CN110585118A - 一种宫内膜干细胞的温敏凝胶制剂及其制备方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种宫内膜干细胞的温敏凝胶制剂包括:宫内膜干细胞细胞制剂、宫内膜干细胞外泌体制剂、壳聚糖、甘露醇、透明质酸、海藻酸钠、β‑甘油磷酸钠。本发明的温敏凝胶制剂不需要经过穿刺回注,仅需要导入女性外生殖***的管腔,待温敏凝胶进行交联,形成与管腔的形状完全匹配的半固体制剂,即可达到修复效果,避免了对机体造成多次伤害。本复合制剂在敷贴后,经由人体的温度会逐渐溶解形成溶液,制剂中的间充质干细胞被释放出来,进而分化形成新生组织,制剂内的外泌体细胞因子会缓慢释放,克服了回注后细胞大量流失的缺点。干细胞分泌的活性因子,能够抑制组织炎症、提高组织的再生能力、促进原有组织的修复,起到创口修复作用。
Description
技术领域
本发明涉及一种医学复合性生物材料,具体涉及一种宫内膜干细胞的温敏凝胶制剂及其制备方法与应用。
背景技术
温敏凝胶(Therm osensitive gel)是指以溶液状态给药后,利用高分子材料对外界温度的响应发生相转变,由液体转化为非化学交联半固体凝胶的制剂。温敏凝胶材料能随环境温度改变而发生一定的相变,具有最低临界溶解温度(Lower critical solutiontemperature,LCST),在人体内产生控释、缓释、靶向、降低毒性等特点;可实现注射植入和长期释药,广泛应用于眼部给药和鼻部给药、直肠给药以及注射给药。
现有技术中单纯使用明胶等医用水凝胶进行伤口敷贴,虽然起到一定的伤口修复作用,但是修复速度慢。为了促进伤口快速愈合,人们在医用水凝胶中添加药物、防腐剂等物料,这会对创口造成一定的刺激,体质敏感的受体还会出现过敏反应。
干细胞在培养过程中会分泌活性物质,细胞因子是主要的活性物质之一。这种培养某种细胞或组织以后,含有细胞分泌物的培养液称为条件培养液。目前,各类型成体间充质干细胞中,ADSCs能分泌多种细胞因子,包括血管内皮生长因子(vEGF)、胎盘生长因子(PGF)、成纤维细胞生长因子(FGFs)、血小板源生长因子(PDGF)、转化生长因子(TGF-β)、肝细胞生长因子(HGF)等在内的各种生长因子,这些生长因子可参与多种细胞反应,促进细胞生长,收集条件培养基是获得这些活性成分的有效方法。
由于近年来,利用干细胞制剂进行创口修复,但是现有的干细胞制剂均为液体,经过静脉回注后,细胞随血液流动而流失,虽然有一定量的细胞归巢到“目的地”,起到很好的修复作用,但是需要的干细胞制剂量较多,且多次回注会对机体造成一定伤害。
发明内容
本发明第一个的目的在于提供一种宫内膜干细胞的温敏凝胶制剂,所述含有宫内膜干细胞温敏凝胶制剂包括:宫内膜干细胞细胞制剂、宫内膜干细胞外泌体制剂、壳聚糖、甘露醇、透明质酸、海藻酸钠、β-甘油磷酸钠,其中宫内膜干细胞外泌体制剂与由壳聚糖、甘露醇、透明质酸、海藻酸钠、β-甘油磷酸钠制备而成的溶液c的体积比为:宫内膜干细胞外泌体制剂:所述溶液c=3~1:1。
优选地,宫内膜干细胞外泌体制剂与由壳聚糖、甘露醇、透明质酸、海藻酸钠、β-甘油磷酸钠制备而成的溶液c的体积比为:宫内膜干细胞外泌体制剂:所述溶液c=2:1。
优选地,宫内膜干细胞细胞制剂与由宫内膜干细胞外泌体制剂、壳聚糖、甘露醇、透明质酸、海藻酸钠、β-甘油磷酸钠制备而成的温敏凝胶制剂的体积比为:温敏凝胶制剂:宫内膜干细胞细胞制剂=3:1。
优选地,所述宫内膜干细胞细胞制剂选用传代至P2~P5的宫内膜干细胞,所述宫内膜干细胞细胞制剂的细胞密度为1×106~5×107cells/mL。
优选地,所述宫内膜干细胞外泌体制剂是通过提取传代至P2~P5,细胞密度为1×106~5×107cells/mL的宫内膜干细胞的细胞培养液获得。
优选地,所述壳聚糖的终浓度为2%,甘露醇的终浓度为0.25%,透明质酸终浓度为0.5-1%,海藻酸钠的终浓度为3-5%,β-甘油磷酸钠的终浓度为50%。
