CN113063942B - 一种检测摩氏摩根菌抗体的间接elisa检测试剂盒及应用 - Google Patents

一种检测摩氏摩根菌抗体的间接elisa检测试剂盒及应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种检测摩氏摩根菌抗体的间接ELISA检测试剂盒及应用。所述间接ELISA检测试剂盒是以摩氏摩根菌重组LPP蛋白作为包被抗原；所述摩氏摩根菌重组LPP蛋白的制备方法如下：以SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列作为编码LPP蛋白的基因，构建重组表达载体，通过真核表达***表达摩氏摩根菌重组LPP蛋白。本发明首次建立了检测摩氏摩根菌抗体的间接ELISA检测方法，该检测方法具有简便、快速、稳定、特异性强、灵敏度高等特性，能够用于摩氏摩根菌抗体的检测，为摩氏摩根菌的流行病学调查以及早期防治提供了基础。

Description

一种检测摩氏摩根菌抗体的间接ELISA检测试剂盒及应用
技术领域
本发明涉及生物制品技术领域，具体涉及一种检测摩氏摩根菌抗体的间接ELISA检测试剂盒及应用。
背景技术
摩氏摩根菌(Morganella morganii)属于摩根菌属，摩根菌属只有摩氏摩根菌一个种。摩氏摩根菌常寄生于人和动物的肠道内，系临床不常见的但是重要的条件致病菌。摩氏摩根菌可引起呼吸道、伤口、泌尿道、胆囊、血液及眼部等部位的感染。同时摩氏摩根菌对青霉素类、苯唑西林、头孢菌素、头孢泊肟、林可酰胺类抗生素，糖肽类、磷霉素等都存在天然耐药性，导致摩氏摩根菌感染治疗时药物选择受到限制。因此，早期检测摩氏摩根菌对于摩氏摩根菌的临床防治将具有十分重要的意义。
由于摩氏摩根菌在临床的分离率比较低，对摩氏摩根菌的生物学特性、致病机制等的研究尚处于起步阶段，其技术成熟度较低。目前对于摩氏摩根菌的检测主要采用PCR检测方法，但PCR检测对设备要求较高，不适宜于基层养殖场使用。
酶联免疫吸附试验(ELISA)是将已知的抗原或抗体包被在固相载体表面，使酶标记的抗原抗体反应在固相表面进行，用洗涤法将液相中的游离成分洗除，加入相应的酶底物后发生颜色反应，通过底物的颜色反应来判定有无相应的免疫反应，通过颜色反应的深浅检测样本中相应抗体或抗原含量的检测技术。ELISA检测具有操作简便、灵敏度高、特异性好、经济安全等特点而在临床上广泛应用，尤其适用于基层检测。但由于摩氏摩根菌难以进行分离，其临床分离率在国内仅为革兰氏阴性菌的0.5％，若以摩氏摩根菌的全菌蛋白作为ELISA检测的包被抗原难以实现大规模应用；另外，对于摩氏摩根菌相关基因和蛋白功能研究分析较少，难以选择摩氏摩根菌的何种蛋白作为包被抗原，而且，包被抗原的制备比较困难，存在蛋白不表达或表达量低、蛋白纯化困难等问题。因此，目前还未见有利用间接ELISA检测摩氏摩根菌抗体的报道。
发明内容
针对上述现有技术，本发明的目的是提供一种检测摩氏摩根菌抗体的间接ELISA检测试剂盒及应用。可以对摩氏摩根菌抗体抗体进行快速、有效的检测，以监测养殖场中摩氏摩根菌的流行情况，从而有利于摩氏摩根菌的临床防治。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
本发明的第一方面，提供摩氏摩根菌重组LPP蛋白作为包被抗原在制备检测摩氏摩根菌抗体的ELISA检测试剂盒中的应用；
所述摩氏摩根菌重组LPP蛋白是由如下方法制备而成：
以SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列作为编码LPP蛋白的基因，构建重组表达载体，通过真核表达***表达摩氏摩根菌重组LPP蛋白。
本发明的第二方面，提供一种检测摩氏摩根菌抗体的间接ELISA检测试剂盒，所述间接ELISA检测试剂盒是以摩氏摩根菌重组LPP蛋白作为包被抗原；
所述摩氏摩根菌重组LPP蛋白的制备方法如下：
以SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列作为编码LPP蛋白的基因，构建重组表达载体，通过真核表达***表达摩氏摩根菌重组LPP蛋白。
优选的，重组表达载体的构建方法为：使用限制性内切酶NheⅠ、EcoRⅠ对pcDNA3.1(+)载体和SEQ ID NO.1所示的编码LPP蛋白的基因进行双酶切处理，再用T4DNA连接酶对酶切后的产物进行连接。
作为优选，所述包被抗原是以碳酸盐溶液作为包被液，摩氏摩根菌重组LPP蛋白的包被浓度为2μg/mL，包被条件为4℃、12h。
进一步的，所述间接ELISA检测试剂盒还包含：酶标二抗、阴性对照血清、阳性对照血清、底物显色液和终止液。
