CN112852828A - 一种植物花粉管液泡荧光标记构建方法与应用 - Google Patents

Abstract

一种植物花粉管液泡荧光标记构建方法，包括，克隆肌醇转运蛋白基因AT2G43330 INT1的CDS序列，其序列如SEQ ID No.1所示，或该序列经替换、缺失或添加一个或几个碱基形成的具有同等功能的核苷酸序列；将INT1连接进入花粉管特异启动子启动红色荧光蛋白RFP的Gateway表达载体，通过所述载体在植物花粉中表达融合蛋白RFP‑INT1，其中，RFP为红色荧光蛋白，INT1为拟南芥AT2G43330编码的氨基酸序列；转化植物，筛选，鉴定，获得具有荧光信号的转基因植物。本发明所构建红色标记能够应用于科学研究，用来确定未知蛋白的亚细胞定位；同时通过瞬时转化，能够快速显示植物花粉液泡动态，间接反映花粉活力，便于筛选优异种质和遗传材料。

Description

一种植物花粉管液泡荧光标记构建方法与应用

技术领域

本发明属于遗传工程领域，具体地说，涉及一种植物花粉管液泡荧光标记构建方法与应用。

背景技术

植物的受精对于结实至关重要，花粉的功能在双受精过程中尤为关键，很多育种技术都是利用雄性不育开展的，比如三系杂交水稻、光敏不育系水稻等。为了丰富种质资源，在自然界野生种中筛选雄性不育株系势在必行，但目前检测花粉活力的分子手段还相对较少。很多植物的花粉在体外能够萌发生长出花粉管，花粉管是一种能够迅速生长的极性细胞，生长过程中伴随着细胞器的动态变化，花粉管的液泡往往呈网状结构，其完整性能够间接反应花粉管生长速度和活力。

发明内容

本发明的目的在于，构建一种植物花粉管液泡荧光标记显示花粉管液泡动态，间接反映花粉活力，以便于筛选优异种质和遗传材料。

为实现上述发明目的，本发明的技术方案具体如下：

一种植物花粉管液泡荧光标记构建方法，包括：克隆肌醇转运蛋白基因AT2G43330INT1的CDS序列，其序列如SEQ ID No.1所示，或该序列经替换、缺失或添加一个或几个碱基形成的具有同等功能的核苷酸序列；将INT1连接进入花粉管特异启动子启动红色荧光蛋白RFP的Gateway表达载体，通过所述载体在植物花粉中表达融合蛋白RFP-INT1，其中，RFP为红色荧光蛋白，INT1为拟南芥AT2G43330编码的氨基酸序列；转化植物，筛选，鉴定，获得具有荧光信号的转基因植物。此构成本发明的第一个方面。

本发明的第二方面是提供了上述载体。

本发明的第三个方面是提供了含上述载体的工程菌。

本发明的第四个方面是提供了含上述载体的转基因植物或细胞。

本发明的第五个方面是提供了上述载体在显示植物花粉液泡动态或检测花粉活力中的应用。

与现有技术相比，本发明的有益效果：

通过与已知液泡定位蛋白PAT10共定位，确定所构建红色荧光标记能够显示花粉管液泡动态；

Lat52启动子是从番茄中获得，能够特异的启动蛋白在花粉中表达，其作用在拟南芥、烟草和百合中也同样有效；

本发明所构建红色标记能够应用于科学研究，用来确定未知蛋白的亚细胞定位；同时通过瞬时转化，能够快速显示植物花粉液泡动态，间接反映花粉活力，便于筛选优异种质和遗传材料。

附图说明

图1为本发明实施例1中改造的pH7WGR2,0载体的图谱；

图2为本发明实施例1中Lat52p::RFP-INT1载体的图谱；

图3为本发明实施例3中观察的拟南芥花粉管照片，包括RFP-INT1、PAT10-GFP和两者叠加的荧光图片。

具体实施方式：

本发明提供的项目实施方案用于说明本发明，但是不局限于本发明的研究范围。如果没有特别指出，本发明实施中的技术手段为本研究领域的常用技术，所用原料为市场所购。

实施例1拟南芥肌醇转运蛋白INT1基因序列的获得以及植物表达载体的构建

登录拟南芥信息资源数据库网站

https://www.arabidopsis.org/servlets/TairObject？type＝sequence&id＝125264，找到肌醇转运蛋白INT1基因的序列(SEQ ID No.1)，根据INT1的CDS设计PCR扩增引物，

INT1 CDS-F:5'-CACCatgacattgacgatcccaaac-3'

INT1 CDS-R:5'-ttaagattgagatccctgctcg-3'

培养野生型拟南芥Col-0，取长日照生长4天的拟南芥小苗为材料，用康为世纪公司试剂盒提取植物总RNA，经反转录PCR获得cDNA，随后以cDNA为模板扩增目的序列。

提取RNA具体步骤如下：

(1)取小苗30-50mg在液氮中充分研磨后加入1mL Buffer RLT。注意：样品体积不超过Buffer RLT体积的10％。

(2)样品中加入Buffer RLT后反复吸打几次，使样品充***解。室温放置5分钟，使蛋白核酸复合物完全分离。

(3)以每1mL Buffer RLT加入200μL氯仿的比例加入氯仿，盖好管盖，剧烈震荡15秒，室温放置2分钟。

(4)4℃12000rpm离心10分钟，此时样品分为三层：红色有机相、中间层和上层无色水相，RNA主要在上层水相中，将上层水相移到一个新的RNase-Free离心管中。

