CN112867510A - 吡咯并苯并二氮杂䓬缀合物 - Google Patents

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Abstract

一种式(I)的化合物，其中RL为用于连接至细胞结合剂的接头。
Figure DDA0003022424320000011

Description

吡咯并苯并二氮杂䓬缀合物
技术领域
本发明涉及包括吡咯并苯并二氮杂
Figure BDA0003022424300000012
和相关二聚体(PBD)的缀合物，以及用于制备所述缀合物的前体药物接头。
背景技术
一些吡咯并苯并二氮杂
Figure BDA0003022424300000013
(PBD)具有识别和键合于特定DNA序列的能力；优选序列为PuGPu。第一PBD抗肿瘤抗生素安曲霉素(anthramycin)发现于1965年(Leimgruber等，J.Am.Chem.Soc.,87,5793-5795(1965)；Leimgruber等，J.Am.Chem.Soc.,87,5791-5793(1965))。自那以后，已报道了许多天然存在的PBD，并且已开发了用于多种类似物的10种以上的合成路线(Thurston等，Chem.Rev.1994,433-465(1994))。家族成员包括修道院霉素(Hochlowski等,J.Antibiotics,40,145-148(1987))、契卡霉素(Konishi等,J.Antibiotics,37,200-206(1984))、DC-81(日本专利58-180 487；Thurston等,Chem.Brit.,26,767-772(1990)；Bose等,Tetrahedron,48,751-758(1992))、甲基氨茴霉素(Kuminoto等,J.Antibiotics,33,665-667(1980))、新茴霉素A和B(Takeuchi等,J.Antibiotics,29,93-96(1976))、泊罗霉素(Tsunakawa等,J.Antibiotics,41,1366-1373(1988))、普拉卡素(Shimizu等,J.Antibiotics,29,2492-2503(1982)；Langley和Thurston,J.Org.Chem.,52,91-97(1987))、西班米星(DC-102)(Hara等,J.Antibiotics,41,702-704(1988)；Itoh等,J.Antibiotics,41,1281-1284(1988))、矛霉素(Leber等,J.Am.Chem.Soc.,110,2992-2993(1988))以及托马霉素(tomamycin)(Arima等,J.Antibiotics,25,437-444(1972))。PBD具有以下通式结构：
Figure BDA0003022424300000014
它们的不同之处在于其芳香族A环和吡咯并C环两者中的取代基的数目、类型和位置以及C环的饱和度。在B环中，在N10-C11位置处存在亚胺(N＝C)、甲醇胺(NH-CH(OH))或甲醇胺甲基醚(NH-CH(OMe))，所述N10-C11位置为负责烷基化DNA的亲电中心。所有已知的天然产物在手性C11a位置处具有(S)-构型，当从C环朝向A环观察时，所述位置为其提供右手扭转。这给予它们适当的三维形状，用于与B型DNA的小沟的同螺旋性(isohelicity)，从而导致在结合位点处的滑动配合(snug fit)(Kohn,在Antibiotics III中.Springer-Verlag,New York,第3-11页(1975)；Hurley和Needham-VanDevanter,Acc.Chem.Res.,19,230-237(1986))。它们在小沟中形成加合物的能力使得它们能够干扰DNA加工，因此使其具有作为抗肿瘤剂的用途。
先前已经公开，这些分子的生物活性可通过将两个PBD单元通过它们的C8/C’-羟基官能团经由柔性亚烷基接头接合在一起而加强(Bose,D.S.等，J.Am.Chem.Soc.,114,4939-4941(1992)；Thurston,D.E.等，J.Org.Chem.,61,8141-8147(1996))。PBD二聚体被认为形成序列选择性DNA损伤，如回文结构5’-Pu-GATC-Py-3’股间交联(Smellie,M.等，Biochemistry,42,8232-8239(2003)；Martin,C.等，Biochemistry,44,4135-4147)，被认为主要负责其生物活性。
第一二聚体(Bose,D.S.等,J.Am.Chem.Soc.,114,4939-4941(1992))具有通式：
Figure BDA0003022424300000021
其中n为3至6。在n为3和5时化合物显示出有前景的体外细胞毒性。然而，当对n＝3化合物(DSB-120)的抗肿瘤活性进行研究(Walton,M.等,Cancer Chemother Pharmacol(1996)38:431.doi:10.1007/s002800050507)时，发现这并没有前景。这种前景的缺乏被认为是“由体内的高蛋白结合和/或广泛药物代谢造成的低肿瘤选择性和药物摄取的结果”。
为了改善这些化合物，在“包括应遵循宿主小沟的轮廓的C2/C2’取代基”的情况下对化合物进行研究(Gregson,S.J.,等,Chem.Commun.,1999,797-798.doi:10.1039/A809791G)。此化合物SG2000(SJG-136)：
Figure BDA0003022424300000022
被发现“在皮摩尔区域中具有异常强烈的细胞毒性，比DSB-120强效9000倍”。
此化合物(还在Gregson,S.等,J.Med.Chem.,44,737-748(2001)；Alley,M.C.等,Cancer Research,64,6700-6706(2004)；以及Hartley,J.A.等,Cancer Research,64,6693-6699(2004)中讨论)已经作为独立药剂参与临床试验，例如，NCT02034227研究了其在治疗急性骨髓性白血病和慢性淋巴细胞性白血病中的用途(参见：https://www.clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT02034227)。
携带C2芳基取代基以及内型不饱和基团(endo-unsaturation)的二聚PBD化合物，如SG2202(ZC-207)，公开于WO 2005/085251中：
Figure BDA0003022424300000031
以及WO2006/111759中，所述PBD化合物的亚硫酸氢盐，例如SG2285(ZC-423)：
Figure BDA0003022424300000032
这些化合物已经显示出为高度可用的细胞毒性剂(Howard,P.W.等，Bioorg.Med.Chem.(2009),doi:10.1016/j.bmcl.2009.09.012)。
在含有ADC的PBD的综述(Mantaj,J.等,Angew.Chem.Int.Ed.(2016),55,2-29；DOI:10.1002/anie.201510610)中，论述了PBD二聚体的SAR。SAR的汇总呈现于图3–B“C2-外型和C1-C2/C2-C3不饱和基团增强活性”中。更详细的论述见于章节2.4中，其中提到：
“DSB-120具有较差的体内活性，这部分由于其与细胞含硫醇分子如谷胱甘肽的高反应性。然而，在SJG-136中引入C2/C2’-外型不饱和基团导致DNA结合亲和力和细胞毒性的总体增加，以及由于更多的试剂可能到达其靶DNA而造成的与细胞亲核物质的较低反应性。
WO 2007/085930描述了具有用于连接至细胞结合剂(如抗体)的接头基团的二聚体PBD化合物的制备。接头存在于连接二聚体的单体PBD单元的桥中。
具有用于连接至细胞结合剂(如抗体)的接头基团的二聚体PBD化合物描述于WO2011/130598中。这些化合物中的接头连接于可用的N10位置中的一个，并且通常因酶对接头基团的作用而被切割。二聚体PBD化合物在C环中具有内型或外型不饱和基团。
WO 2014/057074和WO 2015/052322描述了经由N10位置结合在一个单体上的特异性PBD二聚体缀合物，并且所有这些化合物在C环上具有内型不饱和基团。
WO2014/096365描述了化合物：
Figure BDA0003022424300000033
其中C环中缺乏不饱和基团与B环是双内酰胺结合并且因此不具有共价结合DNA的能力。
发明内容
本发明提供了PBD二聚体药物接头和缀合物，其中C环不具有内型或外型不饱和基团，并且其中两个C2位置均携带羟基。
本发明的第一方面包括一种具有式I的化合物：
Figure BDA0003022424300000041
以及其盐和溶剂化物，其中：
R6和R9独立地选自H、R、OH、OR、SH、SR、NH2、NHR、NRR’、硝基、Me3Sn以及卤素；
其中R和R’独立地选自任选取代的C1-12烷基、C3-20杂环基以及C5-20芳基；
R7选自H、R、OH、OR、SH、SR、NH2、NHR、NRR’、硝基、Me3Sn以及卤素；
R”为C3-12亚烷基，所述链可被一个或多个杂原子，例如O、S、NRN2(其中RN2为H或C1-4烷基)，和/或芳环，例如苯或吡啶中断；
Y和Y’选自O、S或NH；
R6’、R7’、R9’分别选自与R6、R7和R9相同的基团；
R11b选自OH、ORA，其中RA为C1-4烷基；并且
RL为用于连接至细胞结合剂的接头，其选自：
(iiia)：
Figure BDA0003022424300000042
其中
Q为：
Figure BDA0003022424300000051
其中QX是使得Q是氨基酸残基、二肽残基或三肽残基；
X为：
Figure BDA0003022424300000052
其中a＝0至5，b＝0至16，c＝0或1，d＝0至5；
GL为用于连接至配体单元的接头；以及
Figure BDA0003022424300000053
其中RL1和RL2独立地选自H和甲基，或与它们所结合的碳原子一起形成亚环丙基或亚环丁基；
并且e为0或1；
以下三种情况中的任一者：
(a)R20为H并且R21为H；
(b)R20为H并且R21为＝O；或
(c)R21为OH或ORA，其中RA为C1-4烷基并且R20选自：
Figure BDA0003022424300000054
Figure BDA0003022424300000055
Figure BDA0003022424300000061
其中RZ选自：
Figure BDA0003022424300000062
(z-ii)OC(＝O)CH3；
(z-iii)NO2；
(z-iv)OMe；
(z-v)葡萄糖醛酸苷；
(z-vi)NH-C(＝O)-X1-NHC(＝O)X2-NH-C(＝O)-RZC，其中-C(＝O)-X1-NH-和-C(＝O)-X2-NH-代表中性氨基酸残基并且RZC选自Me、OMe、CH2CH2OMe和(CH2CH2O)2Me。
在另选实施方案中，R7和R7’可一起形成以下基团：(i)-O-(CH2)n-O-，其中n为7至16；或(ii)-O-(CH2CH2O)m-，其中m为2至5。
已发现所述药物接头与配体单元如抗体发生预备缀合。据信R20基团的存在对于避免C2-OH基团与N10-C11亚胺基团之间的交叉反应非常重要。同样，用仲胺或内酰胺基团替换N10-C11也避免这一问题。
本发明的第二方面提供了式II的缀合物：
L-(DL)p (II)
其中L为配体单元(即，靶向剂)，DL为式I’的药物接头单元：
Figure BDA0003022424300000063
其中R6、R7、R9、R11b、Y、R”、Y’、R6’、R7’、R9’、R20和R21如本发明的第一方面中所定义；
RLL为用于连接至细胞结合剂的接头，其选自：
Figure BDA0003022424300000071
其中Q和X如第一方面所定义并且GLL是连接至配体单元的接头；以及
Figure BDA0003022424300000072
其中RL1和RL2如第一方面所定义；
其中p为1至20的整数。
下文更全面地描述的配体单元为结合至靶标部分的靶向剂。配体单元可以，例如，特异性地结合细胞组分(细胞结合剂)或其他目标靶分子。配体单元可以是，例如，蛋白质、多肽或肽，如抗体、抗体的抗原结合片段，或其他结合剂，如Fc融合蛋白。
已发现这些缀合物具有导致高治疗指数的高耐受性，从而使得它们有希望用作临床开发的候选物。
本发明的第三方面提供了本发明的第二方面的缀合物在制造用于治疗增殖性疾病的药物中的用途。第三方面还提供了用于治疗增殖性疾病的本发明的第二方面的缀合物。第三方面还提供了一种治疗增殖性疾病的方法，其包括向有需要的患者施用治疗有效量的本发明的第二方面的缀合物。
本领域的普通技术人员能够容易地确定候选缀合物是否治疗任何特定细胞类型的增殖性病状。例如，可以方便地用来评估由特定化合物提供的活性的测定描述于以下实施例中。
本发明的第四方面提供了本发明的第二方面的缀合物的合成，其包括将本发明的第一方面的化合物(药物接头)与配体单元缀合。
本发明的第五方面提供了一种式IV的化合物：
Figure BDA0003022424300000081
其中R6、R7、R9、Y、R”、Y’、R6’、R7’和R9’如本发明的第一方面中所定义；
以下三种情况中的任一者：
(a)R30为H并且R31为H；
(b)R30为H并且R31为＝O；或
(c)R30和R31在它们所连接的N原子与C原子之间形成双键。
式IV的化合物是由第一方面的缀合物释放的弹头。
定义
取代基
如本文所用的短语“任选取代的”涉及可为未取代的或可为取代的亲本基团。
除非另外指明，否则如本文所用的术语“取代的”涉及携带一个或多个取代基的亲本基团。术语“取代基”在本文中以常规意义使用并且是指共价连接至亲本基团或在适当时与亲本基团融合的化学部分。多种取代基是众所周知的，并且它们的形成和引入到各种亲本基团中的方法也是众所周知的。
取代基的实例在下面更详细地描述。
C1-12烷基：如本文所用的术语“C1-12烷基”涉及通过从具有1至12个碳原子的烃化合物的碳原子处移除氢原子获得的一价部分，其可以是脂族或脂环族的，并且可以是饱和或不饱和的(例如部分不饱和的、完全不饱和的)。如本文所用的术语“C1-4烷基”涉及通过从具有1至4个碳原子的烃化合物的碳原子处移除氢原子获得的一价部分，其可以是脂族或脂环族的，并且可以是饱和或不饱和的(例如部分不饱和的、完全不饱和的)。因此，术语“烷基”包括以下论述的亚类烯基、炔基、环烷基等。
饱和烷基的实例包括但不限于甲基(C1)、乙基(C2)、丙基(C3)、丁基(C4)、戊基(C5)、己基(C6)以及庚基(C7)。
饱和直链烷基的实例包括但不限于甲基(C1)、乙基(C2)、正丙基(C3)、正丁基(C4)、正戊基(戊基)(C5)、正己基(C6)以及正庚基(C7)。
饱和支链烷基的实例包括异丙基(C3)、异丁基(C4)、仲丁基(C4)、叔丁基(C4)、异戊基(C5)以及新戊基(C5)。
C2-12烯基：如本文所用的术语“C2-12烯基”涉及具有一个或多个碳-碳双键的烷基。
不饱和烯基的实例包括但不限于乙烯基(乙烯基，-CH＝CH2)、1-丙烯基(-CH＝CH-CH3)、2-丙烯基(烯丙基，-CH-CH＝CH2)、异丙烯基(1-甲基乙烯基，-C(CH3)＝CH2)、丁烯基(C4)、戊烯基(C5)以及己烯基(C6)。
C2-12炔基：如本文所用的术语“C2-12炔基”涉及具有一个或多个碳-碳三键的烷基。
不饱和炔基的实例包括但不限于乙炔基(-C≡CH)和2-丙炔基(炔丙基，-CH2-C≡CH)。
C3-12环烷基：如本文所用的术语“C3-12环烷基”涉及也是环基的烷基；即，通过从环状烃(碳环)化合物的脂环环原子处移除氢原子获得的一价部分，所述部分具有3至7个碳原子，包括3至7个环原子。
环烷基的实例包括但不限于衍生自以下的那些：
饱和的单环烃化合物：
环丙烷(C3)、环丁烷(C4)、环戊烷(C5)、环己烷(C6)、环庚烷(C7)、甲基环丙烷(C4)、二甲基环丙烷(C5)、甲基环丁烷(C5)、二甲基环丁烷(C6)、甲基环戊烷(C6)、二甲基环戊烷(C7)以及甲基环己烷(C7)；
不饱和的单环烃化合物：
环丙烯(C3)、环丁烯(C4)、环戊烯(C5)、环己烯(C6)、甲基环丙烯(C4)、二甲基环丙烯(C5)、甲基环丁烯(C5)、二甲基环丁烯(C6)、甲基环戊烯(C6)、二甲基环戊烯(C7)以及甲基环己烯(C7)；以及
饱和多环烃化合物：
降蒈烷(norcarane)(C7)、降蒎烷(norpinane)(C7)、降莰烷(norbornane)(C7)。
C3-20杂环基：如本文所用的术语“C3-20杂环基”涉及通过从杂环化合物的环原子处移除氢原子获得的一价部分，所述部分具有3至20个环原子，其中1至10个为环杂原子。优选地，各环均具有3至7个环原子，其中1至4个环原子为环杂原子。
在上下文中，前缀(例如C3-20、C3-7、C5-6等)表示环原子的数目或环原子的数目的范围，无论为碳原子还是杂原子。例如，如本文所用的术语“C5-6杂环基”涉及具有5或6个环原子的杂环基。
单环杂环基的实例包括但不限于衍生自以下的杂环基：
N1：氮丙啶(C3)、氮杂环丁烷(C4)、吡咯烷(四氢吡咯)(C5)、吡咯啉(例如，3-吡咯啉、2,5-二氢吡咯)(C5)、2H-吡咯或3H-吡咯(异吡咯、异唑)(C5)、哌啶(C6)、二氢吡啶(C6)、四氢吡啶(C6)、吖庚因(C7)；
O1：环氧乙烷(C3)、氧杂环丁烷(C4)、氧杂环戊烷(四氢呋喃)(C5)、氧杂环戊二烯(oxole)(二氢呋喃)(C5)、噁烷(四氢吡喃)(C6)、二氢吡喃(C6)、吡喃(C6)、氧杂环庚三烯(C7)；
S1：硫杂丙环(thiirane)(C3)、硫杂环丁烷(thietane)(C4)、硫杂环戊烷(thiolane)(四氢噻吩)(C5)、噻烷(四氢噻喃)(C6)、硫杂环庚烷(thiepane)(C7)；
O2：二氧戊烷(C5)、二噁烷(C6)和二氧杂环庚烷(C7)；
O3：三噁烷(C6)；
N2：咪唑烷(C5)、吡唑烷(二氮杂环戊烷(diazolidine))(C5)、咪唑啉(C5)、吡唑啉(二氢吡唑)(C5)、哌嗪(C6)；
N1O1：四氢噁唑(C5)、二氢噁唑(C5)、四氢异噁唑(C5)、二氢异噁唑(C5)、吗啉(C6)、四氢噁嗪(C6)、二氢噁嗪(C6)、噁嗪(C6)；
N1S1：噻唑啉(C5)、噻唑烷(C5)、硫代吗啉(C6)；
N2O1：噁二嗪(C6)；
O1S1：噁噻唑(oxathiole)(C5)和氧硫杂环己烷(oxathiane)(噻噁烷(thioxane))(C6)；以及N1O1S1：噁噻嗪(C6)。