本发明第二个的目的在于提供一种宫内膜干细胞的温敏凝胶制剂的制备方法,包括以下步骤:
(1)在0.1mol/L盐酸溶液中依次加入壳聚糖、甘露醇、透明质酸和海藻酸钠,调节pH值为6.5,高压灭菌该溶液后得a溶液;
(2)将β-甘油磷酸钠溶于三蒸水中,将溶液经0.22μm过滤,得b溶液;
(3)将上述a溶液和b溶液以体积比a:b=5:1的比例混匀,得c溶液;
(4)将上述c溶液和宫内膜干细胞外泌体制剂以体积比:c溶液:宫内膜干细胞外泌体制剂=1:1~3混匀,获得温敏凝胶制剂;
(5)将温敏凝胶制剂与宫内膜干细胞细胞制剂以体积比:温敏凝胶制剂:宫内膜干细胞细胞制剂=3:1混合,获得含有宫内膜干细胞的温敏凝胶制剂。
优选地,所述步骤(1)中壳聚糖的终浓度为2%,甘露醇的终浓度为0.25%,透明质酸终浓度为0.5-1%,海藻酸钠的终浓度为3-5%。
优选地,所述步骤(1)中透明质酸的相对分子量为(120-140)×104。
优选地,所述步骤(2)中β-甘油磷酸钠的终浓度为50%。
优选地,所述步骤(4)中的宫内膜干细胞外泌体制剂采用以下方法制备:将传代至P2-P5代细胞密度为1×106~5×107cells/mL的宫内膜干细胞的培养上清离心去除细胞碎片;收集上清,以细胞上清液:试剂=2:1的比例加入invitrogen试剂盒提取外泌体的试剂,充分混匀后于4℃过夜孵育;孵育完毕后离心弃去上清,用PBS溶液缓冲液重悬即得宫内膜干细胞外泌体悬液。
优选地,所述步骤(5)中的宫内膜干细胞细胞制剂采用以下方法制备:使用杭州易文赛(S-Evans biosciences)经血采集套装获取***的子宫内膜或月经细胞样品;进行培养,使用流式细胞仪检测CD73、CD90、CD105、CD34、CD45及HLA-DR表达情况,收集获得阳性表达的细胞,传代培养至P2-P5,调整细胞密度为1×106~5×107cells/mL,制备成细胞悬浮液,即得宫内膜干细胞细胞制剂。
本发明第三个的目的在于提供如上所述的宫内膜干细胞的温敏凝胶制剂在制备治疗女性生殖***炎症的制剂中的应用。
本发明的有益效果:本发明开创性的采用温敏凝胶和干细胞外泌体的复合性制剂进行女性外生殖***炎症疾病的治疗。本复合制剂在不需要经过穿刺回注,仅需要导入女性外生殖***的管腔,待温敏凝胶进行交联,形成与管腔的形状完全匹配的半固体制剂,即可达到修复效果,避免了对机体造成多次伤害。本复合制剂在敷贴后,经由人体的温度会逐渐溶解形成溶液,制剂中的间充质干细胞被释放出来,进而分化形成新生组织,制剂内的外泌体细胞因子会缓慢释放,克服了回注后细胞大量流失的缺点。此外,干细胞分泌的多种活性因子,能够抑制组织炎症、提高组织的再生能力、促进原有组织的修复,起到全方位创口修复作用。
附图说明
图1为本发明宫内膜干细胞的温敏凝胶制剂的工艺流程图。
图2为宫内膜干细胞第二代和第五代细胞的形态对比示意图(A为第二代4倍镜;B为第二代10倍镜;C为第五代4倍镜;B为第五代10倍镜)。
图3为对照组宫内膜干细胞的流式检测结果示意图。
图4为样品组宫内膜干细胞的流式检测结果示意图。
具体实施方式
为了更加简洁明了的展示本发明的技术方案、目的和优点,下面结合具体实施例及其附图对本发明做进一步的详细描述。
实施例1
本实施例提供一种宫内膜干细胞的温敏凝胶制剂的制备方法,包括以下步骤:
(1)月经采集及宫内膜干细胞分离培养
使用杭州易文赛(S-Evans biosciences)经血采集套装获取***的子宫内膜或月经细胞样品,随后将这些细胞转移到含有青霉素/链霉素和肝素的磷酸盐缓冲液中,4℃条件下保存。在获取样品后的24h~48h内将样品送往实验室离心,取上清液,进行细菌检查后行细胞培养。
