 3은 본 발명의 차가버섯 가수분해 효소 추출물의 산화적 스트레스로 인한 DNA 손실에 대한 DNA 보호능력을 측정한 전기영동 사진이다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 항산화 효능을 갖는 차가버섯(Inonotus Obliquus) 가수분해 효소 추출물을 제공한다.
본 발명의 차가버섯(Inonotus Obliquus)은 대체적으로 검은 색상을 띠며, 길이 40 ㎝, 둘레 15 ㎝, 무게 5 ㎏이 되려면 보통 10~15년이 걸린다. 나무에 붙어있는 접합부분은 부드러운 밝은 빛깔을 가지고 있으며, 쉽게 표면하면 자작나무의 버섯이다. 러시아 캄차카 반도가 주 생산지이고, 효능으로는 당뇨와 교혈압에 효과적으며, 칼슘, 마그네슘, 철 등의 생리학적 요소들이 다량 함유되어 있어 차나 약재로 많이 사용되고 있다.
본 발명의 차가버섯 가수분해 효소 추출물은 상기의 차가버섯을 pH 2.0 내지 8.0의 인산염 완충액, 아세트산 완충액 및 글리신-HCl 중에서 선택된 1종 이상의 용매를 사용하여 용해시킨 후, 여기에 효소 또는 효소 혼합물을 첨가하여 가수분해 반응을 진행시켜 제조되는 것이 바람직하다.
상기 효소는 단백질을 가수분해 하는 단백질 가수분해 효소 또는/및 당을 가수분해 하는 당 가수분해 효소로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상이 포함되는 것이 바람직하며, 더욱 바람직하게는 프로타맥스(Protamex), 플라보자임(Flavourzyme), 뉴트라제(Neutrase), 알카라제(Alcalase), 파파인(Papain), 키모트립신(α-caymotrypsin), 트립신(Trypsin), 펩신(Pepsin), 프로모자임(Promozyme), 셀루클라스트(Celluclast), 말토게나제(Maltogenase), 비스코자임(Viscozyme), 테르마밀(Termamyl), 덱스트로자임(Dextrozyme), 아밀로글루코시다제(Amlyroglucosidase), α,β-글루코시다제(α,β-glucoxidase), 펙티나제(Pectinase), 나린지나제(Naringinase), 셀루라제(Cellulase), 헤미셀룰라제(hemicellulase) 등에서 선택되는 1종 이상인 것이 좋다.
또한, 본 발명에서 상기 "추출물"은 추출액, 정제물, 희석액, 농축액, 및 건조물을 모두 포함한다.
본 발명은 또한 상기 차가버섯(Inonotus Obliquus) 가수분해 효소 추출물을 유효성분으로 하는 항산화 조성물을 제공한다.
본 발명의 차가버섯 가수분해 효소 추출물은 DPPH 라디칼, 하이드록실 라디칼, 알킬 라디칼 등의 소거능 실험을 통해 항산화 효과가 우수한 것을 확인할 수 있었다.
따라서, 상기 차가버섯 가수분해 효소 추출물을 유효성분으로 하는 항산화 조성물은 활성산소에 의해 생성되는 산화물들에 기인하는 노화 및 각종 질환, 바람직하게는 노화, 만성알콜중독, 죽상동맥경화증, 암, 관상심장질환, 백내장, 당뇨병, 다운증후군, 간염, 허혈이나 재관류성 손상, 류마티스성 관절염, 관절염, 신부전증, 염증반응, 각종 퇴행성 신경질환, 뇌졸중 발작 및 심근경색 등에서 선택되는 1종 이상의 질환을 억제 또는 치료하기 위한 의약품, 건강보조세, 화장료, 식품, 식품 첨가제 등에 유용하게 이용될 수 있으며, 이에 의해 제한되지는 않는다.
본 발명의 조성물이 의약품으로 이용될 경우에는 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있으며, 통상적인 방법에 따라 약학적으로 허용되는 제형으로 제조될 수 있다.
상기 담체 또는 부형제로는 물, 덱스트린, 칼슘카보네이느, 락토스, 프로필렌글리콜, 리퀴드, 파라핀, 생리식염수, 덱스트로스, 수크로즈, 솔비통, 만니톨, 자이리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸셀룰로즈, 폴리비닐피릴리돈, 메틸하이드록시벤조에이트, 프로필하이드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테라레이트 및 광물류가 있으며, 이들은 1종 이상 사용될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니며 통상의 담체 및 부형제는 모두 사용 가능하다.