优选的，所述酶标二抗为HRP羊抗鼠酶标二抗。实际检测时可以根据检验样品来源确定不同的酶标二抗。
上述间接ELISA检测试剂盒在摩氏摩根菌的流行病学调查中的应用也是本发明的保护范围。
本发明的第三方面，提供一种摩氏摩根菌抗体的间接ELISA检测方法，包括以下步骤：
(1)包被：以真核表达的摩氏摩根菌重组LPP蛋白作为包被抗原将抗原稀释后加入到酶标板孔中，并在4℃下放置12h；
(2)封闭：每孔加入200μL的5％脱脂奶粉，置4℃作用12h，洗涤5次，一次3min，甩去板中的液体；
(3)加一抗：加入稀释后的待检血清，每孔加100μL，置37℃作用1h；
(4)加酶标二抗：每孔加入100μL稀释后的HRP酶标二抗，酶标二抗稀释浓度为1：40000，置37℃作用1h；
(5)底物显色：每孔加入100μL的TMB显色液，避光显色45min；
(6)加终止液：每孔加入100μL的2M H2SO4震荡混匀，5min内测定OD450nm值。
步骤(1)中，所述摩氏摩根菌重组LPP蛋白由如下方法制备而成：
以SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列作为编码LPP蛋白的基因，构建重组表达载体，通过真核表达***表达摩氏摩根菌重组LPP蛋白。
本发明的有益效果：
本发明首次建立了检测摩氏摩根菌抗体的间接ELISA检测方法，该检测方法具有简便、快速、稳定、特异性强、灵敏度高等特性，能够用于摩氏摩根菌抗体的检测，为摩氏摩根菌的流行病学调查以及早期防治提供了基础。
附图说明
图1：LPP蛋白基因PCR扩增结果；泳道M:DNA Marker；泳道1：目的片段。
图2：重组质粒双酶切产物电泳图；泳道M:DNA Marker；泳道1：目的片段和载体片段。
图3：重组LPP蛋白的表达；泳道M：蛋白Marker；泳道1：转染细胞蛋白；泳道2：未转染细胞蛋白。
图4：重组LPP蛋白的纯化；泳道M：蛋白Marker；泳道1-5分别为：转染细胞蛋白、穿流液、洗涤液、洗涤液、纯化蛋白。
图5：纯化蛋白的Western Blot分析；泳道M：蛋白Marker泳道1：纯化蛋白。
图6：多克隆抗体效价的检测。
图7：多克隆抗体特异性的检测。
图8：Western Blot检测多克隆抗体与重组蛋白反应原性。
图9：最佳包被液的筛选。
图10：最佳包被条件的筛选。
图11：最佳封闭液的筛选。
图12：最佳封闭条件的筛选。
图13：一抗最佳孵育时间的筛选。
图14：酶标二抗稀释度的筛选结果。
图15：酶标二抗孵育时间的筛选结果。
图16：底物最佳孵育时间的筛选。
图17：特异性检测结果(P/N值)。
图18：特异性检测结果(Cut off值)。
图19：间接ELISA检测方法稳定性检测。
具体实施方式
应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
术语说明：
本发明中所提及的“摩氏摩根菌”、“摩根氏菌”表示的为同一菌，均为摩根菌属的摩氏摩根菌(Morganella morganii)。
正如背景技术部分所介绍的，摩氏摩根菌引起的感染越来越多，但摩氏摩根菌难以进行分离，其临床分离率在国内仅为革兰氏阴性菌的0.5％，目前对于摩氏摩根菌的研究还比较少。摩氏摩根菌属于条件性致病菌，对奶牛养殖业存在潜在威胁，一旦爆发死亡率高，但目前大范围爆发，产生较高死亡率的实例还是相对较少的，人们的重视程度不够。
因此需要加强对摩氏摩根菌检测研究。ELISA检测虽然是一种常规的检测方法，但是，对于摩氏摩根菌抗体的间接ELISA检测而言，其却存在诸多的技术难点。具体来说：
由于摩氏摩根菌分离困难，难以直接采用摩氏摩根菌全菌蛋白作为包被抗原用于大规模的ELISA检测。采用重组蛋白作为包被抗原虽然可以实现大规模检测应用，但是目前对于摩氏摩根菌相关基因和蛋白功能研究分析较少，缺少相关理论依据支撑，难以选择合适的蛋白作为摩氏摩根菌抗体检测的包被抗原；另外，包被抗原制备比较困难，存在蛋白不表达或表达量低，蛋白表达条件的优化、表达蛋白纯化等问题，以原核表达的蛋白做包被抗原时，特异性较差，会与其他疫病阳性血清发生交叉反应。
因此，目前还未见有利用间接ELISA检测摩氏摩根菌抗体的报道。
基于此，本发明选择真核表达的摩氏摩根菌重组LPP蛋白作为摩氏摩根菌抗体的间接ELISA检测的包被抗原，该重组蛋白与摩氏摩根菌多克隆抗体具有优异的反应原性，可以用于摩氏摩根菌抗体的检测。
在摩氏摩根菌重组LPP蛋白的基础上，本发明还进一步对间接ELISA检测摩氏摩根菌抗体的检测反应体系进行了优化，实现了对摩氏摩根菌抗体的简单、快速和特异性检测，特别适宜于基层农场的使用。
