CN112877345A

CN112877345A - 一种半胱氨酸脱硫酶tp0614的基因及其重组蛋白与应用

Info

Publication number: CN112877345A
Application number: CN202110122041.8A
Authority: CN
Inventors: 张军华; 陈列松; 陆路; 黄蓉; 张晶晶
Original assignee: Third Xiangya Hospital of Central South University
Current assignee: Third Xiangya Hospital of Central South University
Priority date: 2021-01-29
Filing date: 2021-01-29
Publication date: 2021-06-01
Anticipated expiration: 2041-01-29
Also published as: CN112877345B

Abstract

本发明公开了一种半胱氨酸脱硫酶TP0614的基因序列及其蛋白序列与应用，其核苷酸序列，如序列1所示。本发明中利用TP0614是一个***相关的半胱氨酸脱硫酶，在***的生存中发挥重要作用。本发明可以提供TP0614的基因序列、克隆方法、重组蛋白与制备方法，同时建立重组蛋白TP0614间接ELISA检测法。将为临床上治疗梅毒和评价其疗效提供提供更确切的疗效评估策略。

Description

一种半胱氨酸脱硫酶TP0614的基因及其重组蛋白与应用

技术领域

本发明属于生物医学技术领域，具体涉及一种半胱氨酸脱硫酶TP0614的基因序列及其蛋白序列与应用。

背景技术

***(treponema pallidum，TP)是引发梅毒的主要病原体，梅毒一种慢性传染性疾病，可通过性接触、血液及母婴传播，发病率和病死率均较高，对人们的身心健康造成严重不良影响。梅毒对人体危害严重，具有传染性强、潜伏期长、且临床表现多变等特点，给诊疗带来一定困难，所以历来是性病防治中的重点。因此，针对***在体内的生存和致病机理而开发临床梅毒诊断和疗效评价的新方法，将有助于早期诊断梅毒感染和治疗。

由于梅毒临床表型的多变性，临床上诊断和治疗梅毒感染存在一定的困难。实验室筛查梅毒主要是针对梅毒感染机体后产生的两种抗体，梅毒特异性抗体和梅毒非特异性抗体。梅毒特异性抗体检测主要用于梅毒筛查和早期诊断。而在非特异性抗体检测中，TRUST(甲苯胺红不加热血清试验)定量滴度与患者体内***数量呈正相关，常用于病情及疗效观察。在治疗方面，青霉素作为治疗梅毒的选择已经超过半个世纪，但是在不同阶段的梅毒选择合适的治疗方案的争论一直存在。因为***至今还没有培养成功，因此没有一个金标准来评估治疗。上述提到的TRUST是临床上主要的用于评估疗效的方法，但其易受免疫力下降、自身免疫性疾病或肿瘤等多种因素影响，且存在血清固定现象。此外尽管抗生素对梅毒有较好的治疗效果，但是长期使用易引起***突变且耐药率增加，且某些患者由于抗生素过敏而不耐受，梅毒感染易展为慢性、持续性感染。因此，无论在临床治疗上还是疗效评估都需要新的途径和方法以实现梅毒患者的高效治疗。

梅毒的疗效评价方面，目前常用非Tp血清学检测如VDRL、RPR、TRUST等监测梅毒的活动度，以血清滴度降低4倍以上作为治疗有效的依据。但部分患者经过规范足量抗梅毒治疗后，非Tp血清学试验可维持在低滴度达3个月以上且不继续降低，称为血清固定现象。血清固定现象严重影响了对梅毒病情、疗效的判断和下一步治疗方案的制定。

半胱氨酸脱硫酶(cysteine desulfurase,IscS)是Iron-sulfur[Fe-S]簇的支架蛋白，能够将L-半胱氨酸的硫原子转移给众多含硫生物分子进而参与生命代谢过程。研究发现半胱氨酸脱硫酶在铁硫簇的组装、tRNA的硫修饰、DNA硫修饰、硫胺素的合成、钼喋呤辅因子的合成中发挥重要功能。在原核生物中，[Fe-S]簇是维持基本生命活动所需的，参与电子转移、底物结合/活化、铁/硫储存、基因表达调控和酶活性等。而TP0614是一个***相关的半胱氨酸脱硫酶，可能分解半胱氨酸，参与含硫化合物的合成，在***的生存中发挥重要作用。

