CN115927310B - 月季皮刺特异表达启动子proRcLAC15及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了月季皮刺特异表达启动子proRcLAC15及其应用。本发明首次从月季中克隆一个皮刺特异性表达的启动子proRcLAC15，将其用于构建重组表达载体，可在植物中异源表达该启动子，达到响应损伤应答和培育优新品种等目的。将本发明应用于转基因植物研究中，在植物中能够特异性表达，同时在植物的损伤修复方面起重要的作用。
Description
技术领域
本发明属于植物基因工程技术领域，具体地说，涉及月季皮刺特异表达启动子proRcLAC15及其应用。
背景技术
月季位于四大切花之首，因其独特的观赏特性和重要的经济价值，在全世界广泛栽培(HIBRAND SAINT-OYANT等,2018)。月季的皮刺为植物表皮或皮层形成的尖锐突起，通过自然进化而来，一直是重要的育种目标，在不同的品种中皮刺的形状、大小、密度和颜色都不尽相同，植物皮刺常常起到储水和防御生物及非生物胁迫等作用(ZHOU等,2021)。目前对于月季皮刺的研究较少，研究人员开始通过基因工程技术研究皮刺的功能及分子机制。
在植物的生长发育期和不同逆境胁迫下，进化出严格的基因表达调控网络。其中转录水平上的调控是基因表达的起始和关键的一步，包括基因转录的激活、抑制、延长等行为(李等,2022)。启动子则为调控基因转录的重要元件，是构建表达载体的重要组成部分，可分为组成型启动子、组织特异性启动子与诱导型启动子(刘等，2022；邓等,2021)。人们在研究过程中逐步采用组织特异性启动子和诱导型启动子替代组成型启动子，从而实现基因在特定诱导条件下或特定组织中的特异性表达(贺等, 2014)。启动子调控机制十分复杂，如异源表达组织特异性启动子会改变其时空性 (LI等,2008)，有待进一步研究。
LAC(Laccase，漆酶)属于铜蓝蛋白氧化酶家族，与植物木质素的合成、伤口的愈合及响应生物与非生物胁迫等密切相关(HOEGGER等,2006)。研究表明毛果杨及杜仲等植物中的LAC基因参与木质素合成的调控机制(刘亚娣,2020；刘佳佳, 2020)。在损伤修复方面，LAC基因表达受到机械损伤的诱导，其表达有助于伤口愈合防止感染(黄等,2018；NITTA等,2002)。为了研究LAC基因的表达模式，研究人员对植物LAC基因启动子及其顺式作用元件展开了分析，研究主要集中在拟南芥和烟草等模式植物中(TURLAPATI等,2011；WANG等,2019)，还没有针对月季中漆酶基因的相关报道。
目前已报道的月季组织特异性启动子较少，多为花器官特异性启动子等(李等,2021；王等,2020；KHAN等,2015)。从月季中分离获得皮刺特异性表达启动子，并对启动子进行克隆和功能分析，这对在月季和其它植物(尤其是有刺植物)中研究皮刺功能和分子调控机制，增强损伤修复能力及培育优新品种等方面具有重要意义。
目前皮刺的功能和分子调控机制缺少***全面的研究(ZHOU等,2021)，在观赏植物中漆酶参与损伤修复的报道也较少，而且尚未有在月季皮刺中特异表达的启动子报道，也未有LAC启动子的相关研究报道。
发明内容
本发明的目的是提供月季皮刺特异表达启动子proRcLAC15及其应用。
为了实现本发明目的，第一方面，本发明提供月季皮刺特异表达启动子proRcLAC15，所述启动子为：
i)SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列；或
ii)SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列经取代、缺失和/或增加一个或多个核苷酸且以稳定期特异性方式显示出启动子活性的核苷酸序列；或
iii)在严格条件下与SEQ ID NO:1所示序列杂交且以稳定期特异性方式显示出启动子活性的核苷酸序列，所述严格条件为在含0.1％SDS的0.1×SSPE或含0.1％SDS 的0.1×SSC溶液中，在65℃下杂交，并用该溶液洗膜；或
iv)与i)、ii)或iii)的核苷酸序列具有90％以上同源性且以稳定期特异性方式显示出启动子活性的核苷酸序列。
启动子proRcLAC15具有应答植物机械损失的特性。
第二方面，本发明提供含有所述启动子的表达盒。
第三方面，本发明提供含有所述启动子或所述表达盒的载体(表达载体)。
优选地，出发载体为pBI121。
第四方面，本发明提供含有所述启动子、所述表达盒或所述载体的工程菌。
第五方面，本发明提供一种在植物中表达目的核酸分子的方法，所述方法包括向植物中导入核酸构建体，所述核酸构建体含有所述启动子以及与所述启动子可操作性连接的目的核酸分子。
进一步地，所述目的核酸分子可选自结构基因、调节基因、结构基因的反义基因、调节基因的反义基因或能够干扰内源基因表达的小RNA等。
进一步地，所述植物为双子叶植物，优选蔷薇属植物。
所述植物优选月季或拟南芥。
第六方面，本发明提供所述启动子的以下任一应用：
1)用于构建重组DNA、表达盒、转座子、质粒载体、病毒载体或工程菌；
2)用于构建转基因植物；
3)用于植物育种。