(5)在得到的水相溶液中加入等体积的70％乙醇(无RNase的水配制)，颠倒混匀。

(6)将上步所得溶液全部加入到已装入收集管的吸附柱中。如一次不能加完溶液，可分多次转入。12000rpm离心20秒，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。

(7)向吸附柱中加入350μL Buffer RW1,12000rpm离心20秒，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。

(8)配制DNaseI混合液：取52μL RNase-Free的水，向其中加入8μL 10×ReactionBuffer和20μL DNaseI(1U/μL)混匀，配制成终体积为80μL的反应液。

(9)向吸附柱中直接加入80μL DNaseI混合液，20～30℃孵育15分钟。

(10)向吸附柱中加入350μL Buffer RW1，10000rpm离心1分钟，弃废液，将吸附柱重新放回收集管中。

(11)向吸附柱中加入500μL Buffer RW2(使用前检查是否已加入无水乙醇)，12000rpm离心20秒，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。

(12)重复步骤(11)。

(13)12000rpm离心2分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱置于室温数分钟，以彻底晾干残留的乙醇。注意：这一步的目的是将吸附柱中残余的乙醇去除，乙醇残留会影响后续的酶促反应。

(14)将吸附柱置于一个新的无RNase的离心管中，在吸附柱的中部加入30～50μLRNase-Free的水，室温放置1分钟，12000rpm离心1分钟，收集RNA溶液，为提高RNA浓度，可将得到的溶液重新加入到吸附柱中进行二次收集。用NANODROP 2000检测所得RNA的浓度。-80℃保存RNA，防止降解。

反转录PCR方法如下：

在PCR管中配制RNA和Oligo(dT)primer混合液，总量为6μL，体系如下：

混合液在70℃保温10分钟，迅速在冰上冷却2分钟以上，快速离心，在管中依次加入下列反转录试剂。

混合液在42℃保温1小时，再转移到70℃中保温15分钟，再放冰上充分冷却，即得cDNA，加入适量双蒸水稀释使用，-20℃保存。

获得拟南芥INT1的CDS序列：按照Phusion高保真克隆酶扩增体系和反应程序进行PCR。将PCR产物克隆到连接pENTR/D/TOPOvector入门载体上，经测序鉴定得到与目的基因完全相同的序列。通过LR反应将INT1基因构建到经过改造的植物表达载体pH7WGR2,0(图1)上，pH7WGR2,0从VIB-UGent Center for Plant Systems Biology获得，将原有35S启动子替换成花粉特异启动子Lat52，最终获得载体Lat52p::RFP-INT1(图2)，该载体全序列如SEQID No.2所示。该载体具有在植物花粉中表达融合蛋白RFP-INT1的功能，其中RFP为红色荧光蛋白；INT1为拟南芥肌醇转运蛋白INT1编码的氨基酸序列(SEQ ID No.3)。

实施例2转基因拟南芥植株的获得

首先植物培养至开花期，随后用农杆菌蘸花法进行转化，收取种子后进行转基因植物的筛选。

拟南芥种子表面消毒及培育的方法如下：

(1)用筛子筛去多余杂质仅保留种子，分装到1.5mL离心管中。在超净台中用70％乙醇(用灭菌的吐温水配制)处理5分钟，再用2.6％NaClO(用灭菌的吐温水配制)处理10分钟，随后用灭菌的吐温水漂洗四次，然后将种子均匀地铺在1/2MS固体培养基上。

(2)4℃冰箱春化3天，然后放在长日照光照培养箱中培养4天以上，等到种子萌发并且长出较大真叶即可把小苗移栽到温室中。

(3)用营养钵装满蛭石，然后将营养钵放在大培养盆中，一个培养盆可以放20钵。向培养盆中浇适量的含有花多多肥料的营养液，等蛭石完全被营养液浸透即可开始移栽小苗。

(4)用镊子在蛭石表面戳几个小洞，然后挑选生长情况良好的小苗，轻轻托着小苗子叶放进小洞中，用蛭石盖住小苗根部和下胚轴，仅留两片子叶暴露在蛭石外。每个营养钵中移栽五棵幼苗。移栽完后用透明保鲜膜盖住整个营养盆以保湿。在保鲜膜上再剪几个孔以便透气。

(5)幼苗成活后，待幼苗生长至三周左右去掉保鲜膜。在植物整个生长过程中要及时浇水和除虫。

拟南芥的遗传转化采用花序浸染法，方法如下：

(1)拟南芥开花后即可用于侵染，侵染的植株最好长得强壮一些。侵染前需要把果荚和已经开放的花剪掉，而且要提前浇适量的营养液。

(2)侵染所用农杆菌：提前一天用4mL左右的YEP液体培养基培养农杆菌，取1～2mL培养好的浑浊菌液加入到100mL YEP培养基中，28℃摇床振荡培养过夜，待菌液颜色呈浑浊橘黄色即可用于侵染。