取代的单环杂环基的实例包括衍生自呈环状形式的糖类的杂环基，所述糖类例如呋喃糖(C5)，如***呋喃糖、来苏呋喃糖、核呋喃糖和木呋喃糖；以及吡喃糖(C6)，如阿洛吡喃糖(allopyranose)、阿卓吡喃糖(altropyranose)、葡萄吡喃糖、甘露吡喃糖、古洛吡喃糖(gulopyranose)、艾杜吡喃糖(idopyranose)、半乳吡喃糖以及太洛吡喃糖(talopyranose)。
C5-20芳基：如本文所用的术语“C5-20芳基”涉及通过从芳族化合物的芳族环原子处移除氢原子获得的一价部分，所述部分具有3至20个环原子。如本文所用的术语“C5-7芳基”涉及通过从芳族化合物的芳族环原子处移除氢原子获得的一价部分，所述部分具有5至7个环原子并且如本文所用的术语“C5-10芳基”涉及通过从芳族化合物的芳族环原子处移除氢原子获得的一价部分，所述部分具有5至10个环原子。优选地，每个环具有5至7个环原子。
在上下文中，前缀(例如C3-20、C5-7、C5-6、C5-10等)表示环原子的数目或环原子的数目的范围，无论为碳原子还是杂原子。例如，如本文所用的术语“C5-6芳基”涉及具有5或6个环原子的芳基。
环原子可以全部是碳原子，如在“碳芳基”中。
碳芳基的实例包括但不限于衍生自苯(即苯基)(C6)、萘(C10)、薁(azulene)(C10)、蒽(C14)、菲(C14)、萘并萘(C18)以及嵌二萘(C16)的那些。
包括其中至少一个为芳环的稠环的芳基的实例包括但不限于衍生自茚满(例如2,3-二氢-1H-茚)(C9)、茚(C9)、异茚(C9)、四氢化萘(1,2,3,4-四氢萘(C10)、二氢苊(C12)、芴(C13)、非那烯(phenalene)(C13)、醋菲(acephenanthrene)(C15)以及醋蒽(aceanthrene)(C16)的基团。
另选地，环原子可包括一个或多个杂原子，如在“杂芳基”中。单环杂芳基的实例包括但不限于衍生自以下的那些：
N1：吡咯(唑)(C5)、吡啶(吖嗪)(C6)；
O1：呋喃(氧杂环戊二烯)(C5)；
S1：噻吩(硫杂环戊二烯)(C5)；
N1O1：噁唑(C5)、异噁唑(C5)、异噁嗪(C6)；
N2O1：噁二唑(呋咱)(C5)；
N3O1：噁***(C5)；
N1S1：噻唑(C5)、异噻唑(C5)；
N2：咪唑(1,3-二唑)(C5)、吡唑(1,2-二唑)(C5)、哒嗪(1,2-二嗪)(C6)、嘧啶(1,3-二嗪)(C6)(例如，胞嘧啶、胸腺嘧啶、尿嘧啶)、吡嗪(1,4-二嗪)(C6)；
N3：***(C5)、三嗪(C6)；以及，
N4：四唑(C5)。
包含稠环的杂芳基的实例包括但不限于：
C9(具有2个稠环)，其衍生自苯并呋喃(O1)、异苯并呋喃(O1)、吲哚(N1)、异吲哚(N1)、中氮茚(N1)、吲哚啉(N1)、异吲哚啉(N1)、嘌呤(N4)(例如，腺嘌呤、鸟嘌呤)、苯并咪唑(N2)、吲唑(N2)、苯并噁唑(N1O1)、苯并异噁唑(N1O1)、苯并二噁茂(O2)、苯并呋咱(N2O1)、苯并***(N3)、苯并硫代呋喃(S1)、苯并噻唑(N1S1)、苯并噻二唑(N2S)；
C10(具有2个稠环)，其衍生自苯并吡喃(O1)、异苯并吡喃(O1)、苯并二氢吡喃(O1)、异苯并二氢吡喃(O1)、苯并噁烷(O2)、喹啉(N1)、异喹啉(N1)、喹嗪(N1)、苯并噁嗪(N1O1)、苯并二嗪(N2)、吡啶并吡啶(N2)、喹喔啉(N2)、喹唑啉(N2)、噌啉(N2)、酞嗪(N2)、二氮杂萘(N2)、蝶啶(N4)；
C11(具有2个稠环)，其衍生自苯并二氮杂
Figure BDA0003022424300000111
(N2)；
C13(具有3个稠环)，其衍生自咔唑(N1)、二苯并呋喃(O1)、二苯并噻吩(S1)、咔啉(N2)、萘嵌间二氮杂苯(N2)、吡啶并吲哚(N2)；以及，
C14(具有3个稠环)，其衍生自吖啶(N1)、呫吨(O1)、噻吨(S1)、二苯并对二噁英(oxanthrene)(O2)、氧硫杂蒽(O1S1)、吩嗪(N2)、吩噁嗪(N1O1)、吩噻嗪(N1S1)、噻蒽(S2)、菲啶(N1)、菲咯啉(N2)、吩嗪(N2)。
无论单独还是作为另一取代基的一部分的以上基团均可自身任选地被一个或多个选自自身以及以下列出的另外取代基的基团取代。
卤素：-F、-Cl、-Br和-I。
羟基：-OH。
醚：-OR，其中R是醚取代基，例如，C1-7烷基(也称为C1-7烷氧基，以下进行讨论)、C3-20杂环基(也称为C3-20杂环氧基)或C5-20芳基(也称为C5-20芳基氧基)，优选C1-7烷基。
烷氧基：-OR，其中R为烷基，例如，C1-7烷基。C1-7烷氧基的实例包括但不限于-OMe(甲氧基)、-OEt(乙氧基)、-O(nPr)(正丙氧基)、-O(iPr)(异丙氧基)、-O(nBu)(正丁氧基)、-O(sBu)(仲丁氧基)、-O(iBu)(异丁氧基)以及-O(tBu)(叔丁氧基)。
缩醛：-CH(OR1)(OR2)，其中R1和R2独立地为缩醛取代基，例如，C1-7烷基、C3-20杂环基或C5-20芳基，优选C1-7烷基，或在“环状”缩醛基团的情况下，R1和R2，与它们所连接的两个氧原子，和它们所连接的碳原子一起，形成具有4至8个环原子的杂环。缩醛基团的实例包括但不限于-CH(OMe)2、-CH(OEt)2和-CH(OMe)(OEt)。
半缩醛：-CH(OH)(OR1)，其中R1为半缩醛取代基，例如，C1-7烷基、C3-20杂环基或C5-20芳基，优选C1-7烷基。半缩醛基团的实例包括但不限于-CH(OH)(OMe)和-CH(OH)(OEt)。
缩酮：-CR(OR1)(OR2)，其中R1和R2如对于缩醛所定义，并且R是除氢之外的缩酮取代基，例如，C1-7烷基、C3-20杂环基或C5-20芳基，优选C1-7烷基。缩酮基团的实例包括但不限于-C(Me)(OMe)2、-C(Me)(OEt)2、-C(Me)(OMe)(OEt)、-C(Et)(OMe)2、-C(Et)(OEt)2以及-C(Et)(OMe)(OEt)。
半缩酮：-CR(OH)(OR1)，其中R1如对于半缩醛所定义，并且R是除氢之外的半缩酮取代基，例如，C1-7烷基、C3-20杂环基或C5-20芳基，优选C1-7烷基。半缩醛基团的实例包括但不限于-C(Me)(OH)(OMe)、-C(Et)(OH)(OMe)、-C(Me)(OH)(OEt)以及-C(Et)(OH)(OEt)。
氧代基(酮、-酮)：＝O。
硫酮(Thione)(硫酮(thioketone))：＝S。
亚氨基(亚胺)：＝NR，其中R为亚氨基取代基，例如，氢、C1-7烷基、C3-20杂环基或C5-20芳基，优选氢或C1-7烷基。酯基的实例包括但不限于＝NH、＝NMe、＝NEt及＝NPh。
甲酰基(醛、甲醛)：-C(＝O)H。
酰基(酮基)：-C(＝O)R，其中R是酰基取代基，例如，C1-7烷基(也称为C1-7烷基酰基或C1-7烷酰基)、C3-20杂环基(也称为C3-20杂环酰基)或C5-20芳基(也称为C5-20芳基酰基)，优选C1-7烷基。酰基的实例包括但不限于-C(＝O)CH3(乙酰基)、-C(＝O)CH2CH3(丙酰基)、-C(＝O)C(CH3)3(叔丁酰基)和-C(＝O)Ph(苯甲酰基、酰苯基(phenone))。
羧基(羧酸)：-C(＝O)OH。
硫代羧基(硫代羧酸)：-C(＝S)SH。
硫醇羧基(硫醇羧酸)：-C(＝O)SH。
硫酮羧基(硫酮羧酸)：-C(＝S)OH。
亚胺酸：-C(＝NH)OH。
异羟肟酸：-C(＝NOH)OH。
酯(羧酸酯、羧酸的酯、氧羰基)：-C(＝O)OR，其中R是酯取代基，例如，C1-7烷基、C3-20杂环基或C5-20芳基，优选C1-7烷基。酯基的实例包括但不限于-C(＝O)OCH3、-C(＝O)OCH2CH3、-C(＝O)OC(CH3)3和-C(＝O)OPh。
酰氧基(反酯)：-OC(＝O)R，其中R是酰氧基取代基，例如，C1-7烷基、C3-20杂环基或C5-20芳基，优选C1-7烷基。酰氧基的实例包括但不限于-OC(＝O)CH3(乙酰氧基)、-OC(＝O)CH2CH3、-OC(＝O)C(CH3)3、-OC(＝O)Ph和-OC(＝O)CH2Ph。
氧基羰基氧基：-OC(＝O)OR，其中R是酯取代基，例如，C1-7烷基、C3-20杂环基或C5-20芳基，优选C1-7烷基。酯基的实例包括但不限于-OC(＝O)OCH3、-OC(＝O)OCH2CH3、-OC(＝O)OC(CH3)3和-OC(＝O)OPh。
氨基：-NR1R2，其中R1和R2独立地为氨基取代基，例如，氢、C1-7烷基(也称为C1-7烷基氨基或二-C1-7烷基氨基)、C3-20杂环基或C5-20芳基，优选H或C1-7烷基，或，在“环状”氨基的情况下，R1和R2与它们所连接的氮原子一起形成具有4至8个环原子的杂环。氨基可以是伯(-NH2)、仲(-NHR1)或叔(-NHR1R2)，并且在阳离子形式中，可以是季(-+NR1R2R3)。氨基的实例包括但不限于-NH2、-NHCH3、-NHC(CH3)2、-N(CH3)2、-N(CH2CH3)2和-NHPh。环状氨基的实例包括但不限于氮杂环丙烷基、氮杂环丁烷基、吡咯烷基、哌啶基、哌嗪基、吗啉代以及硫吗啉代。
酰氨基(氨基甲酰基、氨甲酰基、氨基羰基、羧基酰胺)：-C(＝O)NR1R2，其中R1和R2独立地为氨基取代基，如对于氨基所定义。酰氨基的实例包括但不限于-C(＝O)NH2、-C(＝O)NHCH3、-C(＝O)N(CH3)2、-C(＝O)NHCH2CH3和-C(＝O)N(CH2CH3)2，以及其中R1和R2与它们所连接的氮原子一起形成杂环结构的酰氨基，例如哌啶基羰基、吗啉代羰基、硫吗啉代羰基和哌嗪基羰基。
硫代酰氨基(硫代氨甲酰基)：-C(＝S)NR1R2，其中R1和R2独立地为氨基取代基，如对于氨基所定义。酰氨基的实例包括但不限于-C(＝S)NH2、-C(＝S)NHCH3、-C(＝S)N(CH3)2和-C(＝S)NHCH2CH3。
酰氨基(Acylamido)(酰基氨基(acylamino))：-NR1C(＝O)R2，其中R1是酰胺取代基，例如，氢、C1-7烷基、C3-20杂环基或C5-20芳基，优选氢或C1-7烷基，并且R2是酰基取代基，例如，C1-7烷基、C3-20杂环基或C5-20芳基，优选氢或C1-7烷基。酰基酰胺基团的实例包括但不限于-NHC(＝O)CH3、-NHC(＝O)CH2CH3和-NHC(＝O)Ph。R1和R2可一起形成环状结构，如例如在琥珀酰亚胺基、马来酰亚胺基和邻苯二甲酰亚胺基中：
Figure BDA0003022424300000141
氨基羰基氧基：-OC(＝O)NR1R2，其中R1和R2独立地为氨基取代基，如对于氨基所定义。氨基羰基氧基的实例包括但不限于-OC(＝O)NH2、-OC(＝O)NHMe、-OC(＝O)NMe2和-OC(＝O)NEt2。
脲基：-N(R1)CONR2R3，其中R2和R3独立地为氨基取代基，如对于氨基所定义，并且R1是脲基取代基，例如，氢、C1-7烷基、C3-20杂环基或C5-20芳基，优选氢或C1-7烷基。脲基的实例包括但不限于-NHCONH2、-NHCONHMe、-NHCONHEt、-NHCONMe2、-NHCONEt2、-NMeCONH2、-NMeCONHMe、-NMeCONHEt、-NMeCONMe2和-NMeCONEt2。
胍基：-NH-C(＝NH)NH2。
四唑基：具有四个氮原子和一个碳原子的五元芳环，
Figure BDA0003022424300000142
亚氨基：＝NR，其中R为亚氨基取代基，例如，氢、C1-7烷基、C3-20杂环基或C5-20芳基，优选H或C1-7烷基。亚氨基的实例包括但不限于＝NH、＝NMe和＝NEt。
脒(脒基)：-C(＝NR)NR2，其中每个R为脒取代基，例如，氢、C1-7烷基、C3-20杂环基或C5-20芳基，优选H或C1-7烷基。脒基团的实例包括但不限于-C(＝NH)NH2、-C(＝NH)NMe2和-C(＝NMe)NMe2。
硝基：-NO2。
亚硝基：-NO。
叠氮基：-N3。
氰基(腈、甲腈)：-CN。
异氰基：-NC。
氰酰基：-OCN。
异氰酰基：-NCO。
氰硫基(硫氰酰基)：-SCN。
异氰硫基(异硫氰酰基)：-NCS。
硫氢基(Sulfhydryl)(硫醇(thiol)、巯基(mercapto))：-SH。
硫醚(Thioether)(硫醚(sulfide))：-SR，其中R为硫醚取代基，例如，C1-7烷基(也称为C1-7烷硫基)、C3-20杂环基或C5-20芳基，优选C1-7烷基。C1-7烷硫基的实例包括但不限于-SCH3和-SCH2CH3。
二硫醚：-SS-R，其中R为二硫醚取代基，例如，C1-7烷基、C3-20杂环基或C5-20芳基，优选C1-7烷基(本文也称为C1-7烷基二硫醚)。C1-7烷基二硫醚基团的实例包括但不限于-SSCH3和-SSCH2CH3。
锍化物(亚磺酰基、亚砜)：-S(＝O)R，其中R为锍化物取代基，例如，C1-7烷基、C3-20杂环基或C5-20芳基，优选C1-7烷基。锍化物基团的实例包括但不限于-S(＝O)CH3和-S(＝O)CH2CH3。
砜(磺酰基)：-S(＝O)2R，其中R为砜取代基，例如，C1-7烷基、C3-20杂环基或C5-20芳基，优选C1-7烷基，包括例如氟化或全氟化的C1-7烷基。砜基团的实例包括但不限于-S(＝O)2CH3(甲基磺酰基、甲磺酰基)、-S(＝O)2CF3(三氟甲磺酰基)、-S(＝O)2CH2CH3(乙磺酰基)、-S(＝O)2C4F9(九氟丁磺酰基)、-S(＝O)2CH2CF3(三氟乙磺酰基)、-S(＝O)2CH2CH2NH2(牛磺酰基)、-S(＝O)2Ph(苯基磺酰基、苯磺酰基)、4-甲基苯基磺酰基(甲苯磺酰基)、4-氯苯基磺酰基(氯苯磺酰基)、4-溴苯基磺酰基(溴苯磺酰基)、4-硝基苯基磺酰基(硝苯磺酰基)、2-萘磺酸酯(萘磺酰基)以及5-二甲基氨基-萘-1-基磺酸酯(丹磺酰基)。
亚磺酸(亚磺基)：-S(＝O)OH、-SO2H。
磺酸(磺基)：-S(＝O)2OH、-SO3H。
亚磺酸酯(亚磺酸的酯)：-S(＝O)OR，其中R为亚磺酸酯取代基，例如，C1-7烷基、C3-20杂环基或C5-20芳基，优选C1-7烷基。亚磺酸酯基团的实例包括但不限于-S(＝O)OCH3(甲氧基亚磺酰基；甲基亚磺酸酯)和-S(＝O)OCH2CH3(乙氧基亚磺酰基；乙基亚磺酸酯)。
磺酸酯(磺酸的酯)：-S(＝O)2OR，其中R为磺酸酯取代基，例如，C1-7烷基、C3-20杂环基或C5-20芳基，优选C1-7烷基。磺酸酯基团的实例包括但不限于-S(＝O)2OCH3(甲氧基磺酰基；甲基磺酸酯)和-S(＝O)2OCH2CH3(乙氧基磺酰基；乙基磺酸酯)。
亚磺酰氧基：-OS(＝O)R，其中R为亚磺酰氧基取代基，例如，C1-7烷基、C3-20杂环基或C5-20芳基，优选C1-7烷基。亚磺酰氧基的实例包括但不限于-OS(＝O)CH3和-OS(＝O)CH2CH3。
磺酰氧基：-OS(＝O)2R，其中R为磺酰氧基取代基，例如，C1-7烷基、C3-20杂环基或C5-20芳基，优选C1-7烷基。磺酰氧基的实例包括但不限于-OS(＝O)2CH3(甲磺酸酯)和-OS(＝O)2CH2CH3(乙磺酸酯)。
硫酸酯：-OS(＝O)2OR；其中R为硫酸酯取代基，例如，C1-7烷基、C3-20杂环基或C5-20芳基，优选C1-7烷基。硫酸酯基团的实例包括但不限于-OS(＝O)2OCH3和-SO(＝O)2OCH2CH3。
氨磺酰基(氨磺酰；亚磺酸酰胺；亚磺酰胺)：-S(＝O)NR1R2，其中R1和R2独立地为氨基取代基，如对于氨基所定义。氨磺酰基的实例包括但不限于-S(＝O)NH2、-S(＝O)NH(CH3)、-S(＝O)N(CH3)2、-S(＝O)NH(CH2CH3)、-S(＝O)N(CH2CH3)2和-S(＝O)NHPh。
磺酰氨基(Sulfonamido)(氨亚磺酰基；磺酸酰胺；磺酰胺)：-S(＝O)2NR1R2，其中R1和R2独立地为氨基取代基，如对于氨基所定义。磺酰氨基的实例包括但不限于-S(＝O)2NH2、-S(＝O)2NH(CH3)、-S(＝O)2N(CH3)2、-S(＝O)2NH(CH2CH3)、-S(＝O)2N(CH2CH3)2和-S(＝O)2NHPh。
磺氨基：-NR1S(＝O)2OH，其中R1为氨基取代基，如对于氨基所定义。磺氨基的实例包括但不限于-NHS(＝O)2OH和-N(CH3)S(＝O)2OH。
磺氨基：-NR1S(＝O)2R，其中R1为氨基取代基，如对于氨基所定义，并且R为磺氨基取代基，例如，C1-7烷基、C3-20杂环基或C5-20芳基，优选C1-7烷基。磺氨基的实例包括但不限于-NHS(＝O)2CH3和-N(CH3)S(＝O)2C6H5。
亚磺氨基：-NR1S(＝O)R，其中R1为氨基取代基，如对于氨基所定义，并且R为亚磺氨基取代基，例如，C1-7烷基、C3-20杂环基或C5-20芳基，优选C1-7烷基。亚磺氨基的实例包括但不限于-NHS(＝O)CH3和-N(CH3)S(＝O)C6H5。
膦基(膦)：-PR2，其中R为膦基取代基，例如，-H、C1-7烷基、C3-20杂环基或C5-20芳基，优选-H、C1-7烷基或C5-20芳基。膦基的实例包括但不限于-PH2、-P(CH3)2、-P(CH2CH3)2、-P(t-Bu)2和-P(Ph)2。
磷基：-P(＝O)2。
氧膦基(氧化膦)：-P(＝O)R2，其中R为氧膦基取代基，例如，C1-7烷基、C3-20杂环基或C5-20芳基，优选C1-7烷基或C5-20芳基。氧膦基的实例包括但不限于-P(＝O)(CH3)2、-P(＝O)(CH2CH3)2、-P(＝O)(t-Bu)2和-P(＝O)(Ph)2。
膦酸(膦酰基)：-P(＝O)(OH)2。
膦酸酯(膦酰基酯)：-P(＝O)(OR)2，其中R为膦酸酯取代基，例如，-H、C1-7烷基、C3-20杂环基或C5-20芳基，优选-H、C1-7烷基或C5-20芳基。膦酸酯基团的实例包括但不限于-P(＝O)(OCH3)2、-P(＝O)(OCH2CH3)2、-P(＝O)(O-t-Bu)2和-P(＝O)(OPh)2。
磷酸(膦酰基氧基)：-OP(＝O)(OH)2。
磷酸酯(膦酰基氧基酯)：-OP(＝O)(OR)2，其中R为磷酸酯取代基，例如，-H、C1-7烷基、C3-20杂环基或C5-20芳基，优选-H、C1-7烷基或C5-20芳基。磷酸酯基团的实例包括但不限于-OP(＝O)(OCH3)2、-OP(＝O)(OCH2CH3)2、-OP(＝O)(O-t-Bu)2和-OP(＝O)(OPh)2。
亚磷酸：-OP(OH)2。
亚磷酸酯：-OP(OR)2，其中R为亚磷酸酯取代基，例如，-H、C1-7烷基、C3-20杂环基或C5-20芳基，优选-H、C1-7烷基或C5-20芳基。亚磷酸酯基团的实例包括但不限于-OP(OCH3)2、-OP(OCH2CH3)2、-OP(O-t-Bu)2和-OP(OPh)2。
亚磷酰胺：-OP(OR1)-NR2 2，其中R1和R2为亚磷酰胺取代基，例如，-H、(任选取代的)C1-7烷基、C3-20杂环基或C5-20芳基，优选-H、C1-7烷基或C5-20芳基。亚磷酰胺基团的实例包括但不限于-OP(OCH2CH3)-N(CH3)2、-OP(OCH2CH3)-N(i-Pr)2和-OP(OCH2CH2CN)-N(i-Pr)2。