本实施例为经血干细胞的分离,分离方法采用参考文献:王雪丽,经血源性子宫内膜干细胞的生物学特性及多向分化潜能的实验研究,安徽医科大学硕士学位论文[M],2016。最终获得P2-P5代宫内膜干细胞。由于间充质干细胞在体外培养时,代次越低,细胞干性维持得越好,但代次低的干细胞数量达不到临床使用要求,故对细胞进行扩增,干细胞随着扩增培养,细胞代次增加,细胞出现分化的趋势越大,因此,为了保证质量和临床效果,一般选用P2-P5的细胞。
(2)宫内膜干细胞的表面抗原检测
采用流式细胞仪检测CD73、CD90、CD105、CD34、CD45及HLA-DR表达。取不同代数的宫内膜干细胞,吸去培养基,0.25%胰酶常规消化,制成1×105的细胞悬液,分别取抗人CD73、CD90、CD105、CD34、CD45及HLA-DR的单克隆抗体各5μL,加入细胞悬液500μL,室温下避光孵育20min,同时设立空白对照,1500r/min离心5min,弃上清,用含10%FBS的PBS洗涤2遍,用500μL PBS重悬后上机检测。
(3)宫内膜干细胞外泌体的提取
收集上述阳性表达的传代至P2-P5代宫内膜干细胞培养上清,按照invitrogen试剂盒说明书提取外泌体。具体步骤为:将培养上清转至高速离心管中,4℃,2000g离心30min,去除细胞碎片。取上清,转移至新的高速离心管中,以细胞上清液:试剂=2:1的比例加入试剂,用祸旋器充分混匀后,置于冰箱中4℃过夜孵育。在4℃坏境中10000g离心60min,弃去上清,用500μL 4℃的PBS溶液缓冲液重悬即为外泌体悬液,置于-20℃保存。
(4)温敏凝胶制备
a.称取壳聚糖粉末,溶解在0.1mol/L盐酸中,壳聚糖的终浓度为2.0%;在壳聚糖溶液中加入甘露醇粉末,甘露醇的终浓度为0.25%。
b.继续往上述溶液中加入相对分子量为(120-140)×104的大分子透明质酸,浓度为1%;加入海藻酸钠,终浓度为5%;滴入1mol/L NaOH,调pH值为6.5。
c.高压灭菌后为a液。
d.将β-甘油磷酸钠粉末溶于三蒸水中,终浓度为50.0%溶液,0.22μm过滤,为b液。
e.按a液:b液(V:V)=5:1的比例,混匀a液和b液,形成c液。
f.制剂温敏凝胶:按c液:宫内膜干细胞外泌体制剂(V:V)1:1混匀,4℃保存,待用。
g.将P2-P5代宫内膜干细胞密度为1×106cells/mL的细胞制剂;按温敏凝胶制剂:宫内膜干细胞细胞制剂(V:V)=3:1混合,获得含有宫内膜干细胞的温敏凝胶制剂。
实施例2
本实施例与实施例1的唯一区别在于P2-P5代宫内膜干细胞密度为5×106cells/mL。
实施例3
本实施例与实施例1的唯一区别在于P2-P5代宫内膜干细胞密度为1×107cells/mL。
实施例4
本实施例与实施例1的唯一区别在于P2-P5代宫内膜干细胞密度为5×107cells/mL。
实施例5
本实施例与实施例1的唯一区别在于步骤(4)中c液与宫内膜干细胞外泌体制剂的比值为:c液:宫内膜干细胞外泌体制剂(V:V)=1:2。
实施例6
本实施例与实施例1的唯一区别在于步骤(4)中c液与宫内膜干细胞外泌体制剂的比值为:c液:宫内膜干细胞外泌体制剂(V:V)=1:3。
实施例7
本实施例与实施例1的唯一区别在于步骤(4)中的透明质酸浓度为0.5%;海藻酸钠终浓度为3%。
实施例8治疗效果验证
将实施例1~8制备的含有宫内膜干细胞的温敏凝胶制剂验证其对***黏膜的间质炎症的治疗效果。
1、家兔***造模
将家兔固定,取浓度为1×107cells/mL白色念珠菌混悬液0.1mL用大鼠灌胃针头注入家兔***内,注入菌液后,用无菌棉球堵住***口。1次/天,连续注射5天后,肉眼检查家兔外阴、***黏膜有无充血、水肿、出血、糜烂及有无豆渣样分泌物等病理炎性变化,取***分泌物经临床微生物检测是否有白色念珠菌感染,进而判断造模成功与否。
2、分组与给药
将造模成功的家兔随机分组,分为模型组、阳性组、组别1、组别2、组别3、组别4、组别5、组别6、组别7,另设空白对照组,空白对照组不注射白色念珠菌。每组家兔10只。分组与每组给药情况,参见表1。
表1:分组与每组给药情况
3、评价指标