发明内容

本发明的目的是提供一种与***相关的半胱氨酸脱硫酶TP0614的基因及其重组蛋白与应用，其表达产物作为梅毒感染疗效的标记物或是治疗靶点，从而更好的检测梅毒感染和梅毒疗效评估。

本发明这种半胱氨酸脱硫酶TP0614的基因，其核苷酸序列如下序列1所示：

本发明这种获得半胱氨酸脱硫酶TP0614重组蛋白的方法，包括以下步骤：

1)全基因组DNA的获取：取经Tp Nichols株成功感染的新西兰雄兔的睾丸组织，使用Qiagen全基因组提取试剂盒提取Tp全基因组DNA；

2)TP0614基因的扩增：根据序列1中TP0614的基因以及序列2中设计的重组蛋白序列，设计扩增引物，然后将步骤1)中的Tp全基因组DNA与扩增引物进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；

3)PCR扩增产物的纯化：将步骤2)中的PCR扩增产物采用OMEGA DNA纯化试剂盒进行纯化，得到纯化后的PCR扩增产物；

4)构建重组质粒：将载重组质粒体质粒A以及步骤3)中的纯化后的PCR扩增产物TP0614分别进行双酶切，然后进将酶切后的质粒和酶切后PCR扩增产物进行连接反应，得到重组质粒A-TP0614；

5)TP0614-BL21(DE3)重组表达菌的构建：将步骤4)中的重组质粒A-TP0614转化至E.coli BL21(DE3)表达菌中，得到重组表达菌；

6)重组蛋白的TP0614诱导表达：将步骤5)中获得的重组表达菌进行培养，并诱导表达，然后收集菌体，提其重组蛋白，纯化后，得到半胱氨酸脱硫酶TP0614重组蛋白。

所述步骤2)中，扩增引物包括上游引物P1和下游引物P2，上游引物P1的序列如序列3所示，下游引物P2的序列如序列4所示。

本发明这种半胱氨酸脱硫酶TP0614重组蛋白，其氨基酸序列下序列2所示：本发明这种半胱氨酸脱硫酶TP0614重组蛋白检测梅毒的方法，包括以下步骤：

S1包被抗原：将步骤S1中Tp0614重组蛋白，用包被缓冲液进行稀释，得到稀释重组蛋白液，以100μL/孔将稀释重组蛋白液加入96孔酶标板中，4℃环境下包被整夜；

S2洗涤：接着向酶标板中每孔中加入PBST溶液进行洗板，共洗板5次，每次300μL，洗板时长每次约为120s；

S3封闭：洗涤完毕后，加入封闭液在4℃下封闭整夜；

S4洗涤：步骤同S2，得到包被的酶标板；

S5孵一抗：先用经封闭液稀释治疗前和治疗后的梅毒血清，再加入到包被酶标板的96孔板中，每孔100μL，置于环境温度为37℃的培养箱进行孵育，孵育时长约60min；

S6洗涤：步骤同S2；

S7孵二抗：向所有孔中分别加入HRP标记羊抗人IgG100μL，在37℃下孵育60min；

S8洗涤：步骤同S2。

S9显色：向各加样孔中滴入两种显色液各一滴，并在常温避光条件下5min后观察其颜色变化。

S10终止：向溶液中加入终止夜一滴；

S11检测结果：在酶标仪上采用波长为450nm的检测光对各个小孔的吸光度进行检测。

所述S1步骤中，包被缓冲液为0.05mol/L碳酸盐缓冲液，pH＝9.6，稀释重组蛋白至5μg/mL；所述S3步骤中，封闭液为5％脱脂奶粉；所述S5中，用封闭液稀释梅毒血清200倍；所述步骤S9中，两种显色剂为TMB溶液和过氧化氢尿素溶液，其中：TMB溶液的制备方法为：称取20mg四甲基联苯胺(TMB)溶于10mL无水乙醇中，待完全溶解后，加双蒸水至100mL；过氧化氢尿素溶液的制备方法为称取Na₂HPO₄·12H₂O 14.34g，柠檬酸1.87g溶于双蒸水，加0.75％过氧化氢尿素1.28mL，定容至200mL，调pH至5.0～5.4；所述步骤S10中，终止液为2mol/LH₂SO₄溶液。