磷酰胺：-OP(＝O)(OR1)-NR2 2，其中R1和R2为磷酰胺取代基，例如，-H、(任选取代的)C1-7烷基、C3-20杂环基或C5-20芳基，优选-H、C1-7烷基或C5-20芳基。磷酰胺基团的实例包括但不限于-OP(＝O)(OCH2CH3)-N(CH3)2、-OP(＝O)(OCH2CH3)-N(i-Pr)2和-OP(＝O)(OCH2CH2CN)-N(i-Pr)2。
亚烷基
C3-12亚烷基：如本文所用的术语“C3-12亚烷基”涉及通过从具有3至12个碳原子(除非另外指出)的烃化合物上移除2个氢原子(从同一个碳原子处移除两个氢原子或从两个不同碳原子处各移除一个氢原子)而获得的双齿物部分，其可以是脂族的或脂环族的，并且可以是饱和的、部分不饱和的或完全不饱和的。因此，术语“亚烷基”包括以下论述的亚类亚烯基、亚炔基、亚环烷基等。
直链饱和C3-12亚烷基的实例包括但不限于-(CH2)n-，其中n为3至12的整数，例如，-CH2CH2CH2-(亚丙基)、-CH2CH2CH2CH2-(亚丁基)、-CH2CH2CH2CH2CH2-(亚戊基)和-CH2CH2CH2CH-2CH2CH2CH2-(亚庚基)。
支链饱和C3-12亚烷基的实例包括但不限于-CH(CH3)CH2-、-CH(CH3)CH2CH2-、-CH(CH3)CH2CH2CH2-、-CH2CH(CH3)CH2-、-CH2CH(CH3)CH2CH2-、-CH(CH2CH3)-、-CH(CH2CH3)CH2-和-CH2CH(CH2CH3)CH2-。
直链部分不饱和的C3-12亚烷基(C3-12亚烯基和亚炔基)的实例包括但不限于-CH＝CH-CH2-、-CH2-CH＝CH2-、-CH＝CH-CH2-CH2-、-CH＝CH-CH2-CH2-CH2-、-CH＝CH-CH＝CH-、-CH＝CH-CH＝CH-CH2-、-CH＝CH-CH＝CH-CH2-CH2-、-CH＝CH-CH2-CH＝CH-、-CH＝CH-CH2-CH2-CH＝CH-和-CH2-C≡C-CH2-。
支链部分不饱和的C3-12亚烷基(C3-12亚烯基和亚炔基)的实例包括但不限于-C(CH3)＝CH-、-C(CH3)＝CH-CH2-、-CH＝CH-CH(CH3)-和-C≡C-CH(CH3)-。
脂环族饱和的C3-12亚烷基(C3-12亚环烷基)的实例包括但不限于亚环戊基(例如亚环戊-1,3-基)和亚环己基(例如，亚环己-1,4-基)。
脂环族部分不饱和的C3-12亚烷基(C3-12亚环烷基)的实例包括但不限于亚环戊烯基(例如4-亚环戊烯-1,3-基)、亚环己烯基(例如2-亚环己烯-1,4-基；3-亚环己烯-1,2-基；2,5-亚环己二烯-1,4-基)。
其中C3-12亚烷基基团被杂原子中断，下标是指包括杂原子的链中的原子数量。例如，链-C2H4-O-C2H4-将为C5基团。
其中C3-12亚烷基基团被杂原子中断，下标是指直接处于包括芳环的链中的原子数量。
例如，链
Figure BDA0003022424300000181
将为C5基团。
符号*和
Figure BDA0003022424300000182
可互换使用，代表化学基团的连接点。
配体单元
配体单元可以是任何种类，并且包括特异性结合至靶分子的蛋白质、多肽、肽以及非肽药剂。在一些实施方案中，配体单元可以是蛋白质、多肽或肽。在一些实施方案中，配体单元可以是环状多肽。这些配体单元可包括抗体或含有至少一个靶分子结合位点的抗体片段、淋巴因子、激素、生长因子或可与靶标特异性结合的任何其他细胞结合分子或物质。
术语“特异性结合(specifically binds和specific binding)”是指抗体或其他蛋白质、多肽或肽与预定分子(例如，抗原)的结合。通常，抗体或其他分子以至少约1x107M-1的亲和力结合，并且以比与除预定分子或密切相关分子之外的非特异性分子(例如，BSA、酪蛋白)的结合亲和力大至少两倍的亲和力与预定分子结合。
配体单元的实例包括所描述的用于并入本文的WO 2007/085930的那些药剂。
在一些实施方案中，配体单元为与细胞上的细胞外靶标相结合的细胞结合剂。所述细胞结合剂可以是蛋白质、多肽、肽或非肽药剂。在一些实施方案中，细胞结合剂可以是蛋白质、多肽或肽。在一些实施方案中，细胞结合剂可以是环状多肽。细胞结合剂还可以是抗体或抗体的抗原结合片段。因此，在一个实施方案中，本发明提供了一种抗体-药物缀合物(ADC)。
细胞结合剂
细胞结合剂可以是任何种类并且包括肽和非肽。这些细胞结合剂可包括抗体或含有至少一个结合位点的抗体片段、淋巴因子、激素、激素模拟物、维生素、生长因子、营养物转运分子或任何其他细胞结合分子或物质。
肽
在一个实施方案中，细胞结合剂是直链或环状肽，其包含4-30个，优选地6-20个连续的氨基酸残基。在此实施方案中，优选的是一种细胞结合剂连接至一种单体或二聚体吡咯并苯并二氮杂
Figure BDA0003022424300000191
化合物。
在一个实施方案中，细胞结合剂包含结合整联蛋白ανβ6的肽。该肽对ανβ6的选择性超过XYS。
在一个实施方案中，细胞结合剂包括A20FMDV-Cys多肽。A20FMDV-Cys具有序列：NAVPNLRGDLQVLAQKVARTC。可替代地，可使用A20FMDV-Cys序列的变体，其中一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个或十个氨基酸残基被另一氨基酸残基取代。此外，所述多肽可具有序列NAVXXXXXXXXXXXXXXXRTC。
抗体
术语“抗体”在本文中是在最广泛的意义上加以使用并且具体地涵盖单克隆抗体、多克隆抗体、二聚体、多聚体、多特异性抗体(例如，双特异性抗体)、多价抗体以及抗体片段，只要它们显示所期望的生物活性(Miller等(2003)Jour.of Immunology 170:4854-4861)。抗体可以是鼠、人、人源化的、嵌合的，或来源于其他物种。抗体是由免疫***生成的蛋白质，其能够识别并结合特定抗原。(Janeway,C.、Travers,P.、Walport,M.、Shlomchik(2001)Immuno Biology,第5版,Garland Publishing,New York)。靶抗原通常具有通过多个抗体上的CDR识别的许多结合位点，也称为表位。特异性结合不同表位的各个抗体具有不同的结构。因此，一种抗原可具有多于一种的对应抗体。抗体包括全长免疫球蛋白分子或全长免疫球蛋白分子的免疫活性部分，即含有免疫特异性地结合目标靶标的抗原或其部分的抗原结合位点的分子，此类靶标包括但不限于产生与自身免疫疾病相关的自身免疫抗体的一种或多种癌细胞。免疫球蛋白可以属于免疫球蛋白分子的任何类型(例如，IgG、IgE、IgM、IgD和IgA)、类别(例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2)或亚类。免疫球蛋白可以源自任何物种，包括人、鼠或兔来源。
“抗体片段”包含全长抗体的一部分，通常为其抗原结合区或可变区。抗体片段的实例包括Fab、Fab'、F(ab')2和scFv片段；双体分子；线性抗体；由Fab表达文库产生的片段，抗独特型(抗-Id)抗体，CDR(互补决定区)，和任何上述项的表位结合片段，其免疫特异性地结合于癌细胞抗原、病毒抗原或微生物抗原，单链抗体分子；以及由抗体片段形成的多特异性抗体。
如本文所用的术语“单克隆抗体”是指从基本上同质的抗体群获得的抗体，即除了可能存在少量可能天然存在的突变之外，构成群的单个抗体是相同的。单克隆抗体是高度特异性的，针对单个抗原位点。此外，与包括针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制剂相反，每种单克隆抗体针对抗原上的单一决定簇。除了它们的特异性之外，单克隆抗体的优点还在于它们可以在不被其他抗体污染的情况下合成。修饰语“单克隆”表明该抗体的特征，其是从基本上同质的抗体群获得的，并且不应解释为需通过任何特定方法产生该抗体。例如，根据本发明使用的单克隆抗体可以通过Kohler等(1975)Nature256:495最初描述的杂交瘤方法制备，或可以通过重组DNA方法制备(参见US 4816567)。单克隆抗体还可以分离自噬菌体抗体库，其中利用在Clackson等(1991)Nature,352:624-628、Marks等(1991)J.Mol.Biol.,222:581-597中描述的技术，或者可以分离自携带完全人免疫球蛋白***的转基因小鼠(Lonberg(2008)Curr.Opinion 20(4):450-459)。
本文的单克隆抗体具体地包括嵌合抗体、人源化抗体和人抗体。
细胞结合剂的实例包括那些描述的用于并入本文中的WO 2007/085930的细胞结合剂。
用于本发明的实施方案的肿瘤相关抗原和同源抗体在下文列出，并且更详细地描述于被并入本文的WO 2017/186894的第14页至第86页。
(1)BMPR1B(骨形态发生蛋白受体型IB)
(2)E16(LAT1、SLC7A5)
(3)STEAP1(***的六跨膜上皮抗原)
(4)0772P(CA1 25、MUC16)
(5)MPF(MPF、MSLN、SMR、巨核细胞增强因子、间皮素)
(6)Napi3b(NAPI-3B，NPTIIb，SLC34A2，溶质载体家族34(磷酸钠)，成员2，II型钠依赖性磷酸转运蛋白3b)
(7)Sema 5b(FLJ10372，KIAA1445，Mm.42015，SEMA5B，SEMAG，Semaphorin 5bHlog，25sema结构域，7血小板反应蛋白重复(1型和1型样)，跨膜结构域(TM)和短胞质结构域(semaphorin)5B)
(8)PSCA hlg(2700050C12Rik,C530008O16Rik,RIKEN cDNA 2700050C12,RIKENcDNA
2700050C12基因)
(9)ETBR(内皮素B型受体)
(10)MSG783(RNF124，假定蛋白FLJ20315)
(11)STEAP2(HGNC_8639，IPCA-1，PCANAP1，STAMP1，STEAP2，STMP，***癌相关基因1，***癌相关蛋白1，***的六跨膜上皮抗原2，六跨膜***蛋白)
(12)TrpM4(BR22450，FLJ20041，TRPM4，TRPM4B，瞬时受体电位阳离子5通道，亚家族M，成员4)
(13)CRIPTO(CR，CR1，CRGF，CRIPTO，TDGF1，畸胎癌源性生长因子)
(14)CD21(CR2(补体受体2)或C3DR(C3d/埃-巴二氏病毒受体(Epstein Barrvirus receptor))或Hs.73792)
(15)CD79b(CD79B，CD79β，IGb(免疫球蛋白相关β)，B29)
(16)FcRH2(IFGP4，IRTA4，SPAP1A(SH2域，包含磷酸酶锚定蛋白1a)，SPAP1B，SPAP1C)
(17)HER2(ErbB2)
(18)NCA(CEACAM6)
(19)MDP(DPEP1)
(20)IL20R-α(IL20Ra,ZCYTOR7)
(21)短蛋白聚糖(Brevican)(BCAN，BEHAB)
(22)EphB2R(DRT,ERK,Hek5,EPHT3,Tyro5)
(23)ASLG659(B7h)
(24)PSCA(***干细胞抗原前体)
(25)GEDA
(26)BAFF-R(B细胞活化因子受体，BLyS受体3，BR3)
(27)CD22(B细胞受体CD22-B同种型，BL-CAM，Lyb-8，Lyb8，SIGLEC-2，FLJ22814)
(27a)CD22(CD22分子)
(28)CD79a(CD79A，CD79α)，免疫球蛋白相关的α、B细胞特异性蛋白，其共价相互作用于Igβ(CD79B)并在表面上形成与Ig M分子的复合物，转导涉及B细胞分化的信号，pI:4.84,MW:25028TM:2[P]基因染色体：19q13.2)。
(29)CXCR5(伯基特淋巴瘤受体1，G蛋白偶联受体，其被CXCL13趋化因子活化，在淋巴细胞迁移和体液性防御中起作用，10在HIV-2感染中以及也许在AIDS、淋巴瘤、骨髓瘤和白血病的发展中起作用)；372aa,pI:8.54MW:41959TM:7[P]基因染色体：11q23.3，
(30)HLA-DOB(MHC II类分子的β亚基(Ia抗原)，其结合肽并20将它们呈递到CD4+T淋巴细胞)；273aa,pI:6.56,MW:30820.TM:1[P]基因染色体：6p21.3)
(31)P2X5(嘌呤能受体P2X配体门控离子通道5，由细胞外ATP门控的离子通道，可能涉及突触传递和神经发生，缺乏可能有助于特发性逼尿肌不稳定的病理生理学)；422aa),pI:7.63,MW:47206TM:1[P]基因染色体：17p13.3)。
(32)CD72(B细胞分化抗原CD72，Lyb-2)；359aa,pI:8.66,MW:40225,TM:15[P]基因染色体：9p13.3)。
(33)LY64(淋巴细胞抗原64(RP105)，富含亮氨酸重复(LRR)家族的I型膜蛋白，调节B细胞活化和细胞凋亡，在患有***性红斑狼疮的患者中功能的丧失相关于增加的疾病活性)；661aa,pI:6.20,MW:74147TM:1[P]基因染色体：5q12)。
(34)FcRH1(Fc受体样蛋白1，假定受体，用于免疫球蛋白Fc结构域，其包含C2型Ig样和ITAM结构域，在B淋巴细胞20分化中可以具有作用)；429aa,pI:5.28,MW:46925TM:1[P]基因染色体：1q21-1q22)
(35)IRTA2(免疫球蛋白超家族受体易位相关的2，假定的免疫受体，其在B细胞的发育和淋巴瘤发生中具有可能的作用；在一些B细胞恶性疾病中发生基因的去调节(通过易位))；977aa,pI:6.88,MW:106468,TM:1[P]基因染色体：1q21)
(36)TENB2(TMEFF2，tomoregulin，TPEF，HPP1，TR，推定的跨膜35蛋白多糖，涉及到生长因子和卵泡抑素的EGF/调蛋白(heregulin)家族)；374aa)
(37)PSMA–FOLH1(叶酸水解酶(***特异性膜抗原)1)
(38)SST(生长抑素受体；注意：存在5种亚型)
(38.1)SSTR2(生长抑素受体2)
(38.2)SSTR5(生长抑素受体5)
(38.3)SSTR1
(38.4)SSTR3
(38.5)SSTR4
AvB6–两种亚基(39+40)
(39)ITGAV(整联蛋白，αV)
(40)ITGB6(整联蛋白,β6)
(41)CEACAM5(癌胚抗原相关细胞粘附分子5)
(42)MET(met原癌基因；肝细胞生长因子受体)
(43)MUC1(粘蛋白1(Mucin 1)，细胞表面相关的)
(44)CA9(碳酸酐酶IX)
(45)EGFRvIII(表皮生长因子受体(EGFR)，转录变体3，
(46)CD33(CD33分子)
(47)CD19(CD19分子)
(48)IL2RA(白细胞介素2受体，α)；NCBI参考序列：NM_000417.2)；
(49)AXL(AXL受体酪氨酸激酶)
(50)CD30-TNFRSF8(肿瘤坏死因子受体超家族，成员8)
(51)BCMA(B细胞成熟抗原)-TNFRSF17(肿瘤坏死因子受体超家族，成员17)
(52)CT Ags–CTA(睾丸癌抗原(Cancer Testis Antigen))
(53)CD174(Lewis Y)-FUT3(岩藻糖基转移酶3(半乳糖苷3(4)-L-岩藻糖基转移酶，路易斯血型)
(54)CLEC14A(C型凝集素域家族14，成员A；Genbank登录号NM175060)
(55)GRP78–HSPA5(热休克70kDa蛋白5(葡萄糖调节蛋白，78kDa)
(56)CD70(CD70分子)L08096
(57)干细胞特异性抗原。例如：
·5T4(见以下条目(63))
·CD25(见以上条目(48))
·CD32
·LGR5/GPR49
·Prominin/CD133
(58)ASG-5
(59)ENPP3(外核苷酸焦磷酸酶/磷酸二酯酶3)
(60)PRR4(富含脯氨酸4(泪腺的))
(61)GCC–GUCY2C(鸟苷酸环化酶2C(热稳定肠毒素受体)
(62)Liv-1–SLC39A6(溶质载体家族39(锌转运蛋白)，成员6)
(63)5T4，滋养层糖蛋白，TPBG–TPBG(滋养层糖蛋白)
(64)CD56–NCMA1(神经细胞粘附分子1)
(65)CanAg(肿瘤相关抗原CA242)
(66)FOLR1(叶酸盐受体1)
(67)GPNMB(糖蛋白(跨膜)nmb)
(68)TIM-1–HAVCR1(甲型肝炎病毒细胞受体1)
(69)RG-1/***肿瘤靶Mindin–Mindin/RG-1
(70)B7-H4–VTCN1(包含T细胞活化抑制剂的V-set结构域1
(71)PTK7(PTK7蛋白酪氨酸激酶7)
(72)CD37(CD37分子)
(73)CD138-SDC1(多配体聚糖1(syndecan 1))
(74)CD74(CD74分子，主要组织相容性复合物，II类不变链)
(75)Claudins(整合膜连接蛋白)–CLs(Claudins)
(76)EGFR(表皮生长因子受体)
(77)Her3(ErbB3)–ERBB3(v-erb-b2成红细胞白血病病毒癌基因同系物3(禽))
(78)RON-MST1R(巨噬细胞刺激1受体(c-met相关酪氨酸激酶))
(79)EPHA2(EPH受体A2)
(80)CD20–MS4A1(跨膜4结构域，亚家族A，成员1)
(81)腱生蛋白C(肌腱蛋白C，Tenascin C)–TNC(腱生蛋白C)
(82)FAP(成纤维细胞活化蛋白，α)
(83)DKK-1(Dickkopf 1同系物(光滑爪蟾，Xenopus laevis))
(84)CD52(CD52分子)
(85)CS1-SLAMF7(SLAM家族成员7)
(86)Endoglin-ENG(内皮糖蛋白)
(87)膜联蛋白A1-ANXA1(膜联蛋白A1)
(88)V-CAM(CD106)-VCAM1(血管细胞粘附分子1)
另外的肿瘤相关抗原和感兴趣的同源抗体为：
(89)ASCT2(ASC转运蛋白2，也称为SLC1A5)。
ASCT2抗体描述于WO 2018/089393中，其通过引用并入本文。
可在作为缀合物或作为缀合物的一部分掺入之前，对细胞结合剂进行标记，例如以帮助检测或纯化所述药剂。标记可以是生物素标记。在另一个实施方案中，可用放射性同位素标记细胞结合剂。
治疗方法
本发明的化合物可以用于治疗方法。还提供了一种治疗方法，其包括将治疗有效量的式II的缀合物施用给需要治疗的受试者。术语“治疗有效量”是足以对患者显示益处的量。这样的益处可以是至少改善至少一种症状。施用的实际量以及施用的速率和时程将取决于待治疗对象的性质和严重性。治疗处方，例如对剂量的决定，是在全科医生和其他医生的责任范围内。