(1)***分泌物:用棉签蘸取家兔外阴或***分泌物,涂于病理载玻片上,酒精固定,常规HE染色,病理显微镜下观察有无白色念珠菌菌丝及芽孢。末次给药1d后取家兔***分泌物涂片,HE染色,光学显微镜镜下观察,观察白色念珠菌的菌丝和(或)芽孢,不见菌丝和(或)芽孢者为治愈(转阴),还可见菌丝和(或)芽孢者则未治愈。
(2)***黏膜组织活检HE染色:末次给药1d后钳取家兔***肉眼可见病变部位,10%甲醛溶液固定、脱水、包埋、切片、常规HE染色,病理显微镜下观察***黏膜组织炎症反应情况,包括充血、水肿、炎细胞浸润等。***组织活检病理评分分级诊断标准如下:
按照充血、水肿、出血、炎细胞浸润4项基本指标进行分级,无充血水肿者为(-)为0分,轻度为(+)为1分,中度为(++)为2分,重度为(+++)为3分。检测结果如表2所示:
表2:实施例1~7制备的含有宫内膜干细胞的温敏凝胶制剂的治疗效果
*P<0.05,与模型组相比,具有统计学意义;#P<0.05,与阳性组相比,具有统计学意义
由表2可以看出,空白对照组家兔***黏膜上皮结构完整,排列规则,黏膜下层间质无充血水肿及炎细胞浸润。模型组家兔***黏膜上皮结构基本完整、规则,黏膜下层高度水肿、充血,间质血管扩张,大量炎细胞呈灶状或散在浸润。阳性组***黏膜上皮排列完整、规则,间质轻度水肿,少量或无炎细胞浸润。组别1~4比较了宫内膜干细胞密度对温敏凝胶制剂的治疗效果的影响,由表2看出,随着宫内膜干细胞密度的增加,镜***道黏膜组织病变趋于轻微,间质充血水肿及炎细胞浸润程度减轻。组别1、5、6比较了c液与宫内膜干细胞外泌体制剂体积比对温敏凝胶制剂的治疗效果的影响,由表2可知,随着c液与宫内膜干细胞外泌体制剂体积比值的增加(从1:1~1:2),镜***道黏膜组织病变趋于轻微,间质充血水肿及炎细胞浸润程度减轻。但是,当c液与宫内膜干细胞外泌体制剂体积比值的为1:3时(实施例6),与实施例5相比其治疗效果较差,可见c液与宫内膜干细胞外泌体制剂体积比为1:2是本发明的最佳方案,其治疗效果最好。实施例1与实施例7比较了透明质酸与海藻酸钠的终浓度对温敏凝胶制剂的治疗效果的影响,二者的治疗效果相似,说明透明质酸与海藻酸钠的终浓度对本发明的温敏凝胶制剂影响不大。
实施例9制剂质量控制
将实施例1~7制备的含有宫内膜干细胞的温敏凝胶制剂进行质量控制,检测病毒,结果如表3所示。
表3:实施例1~7制备的含有宫内膜干细胞的温敏凝胶制剂检测结果
检测项目 | 实施例1 | 实施例2 | 实施例3 | 实施例4 | 实施例5 | 实施例6 | 实施例7 |
细菌 | _ | _ | _ | _ | _ | _ | _ |
真菌 | _ | _ | _ | _ | _ | _ | _ |
内毒素 | _ | _ | _ | _ | _ | _ | _ |
甲肝病毒 | _ | _ | _ | _ | _ | _ | _ |
乙肝病毒 | _ | _ | _ | _ | _ | _ | _ |
丙肝病毒 | _ | _ | _ | _ | _ | _ | _ |
梅毒 | _ | _ | _ | _ | _ | _ | _ |
HIV | _ | _ | _ | _ | _ | _ | _ |
上述制剂在4℃中是固体状态,当温度高于35℃时,会逐渐融化,与皮肤完全贴合。并经检测细菌、真菌和各类病毒均为阴性。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式,其描述较为具体和详细,但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是,对于本领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明构思的前提下,还可以做出若干变形和改进,这些都属于本发明的保护范围。因此,本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