所述步骤S11中，用TP0614-ELSE检测治疗前后的梅毒血清，计算OD值变化：d_OD＝OD_治疗前-OD_治疗后，将OD变化值与相应TRUST滴度变化进行比较。

本发明的有益效果：本发明中利用TP0614是一个***相关的半胱氨酸脱硫酶，在***的生存中发挥重要作用。本发明可以提供TP0614的基因序列、克隆方法、重组蛋白与制备方法，同时建立重组蛋白TP0614间接ELISA检测法。将为临床上治疗梅毒和评价其疗效提供提供更确切的疗效评估策略。

具体实施方式

实施例1 Tp(Nichols株)全基因组DNA的获取

(1)取经Tp Nichols株成功感染的新西兰雄兔的睾丸组织，将其放入无菌试管，加无菌生理盐水浸泡。无菌试管于37℃水浴摇床震荡3h，转速为180rpm。析出物经灭菌纱布过滤后取滤出物用于制备Tp DNA模板；使用Qiagen全基因组提取试剂盒提取Tp全基因组DNA；

(2)吸取1mL滤液，加入2mL离心管中，12000×g，离心5min，弃去上清。加入200μLBuffer ATL，重悬使组织溶解；

(3)加入20μl proteinase K溶液，振荡混匀，56℃水浴直至完全溶解，12000×g离心2min。收集上清液于2ml的离心管中；

(4)向离心管中加200μL Buffer AL，振荡混匀15s，再70℃孵育10min，10000rpm，1min，收集上清液于2ml的离心管中；

(5)离心管中加入200μl无水乙醇，振荡20s，12000×g离心2min，吸取上清液转移至QIAamp Mini spin column(吸附柱)中，10000rpm，1min，弃滤液；

(6)将吸附柱放入另一2mL配套收集管中，向柱中加入500μl Buffer AW1，10000rpm，1min，弃滤液；

(7)将吸附柱放入另一2mL配套收集管中，向柱中加入500μl Buffer AW2，14000rpm，3min，弃滤液；

(8)将弃去了滤液的吸附柱置于干净的2.0m L离心管中，加(30-50)μL Buffer AE于吸附柱内，在室温放置1min，10000rpm离心1min，收集洗脱液，即Tp全长DNA模板。

实施例2 TP0614基因的扩增

(1)根据TP0614基因序列如序列1，具体如下：

在Primer Premier6.0软件支持下，设计扩增用引物，各引物的具体序列见表1：

表1 TP0614基因的扩增所需引物

引物名称	序列(5’→3’)
		上游引物P1	TCATCGCTCACTGTTACG(序列3)
下游引物P2	TTGACAACGGCAGAGAAG(序列4)

(2)序列的PCR扩增

PCR反应总体系为25μl，按顺序依次加入至0.2mL EP管中，整个操作于冰上完成：

加入各组分后震荡使之混合均匀，短暂离心30s使液体集中到管底，加入石蜡油25μl对液体进行封闭，迅速转移到PCR仪中进行扩增，反应条件如下：

(3)PCR扩增产物的初鉴定

制备1.2％琼脂糖胶，取PCR产物5μL样与6×loading Buffer1μl以5V/cm进行琼脂糖凝胶电泳，电泳完毕后在DNA Marker指示下紫外灯观察电泳结果大致确定PCR产物大小，并用凝胶成像***照相。

实施例3 PCR扩增产物的纯化

采用OMEGA DNA纯化试剂盒纯化实施例2中获得PCR产物，具体操作步骤如下：

(1)向DNA Wash Buffer中加入80mL无水乙醇稀释。

(2)向灭菌好的空的1.5mLEP管中加入PCR产物，再加入5倍体积PCR产物的BufferCP液，充分混匀；

(3)将Hi Bind DNA Column(吸附柱)置于2mL收集管中，将上述混匀的样品吸加入附柱中，室温下12000rpm离心1min，弃滤液，并重新置于之前的收集管中；

(4)向吸附柱中加入700μL的漂洗液(DNA Wash Buffer，预先加无水乙醇稀释)，常温下12000rpm离心1min，去除管中下部废液，吸附柱重新放回收集管中备用；