(3)将菌液分装至大离心管中，室温下4000rpm离心10分钟，去掉上清液，用100mL侵染液悬浮菌体。

(4)将拟南芥花序充分浸入侵染液中，上下轻轻晃动花序，以利于侵染液和花序的充分接触。侵染时间一般为1分钟。将侵染后的拟南芥植株平放在一个干净的培养盆中。侵染完成后，在培养盆外面罩上黑色塑料袋以避光。在温室放置24小时后将植物取出重新放回原来的培养盆中继续培养，等待收种。如果侵染的植株在生长一个星期后再次生长出很多花苞，可以侵染第二次。

拟南芥侵染液配方如下：

用1M KOH调pH值至5.7左右。

转基因植物的筛选：

(1)侵染植株收取的种子为T0代，种子经过表面消毒处理后铺到加有潮霉素的1/2MS固体培养基上。种子可以适当铺得密一些。光照培养10天左右，即可分辨出抗性植株。含有抗性的植株一般子叶较大，主根较长，将抗性植株移栽到培养土中继续生长，为转基因T1代。

(2)如果转基因花粉有荧光，待T1代植株开花后，需要对植株进行筛选备注，主要看荧光强度怎样，是否为单拷贝***。用于分析的转基因植株荧光不宜过强也不能太弱，荧光太强可能导致花粉败育，太弱不利于观察分析。如果有荧光花粉占到所有花粉数量的一半并且荧光强度大体一致，则可认为是单拷贝转基因***。

(3)等T1代植株种子成熟，需要单株收种，单株收取的种子分别铺在添加有相应抗生素的1/2MS固体培养基上，通过计算植株的抗性分离比确定T1代植株的T-DNA***为单拷贝。

(4)选择荧光适中的单拷贝转基因植株进行分析照相和种子的扩繁。

实施例3转基因拟南芥的荧光观察

待转基因植物开花之后，取花粉进行花粉管萌发和荧光观察。

(1)取新鲜配制的液体花粉萌发培养基10mL于新的刻度离心管中。

(2)称取0.1g低熔点花粉萌发专用琼脂粉，在微波炉中加热使其完全融化，注意不要将培养基煮沸溢出离心管。

(3)用移液枪吸取1.9mL于直径为5.5cm的带盖培养皿中，使其均匀平铺在培养皿的底部，开盖冷却几分钟，使其凝固。

(4)用授粉专用的镊子取当天开放最好的花，去掉雌蕊后，轻轻地将花粉涂到培养基的表面，注意涂抹均匀，并且不要戳破培养基。

(5)取直径为10cm的有盖培养皿，在皿底加滤纸并且用水浸湿做成湿盒。将涂有花粉的培养皿去盖后放在滤纸上，盖上大培养皿的盖保湿。置于28℃恒温培养箱中，避光培养4h。

(6)用液体的花粉萌发培养基制片，用显微镜观察，采集图片。注意制片所用的液体花粉萌发培养基要提前从4℃冰箱中取出，以免温度过低导致花粉管破裂，影响观察照相。

拟南芥花粉体外萌发培养基配方如下：

用1M KOH调pH至7.0后放于4℃冰箱保存待用。

荧光标记的材料观察所用的显微镜为LSM880(Zeiss)以及TCS SP5(Leica)显微镜进行观察。GFP、YFP的激发光波长为488nm，接受光波长范围是505-550nm，RFP激发光波长为561nm，接受光波长范围为575-650nm。荧光双标记观察的光路设置为双通道，线性扫描方式。分辨率是1024′1024。针孔大小设置为1个单位。

观察后获得的图片分别用LSM(Zeiss)和TCS(Leica)的软件输出。Z-stack图像的三维重构用软件Imaris7.0进行处理。最终图像用Adobe Photoshope CS3处理。

为了确定INT1在花粉管中显示的荧光结构就是液泡，将本载体转化引入拟南芥棕榈酰转移酶PAT10连接GFP的转基因材料，观察发现红色荧光与绿色荧光叠加呈黄色(图3)，说明两种蛋白完全共定位，已知PAT10定位于液泡膜，所以可以确定RFP-INT1定位于液泡膜。

序列表

<110> 江苏师范大学

<120> 一种植物花粉管液泡荧光标记构建方法与应用

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1530

<212> DNA

<213> 拟南芥(Arabidopsis thaliana)