借由上述技术方案，本发明至少具有下列优点及有益效果：
本发明对月季中RcLAC15基因进行研究，对其表达分析表明该基因在月季皮刺中特异表达。并进一步克隆获得RcLAC15基因的启动子proRcLAC15，通过构建proRcLAC15::GUS转基因拟南芥并对其GUS染色，发现GUS蛋白的蓝色信号出现在拟南芥叶片边缘，而在拟南芥其它部位没有，这可能是由于拟南芥没有皮刺结构， proRcLAC15在异源表达过程中改变了时空性。本发明首次获得来源于月季皮刺的特异表达启动子proRcLAC15。进一步地，发现启动子proRcLAC15在受到机械损伤时在损伤部位表达量显著增加，proRcLAC15可应用于植物的损伤应答研究。
附图说明
图1为本发明较佳实施例中月季基因RcLAC15在不同月季器官中定量表达分析(RT-qPCR分析)。横坐标前四种材料分别是取自绿瓣期(具有绿色花瓣的幼嫩花苞)、转色期(花瓣开始转色的花苞)、红瓣期(花瓣完成着色的花苞)和盛开期(花朵完全开放)的花瓣，其他材料分别是月季的叶、茎、皮刺、雄蕊、雌蕊和根。
图2为本发明较佳实施例中植物表达载体酶切检测琼脂糖凝胶电泳图。从左到右依次为：DNA Marker II，表达载体pBI121-35S::GUS，表达载体 pBI121-proRcLAC15::GUS。采用Hind III和BamH I限制性内切酶进行双酶切。
图3为本发明较佳实施例中植物重组表达载体pBI121-proRcLAC15::GUS的构建图。
图4为本发明较佳实施例中转pBI121-proRcLAC15::GUS的T3代拟南芥植株中的表型观测图。图中从左到右依次为野生型植株，转pBI121-35S::GUS对照植株，转 pBI121-proRcLAC15::GUS实验株系1(右上)，转pBI121-proRcLAC15::GUS实验株系 2(右下)。
具体实施方式
本发明提供一种在月季‘月月粉’皮刺中特异性表达的基因启动子proRcLAC15，所述启动子包含SEQ ID NO:1所示的DNA序列。
本发明还提供一种重组表达载体pBI121-proRcLAC15::GUS，所述重组表达载体包含SEQ ID NO:1所示序列的月季皮刺特异性表达启动子。其中标记基因为GUS基因。
进一步将重组表达载体pBI121-proRcLAC15::GUS用于构建转基因拟南芥，通过对植株进行组织化学染色和人为损伤，来研究该启动子在不同部位的特异性表达。
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册(Sambrook J&Russell DW,Molecular Cloning:a Laboratory Manual,2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。
以下实施例使用的载体pBI121购自NovoPro公司。
实施例1组织特异性基因RcLAC15的表达分析
1.月季总RNA提取
RNA提取采用Trizol法，选用SV Total RNA提取试剂盒(Promega,WI,USA)。RNA 分别取自月季的根、茎、叶、4个不同开放阶段的花瓣、皮刺、雄蕊、雌蕊，对其进行液氮速冻，并保存于-80℃备用。
2.cDNA的合成
cDNA的合成体系见表1。其中RNA与Oligo(dT)15混匀后，需70℃加热5min，然后迅速于冰上降温2min。然后依次加入反应组分，充分混匀后设置42℃50min，95℃ 5min终止反应，并置于冰上冷却。cDNA合成后置于-20℃冰箱内保存。
表1 cDNA合成体系
3.RT-qPCR检测基因RcLAC15的表达模式
荧光定量PCR试验中使用的仪器为CFX Connect Real-Time System仪，参考TBPremix Ex TaqTM II(RR420Q，TaKaRa Bio,Inc.,Tokyo,Japan)试剂盒说明书。每个样品设置3次重复实验，以RcActin为内参基因，验证引物见表2。RT-qPCR反应体系见表3，反应程序为：95℃预变性30s，95℃变性5s，60℃退火30s，以上程序 40个循环；95℃5s；融解曲线温度为65～95℃，以0.5℃/s的速度升温。
表2验证引物
表3 RT-qPCR反应体系
通过RT-qPCR检测，RcLAC15基因仅在月季的皮刺中有着很高的表达水平，而在其它部位如根、茎、雄蕊等都检测不到表达，说明基因RcLAC15在月季皮刺中特异性表达(图1)。
实施例2启动子proRcLAC15的克隆
1.月季基因组DNA提取
月季DNA提取采用常规CTAB法，参考植物DNA提取试剂盒(Omega Bio-Tek,Doraville,GA,USA)说明书。根据月季基因组数据库 (https://lipm-browsers.toulouse.inra.fr/pub/RchiOBHm-V2/)提供的RcLAC15基因序列，通过DNAMAN软件对RcLAC15全长序列设计引物(表4)。使用KOD-plus高保真酶(KOD-201，TOYOBO CO.,LTD.Life Science Department OSAKA JAPAN)进行扩增，参考KOD-plus说明书配制PCR反应体系(50μL)。PCR的反应程序为：94℃5min， 94℃30s，56℃30s，72℃3min，共设置32个循环；72℃延伸5min。通过PCR克隆成功获得长为2,757bp的RcLAC15 DNA全长序列。