(5)重复第四步2次；

(6)将吸附柱置于13000rps的高转速条件下，离心2min左右；

(7)将吸附柱放入一个干净的无菌的1.5mlEP管，在吸附柱中加入30μl ElutionBuffer(无菌水)，室温下静置2min，13000g/min离心1min以洗脱DNA，将回收的PCR纯化产置于-20℃保存；

(8)取纯化PCR产物电泳，电泳结束后，紫外光下观察结果以检测纯化效果。

实施例4构建重组质粒——质粒A-TP0614

(1)载体质粒A及实施例3得到的纯化后的PCR产物分别进行双酶切该酶切反应体系体积各为40.0μL，依次将下述物质加入灭菌的0.2mL EP管：

依次加入上述物质后混匀，随后10s快速离心集中样品，用封口胶密封该EP管管口,再将其至于37℃水浴箱中，酶切4h(恒温保存)，酶切结束条件为65℃水浴箱恒温作用20min；将酶切后的产物5μL与6×loading Buffer 1μL混匀点样在1.0％的琼脂糖胶上进行电泳，凝胶成像观察结果。用OMEGA公司的Cycle Pure Kit DNA纯化提取试剂盒.对PCR产物或者质粒A进行纯化回收，得到二次纯化后的PCR产物和质粒A纯化产物。

(2)连接反应

紫外分光计检测酶切回收后的PCR产物和质粒A纯化产物，确定待***片段与载体的量的比例为1:5的摩尔，该连接反应体系如下：

上述反应物混匀后短暂离心，室温下(约22℃)连接4h后，得到质粒A-TP0614重组质粒，置于4℃冰箱低温保存备用。

实施例5 TP0614-BL21(DE3)重组表达菌的构建

(1)将质粒A-TP0614重组质粒转化至E.coli BL21(DE3)表达菌中。

(2)从平板上挑取单个菌落将其再次接种于含有3m LKan+LB培养管中，同样在室温和高速振荡条件下培养整夜。最后通过菌液PCR鉴定及双酶切效果来判断重组质粒是否被成功转入至E.coli BL21(DE3)中，重组质粒成功转入E.coli BL21(DE3)的菌种，即为重组表达菌

实施例6重组蛋白的TP0614诱导表达

(1)分区划线测序结果正确的重组菌液，接种于卡那抗性的LB固体培养基，37℃温箱过夜培养；

(2)挑取单个菌落，接种至2mL卡那阳性的液体LB，220rpm于振荡箱，37℃过夜培养；

(3)将(2)所得菌液按照1:50的比例接种到新的卡那阳性液体LB中，220rpm 37℃振荡箱培养约4h，至菌体密度A600＝0.6。

(4)取出培养基，在无菌操作下分别向培养基中加入浓度为1M的IPTG使其终浓度为0mM、0.1mM、0.5mM和1mM，同时设空菌和空质粒菌阴性作对照；加入不同IPTG浓度的菌液又分别放置20℃、25℃、30℃和37℃4个不同温度的摇床中以180rpm的转速震荡培养，并分别从诱导后2h、4h、6h以及8h的菌液中取1mL菌液于1.5m L的EP管中做后续鉴定；

(5)常温离心1min转速为10000rpm，收集菌液沉淀，PBS洗涤菌体沉淀，超声裂菌(超声10s，间歇10s)，4℃,14000rpm，15min，分别收集上清和沉淀，SDS-PAGE胶确定最佳诱导时间和温度；

根据实验结果，SDS-PAGE胶确定最佳诱导时间和温度，最终结果表明：鉴定正确后转化到表达宿主菌E.coliBL21，用0.8mmol/L IPTG、37℃、180r/min诱导表达6h收菌，裂解过夜效果最好

(6)根据步骤5)中SDS-PAGE胶确定重组Tp0614最佳诱导条件，诱导重组表达菌进行表达，然后收集菌体，提取Tp0614重组蛋白，做进一步分析，得到其氨基酸序列为序列2所示，具体如下：