可以单独地或与其他治疗组合施用缀合物(同时或相继地，其取决于待治疗的病状)。治疗和疗法的实例包括但不限于化疗(施用活性剂，包括，例如药物；手术；以及放射疗法。
根据本发明和根据本发明使用的药物组合物，除活性成分(即，式II的缀合物)之外，还可以包含药学上可接受的赋形剂、载体、缓冲剂、稳定剂或本领域技术人员众所周知的其他材料。此类材料应为无毒的并且应不干扰活性成分的功效。载体或其他材料的确切性质将取决于施用途径，所述施用途径可以是口服或通过注射，例如皮肤、皮下或静脉内注射。
用于口服施用的药物组合物可以是片剂、胶囊剂、粉剂或液体形式。片剂可以包含固体载体或佐剂。液体药物组合物通常包含液体载体，如水、石油、动物油或植物油、矿物油或合成油。可包含生理盐水溶液、葡萄糖或其他糖溶液或二醇类如乙二醇、丙二醇或聚乙二醇。胶囊剂可以包含固体载体如明胶。
对于静脉内、皮肤或皮下注射或在痛苦部位处的注射，活性成分将具有肠胃外可接受的水性溶液的形式，所述水性溶液是无热原的并具有适宜的pH、等渗性和稳定性。本领域的相关技术人员使用例如等渗媒介物如氯化钠注射液、林格氏注射液、乳酸林格氏注射液完全能够制备合适的溶液。根据需要，可以包含防腐剂、稳定剂、缓冲剂、抗氧化剂和/或其他添加剂。
缀合物可用于治疗增殖性疾病和自身免疫疾病。术语“增殖性疾病”涉及过度或异常细胞的不需要的或不受控制的细胞增殖，这是不期望的，如赘生物或增生性生长(无论是在体外或体内)。
增殖性病状的实例包括但不限于良性、恶化前、和恶性细胞增殖，包括但不限于赘生物和肿瘤(例如组织细胞瘤、神经胶质瘤、星形细胞瘤、骨瘤)、癌症(例如肺癌、小细胞肺癌、胃肠癌、肠癌、结肠癌、乳腺癌、卵巢癌、***癌、睾丸癌、肝癌、肾癌、膀胱癌、胰腺癌、脑癌、肉瘤、骨肉瘤、卡波西肉瘤、黑素瘤)、白血病、银屑癣、骨疾病、纤维增殖性病症(例如***的纤维增殖性病症)以及动脉粥样硬化。其他所关注的癌症包括但不限于血液学；恶性肿瘤，如白血病和淋巴瘤，如非霍奇金淋巴瘤，以及亚型如DLBCL、边缘区、外套层和滤泡、霍奇金淋巴瘤、AML以及B或T细胞来源的其他癌症。
自身免疫疾病的实例包括以下：类风湿性关节炎、自身免疫性脱髓鞘疾病(例如，多发性硬化症、***反应性脑脊髓炎)、银屑病性关节炎、内分泌眼病、葡萄膜视网膜炎、全身性红斑狼疮、重症肌无力、格雷夫斯病、肾小球肾炎、自身免疫性肝病、炎症性肠病(例如，克罗恩病)、过敏性反应、***反应、舍格伦综合症、I型糖尿病、原发性胆汁性肝硬化、韦氏肉芽肿病(Wegener’s granulomatosis)、纤维肌痛症、多肌炎、皮肌炎、多发性内分泌衰竭、施密特氏综合征(Schmidt’s syndrome)、自身免疫性葡萄膜炎、爱迪生氏病(Addison’sdisease)、肾上腺炎、甲状腺炎、桥本氏甲状腺炎(Hashimoto’s thyroiditis)、自身免疫性甲状腺疾病、恶性贫血、胃萎缩、慢性肝炎、狼疮样肝炎、动脉粥样硬化、亚急性皮肤型红斑狼疮、甲状旁腺功能减退症、德雷斯勒综合征(Dressler’s syndrome)、自身免疫性血小板减少症、特发性血小板减少性紫癜、溶血性贫血、寻常型天疱疮、天疱疮、疱疹样皮炎、斑秃、类天疱疮、硬皮病、进行性全身性硬化症、CREST综合征(钙质沉着、雷诺氏现象、食道运动功能障碍、指端硬化以及毛细管扩张)、男性和女性自身免疫性***、强直性脊柱炎、溃疡性结肠炎、混合性结蒂组织病、结节性多动脉炎、***性坏死性血管炎、过敏性皮肤炎、特应性鼻炎、肺出血-肾炎综合征(Goodpasture’s syndrome)、查加斯病(Chagas’disease)、结节病、风湿热、哮喘、复发性流产、抗磷脂综合征、农民肺、多形性红斑、心脏切开后综合征、库欣综合征(Cushing’s syndrome)、自身免疫性慢性活动性肝炎、养鸟人肺(bird-fancier’slung)、中毒性表皮坏死松解症、Alport综合征、肺泡炎、过敏性肺泡炎、纤维性肺泡炎、间质性肺病、结节性红斑、坏疽性脓皮病、输血反应、大动脉炎、风湿性多肌痛、颞动脉炎、血吸虫病、巨细胞动脉炎、蛔虫病、曲霉病、阿司匹林三联症(Sampter’s syndrome)、湿疹、淋巴瘤样肉芽肿病、贝切特氏病(Behcet’s disease)、卡普兰综合征(Caplan’s syndrome)、川崎氏病(Kawasaki’s disease)、登革热、脑脊髓炎、心内膜炎、心内膜心肌纤维化、眼内炎、持久性***性红斑(erythema elevatum et diutinum)、银屑病、胎儿成红细胞增多症、嗜酸细胞性筋膜炎、舒尔曼综合征(Shulman’s syndrome)、费尔蒂氏综合征(Felty’ssyndrome)、丝虫病、睫状体炎、慢性睫状体炎、异时睫状体炎、富克斯氏睫状体炎、IgA肾病、亨-舍二氏紫癜(Henoch-Schonlein purpura)、移植物抗宿主病、移植排斥反应、心肌症、伊顿-兰伯特综合征(Eaton-Lambert syndrome)、复发性多软骨炎、冷沉球蛋白血症、华氏巨球蛋白血症(Waldenstrom’s macroglobulemia)、埃文氏综合征(Evan’s syndrome)以及自身免疫性腺衰竭。
在一些实施方案中，自身免疫性疾病是B淋巴细胞的失调(例如，***性红斑狼疮、肺出血-肾炎综合征、类风湿性关节炎以及I型糖尿病)、Th1淋巴细胞的失调(例如，类风湿性关节炎、多发性硬化症、银屑病、干燥综合征、桥本氏甲状腺炎、格雷夫斯病、原发性胆汁性肝硬化、韦氏肉芽肿病、肺结核或移植物抗宿主病)或Th2淋巴细胞的失调(例如，特应性皮炎、***性红斑狼疮、特应性哮喘、结膜炎、过敏性鼻炎、欧门氏综合征(Omenn’ssyndrome)、***性硬化症或慢性移植物抗宿主病)。一般而言，涉及树突状细胞的病症涉及Th1淋巴细胞或Th2淋巴细胞的失调。在一些实施方案中，自身免疫性病症是T细胞介导的免疫学病症。
在一些实施方案中，所施用的缀合物的量在约0.01mg/kg/剂量至约10mg/kg/剂量的范围内。在一些实施方案中，所施用的缀合物的量在约0.01mg/kg/剂量至约5mg/kg/剂量的范围内。在一些实施方案中，所施用的缀合物的量在约0.05mg/kg/剂量至约5mg/kg/剂量的范围内。在一些实施方案中，所施用的缀合物的量在约0.1mg/kg/剂量至约5mg/kg/剂量的范围内。在一些实施方案中，所施用的缀合物的量在约0.1mg/kg/剂量至约4mg/kg/剂量的范围内。在一些实施方案中，所施用的缀合物的量在约0.05mg/kg/剂量至约3mg/kg/剂量的范围内。在一些实施方案中，所施用的缀合物的量在约0.1mg/kg/剂量至约3mg/kg/剂量的范围内。在一些实施方案中，所施用的缀合物的量在约0.1mg/kg/剂量至约2mg/kg/剂量的范围内。
药物负载量
药物负载量(p)是每个细胞结合剂(例如抗体)的PBD药物的平均数量。在本发明的化合物与半胱氨酸结合的情况下，药物负载量可在每个细胞结合剂1至8个药物(D)的范围内，其中1、2、3、4、5、6、7和8个药物部分与所述细胞结合剂共价连接。缀合物的组合物包括与一定范围的药物(1至8)缀合的细胞结合剂(例如，抗体)的集合。在本发明的化合物与赖氨酸结合的情况下，药物负载量可在每个细胞结合剂1至80个药物(D)的范围内，但是40、20、10或8的上限可为优选的。缀合物的组合物包括与一定范围的药物(1至80、1至40、1至20、1至10或1至8)缀合的细胞结合剂(例如，抗体)的集合。
可以通过常规方法如UV、反相HPLC、HIC、质谱法、ELISA测定和电泳来表征来自缀合反应的ADC的制剂中每个抗体的药物的平均数量。还可以确定就p而言ADC的数量分布。通过ELISA，可确定ADC的特定制剂中p的平均值(Hamblett等(2004)Clin.Cancer Res.10:7063-7070；Sanderson等(2005)Clin.Cancer Res.11:843-852)。然而，通过ELISA的抗体-抗原结合和检测限，无法辨别p(药物)值的分布。此外，用于检测抗体-药物缀合物的ELISA测定不确定在何处药物部分连接至抗体，如重链或轻链片段，或特定氨基酸残基。在一些情况下，可以通过如反相HPLC或电泳的手段来实现其中p是一定值的均质ADC与具有其他药物负载量的ADC的分离、纯化和表征。这样的技术也适用于其他类型的缀合物。
对于一些抗体-药物缀合物，p可受到抗体上的连接位点的数量的限制。举例来说，抗体可仅具有一个或若干个半胱氨酸硫醇基团，或可仅具有可供连接接头的一个或若干个具有足够反应性的硫醇基团。较高的药物负载量，例如p>5，可导致某些抗体-药物缀合物的聚集、不溶性、毒性或细胞渗透性损失。
通常，在缀合反应期间，将小于理论最大值的药物部分缀合于抗体。抗体可以包含，例如，不与药物接头反应的许多赖氨酸残基。只有最具反应性的赖氨酸基团可与胺反应性接头试剂反应。另外，只有最具反应性的半胱氨酸硫醇基团可与硫醇反应性接头试剂反应。通常，抗体不含有许多(如果含有的话)游离且具反应性的半胱氨酸硫醇基团，其可与药物部分连接。化合物的抗体中的大多数半胱氨酸硫醇残基作为二硫桥存在，并且必须用还原剂如二硫苏糖醇(DTT)或TCEP，在部分或完全还原条件下进行还原。可以以几种不同的方式控制ADC的负载量(药物/抗体比率)，包括：(i)限制药物接头相对于抗体的摩尔过量，(ii)限制缀合反应时间或温度，以及(iii)用于半胱氨酸硫醇修饰的部分或限制性还原性条件。
某些抗体具有可还原的链间二硫化物，即半胱氨酸桥。可通过用还原剂如DTT(二硫苏糖醇)处理抗体而使其对于与接头试剂的缀合具有反应性。各半胱氨酸桥因此在理论上将形成两个反应性硫醇亲核体。可通过赖氨酸与2-亚氨基硫杂环戊烷(Traut’s试剂)的反应向抗体中引入另外的亲核基团，其导致胺转化为硫醇。可通过对一个、两个、三个、四个或更多个半胱氨酸残基进行工程改造来向抗体(或其片段)中引入反应性硫醇基团(例如，制备包含一个或多个非天然半胱氨酸氨基酸残基的突变抗体)。US 7521541教导了通过引入反应性半胱氨酸氨基酸对抗体进行工程改造。
可在抗体中的反应性位点处对半胱氨酸氨基酸进行工程改造并且这不形成链内或分子间二硫键(Junutula等,2008b Nature Biotech.,26(8):925-932；Dornan等(2009)Blood114(13):2721-2729；US 7521541；US 7723485；WO2009/052249)。工程改造的半胱氨酸硫醇可与接头试剂或本发明的具有硫醇反应性的亲电子基团(如马来酰亚胺或α-卤代酰胺)的药物-接头试剂反应，以形成具有半胱氨酸工程改造的抗体和PBD药物部分的ADC。药物部分的位置因此可以设计、控制并已知。可以控制药物负载量，因为工程改造的半胱氨酸硫醇基团通常以高收率与硫醇反应性接头试剂或药物接头试剂反应。通过在重链或轻链的单个位点上取代引入半胱氨酸氨基酸来工程改造IgG在对称抗体上得到两个新的半胱氨酸。近似2的药物负载量可以通过缀合产物ADC的近似同质性实现。
在抗体的多于一个亲核或亲电子基团与药物-接头中间体或接头试剂、接着是药物部分试剂反应的情况下，那么得到的产物是ADC化合物与连接于抗体的药物部分的分布的混合物，例如1、2、3等。液相色谱法如聚合物逆相(PLRP)和疏水性相互作用(HIC)可按照药物负载值来分离混合物中的化合物。可以分离具有单药物负载值(p)的ADC的制剂，然而，这些单负载值ADC可仍然是非均匀混合物，因为可通过接头在抗体上的不同位点处连接药物部分。
因此，本发明的抗体-药物缀合物组合物包括抗体-药物缀合化合物的混合物，其中抗体具有一个或多个PBD药物部分以及其中药物部分可以在不同的氨基酸残基处连接于抗体。
在一个实施方案中，每个细胞结合剂的二聚体吡咯并苯并二氮杂
Figure BDA0003022424300000292
基团的平均数量在1至20的范围内。在一些实施方案中，所述范围选自1至8、2至8、2至6、2至4以及4至8。
在一些实施方案中，每个细胞结合剂存在一个二聚体吡咯并苯并二氮杂
Figure BDA0003022424300000293
基团。
附图说明
图1示出本发明的缀合物在体内对肿瘤生长的影响。
具体实施方式
一般合成路线
PBD化合物的合成在以下参考文献中进行了广泛论述，论述内容以引用方式并入本文：
a)WO 00/12508(第14至30页)；
b)WO 2005/023814(第3至10页)；
c)WO 2004/043963(第28至29页)；以及
d)WO 2005/085251(第30至39页)。
合成路线
其中R21不是H或＝O的式I的本发明化合物可由式2的化合物合成：
Figure BDA0003022424300000291
其中R6、R7、R9、R6’、R7’、R9’、R11b、Y、Y’和R”如对于式I的化合物所定义，并且RLL为RL的前体-此方法尤其适用于其中RL具有式IIIa的式I的化合物。R20P是R20或其前体。对于这些化合物，RLL将通常是RL的一部分，如式IIIa’的基团：
Figure BDA0003022424300000301
在这种情况下，反应涉及添加基团GL。当R20为：
Figure BDA0003022424300000302
并且RZ为NH-C(＝O)-X1-NHC(＝O)X2-NH-RZC时，R20的前体可具有类似结构。
式2的化合物可通过对式3的化合物的RLL基团去保护来制备：
Figure BDA0003022424300000303
其中R6、R7、R9、R6’、R7’、R9’、R11b、Y、Y’和R”如对于式I的化合物所定义，RLL-Prot为RLL的受保护型式，并且ProtN代表正交于RLL保护基的简单的氮保护基(例如，Fmoc、Boc)。在适当时，R20P可与式2中的R20P相同，或为其受保护型式。
式3的化合物可通过式4的化合物的环闭合制备：
Figure BDA0003022424300000304
其中环闭合通过氧化(例如Swern)进行。
式4的化合物可由式5的化合物合成：
Figure BDA0003022424300000311
通过逐步添加两个保护基实现。这可以通过简单保护将在最终化合物中导致亚氨基键的氨基(例如通过Fmoc、Boc)，然后在另一个氨基上安装期望的保护基来实现。
其中RL具有式IIIb的式I的化合物可以类似的方式合成，但是完整的RL基团可以从式5的化合物开始安装，而不使用受保护的前体。
式5的化合物可以通过已知方法合成，如WO 2011/130598中公开的那些。
可替代地，式4的化合物可以通过单体路线合成。
其中R21为H或＝O的本发明化合物可以通过单体路线合成，其中含有这些基团的单体在连接至化合物的其余部分之前完全构建。参考WO2014/096368中所示的路线。
药物缀合物的合成
可如先前所述制备缀合物。可如Doronina等,Nature Biotechnology,2003,21,778-784)中所述将抗体缀合至药物接头化合物。简单地说，在37℃下用三(羧乙基)膦盐酸盐(TCEP)还原在pH 7.4的含有50mM硼酸钠的PBS中的抗体(4-5mg/mL)。还原链间二硫化物的反应的进展通过与5,5’-二硫代双(2-硝基苯甲酸)的反应进行监测并且使其进行直到实现期望水平的硫醇/mAb。然后将还原的抗体冷却至0℃并且每抗体硫醇用1.5当量的马来酰亚胺药物-接头进行烷基化。1小时后，通过添加5当量N-乙酰半胱氨酸将反应淬灭。通过在PD-10柱上进行凝胶过滤来移除淬灭的药物-接头。然后通过0.22μm注射过滤器将ADC无菌过滤。可分别在280nm和329nm处进行光谱分析来确定蛋白质浓度，其中针对在280nm处的药物吸光度的贡献进行校正。可使用尺寸排阻色谱确定抗体聚集的程度，并且可使用RP-HPLC确定剩余的NAC淬灭的药物-接头的水平。
另外优选项
以下优选项可应用于如上所述的本发明的所有方面，或者可涉及单个方面。优选项可以任何组合被组合在一起。
在一些实施方案中，R6’、R7’、R9’和Y’分别选自与R6、R7、R9和Y相同的基团。在这些实施方案的一些中，R6’、R7’、R9’和Y’分别与R6、R7、R9和Y相同。
N10’-C11’
在一些实施方案中，R20为H并且R21为H。
在一些实施方案中，R20为H并且R21为＝O。
在一些实施方案中，R21为OH或ORA，其中RA为C1-4烷基并且R20选自：
Figure BDA0003022424300000321
Figure BDA0003022424300000331
-C(＝O)-X1-NHC(＝O)X2-NH-代表二肽。二肽中的氨基酸可以是天然氨基酸的任何组合。二肽可以是组织蛋白酶介导的切割的作用位点。
在一个实施方案中，二肽-C(＝O)-X1-NHC(＝O)X2-NH-选自：
-Phe-Lys-、
-Val-Ala-、
-Val-Lys-、
-Ala-Lys-、
-Val-Cit-、
-Phe-Cit-、
-Leu-Cit-、
-Ile-Cit-、
-Phe-Arg-、
-Trp-Cit-，
其中Cit是瓜氨酸。
优选地，二肽-C(＝O)-X1-NHC(＝O)X2-NH-选自：
-Phe-Lys-、
-Val-Ala-、
-Val-Lys-、
-Ala-Lys-、
-Val-Cit-。
更优选地，二肽-C(＝O)-X1-NHC(＝O)X2-NH-是-Phe-Lys-或-Val-Ala-。
可使用其他二肽组合，包括Dubowchik等,Bioconjugate Chemistry,2002,13,855-869(其通过引用并入本文)所述的那些。
在一个实施方案中，在适当时，氨基酸侧链是衍生化的。例如，氨基酸侧链的氨基或羧基可以是衍生化的。
在一个实施方案中，侧链氨基酸如赖氨酸的氨基NH2是选自由NHR和NRR’组成的组的衍生化形式。
在一个实施方案中，侧链氨基酸如天冬氨酸的羧基COOH是选自由COOR、CONH2、CONHR和CONRR’组成的组的衍生化形式。
在一个实施方案中，在适当时，氨基酸侧链被化学保护。侧链保护基可以是如上文所论述的基团。本发明人已证实，受保护的氨基酸序列可被酶切割。例如，已证实包含Boc侧链保护的Lys残基的二肽序列可被组织蛋白酶切割。
氨基酸侧链的保护基是本领域熟知的，并且描述于Novabiochem目录中。另外的保护基策略阐述于Protective Groups in Organic Synthesis,Greene和Wuts中。
下文示出用于具有反应性侧链官能团的那些氨基酸的可能的侧链保护基：
Arg：Z、Mtr、Tos；
Asn：Trt、Xan；
Asp：Bzl、t-Bu；
Cys：Acm、Bzl、Bzl-OMe、Bzl-Me、Trt；
Glu：Bzl、t-Bu；
Gln：Trt、Xan；
His：Boc、Dnp、Tos、Trt；
Lys：Boc、Z-Cl、Fmoc、Z、Alloc；
Ser：Bzl、TBDMS、TBDPS；
Thr：Bz；
Trp：Boc；
Tyr：Bzl、Z、Z-Br。