또한, 항산화 조성물을 약제화 하는 경우, 통상의 충진제, 증량제, 결합제, 붕해제, 계면활성제, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제 또는 방부제 등을 더 포함할 수 있다.
본 발명의 조성물이 화장료로 이용될 경우에는 주름개선 및 미백 기능성 화장품, 유연화장수, 영양화장수, 아이크림, 영양크림, 맛사지크림, 클렌징크린, 에센스 등의 제형으로 제조될 수 있으며, 각 제형의 화장료 조성물에 있어서, 차가버섯 가수분해 효소 추출물을 포함하여 주름개선 및 미백 원료 또는 통상의 화장료 원료로서 이외의 성분들을 화장료의 제형 또는 사용목적 등에 따라 당업자가 어려움 없이 적의 선정하여 배합할 수 있다.
본 발명은 또한, 상기 차가버섯(Inonotus Obliquus) 가수분해 추출물의 제조방법을 제공한다.
구체적으로, 본 발명의 제조방법은, (1) 차가버섯(Inonotus Obliquus)을 완충액 중에 용해시키는 단계; (2) 상기에 단백질 또는 당 가수분해 효소를 첨가하는 단계; 및 (3) 상기를 30 내지 70℃ 범위의 반응온도에서 6 내지 10시간 가수분해하는 단계;를 포함할 수 있다.
본 발명에서, 상기 완충액은 pH 2.0 내지 8.0의 인산염 완충액, 아세트산 완충액 및 글리신-HCl 중에서 선택되는 1종 이상인 것이 바람직하다. 또한, 상기 단백질 가수분해 효소는 프로타맥스(Protamex), 플라보자임(Flavourzyme), 뉴트라제(Neutrase), 알카라제(Alcalase), 파파인(Papain), 키모트립신(α-Caymotrypsin), 트립신(Trypsin), 펩신(Pepsin) 등에서 선택되는 1종 이상인 것이 바람직하며, 상기 당 가수분해효소는 프로모자임(Promozyme), 셀루클라스트(Celluclast), 말토게나제(Maltogenase), 비스코자임(Viscozyme), 테르마밀(Termamyl), 덱스트로자임(Dextrozyme), 아밀로글루코시다제(Amlyroglucosidase), α,β-글루코시다제(α,β-glucoxidase), 펙티나제(Pectinase), 나린지나제(Naringinase), 셀루라제(Cellulase), 헤미셀룰라제(hemicellulase) 등에서 선택되는 1종 이상인 것이 바람직하다.
또한, 본 발명에서 가수분해시 pH와 반응온도는, 가수분해 효소의 적정 pH와 적정 온도에 따라 달라질 수 있는데, 바람직하게는 단백질 가수분해 효소를 사용하는 경우, pH 6.0 내지 8.0의 인산염 완충액(Phosphate buffer, PB) 또는 pH 2 내지 3의 글리신-HCl(Glycine-HCl, GH) 중에 용해하여 반응온도 30 내지 60℃에서, 또한 당 가수분해 효소의 경우에는 pH 4 내지 5의 아세트산 완충액(Sodium acetate-acetic acid buffer, SB) 또는 pH 5 내지 7의 인산염 완충액(Phosphate buffer, PB) 중에 용해하여 40 내지 70℃에서 6 내지 10시간, 더욱 바람직하게는 8시간 동안 반응시키는 것이 바람직하다.
또한, 가수분해 반응 후에는 100℃에서 5 내지 20분간 가열하여 가수분해 반응을 종결시키는 것이 바람직하다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예 1. 차가버섯 단백질 가수분해 효소 추출물 제조
음지에서 건조한 차가버섯(Inonotus Obliquus)을 마쇄기로 분쇄하여 분말화 한 차가버섯 분말에 0.1 M 인산염 완충액(phosphate buffer, PB; pH 7.0)을 차가버섯 분말 : 인산염 완충액 = 1 : 50의 비율(w/w)로 용해한 후, 30분간 150 rpm으로 교반하면서 30~60℃로 예열한 다음, 여기에 단백질 가수분해 효소를 상기 차가버섯 분말과 1 : 50의 비율(w/w)로 첨가하였다.