MSGPNYKADFPLLLRSPRVHYLDSAATTQRPAPVLERVMHYHTHLNGNAGRGSHELAVESALLIENTRKKTAQFINAAPTHDIVFTKSCTESLNIIAHCYALPRLRAGDEIVLAISNHHANIVPWQHVCRCTGATIQWLYPDAEGNLDIQEAQKKIRACTKIVSFSAVVNATGAVNPAQELTALAHQVGAVVVIDGAQAMVHGVPNVADLGCDFFVFSGHKMFSLFGVGVLCAPHTLLESMPPFLYGGGMVDFVTEQESVFKGAPHKYEGGSANTAAVVSLCAAIEYCESLESSAVRASVHALDAALLARLEELPFLETYHARARERLGIIAFNVKNVHSHDTAHILGEEGVMVRSGDHCSKPFMTHLSIQSCCRASFCIYNTMEDVEALTRALHAVGRIFQCS。

实施例7 TP0614-ELISA间接法的建立

这种半胱氨酸脱硫酶TP0614重组蛋白检测梅毒的方法，包括以下步骤：以Tp0614重组蛋白为抗原建立间接ELISA法，具体操作步骤如下：

(1)包被抗原：将Tp0614重组蛋白，用包被缓冲液进行稀释，得到稀释重组蛋白液，以100μL/孔将稀释重组蛋白液加入96孔酶标板中，4℃环境下包被整夜；

(2)洗涤：向孔中加入PBST溶液进行洗板，共洗板5次，每次300μL，洗板时长每次约为120s；

(3)封闭：以封闭液(5％脱脂奶粉)在4℃下封闭整夜；

(4)洗涤：步骤同S2；

(5)孵一抗：用封闭液分别稀释治疗前和治疗后的梅毒血清，分别加入到Tp0614重组蛋白包被的96孔酶标板中，每孔100μL，置于环境温度为37℃的培养箱进行孵育，孵育时长约60min；

(6)洗涤：步骤同S2；

(7)孵二抗：向所有孔中分别加入HRP标记羊抗人IgG100μL，与37℃下孵育60min；

(8)洗涤：步骤同S2。

(9)显色：向各加样孔中滴入两种显色液各一滴，并在常温避光条件下5min后观察其颜色变化。

(10)终止：向溶液中加入终止夜一滴；

(11)检测结果：在酶标仪上采用波长为450nm的检测光对各个小孔的吸光度进行检测。

将检测过程中，所用到试剂为：步骤(1)中，包被缓冲液为0.05mol/L碳酸盐缓冲液，pH＝9.6，稀释重组蛋白至5μg/mL；步骤(5)中，用封闭液稀释梅毒血清200倍；步骤(9)中，两种显色剂为TMB溶液和过氧化氢尿素溶液，其中：TMB溶液的制备方法为：称取20mg四甲基联苯胺(TMB)溶于10mL无水乙醇中，待完全溶解后，加双蒸水至100mL；过氧化氢尿素溶液的制备方法为称取Na₂HPO₄·12H₂O 14.34g，柠檬酸1.87g溶于双蒸水，加0.75％过氧化氢尿素1.28mL，定容至200mL，调pH至5.0～5.4；所述步骤(10)中，终止液为2mol/L H₂SO₄溶液。

所述步骤(11)中，所述步骤S11中，用TP0614-ELSE检测治疗前后的梅毒血清，计算OD值变化：d_OD＝OD_治疗前-OD_治疗后，将OD变化值与相应TRUST滴度变化进行比较。Tp0614-ELISA法OD值变化与TRUST滴度水平变化的相关系数为0.735，P<0.05，说明存在一定相关性，结果如表2所示。

表2梅毒治疗前后Tp0614-ELISA法OD值变化(d_OD)与TRUST滴度水平变化

序列表

<110> 中南大学湘雅三医院

<120> 一种半胱氨酸脱硫酶TP0614的基因及其重组蛋白与应用

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1215

<212> DNA

<213> 胱氨酸脱硫酶TP0614的基因(人工序列)