在一个实施方案中，对侧链保护进行选择，使得正交于作为封端基团(在存在时)或其一部分提供的基团。因此，侧链保护基的移除不移除封端基团，或作为封端基团的一部分的任何保护基官能团。
在本发明的其他实施方案中，所选氨基酸是不具有反应性侧链官能团的那些。例如，氨基酸可选自：Ala、Gly、Ile、Leu、Met、Phe、Pro和Val。
在本发明中尤其优选的是，如果L1包括二肽，那么-C(＝O)-X1-NHC(＝O)X2-NH-是相同二肽。优选基团的实例为：
Figure BDA0003022424300000351
其他优选的R20基团包括：
Figure BDA0003022424300000352
二聚体连接
在一些实施方案中，Y和Y’均为O。
在一些实施方案中，R”是不具有取代基的C3-7亚烷基。在这些实施方案的一些中，R”是C3、C5或C7亚烷基。具体地讲，R”可以是C3或C5亚烷基。
在其他实施方案中，R”是下式的基团：
Figure BDA0003022424300000353
其中r为1或2。
亚苯基可被亚吡啶基替代。
R6至R9
在一些实施方案中，R9是H。
在一些实施方案中，R6选自H、OH、OR、SH、NH2、硝基和卤素，并且可选自H或卤素。在这些实施方案的一些中，R6是H。
在一些实施方案中，R7选自H、OH、OR、SH、SR、NH2、NHR、NRR’以及卤素。在这些实施方案的一些中，R7选自H、OH和OR，其中R选自任选取代的C1-7烷基、C3-10杂环基以及C5-10芳基。R可更优选地为C1-4烷基，它可以是或可以不是被取代的。感兴趣的取代基为C5-6芳基(例如苯基)。7位上特别优选的取代基为OMe和OCH2Ph。其他特别感兴趣的取代基为二甲氨基(即–NMe2)；-(OC2H4)qOMe，其中q为0至2；含氮C6杂环基，包括吗啉代、哌啶基和N-甲基-哌嗪基。
这些实施方案和优选项分别适用于R9’、R6’和R7’。
R11b
在一些实施方案中，R11b是OH。
在一些实施方案中，R11b是ORA，其中RA是C1-4烷基。在这些实施方案的一些中，RA是甲基。
在本发明的第一方面的一些实施方案中，具有式Ia、Ib或Ic：
Figure BDA0003022424300000361
其中R1a选自甲基和苄基；
R20、R21、RL和R11b如上文所定义。
这些实施方案和优选项也适用于本发明的第二和第五方面。
接头(RL)
在一些实施方案中，RL具有式IIIa。
在一些实施方案中，RLL具有式IIIa’。
GL
GL可选自
Figure BDA0003022424300000371
其中Ar代表C5-6亚芳基，例如亚苯基。
在一些实施方案中，GL选自GL1-1和GL1-2。在这些实施方案的一些中，GL是GL1-1。
GLL
GLL可选自：
Figure BDA0003022424300000381
其中Ar代表C5-6亚芳基，例如亚苯基。
在一些实施方案中，GLL选自GLL1-1和GLL1-2。在这些实施方案的一些中，GLL是GLL1-1。
X
X为：
Figure BDA0003022424300000382
其中a＝0至5，b＝0至16，c＝0或1，d＝0至5。
a可以是0、1、2、3、4或5。在一些实施方案中，a为0至3。在这些实施方案的一些中，a为0或1。在另外的实施方案中，a为0。
b可以是0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或16。在一些实施方案中，b为0至12。在这些实施方案的一些中，b为0至8，并且可以是0、2、4或8。
c可以是0或1。
d可以是0、1、2、3、4或5。在一些实施方案中，d为0至3。在这些实施方案的一些中，d为1或2。在另外的实施方案中，d为2。
在X的一些实施方案中，a为0，c为1且d为2，并且b可以是0至8。在这些实施方案的一些中，b为0、4或8。
Q
在一个实施方案中，Q是氨基酸残基。氨基酸可以是天然氨基酸或非天然氨基酸。
在一个实施方案中，Q选自：Phe、Lys、Val、Ala、Cit、Leu、Ile、Arg和Trp，其中Cit是瓜氨酸。
在一个实施方案中，Q包括二肽残基。二肽中的氨基酸可以是天然氨基酸和非天然氨基酸的任何组合。在一些实施方案中，二肽包含天然氨基酸。在接头是组织蛋白酶不稳定接头的情况下，二肽是组织蛋白酶介导的切割的作用位点。则二肽是组织蛋白酶的识别位点。
在一个实施方案中，Q选自：
CO-Phe-Lys-NH、
CO-Val-Ala-NH、
CO-Val-Lys-NH、
CO-Ala-Lys-NH、
CO-Val-Cit-NH、
CO-Phe-Cit-NH、
CO-Leu-Cit-NH、
CO-Ile-Cit-NH、
CO-Phe-Arg-NH，以及
CO-Trp-Cit-NH；
其中Cit是瓜氨酸。
优选地，Q选自：
CO-Phe-Lys-NH、
CO-Val-Ala-NH、
CO-Val-Lys-NH、
CO-Ala-Lys-NH、
CO-Val-Cit-NH。
最优选地，Q选自CO-Phe-Lys-NH、CO-Val-Cit-NH和CO-Val-Ala-NH。
感兴趣的其他二肽组合包括：
CO-Gly-Gly-NH、
CO-Pro-Pro-NH，以及
CO-Val-Glu-NH。
可使用其他二肽组合，包括Dubowchik等,Bioconjugate Chemistry,2002,13,855-869(其通过引用并入本文)所述的那些。
在一些实施方案中，QX是三肽残基。三肽中的氨基酸可以是天然氨基酸和非天然氨基酸的任何组合。在一些实施方案中，三肽包含天然氨基酸。当接头是组织蛋白酶不稳定接头时，三肽是组织蛋白酶介导的切割的作用位点。则三肽是组织蛋白酶的识别位点。
在一个实施方案中，在适当时，氨基酸侧链被化学保护。侧链保护基可以是如下文所论述的基团。受保护的氨基酸序列可被酶切割。例如，包含Boc侧链保护的Lys残基的二肽序列可被组织蛋白酶切割。
氨基酸侧链的保护基团是本领域熟知的，并且描述于Novabiochem目录中并且如上所述。
在一些实施方案中，RL具有式IIIb。
在一些实施方案中，RLL具有式IIIb’。
RL1和RL2独立地选自H和甲基，或与它们所结合的碳原子一起形成亚环丙基或亚环丁基。
在一些实施方案中，RL1和RL2均为H。
在一些实施方案中，RL1是H并且RL2是甲基。
在一些实施方案中，RL1和RL2均为甲基。
在一些实施方案中，RL1和RL2与它们所结合的碳原子一起形成亚环丙基。
在一些实施方案中，RL1和RL2与它们所结合的碳原子一起形成亚环丁基。
在基团IIIb中，在一些实施方案中，e是0。在其他实施方案中，e是1且硝基可处于环的任何可用位置。在这些实施方案的一些中，它处于邻位。在这些实施方案的其他者中，它处于对位。
在一个特定实施方案中，本发明的第一方面包括式Id的化合物：
Figure BDA0003022424300000411
其中Q选自：
(a)-CH2-；
(b)-C3H6-；以及
Figure BDA0003022424300000412
在一个特定实施方案中，本发明的第二方面，药物接头(DL)具有式(Id’)：
Figure BDA0003022424300000413
其中Q选自：
(a)-CH2-；
(b)-C3H6-；以及
Figure BDA0003022424300000414
在本发明的一些实施方案中，C11取代基可相对于相邻基团处于以下立体化学布置：
Figure BDA0003022424300000415
在其他实施方案中，C11取代基可相对于相邻基团处于以下立体化学布置：
Figure BDA0003022424300000421
在本发明的一些实施方案中，C2 OH取代基可相对于相邻基团处于以下立体化学布置：
Figure BDA0003022424300000422
实施例
一般信息
使用Biotage Isolera 1TM进行快速色谱，使用从88％己烷/EtOAc或99.9％DCM/MeOH开始的梯度洗脱，直到从柱上洗脱所有UV活性组分(在214nm和254nm下检测)。每当观察到UV活性材料的大量洗脱时，手动保持梯度。在铝板上利用荧光指示剂，使用MerckKieselgel 60F254硅胶，用薄层色谱(TLC)检查级分的纯度。除非另有说明，否则借助于UV光或碘蒸气来实现TLC的可视化。从VWR U.K.购买萃取和色谱溶剂且不经进一步纯化即使用。所有精细化学品购自Sigma-Aldrich或TCI Europe，除非另行指出。聚乙二醇化试剂通过Stratech UK从Quanta biodesign US获得。
分析型LC/MS条件(用于反应监测和纯度确定)如下：使用Shimadzu
Figure BDA0003022424300000423
LCMS-2020进行阳性模式电喷雾质谱。使用的流动相是溶剂A(具有0.1％甲酸的H2O)和溶剂B(具有0.1％甲酸的CH3CN)。常规3分钟运行的梯度：初始组成5％B保持25秒，然后经1分钟35秒的时段从5％B增加至100％B。组成在100％B处保持50秒，然后在5秒内回到5％B且在此处保持5秒。梯度运行的总持续时间为3.0分钟。15分钟运行的梯度：初始组成5％B保持1分钟，然后经9分钟的时段从5％B增加至100％B。组成在100％B处保持2分钟，然后在10秒内回到5％B且在此处保持2分钟50秒。梯度运行的总持续时间为15.0分钟。流速为0.8毫升/分钟(运行3分钟)和0.6毫升/分钟(运行15分钟)。在254nm下检测。柱：Waters Acquity
Figure BDA0003022424300000424
BEH Shield RP18 1.7μm 2.1x50mm，在50℃下，配备有WatersAcquity
Figure BDA0003022424300000425
BEH Shield RP18VanGuard前置柱，130A，1.7μm，2.1mm x 5mm(常规3分钟运行)；以及ACE Excel 2C18-AR，2μ，3.0x100mm，配备有Waters Acquity
Figure BDA0003022424300000426
BEHShield RP18VanGuard前置柱，130A，1.7μm，2.1mm x 5mm(15分钟运行)。
制备型HPLC条件如下：反相超快速高效液相色谱(UFLC)在Shimazdzu
Figure BDA0003022424300000431
机器上使用
Figure BDA0003022424300000432
Gemini NX 5μC18柱(在50℃下)150x21.2mm进行。使用的洗脱液是溶剂A(具有0.1％甲酸的H2O)和溶剂B(具有0.1％甲酸的CH3CN)。所有UFLC实验均使用梯度条件进行：
初始组成13％B经15分钟时段增加至60％B，然后经2分钟增加至100％B。组成在100％B处保持1分钟，然后在0.1分钟内回到13％B且在此处保持1.9分钟。梯度运行的总持续时间为20.0分钟。流量为20.0毫升/分钟并且在254nm和280nm下进行检测。
实施例1
Figure BDA0003022424300000433
(i)DIAD/Ph3P/苯甲酸/THF，(ii)锌/甲酸/甲醇，(iii)氯甲酸烯丙酯/吡啶/DCM，(iv)乙酸/甲醇/THF/水，(v)草酰氯/DMSO/三乙胺/DCM，(vi)TBS-OTf/2，6-二甲基砒啶/DCM，(vii)乙酸锂/DMF水溶液，(viii)二卤代烷/碳酸钾/DMF，(ix)1M氢氧化锂/甲醇，(x)Pd(Ph3P)4/吡咯烷/DCM
a)苯甲酸(3S，5S)-5-(((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)甲基)-1-(5-甲氧基-2-硝基-4-((三异丙基甲硅烷基)氧基)苯甲酰基)吡咯烷-3-基酯2
将偶氮二羧酸二乙酯(17.34g，0.085mol，5.0当量)添加到三苯基膦(22.49g，0.085mol，5.0当量)在THF(300mL)中的溶液中并且在室温下搅拌30min。添加1(10g，0.017mol，1.0当量)并且再继续搅拌30min，直到形成白色沉淀。添加苯甲酸(2.1g，0.017mol，1.0当量)，沉淀从白色变成橙色并且接着又变回白色。30min后，通过过滤移除沉淀。将滤液蒸发至干燥并且通过快速色谱纯化(10％乙酸乙酯/庚烷，以移除过量光延试剂，接着是20％乙酸乙酯/庚烷，以洗脱为白色固体的产物)。收率＝9.5g(81％)。LC/MS室温2.28min m/z(687.4)M+H。
b)苯甲酸(3S,5S)-1-(2-氨基-5-甲氧基-4-((三异丙基甲硅烷基)氧基)苯甲酰基)-5-(((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)甲基)吡咯烷-3-基酯3
将锌粉(18.0g，0.27mol，20当量)添加到2在甲醇(75mL)中的溶液中并在室温下搅拌。添加甲酸(15mL)，这导致35℃的放热。10min后，通过使用短的硅藻土床过滤移除锌，然后用乙酸乙酯(250mL)洗涤。将合并的有机级分用饱和NaHCO3(100mL)洗涤，接着用盐水(50mL)洗涤。将所得有机相干燥(MgSO4)并且减压蒸发以得到黄色残余物，通过快速色谱(梯度乙酸乙酯/庚烷，15/85至20/80v/v)纯化所述残余物，得到为无色油状物的3，8.3g(91％)。LC/MS室温2.24min m/z(657.3)M+H。
c)苯甲酸(3S,5S)-1-(2-(((烯丙氧基)羰基)氨基)-5-甲氧基-4-((三异丙基甲硅烷基)氧基)苯甲酰基)-5-(((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)甲基)吡咯烷-3-基酯4
在5℃下，将氯甲酸烯丙酯(1.65g，13.7mmol，1.1当量)逐滴添加到3(8.2g，12.4mmol，1.0当量)和吡啶(1.48g，18.7mmol，5.0当量)在二氯甲烷(75mL)中的溶液中。使反应混合物升温至室温并且再搅拌60min。将有机相依次用0.1M HCl(20mL)、饱和碳酸氢钠(20mL)和盐水(10mL)洗涤。干燥(MgSO4)后，将溶剂减压移除，得到白色固体，其不经进一步纯化即用于下一步骤，8.5g(92％)。
d)苯甲酸(3S,5S)-1-(2-(((烯丙氧基)羰基)氨基)-5-甲氧基-4-((三异丙基甲硅烷基)氧基)苯甲酰基)-5-(羟甲基)吡咯烷-3-基酯5
将4(8.5g，11.5mmol)溶解于乙酸(35mL)、甲醇(5mL)、THF(5mL)和水(10mL)的混合物中。将所得溶液在室温下搅拌过夜。接着将反应混合物倒入乙酸乙酯(100mL)中并且依次用水(2x100mL)、饱和碳酸氢钠(50mL)和盐水(50mL)洗涤。干燥(MgSO4)后，将溶剂减压移除并且通过快速色谱(梯度乙酸乙酯/庚烷，40/60至50/50v/v)纯化残余物，得到为白色固体的5，5.24g(73％)。LC/MS室温1.98min m/z(627.5)M+H。
e)(2S,11S,11aS)-2-(苯甲酰基氧基)-11-羟基-7-甲氧基-5-氧代-8-((三异丙基甲硅烷基)氧基)-2,3,11,11a-四氢-1H-苯并[e]吡咯并[1,2-a][1,4]二氮杂
Figure BDA0003022424300000441
10(5H)-羧酸烯丙基酯6
在-78℃、氩气气氛下，将草酰氯(2M，在DCM中，4.6mL，9.20mmol，1.1当量)逐滴添加到DMSO(1.63g，20.9mmol，2.5当量)在无水二氯甲烷(75mL)中的溶液中。15min后，逐滴添加5(5.24g，8.36mmol，1.0当量)在二氯甲烷(20mL)中的溶液并且再搅拌反应混合物30min。添加三乙胺(4.2g，41.8mmol，5.0当量)并且使所得溶液升温至室温，接着再搅拌60min。接着将有机相依次用0.1M HCl(25mL)、饱和碳酸氢钠(25mL)和盐水(10mL)洗涤。干燥(MgSO4)后，将溶剂减压移除，得到白色固体，其不经进一步纯化即用于下一步骤，4.52g(87％)。LC/MS室温1.90min m/z(625.3)M+H。
f)(2S,11S,11aS)-2-(苯甲酰基氧基)-11-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)-7-甲氧基-5-氧代-8-((三异丙基甲硅烷基)氧基)-2,3,11,11a-四氢-1H-苯并[e]吡咯并[1,2-a][1,4]二氮杂
Figure BDA0003022424300000453
10(5H)-羧酸烯丙基酯7
在5℃、氩气气氛下，将叔丁基二甲基甲硅烷基三氟甲磺酸酯(5.7g，21.6mmol，3.0当量)逐滴添加到6(4.5g，7.2mmol，1.0当量)和2,6-二甲基砒啶(3.1g，28.8mmol，4.0当量)在二氯甲烷(100mL)中的溶液中。使反应混合物升温至室温并且再搅拌3h。接着将有机层依次用水(25mL)、饱和碳酸氢钠(25mL)和盐水(15mL)洗涤。干燥(MgSO4)后，将溶剂减压移除并且通过快速色谱(乙酸乙酯/庚烷，50/50v/v)纯化残余物，得到为白色固体的7，4.0g(76％)。LC/MS室温2.29min m/z(739.3)M+H。
g)(2S,11S,11aS)-2-(苯甲酰基氧基)-11-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)-8-羟基-7-甲氧基-5-氧代-2,3,11,11a-四氢-1H-苯并[e]吡咯并[1,2-a][1,4]二氮杂
Figure BDA0003022424300000451
10(5H)-羧酸烯丙基酯8
将乙酸锂二水合物(0.55g，5.4mmol，1.0当量)添加到7(4.0g，5.4mmol，1.0当量)在DMF/水(98/2，5mL)中的溶液中并且在室温下搅拌5h。将反应混合物用乙酸乙酯(100mL)稀释并且依次用1M柠檬酸(50mL)和盐水(50mL)洗涤有机相。干燥(MgSO4)后，将溶剂减压移除并且通过快速色谱(梯度乙酸乙酯/庚烷，75/25至100/0v/v)纯化残余物，得到为白色固体的8，3.0g(95％)。LC/MS室温1.80min m/z(583.4)M+H。
h)将8二聚化为9的一般方法
将碳酸钾(2.5当量)添加到8(1.0g，1.72mmol，2.1当量)和1,3-二溴丙烷；1,5-二碘戊烷或1,3-双(溴甲基)苯(1.0当量)在DMF(5mL)中的溶液中。将所得混合物在75℃下搅拌3天。在用二氯甲烷(25mL)稀释后，通过过滤移除无机物并且将滤液在减压下蒸发至干燥。通过快速色谱纯化残余物，得到为白色固体的产物。
i)二烯丙基8,8'-(丙烷-1,3-二基双(氧基))(2S,2'S,11S,11aS,11'S,11a'S)-双(2-(苯甲酰基氧基)-11-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)-7-甲氧基-5-氧代-2,3,11,11a-四氢-1H-苯并[e]吡咯并[1,2-a][1,4]二氮杂