表4扩增引物
2.启动子proRcLAC15序列的获得
以月季基因组DNA为模板，设计引物对启动子proRcLAC15进行扩增，参考 KOD-plus高保真酶说明书配制PCR反应体系(50μL)，引物序列见表4。PCR的反应程序为：94℃5min，94℃30s，52℃30s，72℃1min 30s，共设置35个循环；72℃延伸2min。对PCR产物通过1％的琼脂糖凝胶电泳进行检测并使用普通琼脂糖凝胶 DNA回收试剂盒(DP209，天根生化科技(北京)有限公司)进行回收纯化。取4μL回收产物与1μL-Blunt克隆(CB501-01，北京全式金生物有限公司)载体连接，转化大肠杆菌TransT1感受态并提取质粒，最后将阳性重组质粒送至北京诺赛基因组研究中心有限公司测序，将重组质粒命名为pEASY-proRcLAC15。
实施例3重组表达载体pBI121-proRcLAC15::GUS的构建
重组表达载体pBI121-proRcLAC15::GUS构建是将启动子proRcLAC15***到含有GUS基因的载体pBI121中。选择Hind III和BamH I限制性内切酶(TaKaRa)对重组质粒pEASY-proRcLAC15和目的载体pBI121进行双酶切，并进行琼脂糖凝胶电泳，最后切胶回收酶切产物。采用T4连接酶(2011A，TaKaRa)连接目的片段和载体，连接体系见表5。将连接产物转化大肠杆菌感受态并进行单克隆菌斑扩大培养。然后将 PCR验证阳性的重组质粒送至北京诺赛基因组研究中心有限公司测序。对质粒 pBI121-35S::GUS及重组质粒pBI121-proRcLAC15::GUS进行酶切检测(图2)，将重组表达载体命名为pBI121-proRcLAC15::GUS(图3)。
表5连接体系
实施例4构建拟南芥遗传转化体系
1.拟南芥植株的获取
将野生型拟南芥种子播种在配制好的基质中，覆膜黑暗处理2d后移入光照培养箱中培养生长，设置生长条件为16h光照/8h黑暗，温度23℃，湿度70％左右。
2.利用花序侵染法转化拟南芥
将pBI121-35S::GUS和pBI121-proRcLAC15::GUS的阳性菌液分别导入农杆菌感受态AGL0感受态中，并接种到LB培养基(含抗生素Rif和Kana)，28℃条件下200rpm 振荡培养，得到OD600＝0.6-0.8的重组农杆菌菌液。将拟南芥的花序放入重悬液中浸泡3-5min并避光处理，然后采用相同的步骤重复侵染一次，待植株干枯后收获种子并进行筛选。
3.转基因拟南芥的抗性筛选
将种子接种在含有抗生素(Kan，50mg/L)的MS培养基上，直接筛选转基因阳性的幼苗，并将其移栽于培养土，待成熟后收获种子，直至筛选至T3代种子阳性苗，即可对其进行启动子表达模式分析。
实施例5GUS基因在拟南芥中的表达检测
将生长时期为20d的拟南芥幼苗放入离心管中，并提前将proRcLAC15::GUS转基因株系的叶柄轻轻划伤，加入一定量的GUS染色液直至浸没整个株系，GUS染色液配制见表6。将离心管放入37℃的培养箱中避光染色24h，然后用70％乙醇脱色3-4次，至对照的植物组织呈现白色。脱色完成后，对样品进行观察记录。
表6 GUS染色液配制
图4结果显示，野生型植株未被染色，转pBI121-35S::GUS对照植株整株呈蓝色，转pBI121-proRcLAC15::GUS试验株系1叶片边缘和主叶脉呈蓝色而其它部位未被染色，转pBI121-proRcLAC15::GUS试验株系2叶片边缘、主叶脉和损伤部位(箭头指示) 呈蓝色而其它部位未被染色。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
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Claims (7)
1.月季皮刺特异表达启动子proRcLAC15，其特征在于，所述启动子为SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列。
2.含有权利要求1所述启动子的表达盒。
3.含有权利要求1所述启动子或权利要求2所述表达盒的载体。
4.根据权利要求3所述的载体，其特征在于，出发载体为pBI121。
5.含有权利要求1所述启动子、权利要求2所述表达盒或权利要求3或4所述载体的工程菌。
6.在植物中表达目的核酸分子的方法，其特征在于，所述方法包括向植物中导入核酸构建体，所述核酸构建体含有权利要求1所述启动子以及与所述启动子可操作性连接的目的核酸分子；
所述植物为月季或拟南芥。
7.权利要求1所述启动子的以下任一应用：
1）用于构建表达盒、转座子、质粒载体、病毒载体或工程菌；
2）用于构建转基因植物；
3）用于植物育种；
所述植物为月季或拟南芥。
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