<400> 1

atgagcggcc ccaattataa agcagacttt cccctgctgt tgcgcagtcc ccgcgtccac 60

tacctagaca gcgcggccac aacccaacgc cctgcgccgg tgctagagcg cgttatgcac 120

taccacaccc atctgaatgg gaacgcaggc agaggctccc atgaacttgc agttgaatca 180

gcgctcctta tagaaaacac ccggaagaaa acagcgcagt ttatcaacgc agcgccaacg 240

cacgatatcg tttttacaaa gagttgcacc gaatcgctca acatcatcgc tcactgttac 300

gcgctgccac gcctgcgcgc aggagacgag atcgttcttg ctatctccaa tcatcacgca 360

aatatcgtac cgtggcagca cgtgtgccgc tgcacaggtg caacgataca gtggctgtat 420

ccagacgccg aaggaaattt ggatatacaa gaagcgcaga aaaagatacg agcgtgcact 480

aagattgtgt ccttctctgc cgttgtcaat gccaccggcg cggtaaatcc tgcacaggaa 540

ttgaccgcac ttgcacacca agtcggtgca gtggtggtca ttgacggagc acaggctatg 600

gtgcacggcg tgccaaatgt tgcagattta ggctgcgact tctttgtttt ctccggccat 660

aagatgttct ctctttttgg cgtcggcgta ttgtgcgcac cgcacacgct cctggaatcc 720

atgcctcctt ttttgtatgg gggaggcatg gtggattttg tgactgaaca ggaaagtgtc 780

tttaagggtg cgccgcataa gtacgaggga ggtagcgcga atactgcagc tgtcgtgtca 840

ctgtgtgcag cgattgagta ttgcgagtcc ctagagagca gcgcagtccg cgcgtccgta 900

catgcgctgg atgctgcact ccttgcgcgg ctggaggagc ttcccttcct tgaaacgtac 960

catgcgcgcg cacgcgagcg cctaggcatc attgcattca acgtgaagaa cgtgcactcg 1020

cacgatactg cgcatatctt gggcgaagaa ggcgtgatgg ttcgcagcgg cgatcactgt 1080

agtaagcctt tcatgacgca cttgagcatt cagtcctgtt gccgtgcaag tttctgcata 1140

tacaatacca tggaggatgt agaggcgctg acgcgtgcgt tgcacgccgt gggcaggatt 1200

tttcaatgca gctag 1215

<210> 2

<211> 808

<212> PRT

<213> 胱氨酸脱硫酶TP0614的重组蛋白(人工序列)