이때, 상기 단백질 가수분해 효소는 프로타맥스(Protamex), 플라보자임(Flavourzyme), 뉴트라제(Neutrase), 알카라제(Alcalase), 키모트립신(α-Caymotrypsin), 펩신(Pepsin), 트립신(Trypsin), 파파인(Papain)을 사용하였으며, 8시간 동안 180 rmp에서 교반하여 가수분해 후, 가수분해가 완료되면 100℃에서 10분간 가열하여 반응을 종료시켰다.
단, 단백질 가수분해 효소로 펩신을 사용하는 경우에는 0.1 M 글리신-HCl(glycine-HCl, GH; pH 2.2)을 사용하였다.
반응액은 감압증발기로 농축시킨 다음 동결건조하여 차가버섯 단백질 가수분해 추출물을 제조하였다.
실시예 2. 차가버섯 당 가수분해 효소 추출물 제조
차가버섯(Inonotus Obliquus) 분말에 0.1M 아세트산 완충액(sodium acetate-acetatic acid buffer, SB; pH 4.5~5.0)을 차가버섯 분말 : 아세트산염 완충액 = 1 : 50의 비율(w/w)로 용해한 후, 30분간 150 rpm으로 교반하면서 50~60℃로 예열한 다음, 여기에 당 가수분해 효소를 상기 차가버섯 분말과 1 : 50의 비율(w/w)로 첨가하였다.
이때, 상기 당 가수분해 효소는 프로모자임(Promozyme), 셀루클라스트(Celluclast), 말토게나제(Maltogenase), 비스코자임(Viscozyme), 테르마밀(Termamyl), 덱스트로자임(Dextrozyme), 아밀로글루코시다제(Amlyroglucosidase, AMG)를 사용하였으며, 8시간 동안 180 rmp에서 교반하여 가수분해 후, 가수분해가 완료되면 100℃에서 10분간 가열하여 반응을 종료시켰다.
단, 당 가수분해 효소로 테르마밀을 사용하는 경우에는 0.1 M 인산염 완충액(pH 6.0)을 사용하였다.
반응액은 감압증발기로 농축시킨 다음 동결건조하여 차가버섯 당 가수분해 추출물을 제조하였다.
본 발명에서 사용된 효소의 조성 및 반응 조건은 하기 표 1에 나타내었다.
| 효소 | 적정 조건 | 사용된 완충액a |
효소 조성 | |
| pH | 온도 | |||
| 프로타멕스 (Protamex) |
7.0 | 50℃ | 0.1 M PBb | Hydrolysis of food proteins |
| 플라보자임 (Flavourzyme) |
7.0 | 50℃ | 0.1 M PB | Containing both endoprotease and exopeptidase activities |
| 뉴트라제 (Neutrase) |
7.0 | 50℃ | 0.1 M PB | An endo protease |
| 알카라제 (Alcalase) |
7.0 | 50℃ | 0.1 M PB | A endoprotease |
| 프로모자임 (Promozyme) |
5.0 | 60℃ | 0.1 N SBc | Debranching enzymes known as pullulanases |
| 셀루클라스트 (Celluclast) |
4.5 | 50℃ | 0.1 N SB | Catalyzing the breakdown of cellulose into glucose, cellobiose and higher glucose polymer |
| 말토게나제 (Maltogenase) |
5.0 | 60℃ | 0.1 N SB | An alpha-amylase |
| 비스코자임 (Viscozyme) |
4.5 | 50℃ | 0.1 N SB | Arabanase, celluiase, β-glucanase, hemi-cellulase and xyianase |
| 테르마밀 (Termamyl) |
6.0 | 60℃ | 0.1 M PB | A heat-stable α-amylase |
| 덱스트로자임 (Dextrozyme) |
4.5 | 60℃ | 0.1 N SB | A glucoamylase and pullulanase |
| 아밀로글루코시다제 (Amyloglucosidase) |
4.5 | 60℃ | 0.1 N SB | An exo-1,4-α-d-glucosidase |
| 파파인 (Papain) |
7.0 | 37℃ | 0.1 M PB | a digestive enzyme in the juice of papaya fruits and leaves, used for tenderizing meat |
| 펩신 (Pepsin) |
2.2 | 37℃ | 0.1 N GHd | a digestive enzyme produced by the gastric glands that catalyses the partial breakdown of dietary protein |
| 키모트립신 (α-chymotrypsin) |
7.0 | 37℃ | 0.1 M PB | A serine protease |
| 트립신 (tripsing form porcine pancreas) |
7.0 | 37℃ | 0.1 M PB | designation for enzyme preparations derived from porcine pancreas |
단, 상기에서 a는 효소 가수분해(in Ezymatic hydrolysis), b는 인산염 완충액(phosphate buffer), c는 아세트산 완충액(sodium acetate-acetic acid) 및 d는 글리신-HCl(glycine-HCl)을 의미한다.