为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本申请的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本申请的技术方案。
本发明实施例中所用的未进行具体说明试验材料均为本领域常规的试验材料，均可通过商业渠道购买得到。本发明中所用到的部分试剂及组分如下：
磷酸盐缓冲液的配制
称取8.00g NaCl，1.44g Na2HPO4·12H2O，0.25g KCl，0.25g KH2PO4，加入1000mL定容瓶内定容，pH值调至7.2左右，分装备用。
碳酸盐缓冲液的配置
称取0.75g Na2CO3，1.46g NaHCO3，放入到500mL的去离子水中，pH值调至9.6左右分装备用。
TMB显色液：
buffer A：称取66.5063g柠檬酸钠用800mL蒸馏水溶解并用浓HCl调pH至4.0，加入H2O定容至1L，4℃保存；
buffer B：称取0.2956g四甲基联苯胺(TMB)，0.0633g四丁基硼氢化铵(TBABH)溶于30ml二甲基乙酰胺(DMA)，4℃避光保存；
使用时，将buffer A和buffer B以体积39:1的比例混合，现用现配。
2M H2SO4终止液：将浓H2SO4以体积比1:5的比例加入蒸馏水中，混匀冷却至室温即为2M H2SO4终止液。
本发明实施例中未注明具体实验条件和方法的，通常按照常规条件，如J.萨姆布鲁克等主编，科学出版社，2002，分子克隆实验指南(第三版)；D.L.斯佩克特等主编，科学出版社，2001，细胞实验指南；或者按照制造厂商建议的条件。
实施例1：包被抗原的制备
1.制备方法：
1.1摩氏摩根菌LPP蛋白编码基因序列的优化设计：
为了使摩氏摩根菌LPP蛋白能够更好的在真核表达***中表达，本发明在M.morganii prolipoprotein gene and 5'flank(GenBank:K00084.1)的基础上，对摩氏摩根菌LPP蛋白编码基因序列进行了优化设计，序列在5’端加了Kozak序列，理论上可以增加表达；3’端加了His标签，方便纯化；两端的酶切位点全部选择NheI-EcoRI，预期扩增序列大小为276bp左右，优化后的序列如SEQ ID NO.1所示；具体如下：
GCTAGCGCCGCCACCATGGGCAGGTCCAAGATCGTGCTGGGCGCCGTGGTGCTGGCCAGCGCTCTGCTGGCTGGCTGCTCCTCCAACGCCAAGTTCGATCAGCTGGACAACGACGTGAAGACACTGAATGCCAAGGTGGACCAGCTGAGCAATGACGTGAATGCCATCAGGGCCGATGTGCAGCAGGCCAAGGATGAGGCCGCCAGAGCCAACCAGAGACTGGATAACCAGGTGAGGTCCTACAAGAAGCACCACCACCACCATCACTGAGAATTC。
1.2LPP蛋白基因扩增片段的胶回收：
针对优化后的摩氏摩根菌LPP蛋白编码基因序列设计相应的引物进行常规PCR扩增。将扩增出的LPP基因片段进行凝胶电泳实验，跑胶完成后，将含有目的基因片段的胶切下，放入离心管中。按照胶回收试剂盒说明回收纯化后的PCR产物，回收结束后进行凝胶电泳检测，剩余部分-20℃保存，进行后续实验。
引物如下
F1：5’-GCTAGCGCCGCCACCATG-3’；(SEQ ID NO.2)
R1：5’-GAATTCTCAGTGATGGTGGTGGTG-3’。(SEQ ID NO.3)
扩增条件：
预变性：94℃、5min；变性：94℃、30s；退火：50℃、30s；延伸：72℃、1min 30s；
循环：循环32次；延伸：72℃、10min。
琼脂糖凝胶电泳检测的方法具体如下：
(1)用玻璃毛刷将胶床和梳子在流水下刷干净，然后将干净的梳子和胶床安装在制胶的设备中，然后将整个装置放在水平台面上的。
(2)用去离子水将10×TAE稀释成1×TAE，倒入电泳槽中。
(3)称取1g琼脂糖倒入锥形瓶中，配制成2％的琼脂糖。
(4)摇匀后，微波炉高温加热约30s使琼脂糖溶解完全，如有没有再加热一次直到固体琼脂糖完全溶解，然后室温下待其冷却到微微烫手的程度，大约50℃左右再加入10μl的核酸染料，轻晃动三角烧瓶使其充分混匀。
(5)将琼脂糖溶液快速倒入已插好梳子的胶槽中，去除气泡，确保凝胶光滑平整无气泡。
(6)室温下自然凝固20min以上，待凝胶溶液完全凝结成固体后，将梳子拔出，然后将凝胶放入电泳槽的液体中，确保电泳液没过凝胶2mm以上，确保凝胶有孔的一头水平朝着电源负极(黑色)，如样品孔内有气泡用枪头轻轻吸除。