<400> 1

atgacattga cgatcccaaa cgcacctggg agctccgggt acttggatat gttcccagag 60

agaaggatgt cgtattttgg gaattcttac attctgggtt tgactgtcac tgccggaatc 120

ggtggccttc tgttcggtta tgatacaggt gtaatttccg gtgccctttt gtacattaag 180

gatgatttcg aagttgttaa gcagagcagt ttcttacagg aaactattgt aagtatggct 240

ttagttggtg ccatgattgg tgctgcagct ggaggttgga tcaatgacta ctacggtcgt 300

aaaaaggcga ctctttttgc agatgttgtc tttgcagctg gagctatcgt tatggctgct 360

gctcctgatc cgtatgtttt gatatcgggt cgtctcttgg tcggtttagg agttggtgtt 420

gcttctgtga ctgctccggt ttatatagcg gaagcatctc catcggaagt tagaggtgga 480

cttgtgagca ccaacgtatt gatgatcact ggtggacagt ttctttcata tctcgttaat 540

tctgctttca cacaggttcc aggaacatgg agatggatgc ttggtgtttc aggcgttccc 600

gctgtgattc agttcatcct catgcttttc atgccagaat cccctcgatg gcttttcatg 660

aaaaatcgta aagcggaagc catccaagtg ctcgccagaa cctatgacat ctcgcggtta 720

gaagacgaga ttgatcatct ttcagcggct gaagaggaag aaaaacaaag gaagcgcact 780

gttggctact tggatgtttt cagatccaaa gaattgagac ttgcatttct tgccggagca 840

ggacttcagg cgtttcagca gttcactggt atcaatacag ttatgtacta cagccctacg 900

atagtccaaa tggctggatt tcactcaaac cagctcgctt tgttcctgtc tctcattgtt 960

gctgccatga atgctgctgg aacagtcgtg gggatttact tcatcgatca ttgtggaagg 1020

aaaaagctag ctctctcaag tttatttggc gtcattatat cactcttaat cctctcagtc 1080

tcgtttttca aacaatctga gacatcatct gatggagggc tctatggttg gctcgctgtg 1140

cttggcttag ctctatacat tgttttcttt gcaccgggaa tgggaccagt cccatggacg 1200

gtgaactcag agatataccc tcaacaatac cgaggcatat gcggaggcat gtcagctaca 1260

gttaactgga tcagcaattt gattgtggca caaacattct tgacaatcgc ggaagctgct 1320

ggaacaggaa tgactttctt gattttggcg ggaattgcgg ttcttgctgt aatctttgtg 1380

attgtgtttg tccctgagac tcaagggcta acgttttcgg aagttgaaca gatttggaaa 1440

gaaagagctt atggaaatat cagtggctgg ggcagtagca gtgatagcaa caacatggaa 1500

gggttactcg agcagggatc tcaatcttaa 1530

<210> 2

<211> 11614

<212> DNA

<213> 载体(Lat52p::RFP-INT1)

<400> 2

cgacgtcgcc gacgtcgcat gcctgcaggt cactggattt tggttttagg aattagaaat 60

tttattgata gaagtatttt acaaatacaa atacatacta agggtttctt atatgctcaa 120

cacatgagcg aaaccctata agaaccctaa ttcccttatc tgggaactac tcacacatta 180

ttctggagaa aaatagagag agatagattt gtagagagag actggtgatt tttgcggact 240

ctagcatggc cgctcccggc cgccatggcc gcgggatatc ttaagattga gatccctgct 300

cgagtaaccc ttccatgttg ttgctatcac tgctactgcc ccagccactg atatttccat 360

aagctctttc tttccaaatc tgttcaactt ccgaaaacgt tagcccttga gtctcaggga 420

caaacacaat cacaaagatt acagcaagaa ccgcaattcc cgccaaaatc aagaaagtca 480

ttcctgttcc agcagcttcc gcgattgtca agaatgtttg tgccacaatc aaattgctga 540

tccagttaac tgtagctgac atgcctccgc atatgcctcg gtattgttga gggtatatct 600

ctgagttcac cgtccatggg actggtccca ttcccggtgc aaagaaaaca atgtatagag 660

ctaagccaag cacagcgagc caaccataga gccctccatc agatgatgtc tcagattgtt 720

tgaaaaacga gactgagagg attaagagtg atataatgac gccaaataaa cttgagagag 780

ctagcttttt ccttccacaa tgatcgatga agtaaatccc cacgactgtt ccagcagcat 840

tcatggcagc aacaatgaga gacaggaaca aagcgagctg gtttgagtga aatccagcca 900

tttggactat cgtagggctg tagtacataa ctgtattgat accagtgaac tgctgaaacg 960

cctgaagtcc tgctccggca agaaatgcaa gtctcaattc tttggatctg aaaacatcca 1020

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caccaactaa agccatactt acaatagttt cctgtaagaa actgctctgc ttaacaactt 1620

cgaaatcatc cttaatgtac aaaagggcac cggaaattac acctgtatca taaccgaaca 1680

gaaggccacc gattccggca gtgacagtca aacccagaat gtaagaattc ccaaaatacg 1740

acatccttct ctctgggaac atatccaagt acccggagct cccaggtgcg tttgggatcg 1800

tcaatgtcat gatatcggcg ccggtggagt ggcggccctc ggcgcgctcg tactgttcca 1860

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tctcaattat tgcaaattct aagccatccc aagttttgag gctaattttt tttactatac 2880

tatttttaca accacaaaaa cataaaaaat aaaaaataaa aaaaataaac cgagtcaatt 2940

gctacaatca cttcattatt aattttaatt aatattatgt ggttatatat gaaactgtta 3000

gagaaataat agctccacca tatttttttc tcaatttatt ttcactataa aaaggctatt 3060

tcattataat caaaactaga gaccatatgg gagagctcaa gcttagcttg agcttggatc 3120

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tttatccgtt cgtccatttg tatgtgcatg ccaaccacag ggttcccctc gggatcaaag 3300