실험예 1. DPPH 라디칼 소거능을 이용한 항산화 효과 확인
본 발명에 따른 차가버섯 가수분해 효소 추출물의 항산화 효과를 확인하기 위하여, 전자스핀공명기기(ESR spectrometer, JEX-PX 2000-300 모델, JEOL, 일본)를 이용하여 DPPH(1,1-다이페닐-2-피크릴하이드라질) 라디칼의 소거능을 측정하였다.
DPPH는 짙은 자주색을 나타내며, 그 자체가 질소 중심의 라디칼로서, 라디칼 전자의 비편재화에 의해 안정화된 상태로 존재하는데, ESR을 이용한 DPPH 라디칼 소거능 측정방법을 다음과 같다.
구체적으로, 메탄올에 용해시킨 30 μM의 DPPH 30 ㎕와 초순 증류수에 용해시킨 실시예 1 및 실시예 2에서 제조한 농도별 차가버섯 가수분해 추출물 30 ㎕를 혼합한 후 10초간 강하게 볼텍스(vortex)하여 2분간 실온에서 방치한 다음 모세관 튜브(capillary tube)에 옮겨 ESR 스펙트로미터에서 측정하였다[측정조건 - central field: 3475G, modulation frequency: 100 ㎑, modulation amplitude: 2G, micro power: 5 ㎽, gain: 6.3×105, 온도: 298K].
본 발명의 8종의 단백질 가수분해 효소 추출물과 7종의 당 가수분해 효소 추출물에 대한 결과는 표 2에 나타낸 바와 같다.
하기 표 2에서도 알 수 있듯이, 본 발명의 차가버섯 단백질 및 당 가수분해 효소 추출물은 농도 의존적으로 DPPH 라디칼을 소거하였으며, 특히 단백질 가수분해 효소 중에서는 프로타맥스(Protamex)의 추출물이 DPPH 라디칼 소거 활성이 가장 높았으며, 이때 IC50값은 150 ㎍/㎖이었다. 또한, 당 가수분해 효소 중에서는 셀루클라스(Celluclast) 추출물이 IC50값 155 ㎍/㎖로 DPPH 라디칼 소거 활성이 가장 높았다.
| 효소 | IC50 (㎎/㎖) | 효소 | IC50 (㎎/㎖) | ||
| 당 가수분해 효소 |
Viscozyme | 0.175±0.016 | 단백질 가수분해 효소 |
α-chymotrypsin | 0.179±0.018 |
| Celluclast | 0.155±0.016 | Alcalase | 0.165±0.022 | ||
| Dextrozyme | 0.226±0.011 | Flavozyme | 0.169±0.007 | ||
| AMG | 0.168±0.005 | Neutrase | 0.146±0.011 | ||
| Promozyme | 0.311±0.019 | papain | 0.211±0.009 | ||
| Maltogenase | 0.264±0.021 | pepsin | 0.243±0.015 | ||
| Termamyl | 0.246±0.023 | Protamax | 0.151±0.010 | ||
| - | - | trypsin | 0.208±0.013 |
실험예 2. 하이드록실 라디칼 소거능을 이용한 항산화 효과 확인
본 발명에 따른 차가버섯 가수분해 효소 추출물의 항산화 효과를 확인하기 위하여, 상기 실험예 1에서 사용한 전자스핀공명기(ESR spectrometer)를 이용해 하이드록실 라디칼 소거능을 측정하되, 철(Fe) 이온과 과산화수소가 반응하는 펜톤(Fenton) 반응에 따라 하이드록실 라디칼을 생성시켜 DMPO(5,5-디메틸-1-피롤린 N-옥사이드)-OH의 양을 측정하여 하이드록실 라디칼 소거율을 측정하였다.