(7)取10μl的样品混均匀缓慢加入到凝胶加样孔内；同时在凝胶的另一个孔中加等量的Marker。
(8)接通电源，在100V直流电压电泳，待Marker跑到相应位置(一般45min)后切断电源，停止电泳。
(9)带上橡胶手套将凝胶从电泳液中捞出，放在保鲜膜中，接着将凝胶转移到凝胶成像仪的暗室中，打开设备进入曝光页面中观察DNA样品的电泳条带及其位置，并与核酸分子量标准Marker进行仔细的比对，计算出目的条带的大小。
1.3目的片段、真核表达载体双酶切：
使用限制性内切酶NheⅠ、EcoRⅠ对pcDNA3.1(+)载体和LPP基因进行双酶切处理，37℃，水浴3.5h，结果于2％琼脂糖凝胶电泳检测。目的片段(LPP基因扩增产物)的双酶切反应体系如表1所示；真核表达载体(pcDNA3.1(+)载体)的双酶切反应体系如表2所示。
表1：目的片段双酶切反应体系
Figure BDA0003001608810000071
表2：真核表达载体双酶切体系
Figure BDA0003001608810000072
在冰上放置两个无菌PCR管，将上述酶切体系分别装于管中。混匀样品并短暂离心，使样品沉于管底。将离心管置于37℃中温育3h后加入10μL终止液终止酶切反应。取上述酶切产物琼脂糖凝胶电泳分析。
1.4摩氏摩根菌LPP基因真核表达载体的构建：
用T4DNA连接酶将步骤1.3中胶回收的片段37℃过夜，后将过夜的连接物转化入感受态细胞DH5α中，构建pCDNA3.1-His-LPP载体，经蓝白斑筛选白色菌落，接种于提前配好含有Amp的液体培养基中，37℃12h摇床振荡，再次提质粒，NheⅠ、EcoRⅠ双酶切鉴定和PCR鉴定，并交由上海生工生物工程有限公司进行测序。
T4DNA连接酶的连接反应体系如表3所示。
表3：连接体系
Figure BDA0003001608810000081
1.5重组质粒转入感受态细胞：
(1)提前打开无菌工作台的紫外灯进行至少30min的消毒。同时提前把电热恒温水浴箱打开，由于水浴箱温度上升较慢，温度设置至42℃备用。
(2)从-80℃冰库中迅速取一支50μLE.coli DH5α感受态细胞冻存管，放入冰上，用移液枪吸取10μL混匀的连接反应液缓慢加入感受态细胞中，随后轻弹试管壁使之混匀后，放入冰中冰浴30min。
(3)快速转移至42℃水浴箱中热激90s，再迅速转移至冰浴中4min。
(4)感受态细胞中加入500μL无菌的LB培养基(无双抗)，充分混匀后置于37℃，220rpm模式的恒温摇床中震荡培养1h，使细菌充分复苏。
(5)取适量菌液涂布于含100μg/mL氨苄的LB固体培养基，恒温培养箱中孵育过夜。挑取菌落进行阳性菌的鉴定。
1.6重组质粒扩增：
挑取3～5个阳性菌落，分别接种到含100μg/mL氨苄的LB液体培养基中，做好标记，置于37℃摇床中220rpm摇菌过夜。
1.7重组质粒提取：
使用无内毒素质粒提取试剂盒提取质粒。
1.8重组质粒双酶切鉴定
运用Nhe I和EcoR I限制性内切酶将实验室保存的LPP重组蛋白质粒pCDNA3.1-His-LPP进行双酶切，再进行琼脂糖电泳分析，酶切体系如表4所示：
表4：双酶切鉴定体系
Figure BDA0003001608810000082
1.9重组质粒pCDNA3.1-His-LPP的真核表达及表达蛋白纯化：
(1)将状态良好、单层细胞达70％的293T细胞按细胞传代方法接种到六孔板，每个孔板中接种1～3×105个细胞，加入2mL培养基，置37℃、5％CO2培养箱中培养过夜。
(2)显微镜下观察六孔板中单层细胞长到60％～70％时，可以进行转染质粒操作。
(3)将2μg质粒DNA用200μL Opti-MEM稀释，质粒终浓度应大于0.01μg/μL，轻柔混匀制备DNA稀释液。
(4)将4μL转染试剂直接添加至含DNA的稀释液中，轻柔混匀。
(5)在室温条件下孵育转染试剂与DNA的复合物5min，转染复合物即可制备完成。
(6)取出细胞培养皿，将转染复合物逐滴加至细胞中。
(7)转染后，培养293T细胞4小时后，换液，培养箱中继续培养24h后提取总蛋白检测融合蛋白质的表达情况。
1.10重组LPP蛋白的纯化：
标签重组LPP蛋白纯化使用HIS标签蛋白纯化试剂盒提取。
2.实验结果：
2.1LPP蛋白基因PCR扩增结果：
经琼脂糖凝胶电泳分析，结果显示PCR成功扩增出276bp的LPP蛋白基因(图1)，与预期条带大小相符。
2.2重组质粒pCDNA3.1-His-LPP双酶切鉴定结果：
经琼脂糖凝胶电泳分析，结果表明，双酶切后得到276bp和5158bp的片段(图2)，与预期条带大小一致。