Figure BDA0003022424300000452
10(5H)-羧酸酯)9a
(梯度：乙酸乙酯/庚烷，50/50至100/0v/v)。收率0.88g(90％)。LC/MS室温2.17minm/z(1227.4)M+Na。
ii)二烯丙基8,8'-(戊烷-1,5-二基双(氧基))(2S,2'S,11S,11aS,11'S,11a'S)-双(2-(苯甲酰基氧基)-11-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)-7-甲氧基-5-氧代-2,3,11,11a-四氢-1H-苯并[e]吡咯并[1,2-a][1,4]二氮杂
Figure BDA0003022424300000461
10(5H)-羧酸酯)9b
(乙酸乙酯)。收率0.82g(82％)。LC/MS室温2.20min m/z(1255.3)M+Na。
二烯丙基8,8'-((1,3-亚苯基双(亚甲基))双(氧基))(2S,2'S,11S,11aS,11'S,11a'S)-双(2-(苯甲酰基氧基)-11-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)-7-甲氧基-5-氧代-2,3,11,11a-四氢-1H-
iii)苯并[e]吡咯并[1,2-a][1,4]二氮杂
Figure BDA0003022424300000462
10(5H)-羧酸酯)9c
(梯度：乙酸乙酯/庚烷，75/25至100/0v/v)。收率0.9g(85％)。LC/MS室温2.20minm/z(1267.8)M+H。
i)将9酯水解为10的一般方法
将1M氢氧化锂(1mL)添加到9在甲醇(10mL)中的溶液中并且在室温下搅拌2h。接着将甲醇减压移除并且用1M柠檬酸酸化(pH 6)剩余水层。将产物萃取到乙酸乙酯(30mL)中，干燥(MgSO4)并且在减压下蒸发，得到白色固体，通过快速色谱对其进行纯化。
i)二烯丙基8,8'-(丙烷-1,3-二基双(氧基))(2S,2'S,11S,11aS,11'S,11a'S)-双(11-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)-2-羟基-7-甲氧基-5-氧代-2,3,11,11a-四氢-1H-苯并[e]吡咯并[1,2-a][1,4]二氮杂
Figure BDA0003022424300000463
10(5H)-羧酸酯)10a
(梯度：甲醇/二氯甲烷，2/98至4/96v/v)。收率0.64g(89％)。LC/MS室温1.86minm/z(997.4)M+H。
ii)二烯丙基8,8'-(戊烷-1,5-二基双(氧基))(2S,2'S,11S,11aS,11'S,11a'S)-双(11-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)-2-羟基-7-甲氧基-5-氧代-2,3,11,11a-四氢-1H-苯并[e]吡咯并[1,2-a][1,4]二氮杂
Figure BDA0003022424300000464
10(5H)-羧酸酯)10b
(甲醇/二氯甲烷，5/95v/v)。收率0.68g(93％)。LC/MS室温1.91min m/z(1025.7)M+H。
iii)二烯丙基8,8'-((1,3-亚苯基双(亚甲基))双(氧基))(2S,2'S,11S,11aS,11'S,11a'S)-双(11-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)-2-羟基-7-甲氧基-5-氧代-2,3,11,11a-四氢-1H-苯并[e]吡咯并[1,2-a][1,4]二氮杂
Figure BDA0003022424300000465
10(5H)-羧酸酯)10c
(梯度：甲醇/二氯甲烷，2/98至4/96v/v)。收率0.54g(74％)。LC/MS室温1.92minm/z(1060.5)M+H。
j)将10 Alloc/TBS去保护为11的一般方法
将四(三苯基膦)钯(0)(2mol％)添加到10(1.0当量)和吡咯烷(2.5当量)在二氯甲烷中的溶液中并且在室温下搅拌30min。将反应混合物用二氯甲烷稀释并用饱和氯化铵洗涤。将有机相干燥(MgSO4)并且减压移除溶剂。通过反相HPLC纯化残余物，得到为白色固体的产物。
i)(2S,2'S,11aS,11a'S)-8,8'-(丙烷-1,3-二基双(氧基))双(2-羟基-7-甲氧基-1,2,3,11a-四氢-5H-苯并[e]吡咯并[1,2-a][1,4]二氮杂
Figure BDA0003022424300000471
5-酮)11a
LC/MS室温3.84min m/z(565.3)M+H。
ii)(2S,2'S,11aS,11a'S)-8,8'-(戊烷-1,5-二基双(氧基))双(2-羟基-7-甲氧基-1,2,3,11a-四氢-5H-苯并[e]吡咯并[1,2-a][1,4]二氮杂
Figure BDA0003022424300000472
5-酮)11b
LC/MS室温1.12min m/z(593.3)M+H。
iii)(2S,2'S,11aS,11a'S)-8,8'-((1,3-亚苯基双(亚甲基))双(氧基))双(2-羟基-7-甲氧基-1,2,3,11a-四氢-5H-苯并[e]吡咯并[1,2-a][1,4]二氮杂
Figure BDA0003022424300000473
5-酮)11c
LC/MS室温4.51min m/z(626.7)M+H。
实施例2
Figure BDA0003022424300000481
(i)三光气/三乙胺/Alloc-Val-Ala-对氨基苄醇/THF，(ii)乙酸/甲醇/THF/水，(iii)草酰氯/DMSO/三乙胺/DCM，(iv)TBS-OTf/2，6-二甲基吡啶/DCM，(v)乙酸锂/DMF水溶液，(vi)1，3-二溴丙烷/碳酸钾/DMF，(vii)Pd(Ph3P)4/吡咯烷/DCM(viii)1M氢氧化锂/甲醇，(ix)三乙胺三氢氟酸盐/THF
a)苯甲酸(3S，5S)-1-(2-((((4-((R)-2-((R)-2-(((烯丙氧基)羰基)氨基)-3-甲基丁酰氨基)丙酰氨基)苄基)氧基)羰基)氨基)-5-甲氧基-4-((三异丙基甲硅烷基)氧基)苯甲酰基)-5-(((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)甲基)吡咯烷-3-基酯12
将三乙胺(1.35g，13.4mmol，2.2当量)添加到3(4.0g，6.0mmol，1.0当量)和三光气(0.65g，2.2mmol，0.36当量)在THF(40mL)中的溶液中并且在室温、N2气氛下搅拌5min。添加Alloc-Val-Ala-对氨基苄醇(2.75g，7.3mmol，1.2当量)和三乙胺(0.92g，9.1mmol，1.5当量)在THF(25mL)中的悬浮液并且将所得混合物在40℃下加热2h。过滤反应混合物，将滤液蒸发至干燥并通过快速色谱纯化(甲醇/二氯甲烷，2/98v/v)，得到为淡黄色固体的12，5.0g(78％)。LC/MS室温2.24min m/z(1082.4)M+Na。
b)苯甲酸(3S，5S)-1-(2-((((4-((R)-2-((R)-2-(((烯丙氧基)羰基)氨基)-3-甲基丁酰氨基)丙酰氨基)苄基)氧基)羰基)氨基)-5-甲氧基-4-((三异丙基甲硅烷基)氧基)苯甲酰基)-5-(羟甲基)吡咯烷-3-基酯13
将12(8.0g，7.5mmol)溶解于乙酸(35mL)、甲醇(5mL)、THF(5mL)和水(10mL)的混合物中。将所得溶液在室温下搅拌过夜。接着将反应混合物倒入乙酸乙酯(100mL)中并且依次用水(2x100mL)、饱和碳酸氢钠(50mL)和盐水(50mL)洗涤。干燥(MgSO4)后，将溶剂减压移除并且通过快速色谱(甲醇/二氯甲烷，3/97v/v)纯化残余物，得到为白色固体的13，5.6g(79％)。LC/MS室温1.95min m/z(946.3)M+H。
c)(2S,11S)-2-(苯甲酰基氧基)-11-羟基-7-甲氧基-5-氧代-8-((三异丙基甲硅烷基)氧基)-2,3,11,11a-四氢-1H-苯并[e]吡咯并[1,2-a][1,4]二氮杂
Figure BDA0003022424300000491
10(5H)-羧酸4-((R)-2-((R)-2-(((烯丙氧基)羰基)氨基)-3-甲基丁酰氨基)丙酰氨基)苄基酯14
在-78℃、氩气气氛下，将草酰氯(2M，在DCM中，0.83mL，1.6mmol，1.1当量)逐滴添加到DMSO(0.27mL，3.7mmol，2.5当量)在无水二氯甲烷(20mL)中的溶液中。15min后，逐滴添加13(1.43g，1.5mmol，1.0当量)在二氯甲烷(5mL)中的溶液并且再搅拌反应混合物30min。添加三乙胺(1.05mL，7.5mmol，5.0当量)并且使所得溶液升温至室温，接着再搅拌60min。接着将有机相依次用0.1M HCl(15mL)、饱和碳酸氢钠(15mL)和盐水(10mL)洗涤。干燥(MgSO4)后，将溶剂减压移除并且通过快速色谱(甲醇/二氯甲烷，2/98v/v)纯化，得到为白色固体的14，1.1g(77％)。LC/MS室温1.86min m/z(944.3)M+H。
d)(2S,11S)-2-(苯甲酰基氧基)-11-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)-7-甲氧基-5-氧代-8-((三异丙基甲硅烷基)氧基)-2,3,11,11a-四氢-1H-苯并[e]吡咯并[1,2-a][1,4]二氮杂
Figure BDA0003022424300000493
10(5H)-羧酸4-((R)-2-((R)-2-(((烯丙氧基)羰基)氨基)-3-甲基丁酰氨基)丙酰氨基)苄基酯15
在5℃、氩气气氛下，将叔丁基二甲基甲硅烷基三氟甲磺酸酯(0.92g，3.5mmol，3.0当量)逐滴添加到14(1.1g，1.16mmol，1.0当量)和2,6-二甲基砒啶(0.5g，4.7mmol，4.0当量)在二氯甲烷(15mL)中的溶液中。使反应混合物升温至室温并且再搅拌3h。接着将有机层依次用水(25mL)、饱和碳酸氢钠(25mL)和盐水(15mL)洗涤。干燥(MgSO4)后，将溶剂减压移除，并且残余物不经进一步纯化即用于下一步骤，1.2g(97％)。LC/MS室温2.20min m/z(1058.4)M+H。
e)(2S,11S)-2-(苯甲酰基氧基)-11-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)-8-羟基-7-甲氧基-5-氧代-2,3,11,11a-四氢-1H-苯并[e]吡咯并[1,2-a][1,4]二氮杂
Figure BDA0003022424300000492
10(5H)-羧酸4-((R)-2-((R)-2-(((烯丙氧基)羰基)氨基)-3-甲基丁酰氨基)丙酰氨基)苄基酯16
将乙酸锂二水合物(0.11g，1.04mmol，1.0当量)添加到15(1.1g，1.04mmol，1.0当量)在DMF/水(98/2，3mL)中的溶液中并且在室温下搅拌5h。将反应混合物用乙酸乙酯(25mL)稀释并且依次用1M柠檬酸(20mL)和盐水(20mL)洗涤有机相。干燥(MgSO4)后，将溶剂减压移除并且通过快速色谱(梯度甲醇/二氯甲烷，1/99至3/97v/v)纯化残余物，得到为白色固体的16，0.82g(85％)。LC/MS室温1.77min m/z(902.3)M+H。
f)(2S,11S,11aS)-8-(3-(((2S,11S,11aS)-10-(((4-((S)-2-((S)-2-(((烯丙氧基)羰基)氨基)-3-甲基丁酰氨基)丙酰氨基)苄基)氧基)羰基)-2-(苯甲酰基氧基)-11-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)-7-甲氧基-5-氧代-2,3,5,10,11,11a-六氢-1H-苯并[e]吡咯并[1,2-a][1,4]二氮杂
Figure BDA0003022424300000501
8-基)氧基)丙氧基)-2-(苯甲酰基氧基)-11-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)-7-甲氧基-5-氧代-2,3,11,11a-四氢-1H-苯并[e]吡咯并[1,2-a][1,4]二氮杂
Figure BDA0003022424300000502
10(5H)-羧酸4-((R)-2-((R)-2-(((烯丙氧基)羰基)氨基)-3-甲基丁酰氨基)丙酰氨基)苄基酯17
将碳酸钾(0.18g，1.3mmol，2.5当量)添加到8(1.0g，1.1mmol，2.1当量)和1,3-二溴丙烷(0.1g，0.05mmol，1.0当量)在DMF(5mL)中的溶液中。将所得混合物在75℃下搅拌3天。在用二氯甲烷(25mL)稀释后，通过过滤移除无机物并且将滤液在减压下蒸发至干燥。通过快速色谱(梯度甲醇/二氯甲烷，2/98至4/96v/v)纯化残余物，得到为白色固体的17，0.77g(79％)。LC/MS室温2.04min m/z(1844.3)M+H。
g)(2S,11S,11aS)-8-(3-(((2S,11S,11aS)-10-(((4-((S)-2-((S)-2-氨基-3-甲基丁酰氨基)丙酰氨基)苄基)氧基)羰基)-2-(苯甲酰基氧基)-11-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)-7-甲氧基-5-氧代-2,3,5,10,11,11a-六氢-1H-苯并[e]吡咯并[1,2-a][1,4]二氮杂
Figure BDA0003022424300000503
8-基)氧基)丙氧基)-2-(苯甲酰基氧基)-11-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)-7-甲氧基-5-氧代-2,3,11,11a-四氢-1H-苯并[e]吡咯并[1,2-a][1,4]二氮杂
Figure BDA0003022424300000504
10(5H)-羧酸4-((R)-2-((R)-2-氨基-3-甲基丁酰氨基)丙酰氨基)苄基酯18
将Pd(Ph3P)4(21mg，5mol％)添加到17(0.65g，0.35mmol，1.0当量)和吡咯烷(0.15g，2.1mmol，6.0当量)在二氯甲烷(10mL)中的溶液中并且在室温下搅拌60min。将反应混合物蒸发至干燥并且通过快速色谱(梯度甲醇/二氯甲烷，5/95至20/80v/v)纯化，得到为白色固体的18，0.55g(93％)。LC/MS室温1.39min m/z(1676.5)M+H。
h)(2S,11S,11aS)-8-(3-(((2S,11S,11aS)-10-(((4-((S)-2-((S)-2-氨基-3-甲基丁酰氨基)丙酰氨基)苄基)氧基)羰基)-11-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)-2-羟基-7-甲氧基-5-氧代-2,3,5,10,11,11a-六氢-1H-苯并[e]吡咯并[1,2-a][1,4]二氮杂
Figure BDA0003022424300000505
8-基)氧基)丙氧基)-11-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)-2-羟基-7-甲氧基-5-氧代-2,3,11,11a-四氢-1H-苯并[e]吡咯并[1,2-a][1,4]二氮杂
Figure BDA0003022424300000506
10(5H)-羧酸4-((R)-2-((R)-2-氨基-3-甲基丁酰氨基)丙酰氨基)苄基酯19
将1M氢氧化锂(0.5mL)添加到18(250mg，0.15mmol)在甲醇(3mL)中的溶液中并且在室温下搅拌4h。将甲醇减压移除并且用1M柠檬酸酸化(pH 4)水相。所得溶液通过反相isolera(乙腈/水，35/65v/v+0.1％甲酸)纯化，得到为白色固体的19，156mg(71％)。LC/MS室温1.24min m/z(1468.2)M+H。
i)(2S,11S,11aS)-8-(3-(((2S,11S,11aS)-10-(((4-((S)-2-((S)-2-氨基-3-甲基丁酰氨基)丙酰氨基)苄基)氧基)羰基)-2,11-二羟基-7-甲氧基-5-氧代-2,3,5,10,11,11a-六氢-1H-苯并[e]吡咯并[1,2-a][1,4]二氮杂
Figure BDA0003022424300000511
8-基)氧基)丙氧基)-2,11-二羟基-7-甲氧基-5-氧代-2,3,11,11a-四氢-1H-苯并[e]吡咯并[1,2-a][1,4]二氮杂
Figure BDA0003022424300000512
10(5H)-羧酸4-((R)-2-((R)-2-氨基-3-甲基丁酰氨基)丙酰氨基)苄基酯20
将三乙胺三氢氟酸盐(96mg，0.59mmol，5.0当量)添加到19(175mg，0.12mmol，1.0当量)在THF(10mL)中的溶液中并且在室温下搅拌5天。真空移除溶剂并且通过制备型HPLC纯化残余物，得到为白色固体的20，91mg(62％)。LC/MS室温0.95min m/z(1239.9)M+H。
Figure BDA0003022424300000513
(i)PEG2-酸-NHS酯/THF/水，(ii)Mal-PEG8-酸-NHS酯/THF/水
j)(2S,11S,11aS)-8-(3-(((2S,11S,11aS)-2,11-二羟基-10-(((4-((10R,13R)-10-异丙基-13-甲基-8,11-二氧代-2,5-二氧杂-9,12-二氮杂十四碳-14-酰氨基)苄基)氧基)羰基)-7-甲氧基-5-氧代-2,3,5,10,11,11a-六氢-1H-苯并[e]吡咯并[1,2-a][1,4]二氮杂
Figure BDA0003022424300000514
8-基)氧基)丙氧基)-2,11-二羟基-7-甲氧基-5-氧代-2,3,11,11a-四氢-1H-苯并[e]吡咯并[1,2-a][1,4]二氮杂
Figure BDA0003022424300000515
10(5H)-羧酸4-((R)-2-((R)-2-氨基-3-甲基丁酰氨基)丙酰氨基)苄基酯22
将碳酸氢钠(6mg，0.07mmol，1.05当量)溶解于水(0.5mL)中并且添加到20(91mg，0.07mmol，1.0当量)在THF(0.5mL)中的溶液中。添加PEG2-COOH NHS酯(18mg，0.07mmol，1.0当量)并将所得混合物在室温下搅拌20min。接着通过制备型HPLC纯化反应混合物，得到2种级分；21，白色固体，18mg(16％)和22，白色固体，41mg(41％)。21LC/MS室温1.28min m/z(1499.8)M+H。22LC/MS室温1.07min m/z(1367.1)M-H。