구체적으로, 실시예 1 및 2의 농도별 차가버섯 가수분해 효소 추출물 2 ㎖에 0.3 M의 DMPO 0.2 ㎖, 10 mM의 FeSO4 0.2 ㎖ 및 10 mM의 H2O2 0.2 ㎖를 차례로 첨가한 후, 10초간 강하게 vortex 하여 반응 혼합물을 모세관 튜브로 옮겨 ESR 스펙트로미터에서 하이드록실 라디칼 발생량을 측정하였다[측정조건 - central field: 3475G, modulation frequency: 100 ㎑, modulation amplitude: 2G, micro power: 1 ㎽, gain: 6.3×105, 온도: 298K].
그 결과를 나타낸 표 3에서도 알 수 있듯이, 본 발명의 차가버섯 단백질 및 당 가수분해 효소 추출물은 농도 의존적으로 하이드록실 라디칼을 소거하는 것을 확인할 수 있었으며, 그 중 단백질 가수분해 효소인 펩신(Pepsin) 추출물이 IC50값 847 ㎍/㎖로 하이드록실 라디칼 소거 활성이 높았다.
| 효소 | IC50 (㎎/㎖) | 효소 | IC50 (㎎/㎖) | ||
| 당 가수분해 효소 |
Viscozyme | >1.0 | 단백질 가수분해 효소 |
α-chymotrypsin | >1.0 |
| Celluclast | >1.0 | Alcalase | >1.0 | ||
| Dextrozyme | >1.0 | Flavozyme | >1.0 | ||
| AMG | >1.0 | Neutrase | >1.0 | ||
| Promozyme | >1.0 | papain | >1.0 | ||
| Maltogenase | >1.0 | pepsin | 0.847±0.014 | ||
| Termamyl | >1.0 | Protamax | >1.0 | ||
| - | - | trypsin | >1.0 |
실험예 3. 알킬 라디칼 소거능을 이용한 항산화 효과 확인
본 발명에 따른 차가버섯 가수분해 효소 추출물의 항산화 효과를 확인하기 위하여, 상기 실험예 1에서 사용한 전자스핀공명기(ESR spectrometer)를 이용해 알킬 라디칼 소거능을 측정하였다.
알킬 라디칼은 APPH(2,2′-아조비스(2-아미디노프로판) 다이하이드로클로라이드)에 의해 생성되며, 소거능은 POBN(α-(4-프로디닐 1-옥사이드)-N-3가-부틸니트론)과의 반응물의 양으로 측정할 수 있다.
본 발명에서는 PBS(phosphate buffered saline, 인산염 완충액)에 상기 실시예 1 및 2의 농도별 차가버섯 가수분해 효소 추출물 10 ㎕, 40 mM의 AAPH 10 ㎕, 40 mM의 POBN 10 ㎕를 차례로 첨가한 후, 10초간 강하게 vortex 하여 반응 혼합물을 37℃ 수욕조(water bath)에서 30분간 반응시킨 다음, 모세관 튜브로 옮겨 ESR 스펙트로미터에서 하이드록실 라디칼 발생량을 측정하였다[측정조건 - central field: 3475G, modulation frequency: 100 ㎑, modulation amplitude: 2G, micro power: 10 ㎽, gain: 6.3×105, 온도: 298K].
그 결과, 표 4에 나타난 바와 같이, 본 발명의 차가버섯 단백질 및 당 가수분해 효소 추출물은 농도 의존적으로 알킬 라디칼을 소거하는 것을 확인할 수 있었으며, 단백질 가수분해 효소 중 플라보자임(Flavozyme)의 추출물이 알킬 라디칼 소거 활성이 가장 높았으며, 이때 IC50값은 0.082 ㎎/㎖었다. 또한, 당 가수분해 효소 중에서는 말토게네이즈(Maltogenase) 추출물이 IC50값 0.082 ㎎/㎖로 알킬 라디칼 소거 활성이 가장 높았다.