<400> 2

Met Ser Gly Pro Asn Tyr Lys Ala Asp Phe Pro Leu Leu Leu Arg Ser

1 5 10 15

Pro Arg Val His Tyr Leu Asp Ser Ala Ala Thr Thr Gln Arg Pro Ala

20 25 30

Pro Val Leu Glu Arg Val Met His Tyr His Thr His Leu Asn Gly Asn

35 40 45

Ala Gly Arg Gly Ser His Glu Leu Ala Val Glu Ser Ala Leu Leu Ile

50 55 60

Glu Asn Thr Arg Lys Lys Thr Ala Gln Phe Ile Asn Ala Ala Pro Thr

65 70 75 80

His Asp Ile Val Phe Thr Lys Ser Cys Thr Glu Ser Leu Asn Ile Ile

85 90 95

Ala His Cys Tyr Ala Leu Pro Arg Leu Arg Ala Gly Asp Glu Ile Val

100 105 110

Leu Ala Ile Ser Asn His His Ala Asn Ile Val Pro Trp Gln His Val

115 120 125

Cys Arg Cys Thr Gly Ala Thr Ile Gln Trp Leu Tyr Pro Asp Ala Glu

130 135 140

Gly Asn Leu Asp Ile Gln Glu Ala Gln Lys Lys Ile Arg Ala Cys Thr

145 150 155 160

Lys Ile Val Ser Phe Ser Ala Val Val Asn Ala Thr Gly Ala Val Asn

165 170 175

Pro Ala Gln Glu Leu Thr Ala Leu Ala His Gln Val Gly Ala Val Val

180 185 190

Val Ile Asp Gly Ala Gln Ala Met Val His Gly Val Pro Asn Val Ala

195 200 205

Asp Leu Gly Cys Asp Phe Phe Val Phe Ser Gly His Lys Met Phe Ser

210 215 220

Leu Phe Gly Val Gly Val Leu Cys Ala Pro His Thr Leu Leu Glu Ser

225 230 235 240

Met Pro Pro Phe Leu Tyr Gly Gly Gly Met Val Asp Phe Val Thr Glu

245 250 255

Gln Glu Ser Val Phe Lys Gly Ala Pro His Lys Tyr Glu Gly Gly Ser

260 265 270

Ala Asn Thr Ala Ala Val Val Ser Leu Cys Ala Ala Ile Glu Tyr Cys

275 280 285

Glu Ser Leu Glu Ser Ser Ala Val Arg Ala Ser Val His Ala Leu Asp

290 295 300

Ala Ala Leu Leu Ala Arg Leu Glu Glu Leu Pro Phe Leu Glu Thr Tyr

305 310 315 320

His Ala Arg Ala Arg Glu Arg Leu Gly Ile Ile Ala Phe Asn Val Lys

325 330 335

Asn Val His Ser His Asp Thr Ala His Ile Leu Gly Glu Glu Gly Val

340 345 350

Met Val Arg Ser Gly Asp His Cys Ser Lys Pro Phe Met Thr His Leu

355 360 365

Ser Ile Gln Ser Cys Cys Arg Ala Ser Phe Cys Ile Tyr Asn Thr Met

370 375 380

Glu Asp Val Glu Ala Leu Thr Arg Ala Leu His Ala Val Gly Arg Ile

385 390 395 400

Phe Gln Cys Ser Met Ser Gly Pro Asn Tyr Lys Ala Asp Phe Pro Leu

405 410 415

Leu Leu Arg Ser Pro Arg Val His Tyr Leu Asp Ser Ala Ala Thr Thr

420 425 430

Gln Arg Pro Ala Pro Val Leu Glu Arg Val Met His Tyr His Thr His

435 440 445

Leu Asn Gly Asn Ala Gly Arg Gly Ser His Glu Leu Ala Val Glu Ser

450 455 460

Ala Leu Leu Ile Glu Asn Thr Arg Lys Lys Thr Ala Gln Phe Ile Asn

465 470 475 480

Ala Ala Pro Thr His Asp Ile Val Phe Thr Lys Ser Cys Thr Glu Ser

485 490 495

Leu Asn Ile Ile Ala His Cys Tyr Ala Leu Pro Arg Leu Arg Ala Gly

500 505 510

Asp Glu Ile Val Leu Ala Ile Ser Asn His His Ala Asn Ile Val Pro

515 520 525

Trp Gln His Val Cys Arg Cys Thr Gly Ala Thr Ile Gln Trp Leu Tyr

530 535 540

Pro Asp Ala Glu Gly Asn Leu Asp Ile Gln Glu Ala Gln Lys Lys Ile

545 550 555 560

Arg Ala Cys Thr Lys Ile Val Ser Phe Ser Ala Val Val Asn Ala Thr

565 570 575

Gly Ala Val Asn Pro Ala Gln Glu Leu Thr Ala Leu Ala His Gln Val

580 585 590

Gly Ala Val Val Val Ile Asp Gly Ala Gln Ala Met Val His Gly Val

595 600 605

Pro Asn Val Ala Asp Leu Gly Cys Asp Phe Phe Val Phe Ser Gly His

610 615 620

Lys Met Phe Ser Leu Phe Gly Val Gly Val Leu Cys Ala Pro His Thr

625 630 635 640

Leu Leu Glu Ser Met Pro Pro Phe Leu Tyr Gly Gly Gly Met Val Asp

645 650 655

Phe Val Thr Glu Gln Glu Ser Val Phe Lys Gly Ala Pro His Lys Tyr

660 665 670

Glu Gly Gly Ser Ala Asn Thr Ala Ala Val Val Ser Leu Cys Ala Ala

675 680 685

Ile Glu Tyr Cys Glu Ser Leu Glu Ser Ser Ala Val Arg Ala Ser Val

690 695 700

His Ala Leu Asp Ala Ala Leu Leu Ala Arg Leu Glu Glu Leu Pro Phe

705 710 715 720

Leu Glu Thr Tyr His Ala Arg Ala Arg Glu Arg Leu Gly Ile Ile Ala

725 730 735

Phe Asn Val Lys Asn Val His Ser His Asp Thr Ala His Ile Leu Gly

740 745 750

Glu Glu Gly Val Met Val Arg Ser Gly Asp His Cys Ser Lys Pro Phe

755 760 765

Met Thr His Leu Ser Ile Gln Ser Cys Cys Arg Ala Ser Phe Cys Ile

770 775 780

Tyr Asn Thr Met Glu Asp Val Glu Ala Leu Thr Arg Ala Leu His Ala

785 790 795 800

Val Gly Arg Ile Phe Gln Cys Ser

805

<210> 4

<211> 18

<212> DNA

<213> 上游引物(人工序列)