2.3重组LPP蛋白的表达：
重组质粒诱导表达后，由SDS-PAGE凝胶电泳可知，12KD处有明显的目的条带(图3)，说明重组质粒诱导表达成功。
2.4重组LPP蛋白的纯化：
重组质粒诱导表达成功后，使用试剂盒提纯目的蛋白，由SDS-PAGE凝胶电泳可知，12KD处有明显的目的条带，且没有杂带，说明蛋白提取成功且纯度较高(图4)。利用针对HIS标签蛋白的抗体进行Western Blot分析，结果显示，在12KD处得到清晰的目的条带(图5)。
实施例2：摩氏摩根菌多克隆抗体的制备及效价检测
1.多克隆抗体的制备：
首先将抗原(抗原是摩氏摩根菌的全菌蛋白和灭活菌两种抗原，分不同的组进行免疫)免疫小鼠，其程序如下：首先选取健康未免疫过的SPF小鼠20只，抗原与完全弗氏佐剂乳化后取0.5mL对小鼠腹腔注射的方式注射50μg/只；首免两周后，抗原与不完全弗氏佐剂乳化后取抗原0.5mL腹腔注射50μg/只；10d后同种的方式进行第三次免疫；三免结束后10d用抗原加疫，剂量为100μg/只。加强免疫15d后对实验小鼠进行断尾采血并收集血清。
2.多克隆抗体效价的检测：
用抗原包被液稀释抗原，酶标板每个孔包被100μL的菌体全蛋白稀释液和0.4％甲醛灭活的摩根氏菌3.1×107CFU/mL，100μL每孔，PBS作为阴性对照组。置4℃作用过夜。洗涤，拍干。每孔加入200μL的5％脱脂奶粉封闭液，置37℃作用1h，洗涤，拍干。血清从1：100倍比稀释，每孔加入待检血清100μL，置37℃作用1h。洗涤后，每孔加入100μL稀释后的山羊抗鼠酶标二抗，置37℃作用1h。洗涤后，每孔加入100μL的TMB显色液，避光显色30min。加终止液：每孔加入100μL的2M H2SO4震荡混匀，5min内测定OD450nm值，并计算P/N值。
结果显示，摩氏摩根菌全蛋白和灭活摩氏摩根菌免疫的小鼠血清效价均可达到1：12800以上，且最高可达1：204800以上(图6)，抗体水平较高，可用于后续实验。
3.多克隆抗体特异性检测：
(1)多克隆抗体特异性检测的具体检测方法：玻片凝集试验方法，用制备的多克隆抗体作为诊断血清、与受检颗粒抗原菌悬液各加一滴在玻片上，混匀，数分钟后即可用肉眼观察凝集结果，出现颗粒凝集的为阳性反应。
(2)以菌的全蛋白为抗原制备的多克隆抗体、以灭活的摩根氏菌为抗原制备的多克隆抗体、两种抗原制备抗体的混合抗体进行抗体特异性检测结果都与上述结果一致。
(3)使用制备的多克隆抗体作为诊断血清与不同的细菌进行玻片凝集实验。
结果显示，只有摩根氏菌出现了凝集颗粒，反应结果为阳性，说明该制备的抗体与其他细菌没有发生交叉反应，能够和摩根氏菌发生特异性结合，该抗体具有特异性(图7)。
4.多克隆抗体与重组LPP蛋白反应原性测定：
Western Blot检测多克隆抗体与重组LPP蛋白反应原性
SDS-PAGE电泳
(1)胶板：选择1.5mm的胶板用洗涤剂洗涤并擦干。首先对齐胶板，然后将其固定在板架上以夹紧，在灌胶之前添加去离子水放置半小时，如果没有漏，倒出水并用吸水纸将其吸干，然后再继续使用。
(2)胶准备和灌胶：选择12％分离胶水浓度，并按表2.5进行配制。加入试剂后，就应立即摇晃，吹动并混合，以防止凝固，将分离胶添加到胶板上，并加入无水乙醇压平胶线。
(3)放置半小时后，待分离凝胶凝固后，丢弃掉无水乙醇并用吸水纸吸干。制备5％浓缩胶，依次添加相关试剂，并不断的摇晃以阻止提前凝固，添加至胶板中，***可接受厚度的梳子以防止气泡进入。将其在室温下放置约半小时以使其胶凝固。
(4)蛋白电泳：取出梳子，取下固定在架子上的胶板，然后将其放入电泳槽中，并添加适量的电泳液，然后添加要检测的样品和蛋白Maker。以80V的持续电压运行约3h，可获得该实验所需的蛋白条带。
转膜
(1)切胶：电泳后，移出胶板并小心分离。根据Maker大小切下目的蛋白胶块并做好标记，放入转膜液中以防止干燥。
(2)滤纸和PVDF膜的制备：根据胶块切割的尺寸切割大小相同的滤纸和PVDF膜。将滤纸浸入转膜液中3min，使其完全浸透并激活PVDF膜，以备后用。
(3)转膜：按由负到正的顺序正确放置滤纸、胶块和PVDF膜，除去气泡。将转膜夹放入转膜槽；将转膜槽放入冰水中，电压70V，持续50min转膜。
抗体孵育
(1)洗涤：取下PVDF膜，放入TBST中，清洗10min，重复3次。
(2)封闭：将PVDF膜放入封闭液中，在水平摇床上封闭90min，封闭后，按上述方法清洗3次。
(3)一抗的孵育：将PVDF膜放入按比例稀释好的一抗中，并在4℃下孵育过夜。孵育完成后，按上述方法清洗3次。