k)(2S,11S,11aS)-8-(3-(((2S,11S,11aS)-2,11-二羟基-10-(((4-((10R,13R)-10-异丙基-13-甲基-8,11-二氧代-2,5-二氧杂-9,12-二氮杂十四烷-14-酰氨基)苄基)氧基)羰基)-7-甲氧基-5-氧代-2,3,5,10,11,11a-六氢-1H-苯并[e]吡咯并[1,2-a][1,4]二氮杂
Figure BDA0003022424300000521
8-基)氧基)丙氧基)-2,11-二羟基-7-甲氧基-5-氧代-2,3,11,11a-四氢-1H-苯并[e]吡咯并[1,2-a][1,4]二氮杂
Figure BDA0003022424300000522
10(5H)-羧酸4-((2R,5R)-38-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-5-异丙基-2-甲基-4,7,34,36-四氧代-10,13,16,19,22,25,28,31-八氧杂-3,6,35-三氮杂三十八烷酰氨基)苄基酯23
将碳酸氢钠(3mg，0.036mmol，1.2当量)溶解于水(0.5mL)中并且添加到22(41mg，0.03mmol，1.0当量)在THF(0.5mL)中的溶液中。添加Mal-PEG8-COOH NHS酯(23mg，0.033mmol，1.1当量)并将所得混合物在室温下搅拌30min。接着通过制备型HPLC纯化反应混合物，得到为白色固体的23，16mg(28％)。LC/MS室温1.31min m/z(1944.45)M+H。
实施例3-缀合
Conj-HER-23
根据专利US2014/038041A1，将位点特异性曲妥珠单抗(tratuzumab)(30mg)加载到固体支持体上并还原、再氧化、与化合物23缀合、纯化、从树脂中释放并配制到25mM组氨酸、200mM蔗糖、吐温20 0.02％(pH 6.0)中。
在Shimadzu Prominence***上，使用Thermo Scientific MAbPac 50mm x 2.1mm柱(用水和乙腈的梯度进行洗脱)对缀合物的还原样品在214nm和330nm处(化合物23特异性)进行的UHPLC分析表明，未缀合轻链与未缀合重链和连接于单分子化合物23的重链的混合物与1.9分子化合物23/抗体的药物/抗体比率(DAR)一致。
在Shimadzu Prominence***上，使用Tosoh Bioscience TSKgel SuperSW mAbHTP 4μm 4.6x150mm柱(具有4μm 3.0x20mm保护柱)，用含有200mM磷酸钾pH 6.95、250mM氯化钾和10％异丙醇(v/v)的0.3mL/分钟无菌过滤的SEC缓冲液洗脱，在280nm处对ADC样品的UHPLC分析显示出大于97％的单体纯度。UHPLC SEC分析给出最终ADC的浓度为在10.5mL中的1.7mg/mL，并且获得的ADC质量是17.9mg(60％收率)。
Conj-HER-23*
将(TCEP)在磷酸盐缓冲盐水pH 7.4(PBS)中的10mM溶液添加(2.1摩尔当量/抗体，210纳摩尔，21μL)到曲妥珠单抗(15mg，100纳摩尔)在含有PBS和1mM乙二胺四乙酸(EDTA)的还原缓冲液中的最终抗体浓度为2.0mg/mL的7.5mL溶液中。在温和(60rpm)振荡下，在轨道振荡器中，使还原混合物在+37℃下反应2小时。使还原抗体溶液冷却至室温并且将化合物23以DMSO溶液(10摩尔当量/抗体，1.0微摩尔，在0.75mL DMSO中)的形式添加到7.5mL的这一还原抗体溶液(15mg，100纳摩尔)中，实现10％(v/v)最终DMSO浓度和～2mg/mL的最终抗体浓度。将溶液在室温下混合1小时。UHPLC分析显示药物/抗体比率(DAR)过低，因此使用15mL Amicon Ultracell 50KDa MWCO自旋过滤器通过自旋过滤器离心到PBS+1mM EDTA中对缀合混合物进行纯化，并且将更多TCEP(0.8摩尔当量/抗体，80纳摩尔，8μL)添加到5mL的这一缓冲液交换的缀合混合物(15mg抗体，100纳摩尔)中，抗体浓度为～3mg/mL。在温和(60rpm)振荡下，在轨道振荡器中，使新还原混合物在+37℃下反应1.75小时。使还原抗体溶液冷却至室温并且将化合物23以DMSO溶液(3摩尔当量/抗体，0.3微摩尔，在0.5mL DMSO中)的形式添加到5mL的这一还原抗体溶液(15mg，100纳摩尔)中，实现10％(v/v)最终DMSO浓度和～3mg/mL的最终抗体浓度。将溶液在室温下混合16小时，然后通过添加N-乙酰基半胱氨酸(1.5微摩尔，15μL，100mM)淬灭缀合，然后使用15mL Amicon Ultracell 50KDa MWCO自旋过滤器通过自旋过滤器离心到25mM组氨酸205mM蔗糖pH 6.0缓冲液中进行纯化、无菌过滤并分析。然后通过自旋过滤器离心将Conj-Her-23*缓冲液交换到PBS中、无菌过滤并分析。
在Shimadzu Prominence***上，使用Thermo Scientific MAbPac 50mm x 2.1mm柱(用水和乙腈的梯度进行洗脱)对Conj-Her-23*的还原样品在214nm处进行的UHPLC分析表明，未缀合轻链、连接至单分子化合物23的轻链、未缀合重链以及连接至最多三分子化合物23的重链的混合物与3.87分子化合物23/抗体的药物/抗体比率(DAR)一致。
在Shimadzu Prominence***上，使用Tosoh Bioscience TSKgel SuperSW mAbHTP 4μm 4.6x150mm柱(具有4μm 3.0x20mm保护柱)，用含有200mM磷酸钾pH 6.95、250mM氯化钾和10％异丙醇(v/v)的0.3mL/分钟无菌过滤的SEC缓冲液洗脱，在280nm处对Conj-Her-23*样品的UHPLC分析显示出99％的单体纯度。还原SDS-PAGE分析给出最终Conj-Her-23*的浓度为在4.4mL中的1.16mg/mL，并且获得的Conj-Her-23*质量是5.1mg(34％收率)。
Conj-Her-23**
将(TCEP)在磷酸盐缓冲盐水pH 7.4(PBS)中的10mM溶液添加(10摩尔当量/抗体，1微摩尔，100μL)到曲妥珠单抗(15mg，100纳摩尔)在含有PBS和1mM乙二胺四乙酸(EDTA)的还原缓冲液中的最终抗体浓度为2.0mg/mL的7.5mL溶液中。在温和(60rpm)振荡下，在轨道振荡器中，使还原混合物在+37℃下反应3小时(或直到通过UHPLC观察到完全还原)。使还原抗体溶液冷却至室温并且再用6mL PBS和1mM EDTA稀释。将化合物23以DMSO溶液(15摩尔当量/抗体，1.5微摩尔，在1.5mL DMSO中)的形式添加到13.5mL的这一还原抗体溶液(15mg，100纳摩尔)中，实现10％(v/v)最终DMSO浓度和1.0mg/mL的最终抗体浓度。将溶液在室温下混合16小时，然后通过添加N-乙酰基半胱氨酸(7.5微摩尔，75μL，100mM)淬灭缀合，然后使用15mL Amicon Ultracell 50KDa MWCO自旋过滤器通过自旋过滤器离心到25mM组氨酸205mM蔗糖pH 6.0缓冲液中进行纯化、无菌过滤并分析。然后通过自旋过滤器离心将Conj-Her-23**缓冲液交换到PBS中、无菌过滤并分析。
在Shimadzu Prominence***上，使用Thermo Scientific MAbPac 50mm x 2.1mm柱(用水和乙腈的梯度进行洗脱)对Conj-Her-23**的还原样品在214nm处进行的UHPLC分析表明，未缀合轻链、连接至单分子化合物23的轻链、未缀合重链以及连接至最多三分子化合物23的重链的混合物与7.60分子化合物23/抗体的药物/抗体比率(DAR)一致。
在Shimadzu Prominence***上，使用Tosoh Bioscience TSKgel SuperSW mAbHTP 4μm 4.6x150mm柱(具有4μm 3.0x20mm保护柱)，用含有200mM磷酸钾pH 6.95、250mM氯化钾和10％异丙醇(v/v)的0.3mL/分钟无菌过滤的SEC缓冲液洗脱，在280nm处对Conj-Her-23**样品的UHPLC分析显示出95％的单体纯度。还原SDS-PAGE分析给出最终Conj-Her-23**的浓度为在6mL中的0.2mg/mL，并且获得的Conj-Her-23**质量是1.2mg(8％收率)。
实施例4–体内测定
测试缀合物：Conj-Her-23
将十周龄的雌性CB.17SCID小鼠在右侧腹部皮下注射0.1ml的在50％Matrigel中的1x107个NCI-N87细胞。当肿瘤达到100-150mm3的平均尺寸时，开始治疗。每周称重小鼠两次。每周测量肿瘤尺寸两次。单独地监测动物。实验的终点是肿瘤体积达到800mm3或83天，以先到者为准。
对10只异种移植小鼠的组静脉内注射0.2ml/20g体重的在磷酸盐缓冲盐水(媒介物)中的抗体药物缀合物(ADC)，或注射单独的0.2ml/20g体重的媒介物。调节ADC的浓度以单剂量产生0.6或6mg ADC/kg体重。
归一化肿瘤体积随时间的变化在图1中示出。
终点和肿瘤生长延迟(TGD)分析
使用卡尺每周两次测量肿瘤，并且当其肿瘤达到800mm3的终点体积时或在研究结束时(第82天)(以先到者为准)对每只动物实施安乐死。将由于达到肿瘤体积终点而退出研究的动物记录为由于肿瘤进展(TP)而被实施安乐死，并记录安乐死的日期。通过以下公式计算每只小鼠用于分析的终点时间(TTE)：
Figure BDA0003022424300000551
其中TTE以天表示，终点体积以mm3表示，b为截距，并且m为通过对数转化的肿瘤生长数据集的线性回归获得的直线斜率。数据集由超出分析中所用的终点体积的第一观察值和即将达到此终点体积之前的三个连续观察值组成。计算出的TTE通常不到TP日期，即动物因肿瘤尺寸而被实施安乐死的这天。为肿瘤未达到终点体积的动物分配等于研究最后一天(第82天)的TTE值。在对数转化的计算出的TTE不到达到终点之前的这天或超出达到肿瘤体积终点的这天的情况下，进行线性内插以估算TTE。由于意外(NTRa)或由于未知原因(NTRu)被分类为死于NTR(非治疗相关)原因的任何动物从TTE计算(和所有进一步分析)中排除。对分类为TR(治疗相关)死亡或NTRm(由转移造成的非治疗相关死亡)的动物分配等于死亡这天的TTE值。由肿瘤生长延迟(TGD)评估治疗结果，将TGD定义为治疗组相比于对照组的中值终点时间(TTE)的增加：
TGD＝T–C，
以天表示，或表示为对照组的中值TTE的百分比：
Figure BDA0003022424300000552
其中：
T＝治疗组的中值TTE，并且
C＝指定对照组的中值TTE。
肿瘤生长抑制
肿瘤生长抑制(TGI)分析评价治疗小鼠和对照小鼠的中值肿瘤体积(MTV)的差异。对于此研究，用于确定TGI的终点为第33天，其为所有可评价的对照小鼠保留在研究中的最后一天。确定每组的MTV(n)，即TGI分析当天n只动物的中值肿瘤体积。肿瘤生长抑制百分比(％TGI)定义为指定对照组的MTV与药物治疗组的MTV之间的差，表示为对照组的MTV的百分比。
Figure BDA0003022424300000553
用于TGI分析的数据集包括组中的所有动物，在TGI分析这天之前死于治疗相关(TR)或非治疗相关(NTR)原因的那些动物除外。
MTV和消退反应的标准
可由在最后一天保留在研究中的动物的肿瘤体积确定治疗功效。MTV(n)定义为肿瘤尚未达到终点体积的剩余数量的动物(n)在研究最后一天的中值肿瘤体积。也可由在研究过程中观察到的消退反应的发生率和幅度确定治疗功效。治疗可导致动物肿瘤的部分消退(PR)或完全消退(CR)。在PR反应中，对于研究过程期间的连续三次测量，肿瘤体积为其第1天体积的50％或更小，并且这三次测量中的一个或多个等于或大于13.5mm3。在CR反应中，对于研究过程期间的连续三次测量，肿瘤体积小于13.5mm3。在研究期间仅可针对PR或CR事件对动物评分一次，并且在满足PR和CR两种标准的情况下，仅评分为CR。在研究终止时具有CR反应的动物另外被分类为无肿瘤存活者(TFS)。针对消退反应对动物进行监测。
毒性
在第1-5天每天对动物称重，接着每周两次称重，直到研究完成。频繁观察小鼠的任何不良的治疗相关(TR)副作用的明显征象，并且在观察到时记录临床征象。根据方案监测各个体重，并且对一次测量体重减轻超过30％或三次连续测量超过25％的任何动物实施安乐死，作为TR死亡。还根据CR Discovery Services方案监测组平均体重减轻。可接受毒性定义为在研究期间组平均体重(BW)减轻小于20％并且不超过10％TR死亡。在任何组的平均体重减轻超过可接受极限时，暂停给药。如果组平均体重恢复至可接受水平，则将给药修改为较低水平和/或降低的频率，接着重新开始。如果临床征象和/或尸体剖检证明死亡归因于治疗副作用，则将其分类为TR。在给药期间或在最后一次剂量的14天内因未知原因造成的死亡也被指定为TR分类。如果没有证据表明死亡与治疗副作用相关，则将所述死亡分类为非治疗相关(NTR)。NTR死亡还归类如下：NTRa描述由意外或人为失误造成的死亡；据认为由肿瘤播散(通过侵犯)和/或转移(基于尸体剖检结果)造成的死亡被指定为NTRm；NTRu描述未知原因的死亡，其缺乏死亡与转移、肿瘤进展、意外或人为失误相关的可获得证据。应当指出的是，被分类为NTRu的死亡中不可排除治疗副作用。
统计和图形分析
使用用于Windows的GraphPad Prism 8.0进行所有统计分析和图形演示。统计分析中不包括所经历的毒性超过可接受极限(>20％组平均体重减轻或大于10％治疗相关死亡)或具有少于五个可评价观察值的研究组。采用对数秩检验评估两组的总体生存情况(survival experience)之间差异的显著性。对数秩检验分析组中所有动物的各个TTE，由于NTR死亡退出研究的那些除外。使用Mann-Whitney U检验完成对照组与治疗组的第33天中值肿瘤体积(MTV)之间差异的统计分析。对于统计分析，以显著性水平P＝0.05进行双尾检验。Prism将检验结果总结为不显著(ns)，P>0.05；显著(符号为“*”)，0.01<P≤0.05；非常显著(“**”)，0.001<P≤0.01；以及极显著(“***”)，P≤0.001。由于统计显著性的检验不提供组间差异幅度的估计，因此在此报道的上下文中将所有显著性水平描述为显著或不显著。构建散点图以按组示出单个小鼠的TTE值。肿瘤生长曲线示出作为时间的函数的组中值、平均和单个肿瘤体积，其中误差条(当存在时)指示平均值的一个标准误差(SEM)。当动物由于肿瘤尺寸退出研究时，所记录的该动物的最终肿瘤体积被包括在内，其中该数据用于计算后续时间点的平均体积。当组中超过50％的可评估动物的肿瘤生长至终点体积时，将肿瘤生长曲线截断，并且排除其死亡被评估为NTR的动物的数据。Kaplan-Meier图示出相对于时间，保留在研究中的每组动物的百分比。Kaplan-Meier图和对数秩检验共享相同的TTE数据集。构建箱线图(Box and whisker plot)，以按组示出第33天肿瘤体积数据，其中“箱”代表观察值的第25和第75百分位，“线”代表观察值的中值，并且“须”代表极端观察值。研究期间的组体重变化绘制为从第1天的平均变化百分比。在组中50％的可评估动物已退出研究之后，将体重图截断，并且排除其死亡被评估为NTR的动物的数据。
Figure BDA0003022424300000571
Figure BDA0003022424300000572
上文提及的所有文档和其他参考文献均以引用方式并入本文。
本发明的实施方案
1.一种式I的化合物：
Figure BDA0003022424300000581
以及其盐和溶剂化物，其中：
R6和R9独立地选自H、R、OH、OR、SH、SR、NH2、NHR、NRR’、硝基、Me3Sn以及卤素；
其中R和R’独立地选自任选取代的C1-12烷基、C3-20杂环基以及C5-20芳基；
R7选自H、R、OH、OR、SH、SR、NH2、NHR、NRR’、硝基、Me3Sn以及卤素；
R”为C3-12亚烷基，所述链可被一个或多个杂原子，例如O、S、NRN2(其中RN2为H或C1-4烷基)，和/或芳环，例如苯或吡啶中断；
Y和Y'选自O、S或NH；
R6’、R7’、R9’分别选自与R6、R7和R9相同的基团；
R11b选自OH、ORA，其中RA为C1-4烷基；并且
RL为用于连接至细胞结合剂的接头，其选自：
Figure BDA0003022424300000582
其中
Q为：
Figure BDA0003022424300000583
其中QX是使得Q是氨基酸残基、二肽残基或三肽残基；
X为：
Figure BDA0003022424300000591
其中a＝0至5，b＝0至16，c＝0或1，d＝0至5；
GL为用于连接至配体单元的接头；以及
Figure BDA0003022424300000592
其中RL1和RL2独立地选自H和甲基，或与它们所结合的碳原子一起形成亚环丙基或亚环丁基；
并且e为0或1；
以下三种情况中的任一者：
(a)R20为H并且R21为H；
(b)R20为H并且R21为＝O；或
(c)R21为OH或ORA，其中RA为C1-4烷基并且R20选自：
Figure BDA0003022424300000593
Figure BDA0003022424300000594
Figure BDA0003022424300000595
其中RZ选自：
Figure BDA0003022424300000601
(z-ii)OC(＝O)CH3；
(z-iii)NO2；
(z-iv)OMe；
(z-v)葡萄糖醛酸苷；
(z-vi)NH-C(＝O)-X1-NHC(＝O)X2-NH-C(＝O)-RZC，其中-C(＝O)-X1-NH-和-C(＝O)-X2-NH-代表中性氨基酸残基并且RZC选自Me、OMe、CH2CH2OMe和(CH2CH2O)2Me。
2.根据陈述1所述的化合物，其中Y和Y’均为O。
3.根据陈述1或陈述2所述的化合物，其中R”为C3-7亚烷基。
4.根据陈述1或陈述2所述的化合物，其中R”为下式的基团：
Figure BDA0003022424300000602
其中r为1或2。
5.根据陈述1至4中任一项所述的化合物，其中R9为H。
6.根据陈述1至5中任一项所述的化合物，其中R6为H。
7.根据陈述1至6中任一项所述的化合物，其中R7选自H、OH和OR。
8.根据陈述7所述的化合物，其中R7为C1-4烷氧基。