tactttgatc caacccctcc gctgctatag tgcagtcggc ttctgacgtt cagtgcagcc 3360

gtcttctgaa aacgacatgt cgcacaagtc ctaagttacg cgacaggctg ccgccctgcc 3420

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gaaccggaga cattacgcca tgaacaagag cgccgccgct ggcctgctgg gctatgcccg 3540

cgtcagcacc gacgaccagg acttgaccaa ccaacgggcc gaactgcacg cggccggctg 3600

caccaagctg ttttccgaga agatcaccgg caccaggcgc gaccgcccgg agctggccag 3660

gatgcttgac cacctacgcc ctggcgacgt tgtgacagtg accaggctag accgcctggc 3720

ccgcagcacc cgcgacctac tggacattgc cgagcgcatc caggaggccg gcgcgggcct 3780

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cgtgttcgcc ggcattgccg agttcgagcg ttccctaatc atcgaccgca cccggagcgg 3900

gcgcgaggcc gccaaggccc gaggcgtgaa gtttggcccc cgccctaccc tcaccccggc 3960

acagatcgcg cacgcccgcg agctgatcga ccaggaaggc cgcaccgtga aagaggcggc 4020

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cgccctggcg gccgccgaga atgaacgcca agaggaacaa gcatgaaacc gcaccaggac 4200

ggccaggacg aaccgttttt cattaccgaa gagatcgagg cggagatgat cgcggccggg 4260

tacgtgttcg agccgcccgc gcacgtctca accgtgcggc tgcatgaaat cctggccggt 4320

ttgtctgatg ccaagctggc ggcctggccg gccagcttgg ccgctgaaga aaccgagcgc 4380

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tatatgatgc gatgagtaaa taaacaaata cgcaagggga acgcatgaag gttatcgctg 4500

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tgcaactcgc cggggccgat gttctgttag tcgattccga tccccagggc agtgcccgcg 4620