| 효소 | IC50 (㎎/㎖) | 효소 | IC50 (㎎/㎖) | ||
| 당 가수분해 효소 |
Viscozyme | 0.098±0.003 | 단백질 가수분해 효소 |
α-chymotrypsin | 0.171±0.017 |
| Celluclast | 0.319±0.012 | Alcalase | 0.098±0.013 | ||
| Dextrozyme | 0.107±0.015 | Flavozyme | 0.082±0.006 | ||
| AMG | 0.131±0.014 | Neutrase | 0.096±0.011 | ||
| Promozyme | 0.192±0.008 | papain | 0.189±0.012 | ||
| Maltogenase | 0.082±0.018 | pepsin | 0.219±0.013 | ||
| Termamyl | 0.156±0.017 | Protamax | 0.144±0.008 | ||
| - | - | trypsin | 0.094±0.018 |
실험예 4. 펩신 가수분해 추출물의 항산화 효과 확인(1)
본 발명의 펩신 가수분해 추출물의 항산화 효과를 확인하기 위하여, 신경세포 내 활성산소종(reactive oxygen species, ROS) 생성에 미치는 영향을 측정하였다.
활성산소종(ROS)는 호흡과정에서 몸속으로 들어간 산소가 산화과정에 이용되면서 여러 대사과정에서 생성되어 생체조직을 공격하고, 세포를 손상시키는 산화력이 강한 산소종으로 과잉생성시에는 우리 몸의 산화를 촉진시킨다.
본 발명에서는 6-웰 플레이트에 2.1×105개의 신경세포를 접종하고 24시간 뒤에 1 mM H2O2 또는 1 mM H2O2 + 펩신 가수분해 추출물을 처리한 후 37℃, CO2 인큐베이터에서 24시간 반응시킨 다음, 24시간 경과 후에 각 배지에 5 μM의 2′,7′-dichlorofluoroscein diacetate(DCF-DA)를 첨가하여 30분 동안 반응시키고, 이를 수확하여 유세포 분석기(FACScan, BD Science, 미국)로 활성산소종의 생성량을 측정하였다.
표 5는 본 발명의 펩신 가수분해 추출물의 활성산소종 생성량을 나타낸 것으로, 펩신 가수분해 추출물 처리군이 비처리군(control)과 비교하여 생성량이 감소한 것으로 볼 때, 본 발명의 펩신 가수분해 추출물은 활성산소종의 생성을 억제시키는 것을 알 수 있었다.
| control | H2O2 1mM | 0.125 ㎎/㎖ + H2O2 1mM |
0.25 ㎎/㎖ + H2O2 1mM |
0.5 ㎎/㎖ + H2O2 1mM |
1.0 ㎎/㎖ + H2O2 1mM |
|
| Ros generation |
147.17±8.9 | 179.18 ±8.9 |
176.04 ±8.9 |
164.41 ±8.9* |
159.70 ±8.9* |
140.23 ±8.9** |
실험예 5. 펩신 가수분해 추출물의 항산화 효과 확인(2)
본 발명의 펩신 가수분해 추출물의 항산화 효과를 확인하기 위하여, 산화스트레스로 인한 신경세포 손상을 억제능을 측정하였다.
요오드 프로피디움(propidium iodine, PI)은 자동세포사멸인 아폽토시스를 측정하기 위해 자주 사용되는 형광색소로 DNA와 결합하므로 PI로 염색된 DNA 양으로부터 세포사멸과 세포주기를 유추할 수 있다.
본 발명에서는 6-웰 플레이트에 2.1×105개의 신경세포를 접종하고 24시간 뒤에 1 mM H2O2 또는 1 mM H2O2 + 펩신 가수분해 추출물을 처리한 후 37℃, CO2 인큐베이터에서 24시간 반응시키고, 반응이 완료되면 수확하여 4℃, 13,000 rpm에서 3분간 원심분리하여 상층액을 버리고 인산염 완충액 300 ㎕를 첨가하여 잘 혼합하고, tween 20 0.5%가 함유된 차가운 에탄올 1 ㎖을 첨가하여 4℃에서 고정한 다음, 24시간 후 다시 4℃, 13,000 rpm에서 3분간 원심분리하고, 상층액을 버리고 여기에 RNase 10 ㎍/㎖이 포함된 요오드 프로피디움 용액(최종 농도 50 ㎍/㎖) 300 ㎕를 첨가하여 잘 혼합한 다음 37℃에서 30분 염색하여 유세포 분석기(FACScan, BD Science, 미국)에서 세포사멸과 세포주기를 측정하였다.