9.根据陈述1至8中任一项所述的化合物，其中R6’是与R6相同的基团，R7'是与R7相同的基团，R9'是与R9相同的基团并且Y'是与Y相同的基团。
10.根据陈述1至9中任一项所述的化合物，其中R21为OH或ORA并且R20选自：
Figure BDA0003022424300000603
Figure BDA0003022424300000611
11.根据陈述1至10中任一项所述的化合物，其中-C(＝O)-X1-NHC(＝O)X2-NH-选自：-Phe-Lys-、-Val-Ala-、-Val-Lys-、-Ala-Lys-和-Val-Cit-。
12.根据陈述11所述的化合物，其中-C(＝O)-X1-NHC(＝O)X2-NH-选自：-Phe-Lys-和-Val-Ala-。
13.根据陈述10至12中任一项所述的化合物，其中RZC选自CH2CH2OMe和(CH2CH2O)2Me。
14.根据陈述13所述的化合物，其中RZC为(CH2CH2O)2Me。
15.根据陈述1所述的化合物，其具有式Ia、Ib或Ic：
Figure BDA0003022424300000621
其中R1a选自甲基和苄基；
RL和R11b如陈述1中所定义。
16.根据陈述1至15中任一项所述的化合物，其中R11b为OH。
17.根据陈述1至15中任一项所述的化合物，其中R11b为ORA，其中RA为C1-4烷基。
18.根据陈述17所述的化合物，其中RA为甲基。
19.根据陈述1至18中任一项所述的化合物，其中RL具有式IIIa，并且Q是选自Phe、Lys、Val、Ala、Cit、Leu、Ile、Arg和Trp的氨基酸残基。
20.根据陈述1至18中任一项所述的化合物，其中RL具有式IIIa，并且Q是选自以下的二肽残基：
CO-Phe-Lys-NH、
CO-Val-Ala-NH、
CO-Val-Lys-NH、
CO-Ala-Lys-NH、
CO-Val-Cit-NH、
CO-Phe-Cit-NH、
CO-Leu-Cit-NH、
CO-Ile-Cit-NH、
CO-Phe-Arg-NH，以及
CO-Trp-Cit-NH。
21.根据陈述20所述的化合物，其中Q选自CO-Phe-Lys-NH、CO-Val-Cit-NH和CO-Val-Ala-NH。
22.根据陈述1至18中任一项所述的化合物，其中RL具有式IIIa，并且Q为三肽残基。
23.根据陈述1至22中任一项所述的化合物，其中RL具有式IIIa并且a为0至3。
24.根据陈述23所述的化合物，其中a为0。
25.根据陈述1至24中任一项所述的化合物，其中RL具有式IIIa并且b为0至12。
26.根据陈述25所述的化合物，其中b为0至8。
27.根据陈述1至26中任一项所述的化合物，其中RL具有式IIIa并且d为0至3。
28.根据陈述27所述的化合物，其中d为2。
29.根据陈述1至22中任一项所述的化合物，其中RL具有式IIIa，并且a为0，c为1且d为2，并且b为0至8。
30.根据陈述29所述的化合物，其中b为0、4或8。
31.根据陈述1至30中任一项所述的化合物，其中RL具有式IIIa并且GL选自：
Figure BDA0003022424300000631
Figure BDA0003022424300000641
其中Ar代表C5-6亚芳基。
32.根据陈述31所述的化合物，其中Ar是亚苯基。
33.根据陈述31或陈述32所述的化合物，其中GL选自GL1-1和GL1-2。
34.根据陈述33所述的化合物，其中GL为GL1-1。
35.根据陈述1至18中任一项所述的化合物，其中RL具有式IIIb，并且RL1和RL2均为H。
36.根据陈述1至18中任一项所述的化合物，其中RL具有式IIIb，RL1是H并且RL2是甲基。
37.根据陈述1至18中任一项所述的化合物，其中RL具有式IIIb，并且RL1和RL2均为甲基。
38.根据陈述1至18中任一项所述的化合物，其中RL具有式IIIb，并且RL1和RL2与它们所结合的碳原子一起形成亚环丙基。
39.根据陈述1至18中任一项所述的化合物，其中RL具有式IIIb，并且RL1和RL2与它们所结合的碳原子一起形成亚环丁基。
40.根据陈述1至18和35至39中任一项所述的化合物，其中RL具有式IIIb，并且e是0。
41.根据陈述1至18和35至39中任一项所述的化合物，其中RL具有式IIIb，并且e是1。
42.根据陈述41所述的化合物，其中所述硝基处于对位。
43.根据陈述1所述的化合物，其中所述化合物具有式Id：
Figure BDA0003022424300000651
其中Q选自：
(a)-CH2-；
(b)-C3H6-；以及
Figure BDA0003022424300000652
44.一种式II的缀合物：
L-(DL)p (I)
其中L为配体单元，DL为式I’的药物接头单元：
Figure BDA0003022424300000661
其中R6、R7、R9、R11b、Y、R”、Y’、R6’、R7、R9’、R20和R21如陈述1至18中任一项所定义；
RLL为用于连接至细胞结合剂的接头，其选自：
Figure BDA0003022424300000662
其中Q和X如陈述1和19至21中任一项所定义，并且GLL是连接至配体单元的接头；以及
Figure BDA0003022424300000663
其中RL1和RL2如陈述1和35至39中任一项所定义；
其中p为1至20的整数。
45.根据陈述44所述的缀合物，其中GLL选自：
Figure BDA0003022424300000664
Figure BDA0003022424300000671
其中Ar代表C5-6亚芳基。
46.根据陈述45所述的缀合物，其中Ar是亚苯基。
47.根据陈述45或陈述46所述的缀合物，其中GLL选自GLL1-1和GLL1-2。
48.根据陈述47所述的缀合物，其中GLL为GLL1-1。
49.根据陈述44所述的缀合物，其中DL具有式(Id’)：
Figure BDA0003022424300000672
其中Q选自：
(a)-CH2-；
(b)-C3H6-；以及
Figure BDA0003022424300000673
50.根据陈述44至49中任一项所述的缀合物，其中所述配体单元为抗体或其活性片段。
51.根据陈述50所述的缀合物，其中所述抗体或抗体片段是肿瘤-相关抗原的抗体或抗体片段。
52.根据陈述51所述的缀合物，其中所述抗体或抗体片段是抗体，所述抗体结合于一种或多种肿瘤相关抗原或细胞表面受体，所述肿瘤相关抗原或细胞表面受体选自(1)-(89)：
(1)BMPR1B；
(2)E16；
(3)STEAP1；
(4)0772P；
(5)MPF；
(6)Napi3b；
(7)Sema 5b；
(8)PSCA hlg；
(9)ETBR；
(10)MSG783；
(11)STEAP2；
(12)TrpM4；
(13)CRIPTO；
(14)CD21；
(15)CD79b；
(16)FcRH2；
(17)HER2；
(18)NCA；
(19)MDP；
(20)IL20R-α；
(21)短蛋白聚糖；
(22)EphB2R；
(23)ASLG659；
(24)PSCA；
(25)GEDA；
(26)BAFF-R；
(27)CD22；
(28)CD79a；
(29)CXCR5；
(30)HLA-DOB；
(31)P2X5；
(32)CD72；
(33)LY64；
(34)FcRH1；
(35)IRTA2；
(36)TENB2；
(37)PSMA–FOLH1；
(38)SST；
(38.1)SSTR2；
(38.2)SSTR5；
(38.3)SSTR1；
(38.4)SSTR3；
(38.5)SSTR4；
(39)ITGAV；
(40)ITGB6；
(41)CEACAM5；
(42)MET；
(43)MUC1；
(44)CA9；
(45)EGFRvIII；
(46)CD33；
(47)CD19；
(48)IL2RA；
(49)AXL；
(50)CD30-TNFRSF8；
(51)BCMA-TNFRSF17；
(52)CT Ags–CTA；
(53)CD174(Lewis Y)-FUT3；
(54)CLEC14A；
(55)GRP78–HSPA5；
(56)CD70；
(57)干细胞特异性抗原；
(58)ASG-5；
(59)ENPP3；
(60)PRR4；
(61)GCC–GUCY2C；
(62)Liv-1–SLC39A6；
(63)5T4；
(64)CD56–NCMA1；
(65)CanAg；
(66)FOLR1；
(67)GPNMB；
(68)TIM-1–HAVCR1；
(69)RG-1/***肿瘤靶Mindin–Mindin/RG-1；
(70)B7-H4–VTCN1；
(71)PTK7；
(72)CD37；
(73)CD138–SDC1；
(74)CD74；
(75)紧密连接蛋白–CL；
(76)EGFR；
(77)Her3；
(78)RON-MST1R；
(79)EPHA2；
(80)CD20–MS4A1；
(81)腱生蛋白C–TNC；
(82)FAP；
(83)DKK-1；
(84)CD52；
(85)CS1-SLAMF7；
(86)内皮糖蛋白–ENG；
(87)膜联蛋白A1–ANXA1；
(88)V-CAM(CD106)-VCAM1；
(89)ASCT2(SLC1A5)。
53.根据陈述50至52中任一项所述的缀合物，其中所述抗体或抗体片段是半胱氨酸工程改造的抗体。
54.根据陈述44至53中任一项所述的缀合物，其中p为1至8的整数。
55.根据陈述54所述的缀合物，其中p为1、2、3或4。
56.一种组合物，其包含根据陈述44至55中任一项所述的缀合物的混合物，其中在所述缀合化合物的混合物中，平均p为约1至约8。
57.根据陈述44至55中任一项所述的缀合物，其在治疗中使用。
58.一种药物组合物，其包含如陈述44至55中任一项所述的缀合物，以及药学上可接受的稀释剂、载体或赋形剂。
59.根据陈述44至55中任一项所述的缀合物或根据陈述58所述的药物组合物，其在治疗受试者的增殖性疾病中使用。
60.根据陈述61所述所使用的缀合物，其中所治疗的所述疾病为癌症。
61.根据陈述44至55中任一项所述的缀合物或根据陈述58所述的药物组合物在医学治疗方法中的用途。
62.一种医学治疗的方法，其包括向患者施用如陈述58所述的药物组合物。
63.根据陈述62所述的方法，其中所述医学治疗方法是用于治疗癌症。
64.根据陈述63所述的方法，其中与所述缀合物组合地向所述患者施用化学治疗剂。
65.根据陈述44至55中任一项所述的缀合物在制造用于治疗增殖性疾病的药物的方法中的用途。
66.一种治疗具有增殖性疾病的哺乳动物的方法，其包括施用有效量的根据陈述44至55中任一项所述的缀合物或根据陈述58所述的药物组合物。
67.一种式IV的化合物：
Figure BDA0003022424300000721
其中R6、R7、R9、Y、R”、Y’、R6’、R7和R9’如陈述1至18中任一项所定义；
以下三种情况中的任一者：
(a)R30为H并且R31为H；
(b)R30为H并且R31为＝O；或
(c)R30和R31在它们所连接的N原子与C原子之间形成双键。

Claims (25)

1.一种式I的化合物：
Figure FDA0003022424290000011
以及其盐和溶剂化物，其中：
R6和R9独立地选自H、R、OH、OR、SH、SR、NH2、NHR、NRR’、硝基、Me3Sn以及卤素；
其中R和R’独立地选自任选取代的C1-12烷基、C3-20杂环基以及C5-20芳基；
R7选自H、R、OH、OR、SH、SR、NH2、NHR、NRR’、硝基、Me3Sn以及卤素；
R”为C3-12亚烷基，所述链可被一个或多个杂原子，例如O、S、NRN2(其中RN2为H或C1-4烷基)，和/或芳环，例如苯或吡啶中断；
Y和Y'选自O、S或NH；
R6’、R7’、R9’分别选自与R6、R7和R9相同的基团；
R11b选自OH、ORA，其中RA为C1-4烷基；并且
RL为用于连接至细胞结合剂的接头，其选自：
(iiia)：
Figure FDA0003022424290000012
其中
Q为：
Figure FDA0003022424290000013
其中QX是使得Q是氨基酸残基、二肽残基或三肽残基；
X为：
Figure FDA0003022424290000021
其中a＝0至5，b＝0至16，c＝0或1，d＝0至5；
GL为用于连接至配体单元的接头；以及
(iiib)：
Figure FDA0003022424290000022
其中RL1和RL2独立地选自H和甲基，或与它们所结合的碳原子一起形成亚环丙基或亚环丁基；
并且e为0或1；
以下三种情况中的任一者：
(a)R20为H并且R21为H；
(b)R20为H并且R21为＝O；或
(c)R21为OH或ORA，其中RA为C1-4烷基并且R20选自：
(i)
Figure FDA0003022424290000023
(ii)
Figure FDA0003022424290000024
(iii)
Figure FDA0003022424290000025
其中RZ选自：
(z-i)
Figure FDA0003022424290000031
(z-ii)OC(＝O)CH3；
(z-iii)NO2；
(z-iv)OMe；
(z-v)葡萄糖醛酸苷；
(z-vi)NH-C(＝O)-X1-NHC(＝O)X2-NH-C(＝O)-RZC，其中-C(＝O)-X1-NH-和-C(＝O)-X2-NH-代表中性氨基酸残基并且RZC选自Me、OMe、CH2CH2OMe和(CH2CH2O)2Me。
2.根据权利要求1所述的化合物，其中Y和Y’均为O。
3.根据权利要求1或权利要求2所述的化合物，其中R”为C3-7亚烷基。
4.根据权利要求1或权利要求2所述的化合物，其中R”为下式的基团：
Figure FDA0003022424290000032
其中r为1或2。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的化合物，其中R9为H，R6为H并且R7为C1-4烷氧基。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的化合物，其中R6’是与R6相同的基团，R7’是与R7相同的基团，R9'是与R9相同的基团并且Y'是与Y相同的基团。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的化合物，其中R21为OH或ORA并且R20为
Figure FDA0003022424290000033
并且-C(＝O)-X1-NHC(＝O)X2-NH-选自：-Phe-Lys-、-Val-Ala-、-Val-Lys-、-Ala-Lys-和-Val-Cit-。
8.根据权利要求7所述的化合物，其中-C(＝O)-X1-NHC(＝O)X2-NH-选自：-Phe-Lys-和-Val-Ala-。
9.根据权利要求7或8所述的化合物，其中RZC为(CH2CH2O)2Me。
10.根据权利要求1所述的化合物，其具有式Ia、Ib或Ic：
Figure FDA0003022424290000041
其中R1a选自甲基和苄基；
RL和R11b如权利要求1中所定义。
11.根据权利要求1至10中任一项所述的化合物，其中RL具有式IIIa，并且Q是选自以下的二肽残基：
CO-Phe-Lys-NH、
CO-Val-Ala-NH、
CO-Val-Lys-NH、
CO-Ala-Lys-NH、
CO-Val-Cit-NH、
CO-Phe-Cit-NH、
CO-Leu-Cit-NH、
CO-Ile-Cit-NH、
CO-Phe-Arg-NH，以及
CO-Trp-Cit-NH。
12.根据权利要求1至11中任一项所述的化合物，其中RL具有式IIIa，并且a是0，c是1且d是2，并且b是0至8。
13.根据权利要求12所述的化合物，其中b是0、4或8。
14.根据权利要求1至13中任一项所述的化合物，其中RL具有式IIIa并且GL选自：
Figure FDA0003022424290000051
Figure FDA0003022424290000061
其中Ar代表C5-6亚芳基。
15.根据权利要求14所述的化合物，其中GL为GL1-1。
16.根据权利要求1所述的化合物，其中所述化合物具有式Id：
Figure FDA0003022424290000062
其中Q选自：
(a)-CH2-；
(b)-C3H6-；以及
(c)
Figure FDA0003022424290000063
17.一种式II的缀合物：
L-(DL)p (I)
其中L为配体单元，DL为式I’的药物接头单元：
Figure FDA0003022424290000064
其中R6、R7、R9、R11b、Y、R”、Y’、R6’、R7、R9’、R20和R21如权利要求1至9中任一项所定义；
RLL为用于连接至细胞结合剂的接头，其选自：
(iiia)：
Figure FDA0003022424290000071
其中Q和X如权利要求1和11中任一项所定义，并且GLL是连接至配体单元的接头；以及
(iiib)：
Figure FDA0003022424290000072
其中RL1和RL2如权利要求1中所定义；
其中p为1至20的整数。
18.根据权利要求17所述的缀合物，其中GLL选自：
Figure FDA0003022424290000073
Figure FDA0003022424290000081
其中Ar代表C5-6亚芳基。
19.根据权利要求17所述的缀合物，其中DL具有式(Id’)：
Figure FDA0003022424290000082
其中Q选自：
(a)-CH2-；
(b)-C3H6-；以及
(c)
Figure FDA0003022424290000083
20.一种式IV的化合物：
Figure FDA0003022424290000084
其中R6、R7、R9、Y、R”、Y’、R6’、R7和R9’如权利要求1至9中任一项所定义；
以下三种情况中的任一者：
(a)R30为H并且R31为H；
(b)R30为H并且R31为＝O；或
(c)R30和R31在它们所连接的N原子与C原子之间形成双键。
21.一种组合物，其包含根据权利要求17至19中任一项所述的缀合物的混合物，其中在所述缀合化合物的混合物中，平均p为约1至约8。
22.根据权利要求17至19中任一项所述的缀合物，其在治疗中使用。
23.一种药物组合物，其包含如权利要求17至19中任一项所述的缀合物，以及药学上可接受的稀释剂、载体或赋形剂。
24.根据权利要求17至19中任一项所述的缀合物或根据陈述23所述的药物组合物，其在治疗受试者的增殖性疾病中使用。
25.根据权利要求24所述所使用的缀合物，其中所治疗的所述疾病为癌症。
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