attgggcggc cgtgcgggaa gatcaaccgc taaccgttgt cggcatcgac cgcccgacga 4680

ttgaccgcga cgtgaaggcc atcggccggc gcgacttcgt agtgatcgac ggagcgcccc 4740

aggcggcgga cttggctgtg tccgcgatca aggcagccga cttcgtgctg attccggtgc 4800

agccaagccc ttacgacata tgggccaccg ccgacctggt ggagctggtt aagcagcgca 4860

ttgaggtcac ggatggaagg ctacaagcgg cctttgtcgt gtcgcgggcg atcaaaggca 4920

cgcgcatcgg cggtgaggtt gccgaggcgc tggccgggta cgagctgccc attcttgagt 4980

cccgtatcac gcagcgcgtg agctacccag gcactgccgc cgccggcaca accgttcttg 5040

aatcagaacc cgagggcgac gctgcccgcg aggtccaggc gctggccgct gaaattaaat 5100

caaaactcat ttgagttaat gaggtaaaga gaaaatgagc aaaagcacaa acacgctaag 5160

tgccggccgt ccgagcgcac gcagcagcaa ggctgcaacg ttggccagcc tggcagacac 5220

gccagccatg aagcgggtca actttcagtt gccggcggag gatcacacca agctgaagat 5280

gtacgcggta cgccaaggca agaccattac cgagctgcta tctgaataca tcgcgcagct 5340

accagagtaa atgagcaaat gaataaatga gtagatgaat tttagcggct aaaggaggcg 5400

gcatggaaaa tcaagaacaa ccaggcaccg acgccgtgga atgccccatg tgtggaggaa 5460

cgggcggttg gccaggcgta agcggctggg ttgtctgccg gccctgcaat ggcactggaa 5520

cccccaagcc cgaggaatcg gcgtgacggt cgcaaaccat ccggcccggt acaaatcggc 5580

gcggcgctgg gtgatgacct ggtggagaag ttgaaggccg cgcaggccgc ccagcggcaa 5640

cgcatcgagg cagaagcacg ccccggtgaa tcgtggcaag cggccgctga tcgaatccgc 5700

aaagaatccc ggcaaccgcc ggcagccggt gcgccgtcga ttaggaagcc gcccaagggc 5760

gacgagcaac cagatttttt cgttccgatg ctctatgacg tgggcacccg cgatagtcgc 5820

agcatcatgg acgtggccgt tttccgtctg tcgaagcgtg accgacgagc tggcgaggtg 5880

atccgctacg agcttccaga cgggcacgta gaggtttccg cagggccggc cggcatggcc 5940

agtgtgtggg attacgacct ggtactgatg gcggtttccc atctaaccga atccatgaac 6000

cgataccggg aagggaaggg agacaagccc ggccgcgtgt tccgtccaca cgttgcggac 6060

gtactcaagt tctgccggcg agccgatggc ggaaagcaga aagacgacct ggtagaaacc 6120

tgcattcggt taaacaccac gcacgttgcc atgcagcgta cgaagaaggc caagaacggc 6180

cgcctggtga cggtatccga gggtgaagcc ttgattagcc gctacaagat cgtaaagagc 6240

gaaaccgggc ggccggagta catcgagatc gagctagctg attggatgta ccgcgagatc 6300

acagaaggca agaacccgga cgtgctgacg gttcaccccg attacttttt gatcgatccc 6360

ggcatcggcc gttttctcta ccgcctggca cgccgcgccg caggcaaggc agaagccaga 6420

tggttgttca agacgatcta cgaacgcagt ggcagcgccg gagagttcaa gaagttctgt 6480

ttcaccgtgc gcaagctgat cgggtcaaat gacctgccgg agtacgattt gaaggaggag 6540

gcggggcagg ctggcccgat cctagtcatg cgctaccgca acctgatcga gggcgaagca 6600

tccgccggtt cctaatgtac ggagcagatg ctagggcaaa ttgccctagc aggggaaaaa 6660

ggtcgaaaag gtctctttcc tgtggatagc acgtacattg ggaacccaaa gccgtacatt 6720

gggaaccgga acccgtacat tgggaaccca aagccgtaca ttgggaaccg gtcacacatg 6780

taagtgactg atataaaaga gaaaaaaggc gatttttccg cctaaaactc tttaaaactt 6840

attaaaactc ttaaaacccg cctggcctgt gcataactgt ctggccagcg cacagccgaa 6900

gagctgcaaa aagcgcctac ccttcggtcg ctgcgctccc tacgccccgc cgcttcgcgt 6960

cggcctatcg cggccgctgg ccgctcaaaa atggctggcc tacggccagg caatctacca 7020

gggcgcggac aagccgcgcc gtcgccactc gaccgccggc gcccacatca aggcaccctg 7080

cctcgcgcgt ttcggtgatg acggtgaaaa cctctgacac atgcagctcc cggagacggt 7140

cacagcttgt ctgtaagcgg atgccgggag cagacaagcc cgtcagggcg cgtcagcggg 7200

tgttggcggg tgtcggggcg cagccatgac ccagtcacgt agcgatagcg gagtgtatac 7260

tggcttaact atgcggcatc agagcagatt gtactgagag tgcaccatat gcggtgtgaa 7320

ataccgcaca gatgcgtaag gagaaaatac cgcatcaggc gctcttccgc ttcctcgctc 7380

actgactcgc tgcgctcggt cgttcggctg cggcgagcgg tatcagctca ctcaaaggcg 7440

gtaatacggt tatccacaga atcaggggat aacgcaggaa agaacatgtg agcaaaaggc 7500

cagcaaaagg ccaggaaccg taaaaaggcc gcgttgctgg cgtttttcca taggctccgc 7560

ccccctgacg agcatcacaa aaatcgacgc tcaagtcaga ggtggcgaaa cccgacagga 7620

ctataaagat accaggcgtt tccccctgga agctccctcg tgcgctctcc tgttccgacc 7680

ctgccgctta ccggatacct gtccgccttt ctcccttcgg gaagcgtggc gctttctcat 7740

agctcacgct gtaggtatct cagttcggtg taggtcgttc gctccaagct gggctgtgtg 7800

cacgaacccc ccgttcagcc cgaccgctgc gccttatccg gtaactatcg tcttgagtcc 7860

aacccggtaa gacacgactt atcgccactg gcagcagcca ctggtaacag gattagcaga 7920

gcgaggtatg taggcggtgc tacagagttc ttgaagtggt ggcctaacta cggctacact 7980

agaaggacag tatttggtat ctgcgctctg ctgaagccag ttaccttcgg aaaaagagtt 8040

ggtagctctt gatccggcaa acaaaccacc gctggtagcg gtggtttttt tgtttgcaag 8100

cagcagatta cgcgcagaaa aaaaggatct caagaagatc ctttgatctt ttctacgggg 8160