(4)二抗的孵育：将PVDF膜放入按比例稀释好的二抗中，在室温下孵育1小时h。孵育完成后，按上述方法清洗3次。抗体孵育
(5)蛋白显影：使用超敏发光液ECL对PVDF膜显影。
结果表明，多克隆抗体与重组LPP蛋白的结合效果较好，但与空载体蛋白无反应。说明多克隆抗体与重组LPP蛋白具有优异的反应原性(图8)。
实施例3：间接ELISA检测方法的建立及反应条件的优化
间接ELISA检测方法主要包括：包被、封闭、加一抗、加酶标二抗、底物显色、加终止液等步骤。本实施例对各步骤的反应条件进行优化。具体如下：
1.优化方法：
1.1最适抗原包被浓度与最适多抗稀释浓度的选择：
采用方阵滴定法来选择最佳条件。其中酶标板横排(1-12)设为血清稀释度，竖排(A-H)设为抗原包被浓度，其中横排依次倍比稀释为100～1：204800。竖排按1：100～1：12800稀释，P/N最大值对应的孔为最佳的血清稀释度和抗原最佳包被浓度(P为阳性血清OD450nm读值，N为阴性血清OD450nm读值)。
1.2抗原最适包被液的选择：
抗原进行包被，包被液的选择有3种，分别是去离子水、碳酸盐溶液(即碳酸盐缓冲液)、磷酸盐溶液(即磷酸盐缓冲液)，在其他条件相同的情况下，根据P/N的最大值来选择抗原最佳包被液。
1.3抗原最适包被时间的选择：
抗原最佳包被时间有3种，分别是37℃1h、37℃2h和4℃过夜，在其他条件相同的情况下，根据P/N的最大值来选择抗原最佳包被时间。
1.4最适封闭液的选择：
首先分别配制含1％的BSA、3％的BSA、5％的BSA、1％的脱脂奶、3％的脱脂奶、5％的脱脂奶的封闭剂(均为质量百分数)，然后用这些封闭剂对准备好的酶标板进行封闭。在确定最佳封闭剂时，应该保证其他条件相同，根据P/N的最大值来选取。
1.5最适封闭时间的选择：
在其他条件相同的情况下，用封闭液进行封闭，作用时间分别为1h、2h、温度为37℃，4℃12h。封闭时间应该根据P/N的最大值来确定。
1.6多抗最佳作用时间的选择：
在保证其他条件相同后，对阳性血清和阴性血清分别进行稀释，稀释的比例选择最佳比例。稀释后血清的作用时间分别为30min、45min、60min和75min，作用温度为37℃。最佳的作用时间应该根据P/N的最大值来进行选择。
1.7酶标抗体最适稀释度的选择：
在保证相同的其他条件后，倍比稀释酶标二抗，稀释的比例分别为1:5000、1:10000、1:20000、1:40000和1:80000。最佳稀释倍数应该根据P/N的最大值来进行选择。
1.8酶标抗体最适作用时间的选择：
在保证相同的其他条件后，将稀释后的酶标二抗加入每孔，作用时间分别选30min、45min、60min和75min，放置于37℃条件下作用。最佳反应时间根据P/N的最大值来进行选取。
1.9底物的最适作用时间的选择：
根据以上选取的条件，在保证相同的其他条件后，加入底物显色液TMB，作用的时间分别选取15min、30min和45min，作用温度为室温。最佳反应时间应该根据P/N的最大值来进行选取。
1.10判定标准的确定：
通过对36份经镜检和PCR检测证实为阴性的样品测定其OD450值。阳性样品临界值确定为阴性样品平均值+3SD；阴性样品的临界值确定为阴性样品平均值+2SD。
2.优化结果：
2.1重组蛋白、多抗最佳稀释度的筛选结果：
利用方阵滴定法进行重组蛋白、多抗最佳稀释度的筛选，当重组蛋白包被浓度为1：1600，多抗浓度为1：12800时，P/N值最高，因此重组蛋白最佳包被浓度为1：1600，重组蛋白浓度计算即2ug/mL；多抗最佳工作浓度为1：12800。
表5：蛋白、多抗最佳稀释度的筛选
Figure BDA0003001608810000131
2.2最佳包被液的筛选结果：
实验结果显示，当包被液为碳酸盐时，P/N值最高，因此最佳包被液为碳酸盐。
表6：最佳包被液的筛选
Figure BDA0003001608810000132
2.3最佳包被条件的筛选结果：
实验结果显示，当包被条件为4℃12h时，P/N值最高，因此最佳包被条件为4℃12h。
表7：最佳包被条件的筛选
Figure BDA0003001608810000141
2.4最佳封闭液的筛选结果：
实验结果显示，当封闭液为5％脱脂奶粉时，P/N值最高，因此最佳封闭液为5％脱脂奶粉。
表8：最佳封闭液的筛选
Figure BDA0003001608810000142
2.5最佳封闭条件的筛选结果：
实验结果表明当封闭条件为4℃12h时，P/N值最高，因此最佳封闭条件为4℃12h。
表9：最佳封闭条件的筛选
Figure BDA0003001608810000143
2.6多抗最佳孵育时间的筛选结果：