도 2는 본 발명의 펩신 가수분해 추출물의 산화스트레스로 인한 신경세포 손상정도를 나타낸 것으로, 펩신 가수분해 추출물 처리군이 비처리군(control)에 비해 세포사멸 수가 감소한 것으로 볼 때 본 발명의 펩신 가수분해 추출물은 신경세포 사멸을 억제시키는 것을 알 수 있었다.
실험예 6. 자유 라디칼로부터의 DNA 보호 효과 확인
본 발명에 따른 차가버섯 가수분해 효소 추출물의 자유 라디칼로부터의 DNA 보호 효과를 확인하기 위하여, 플라스미드 DNA를 이용한 전기영동(electrophoresis)을 실시하여 하이드록실 라디칼에 의해 유도된 충격으로부터의 DNA 보호 효과를 측정하였다.
정상 플라스마드 DNA를 전기영동하면 초나선 DNA(supercoiled DNA), 선형 DNA(linear DNA), 고리열림 DNA(open circular DNA)로 나뉘어지며, 초나선 DNA가 가장 많은 양을 차지한다. 여기에 펜톤(Fenton) 반응을 실시하여 DNA에 충격을 가하면 DNA는 손실을 입고 초나선 DNA가 고리열림 DNA로 변화하는데, 초나선 DNA 양의 감소로 DNA 손실여부를 알 수 있다.
본 발명에서는 하이드록실 라디칼 소거 효과가 가장 우수한 펩신 가수분해 추출물을 가지고 DNA 보호 효과를 측정하였으며, 실험방법은 하기와 같다.
0.5 ㎍의 pBR 322 DNA, 3 ㎕의 2 mM FeSO4, 2 ㎕의 농도별 차가버섯 가수분해 효소 추출물 및 4 ㎕의 30% H2O2를 혼합하여 37℃에서 1시간 반응시키고, 상기 반응액은 EDTA로 염색된 0.8% 아가로스 겔 전기영동을 실시하여 밴드를 관찰하였다.
그 결과를 나타낸 도 3에서 보듯이, 본 발명의 차가버섯 가수분해 효소 추출물에서 정상 플라스미드 DNA(레인 1)와 비교하여 펜톤 반응 하에서 초나선 DNA가 완전히 고리열림 DNA로 전환된 것을 확인할 수 있었다(레인 2).
이는 본 발명의 차가버섯 펩신 가수분해 효소 추출물이 모두 0.125~1 ㎎의 범위에서 농도 의존적으로 DNA 보호 효과를 나타내는 것을 시사한다.
이상, 본 발명의 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
Claims (11)
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- (1) 차가버섯(Inonotus Obliquus)을 완충액 중에 용해시키는 단계;
(2) 상기 (1)단계에 의해 차가버섯이 용해된 완충액에 프로타멕스(protamex), 플라보자임(flavourzyme), 뉴트라제(neutrase), 알카라제(alcalase), 파파인(papain), 키모트립신(α-caymotrypsin), 트립신(trypsin) 및 펩신(pepsin) 중에서 선택되는 1종 이상의 단백질 가수분해 효소를 첨가하는 단계;
(3) 상기 (2)단계에 의해 단백질 가수분해 효소를 첨가한 다음 반응온도 30 내지 70℃, 반응시간 6 내지 10시간 동안 가수분해하는 단계;를 포함하는 차가버섯(Inonotus Obliquus) 가수분해 추출물의 제조방법.
- 제 7 항에 있어서,
상기 (1)단계에서 사용되는 완충액은 pH 2.0 내지 8.0의 인산염 완충액, 아세트산 완충액 및 글리신-HCl 완충액 중에서 선택되는 1종 이상인 것을 특징으로 하는 차가버섯 가수분해 추출물의 제조방법.
- 제7항의 방법으로 제조되는 차가버섯 가수분해 추출물.
- 제9항의 차가버섯 가수분해 추출물을 유효성분으로 포함하는 항산화 조성물.
- 제 10 항에 있어서,
상기 항산화 조성물은 의약품, 건강보조제, 화장료, 식품 또는 식품첨가제로 사용되는 것을 특징으로 하는 항산화 조성물.
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| H. Kayali et al. The antioxidant effect of β-Glucan on oxidative stress status in experimental spinal cord injury in rats, Neurosurgical Review, Vol.28, No.4, pp.298-302 (2005.04.30.)* |
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