tctgacgctc agtggaacga aaactcacgt taagggattt tggtcatgca tgatatatct 8220

cccaatttgt gtagggctta ttatgcacgc ttaaaaataa taaaagcaga cttgacctga 8280

tagtttggct gtgagcaatt atgtgcttag tgcatctaat cgcttgagtt aacgccggcg 8340

aagcggcgtc ggcttgaacg aatttctagc tagacattat ttgccgacta ccttggtgat 8400

ctcgcctttc acgtagtgga caaattcttc caactgatct gcgcgcgagg ccaagcgatc 8460

ttcttcttgt ccaagataag cctgtctagc ttcaagtatg acgggctgat actgggccgg 8520

caggcgctcc attgcccagt cggcagcgac atccttcggc gcgattttgc cggttactgc 8580

gctgtaccaa atgcgggaca acgtaagcac tacatttcgc tcatcgccag cccagtcggg 8640

cggcgagttc catagcgtta aggtttcatt tagcgcctca aatagatcct gttcaggaac 8700

cggatcaaag agttcctccg ccgctggacc taccaaggca acgctatgtt ctcttgcttt 8760

tgtcagcaag atagccagat caatgtcgat cgtggctggc tcgaagatac ctgcaagaat 8820

gtcattgcgc tgccattctc caaattgcag ttcgcgctta gctggataac gccacggaat 8880

gatgtcgtcg tgcacaacaa tggtgacttc tacagcgcgg agaatctcgc tctctccagg 8940

ggaagccgaa gtttccaaaa ggtcgttgat caaagctcgc cgcgttgttt catcaagcct 9000

tacggtcacc gtaaccagca aatcaatatc actgtgtggc ttcaggccgc catccactgc 9060

ggagccgtac aaatgtacgg ccagcaacgt cggttcgaga tggcgctcga tgacgccaac 9120

tacctctgat agttgagtcg atacttcggc gatcaccgct tcccccatga tgtttaactt 9180

tgttttaggg cgactgccct gctgcgtaac atcgttgctg ctccataaca tcaaacatcg 9240

acccacggcg taacgcgctt gctgcttgga tgcccgaggc atagactgta ccccaaaaaa 9300

acatgtcata acaagaagcc atgaaaaccg ccactgcgcc gttaccaccg ctgcgttcgg 9360

tcaaggttct ggaccagttg cgtgacggca gttacgctac ttgcattaca gcttacgaac 9420

cgaacgaggc ttatgtccac tgggttcgtg cccgaattga tcacaggcag caacgctctg 9480

tcatcgttac aatcaacatg ctaccctccg cgagatcatc cgtgtttcaa acccggcagc 9540

ttagttgccg ttcttccgaa tagcatcggt aacatgagca aagtctgccg ccttacaacg 9600

gctctcccgc tgacgccgtc ccggactgat gggctgcctg tatcgagtgg tgattttgtg 9660

ccgagctgcc ggtcggggag ctgttggctg gctggtggca ggatatattg tggtgtaaac 9720

aaattgacgc ttagacaact taataacaca ttgcggacgt ttttaatgta ctgaattaac 9780

gccgaattga attatcagct tgcatgccgg tcgatctagt aacatagatg acaccgcgcg 9840

cgataattta tcctagtttg cgcgctatat tttgttttct atcgcgtatt aaatgtataa 9900

ttgcgggact ctaatcataa aaacccatct cataaataac gtcatgcatt acatgttaat 9960

tattacatgc ttaacgtaat tcaacagaaa ttatatgata atcatcgcaa gaccggcaac 10020

aggattcaat cttaagaaac tttattgcca aatgtttgaa cgatctgctt gactctaggg 10080

aattaattcc tgaatcactg cgaccggccc tcccgcgacc cagccgagcg agcttagcga 10140

actgtggacg agaactgtgc caccaagcgt aaggccgttc tctcgcattt gccttgctag 10200

gctcgcgcga gttgctggct gaggcgttct cgaaatcagc tcttgttcgg tcggcatcta 10260

ctctattcct ttgccctcgg acgagtgctg gggcgtcggt ttccactatc ggcgagtact 10320

tctacacagc catcggtcca gacggccgcg cttctgcggg cgatttgtgt acgcccgaca 10380

gtcccggctc cggatcggac gattgcgtcg catcgaccct gcgcccaagc tgcatcatcg 10440

aaattgccgt caaccaagct ctgatagagt tggtcaagac caatgcggag catatacgcc 10500

cggagccttg gcgatcctgc aagctccgga tgcctccgct cgaagtagcg cgtctgctgc 10560

tccatacaag ccaaccacgg cctccagaag aagatgttgg cgacctcgta ttgggaatcc 10620

ccgaacatcg cctcgctcca gtcaatgacc gctgttatgc ggccattgtc cgtcaggaca 10680

ttgttggagc cgaatccgcg tgcacgagtg ccggacttcg gggcagtcct cgcccaaagc 10740

atcagctcat cgagagcctg cgcgacggac gcactgacgg tgtcgtccat cacagtttgc 10800

cagtgataca catggggatc agcaatcgcg catatgaaat cacgccatgt agtgtattga 10860

ccgattcctt gcggtccgaa tgggccgaac ccgctcgtct ggctaagatc ggccgcagcg 10920

atagcatcca tagcctccgc gaccggctga agaacagcgg gcagttcggt ttcaggcagg 10980

tcttgcaacg tgacaccctg tgcacggcgg gagatgcaat aggtcaggct ctcgctgaac 11040

tccccaatgt caagcacttc cggaatcggg agcgcggccg atgcaaagtg ccgataaaca 11100

taacgatctt tgtagaaacc atcggcgcag ctatttaccc gcaggacata tccacgccct 11160

cctacatcga agctgaaagc acgagattct tcgccctccg agagctgcat caggtcggag 11220

acgctgtcga acttttcgat cagaaacttc tcgacagacg tcgcggtgag ttcaggcttt 11280

ttcatagggg ggattcgagt tgagagtgaa tatgagactc taattggata ccgaggggaa 11340

tttatggaac gtcagtggag catttttgac aagaaatatt tgctagctga tagtgacctt 11400

aggcgacttt tgaacgcgca ataatggttt ctgacgtatg tgcttagctc attaaactcc 11460

agaaacccgc ggctcagtgg ctccttcaac gttgcggttc tgtcagttcc aaacgtaaaa 11520

cggcttgtcc cgcgtcatcg gcggggtcat aacgtgactc ccttaattct catgtatgat 11580

aattcgaggg tacccgggga tcctctagag ggcc 11614

<210> 3

<211> 509

<212> PRT

<213> 拟南芥(Arabidopsis thaliana)