<400> 3

tcatcgctca ctgttacg 18

<210> 4

<211> 18

<212> DNA

<213> 下游引物(人工序列)

<400> 4

ttgacaacgg cagagaag 18

Claims

1.一种半胱氨酸脱硫酶TP0614的基因，其特征在于，其核苷酸序列，如序列1所示。

2.一种提取半胱氨酸脱硫酶TP0614重组蛋白的方法，包括以下步骤：

2)TP0614基因的扩增：根据权利要求1所述的序列1中TP0614的基因，设计扩增引物，然后将步骤1)中的Tp全基因组DNA与扩增引物进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；

5)TP0614-BL21(DE3)重组表达菌的构建：将步骤4)中的重组质粒A-TP0614转化至E.coliBL21(DE3)表达菌中，得到重组表达菌；

3.根据权利要求2所述的提取半胱氨酸脱硫酶TP0614重组蛋白的方法，其特征在于，所述步骤2)中，扩增引物包括上游引物P1和下游引物P2，上游引物P1的序列如序列3所示，下游引物P2的序列如序列4所示。

4.根据权利要求2所述的提取半胱氨酸脱硫酶TP0614重组蛋白的方法得到半胱氨酸脱硫酶TP0614重组蛋白，其特征在于，所述的半胱氨酸脱硫酶TP0614重组蛋白的氨基酸序列，如序列2所示。

5.一种根据权利要求4所述的半胱氨酸脱硫酶TP0614重组蛋白检测梅毒的方法，包括以下步骤：S1包被抗原：将步骤S1中Tp0614重组蛋白，用包被缓冲液进行稀释，得到稀释重组蛋白液，以100μL/孔将稀释重组蛋白液加入96孔酶标板中，4℃环境下包被整夜；

S3封闭：洗涤完毕后，加入封闭液在4℃下封闭整夜；

S4洗涤：步骤同S2，得到包被的酶标板；

S5孵一抗：先用经封闭液稀释治疗前和治疗后的梅毒血清，再分别加入到包被酶标板的96孔板中，每孔100μL，置于环境温度为37℃的培养箱进行孵育，孵育时长约60min；

S6洗涤：步骤同S2；

S7孵二抗：向所有孔中分别加入HRP标记羊抗人IgG100μL，与37℃下孵育60min；

S8洗涤：步骤同S2；

S9显色：向各加样孔中滴入两种显色液各一滴，并在常温避光条件下5min后观察其颜色变化；

S10终止：向溶液中加入终止夜一滴；

6.根据权利要求5所述的半胱氨酸脱硫酶TP0614重组蛋白检测梅毒治疗前后血清的方法，其特征在于，所述S1步骤中，包被缓冲液为0.05mol/L碳酸盐缓冲液，pH＝9.6，稀释重组蛋白至5μg/mL。

7.根据权利要求5所述的半胱氨酸脱硫酶TP0614重组蛋白检测梅毒治疗前后血清的方法，其特征在于所述S3步骤中，封闭液为5％脱脂奶粉；所述S5中，用封闭液稀释梅毒血清200倍。

8.根据权利要求5所述的半胱氨酸脱硫酶TP0614重组蛋白检测梅毒治疗前后血清的方法，其特征在于，所述步骤S9中，两种显色剂为TMB溶液和过氧化氢尿素溶液，其中：TMB溶液的制备方法为：称取20mg四甲基联苯胺(TMB)溶于10mL无水乙醇中，待完全溶解后，加双蒸水至100mL；过氧化氢尿素溶液的制备方法为称取Na₂HPO₄·12H₂O 14.34g，柠檬酸1.87g溶于双蒸水，加0.75％过氧化氢尿素1.28mL，定容至200mL，调pH至5.0～5.4。

9.根据权利要求5所述的半胱氨酸脱硫酶TP0614重组蛋白检测梅毒治疗前后血清的方法，其特征在于所述步骤S10中，终止液为2mol/L H₂SO₄溶液。

10.根据权利要求5所述的半胱氨酸脱硫酶TP0614重组蛋白检测梅毒治疗前后血清的方法，其特征在于，所述步骤S11中，用TP0614-ELSE检测治疗前后的梅毒血清，计算OD值变化：d_OD＝OD_治疗前-OD_治疗后，将OD变化值与相应TRUST滴度变化进行比较。