实验结果显示，当一抗孵育时间为60min时，P/N值最高，因此一抗最佳孵育时间为60min。
表10：一抗最佳孵育时间的筛选
Figure BDA0003001608810000144
Figure BDA0003001608810000151
2.7酶标二抗最佳稀释度的筛选结果：
实验结果显示，当酶标二抗稀释浓度为1：40000时，P/N值最高，因此酶标二抗最佳稀释浓度为1：40000。
表11：酶标二抗稀释度的筛选结果
Figure BDA0003001608810000152
2.8酶标二抗最佳孵育时间的筛选结果：
实验结果显示，当二抗孵育时间为60min时，P/N值最高，因此二抗最佳孵育时间为60min。
表12：酶标二抗孵育时间的筛选结果
Figure BDA0003001608810000153
2.9底物最佳孵育时间的筛选结果：
根据以上选取的条件，在保证相同的其他条件后，加入底物显色液TMB，作用的时间分别选取15min、30min和45min，作用温度为室温。实验结果显示当底物孵育时间为45min时，P/N值最高，因此最佳底物孵育时间为45min。
表13：底物最佳孵育时间的筛选
Figure BDA0003001608810000154
2.10判定标准的确定(Cut off值)
根据确定好的最佳条件包被酶标板，检测36份阴性血清，判定临界值标准。求得其平均值为0.075，标准差(SD)为0.0147根据统计学原理，判定当血清OD450nm值>0.119判断为阳性，OD450nm值<0.104时判断为阴性，两者之间为可疑。
表14：阴性血清OD450nm值
Figure BDA0003001608810000161
经优化后的间接ELISA检测条件如下：
(1)包被：按照1：1600的比例用包被液稀释重组蛋白，用100μL重组蛋白(重组蛋白的浓度为2μg/mL)包被微量滴定板的每个孔，并在4℃下放置12h。使用时，洗涤5次，一次3min，甩去板中的液体，在干净并且吸水性强的纸上拍打，保证各孔内均无残留液体。
(2)封闭：每孔加入200μL的5％脱脂奶粉，置4℃作用12h，洗涤5次，一次3min，甩去板中的液体，在干净并且吸水性强的纸上拍打，保证各孔内均无残留液体。
(3)加一抗：加入稀释后的待检血清，每孔加100μL，置37℃作用1h。洗涤5次，一次3min，甩去板中的液体，在干净并且吸水性强的纸上拍打，保证各孔内均无残留液体。
(4)加酶标二抗：每孔加入100μL稀释后的HRP酶标二抗，酶标二抗稀释浓度为1：40000，置37℃作用1h。洗涤5次，一次3min，甩去板中液体，在干净并且吸水性强的纸上拍打，保证各孔内均无残留液体。
(5)底物显色：每孔加入100μL的TMB显色液，避光显色45min。
(6)加终止液：每孔加入100μL的2M H2SO4震荡混匀，5min内测定OD450nm值。
实施例4：方法学考察
对实施例3建立的间接ELISA检测方法进行方法学考察，具体如下：
1.特异性试验：
应用所建立的方法对沙门氏菌、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌，巴氏杆菌等病原血清进行检测，根据Cut off值来判定所建立的间接ELISA检测方法是否与上述病原发生交叉反应。
结果显示，所建立的间接ELISA检测方法与上述病原没有发生交叉反应(图17和图18)。
2.重复性试验：
使用同一批包被的ELISA板，根据优化的间接ELISA方法检测12份摩根氏菌感阳性血清样品和12份摩根氏菌感阴性血清样品，每个样品重复3次，并对测试结果进行统计分析，以评估间接ELISA测试方法的批内重复性。并使用3批不同批次的酶标包被板进行间接ELISA检测。以评估间接ELISA测试方法在批次之间的可重复性。
结果表明：批内CV值在0.6％-13.2％，批间CV值在0.6％-10.3％，均小于15％，说明该方法重复稳定性良好(图19)。
实施例5：临床应用
于山东省济宁、烟台、潍坊、枣庄、泰安、临沂、德州、东营、聊城、淄博、菏泽、济南12个市奶牛养殖场进行了476份血清样本的采集及间接ELISA方法的检测，结果显示共有28份阳性血清占总数的5.9％。
表15：间接ELISA检测方法检测血清样本
Figure BDA0003001608810000171
实验使用摩根氏菌菌体包被的酶标板进行对比检测，两者结果一致，说明本发明方法可以用于实际样品的临床检测，检测结果的准确性好。
以上所述仅为本申请的优选实施例而已，并不用于限制本申请，对于本领域的技术人员来说，本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 山东农业大学