<400> 3

Met Thr Leu Thr Ile Pro Asn Ala Pro Gly Ser Ser Gly Tyr Leu Asp

1 5 10 15

Met Phe Pro Glu Arg Arg Met Ser Tyr Phe Gly Asn Ser Tyr Ile Leu

20 25 30

Gly Leu Thr Val Thr Ala Gly Ile Gly Gly Leu Leu Phe Gly Tyr Asp

35 40 45

Thr Gly Val Ile Ser Gly Ala Leu Leu Tyr Ile Lys Asp Asp Phe Glu

50 55 60

Val Val Lys Gln Ser Ser Phe Leu Gln Glu Thr Ile Val Ser Met Ala

65 70 75 80

Leu Val Gly Ala Met Ile Gly Ala Ala Ala Gly Gly Trp Ile Asn Asp

85 90 95

Tyr Tyr Gly Arg Lys Lys Ala Thr Leu Phe Ala Asp Val Val Phe Ala

100 105 110

Ala Gly Ala Ile Val Met Ala Ala Ala Pro Asp Pro Tyr Val Leu Ile

115 120 125

Ser Gly Arg Leu Leu Val Gly Leu Gly Val Gly Val Ala Ser Val Thr

130 135 140

Ala Pro Val Tyr Ile Ala Glu Ala Ser Pro Ser Glu Val Arg Gly Gly

145 150 155 160

Leu Val Ser Thr Asn Val Leu Met Ile Thr Gly Gly Gln Phe Leu Ser

165 170 175

Tyr Leu Val Asn Ser Ala Phe Thr Gln Val Pro Gly Thr Trp Arg Trp

180 185 190

Met Leu Gly Val Ser Gly Val Pro Ala Val Ile Gln Phe Ile Leu Met

195 200 205

Leu Phe Met Pro Glu Ser Pro Arg Trp Leu Phe Met Lys Asn Arg Lys

210 215 220

Ala Glu Ala Ile Gln Val Leu Ala Arg Thr Tyr Asp Ile Ser Arg Leu

225 230 235 240

Glu Asp Glu Ile Asp His Leu Ser Ala Ala Glu Glu Glu Glu Lys Gln

245 250 255

Arg Lys Arg Thr Val Gly Tyr Leu Asp Val Phe Arg Ser Lys Glu Leu

260 265 270

Arg Leu Ala Phe Leu Ala Gly Ala Gly Leu Gln Ala Phe Gln Gln Phe

275 280 285

Thr Gly Ile Asn Thr Val Met Tyr Tyr Ser Pro Thr Ile Val Gln Met

290 295 300

Ala Gly Phe His Ser Asn Gln Leu Ala Leu Phe Leu Ser Leu Ile Val

305 310 315 320

Ala Ala Met Asn Ala Ala Gly Thr Val Val Gly Ile Tyr Phe Ile Asp

325 330 335

His Cys Gly Arg Lys Lys Leu Ala Leu Ser Ser Leu Phe Gly Val Ile

340 345 350

Ile Ser Leu Leu Ile Leu Ser Val Ser Phe Phe Lys Gln Ser Glu Thr

355 360 365

Ser Ser Asp Gly Gly Leu Tyr Gly Trp Leu Ala Val Leu Gly Leu Ala

370 375 380

Leu Tyr Ile Val Phe Phe Ala Pro Gly Met Gly Pro Val Pro Trp Thr

385 390 395 400

Val Asn Ser Glu Ile Tyr Pro Gln Gln Tyr Arg Gly Ile Cys Gly Gly

405 410 415

Met Ser Ala Thr Val Asn Trp Ile Ser Asn Leu Ile Val Ala Gln Thr

420 425 430

Phe Leu Thr Ile Ala Glu Ala Ala Gly Thr Gly Met Thr Phe Leu Ile

435 440 445

Leu Ala Gly Ile Ala Val Leu Ala Val Ile Phe Val Ile Val Phe Val

450 455 460

Pro Glu Thr Gln Gly Leu Thr Phe Ser Glu Val Glu Gln Ile Trp Lys

465 470 475 480

Glu Arg Ala Tyr Gly Asn Ile Ser Gly Trp Gly Ser Ser Ser Asp Ser

485 490 495

Asn Asn Met Glu Gly Leu Leu Glu Gln Gly Ser Gln Ser

500 505

Claims (5)

1.一种植物花粉管液泡荧光标记构建方法，其特征在于，包括：

克隆肌醇转运蛋白基因AT2G43330 INT1的CDS序列，其序列如SEQ ID No.1所示，或该序列经替换、缺失或添加一个或几个碱基形成的具有同等功能的核苷酸序列；将INT1连接进入花粉管特异启动子启动红色荧光蛋白RFP的Gateway表达载体，通过所述载体在植物花粉中表达融合蛋白RFP-INT1，其中，RFP为红色荧光蛋白，INT1为拟南芥AT2G43330编码的氨基酸序列；转化植物，筛选，鉴定，获得具有荧光信号的转基因植物。

2.权利要求1中的所述载体。

3.含有权利要求2中所述载体的工程菌。

4.含有权利要求2中所述载体的转基因植物或细胞。

5.权利要求2中的所述载体在显示植物花粉液泡动态或检测花粉活力中的应用。

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