Claims (10)
1.一种宫内膜干细胞的温敏凝胶制剂,其特征在于,所述宫内膜干细胞温敏凝胶制剂包括:宫内膜干细胞细胞制剂、宫内膜干细胞外泌体制剂、壳聚糖、甘露醇、透明质酸、海藻酸钠、β-甘油磷酸钠,其中宫内膜干细胞外泌体制剂与由壳聚糖、甘露醇、透明质酸、海藻酸钠、β-甘油磷酸钠制备而成的溶液的体积比为:宫内膜干细胞外泌体制剂:所述溶液=3~1:1。
2.如权利要求1所述的宫内膜干细胞的温敏凝胶制剂,其特征在于,宫内膜干细胞外泌体制剂与由壳聚糖、甘露醇、透明质酸、海藻酸钠、β-甘油磷酸钠制备而成的溶液的体积比为:宫内膜干细胞外泌体制剂:所述溶液=2:1。
3.如权利要求1所述的宫内膜干细胞的温敏凝胶制剂,其特征在于,宫内膜干细胞细胞制剂与由宫内膜干细胞外泌体制剂、壳聚糖、甘露醇、透明质酸、海藻酸钠、β-甘油磷酸钠制备而成的温敏凝胶制剂的体积比为:温敏凝胶制剂:宫内膜干细胞细胞制剂=3:1。
4.如权利要求1所述的宫内膜干细胞的温敏凝胶制剂,其特征在于,所述宫内膜干细胞细胞制剂选用传代至P2~P5的宫内膜干细胞,所述宫内膜干细胞细胞制剂的细胞密度为1×106~5×107cells/mL;所述宫内膜干细胞外泌体制剂是通过提取传代至P2~P5,细胞密度为1×106~5×107cells/mL的宫内膜干细胞的细胞培养液获得。
5.如权利要求1所述的宫内膜干细胞的温敏凝胶制剂,其特征在于,所述壳聚糖的终浓度为2%,甘露醇的终浓度为0.25%,透明质酸终浓度为0.5-1%,海藻酸钠的终浓度为3-5%,β-甘油磷酸钠的终浓度为50%。
6.一种宫内膜干细胞的温敏凝胶制剂的制备方法,其特征在于,包括以下步骤:
(1)在0.1mol/L盐酸溶液中依次加入壳聚糖、甘露醇、透明质酸和海藻酸钠,调节pH值为6.5,高压灭菌该溶液后得a溶液;
(2)将β-甘油磷酸钠溶于三蒸水中,将溶液经0.22μm过滤,得b溶液;
(3)将上述a溶液和b溶液以体积比a:b=5:1的比例混匀,得c溶液;
(4)将上述c溶液和宫内膜干细胞外泌体制剂以体积比:c溶液:宫内膜干细胞外泌体制剂=1:1~3混匀,获得温敏凝胶制剂;
(5)将温敏凝胶制剂与宫内膜干细胞细胞制剂以体积比:温敏凝胶制剂:宫内膜干细胞细胞制剂=3:1混合,获得含有宫内膜干细胞的温敏凝胶制剂。
7.如权利要求6所述的宫内膜干细胞的温敏凝胶制剂的制备方法,其特征在于,所述步骤(1)中壳聚糖的终浓度为2%,甘露醇的终浓度为0.25%,透明质酸终浓度为0.5-1%,海藻酸钠的终浓度为3-5%;所述步骤(2)中β-甘油磷酸钠的终浓度为50%;所述步骤(1)中透明质酸的相对分子量为(120-140)×104。
8.如权利要求6所述的宫内膜干细胞的温敏凝胶制剂的制备方法,其特征在于,所述步骤(4)中的宫内膜干细胞外泌体制剂采用以下方法制备:将传代至P2-P5代细胞密度为1×106~5×107cells/mL的宫内膜干细胞的培养上清离心去除细胞碎片;收集上清,以细胞上清液:试剂=2:1的比例加入invitrogen试剂盒提取外泌体的试剂,充分混匀后于4℃过夜孵育;孵育完毕后离心弃去上清,用PBS溶液缓冲液重悬即得宫内膜干细胞外泌体悬液。
9.如权利要求6所述的宫内膜干细胞的温敏凝胶制剂的制备方法,其特征在于,所述步骤(5)中的宫内膜干细胞细胞制剂采用以下方法制备:使用经血采集套装获取***的子宫内膜或月经细胞样品;进行培养,使用流式细胞仪检测CD73、CD90、CD105、CD34、CD45及HLA-DR表达情况,收集获得阳性表达的细胞,传代培养至P2-P5,调整细胞密度为1×106~5×107cells/mL,制备成细胞悬浮液,即得宫内膜干细胞细胞制剂。
10.如权利要求1~5任一项所述的宫内膜干细胞的温敏凝胶制剂在制备治疗女性生殖***炎症的制剂中的应用。
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