<120> 一种检测摩氏摩根菌抗体的间接ELISA检测试剂盒及应用
<130> 2021
<160> 3
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 276
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
gctagcgccg ccaccatggg caggtccaag atcgtgctgg gcgccgtggt gctggccagc 60
gctctgctgg ctggctgctc ctccaacgcc aagttcgatc agctggacaa cgacgtgaag 120
acactgaatg ccaaggtgga ccagctgagc aatgacgtga atgccatcag ggccgatgtg 180
cagcaggcca aggatgaggc cgccagagcc aaccagagac tggataacca ggtgaggtcc 240
tacaagaagc accaccacca ccatcactga gaattc 276
<210> 2
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
gctagcgccg ccaccatg 18
<210> 3
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
gaattctcag tgatggtggt ggtg 24

Claims (8)

1.摩氏摩根菌重组LPP蛋白作为包被抗原在制备检测摩氏摩根菌抗体的ELISA检测试剂盒中的应用；
所述摩氏摩根菌重组LPP蛋白是由如下方法制备而成：
以SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列作为编码LPP蛋白的基因，构建重组表达载体，通过真核表达***表达摩氏摩根菌重组LPP蛋白。
2.一种检测摩氏摩根菌抗体的间接ELISA检测试剂盒，其特征在于，所述间接ELISA检测试剂盒是以摩氏摩根菌重组LPP蛋白作为包被抗原；
所述摩氏摩根菌重组LPP蛋白的制备方法如下：
以SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列作为编码LPP蛋白的基因，构建重组表达载体，通过真核表达***表达摩氏摩根菌重组LPP蛋白。
3.根据权利要求2所述的间接ELISA检测试剂盒，其特征在于，重组表达载体的构建方法为：使用限制性内切酶NheⅠ、EcoRⅠ对pcDNA3.1(+)载体和SEQ ID NO.1所示的编码LPP蛋白的基因进行双酶切处理，再用T4DNA连接酶对酶切后的产物进行连接。
4.根据权利要求2所述的间接ELISA检测试剂盒，其特征在于，所述包被抗原是以碳酸盐溶液作为包被液，摩氏摩根菌重组LPP蛋白的包被浓度为2μg/mL，包被条件为4℃、12h。
5.根据权利要求2-4任一项所述的间接ELISA检测试剂盒，其特征在于，所述间接ELISA检测试剂盒还包含：酶标二抗、阴性对照血清、阳性对照血清、底物显色液和终止液。
6.根据权利要求5所述的间接ELISA检测试剂盒，其特征在于，所述酶标二抗为HRP羊抗鼠酶标二抗。
7.一种摩氏摩根菌抗体的间接ELISA检测方法，其特征在于，所述间接ELISA检测方法不以疾病诊断或治疗为目的，包括以下步骤：
（1）包被：以真核表达的摩氏摩根菌重组LPP蛋白作为包被抗原将抗原稀释后加入到酶标板孔中，并在4℃下放置12h；
（2）封闭：每孔加入200µL的5%脱脂奶粉，置4℃作用12h，洗涤5次，一次3min，甩去板中的液体；
（3）加一抗：加入稀释后的待检血清，每孔加100µL，置37℃作用1h；
（4）加酶标二抗：每孔加入100µL稀释后的HRP酶标二抗，酶标二抗稀释浓度为1：40000，置37℃作用1h；
（5）底物显色：每孔加入100µL的TMB显色液，避光显色45min；
（6）加终止液：每孔加入100µL的2M H2SO4震荡混匀，5min内测定OD450nm值。
8.根据权利要求7所述的间接ELISA检测方法，其特征在于，步骤（1）中，所述摩氏摩根菌重组LPP蛋白由如下方法制备而成：
以SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列作为编码LPP蛋白的基因，构建重组表达载体，通过真核表达***表达摩氏摩根菌重组LPP蛋白。
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