CN112852705B - 一种用于单细胞配对的双液核水凝胶微囊制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种用于单细胞配对的双液核水凝胶微囊制备方法。该方法包括微流控芯片的制备、体系材料的选择、双液核水凝胶微囊合成及细胞配对、细胞的3D培养等。本发明利用微流控技术一部步形成负载细胞的双液核水凝胶微囊，体系简单、灵活、生物相容性好，基于双水相体系良好的生物相容性及微流控技术的精确可控性，该方法在体外3D组织构建方面具有极大的应用价值。

Description

一种用于单细胞配对的双液核水凝胶微囊制备方法
技术领域
本发明涉及微流控技术、生物材料、组织工程等领域，具体涉及一种用于单细胞配对的双液核水凝胶微囊制备方法。
背景技术
人体组织是由不同的种类的细胞组成的，细胞间以直接或者间接接触的方式组装和相互作用，以实现组织特有的功能。细胞之间通过生化信号来调节彼此的行为，对于体外共培养不同种类细胞，探究细胞间的信号通路及相互作用是一大热点。传统的块状水凝胶共培养方法即将不同种类的细胞直接共混或者是空间组装的方式集中在块状水凝胶材料中，这种方式不能实现不同的细胞的精确控制和组装，在小尺度上很难构建复杂的组织结构，对于细胞间相互作用信号通路的研究存在局限性。
微流控技术以其独特的优势(体积小、精确可控)在组织工程领域占据优势。通过微流控芯片设计，可实现细胞间分区化，利用微流体可模拟体内血液流体循环的操作等来模拟细胞微环境。多液核水凝胶是研究不同类型细胞配对的一种方式。因水凝胶固有的微孔隙、生物相容性以及与天然细胞外基质的相似性质，使它们能够通过生物物理和生物化学信号线索调控细胞行为。多液核水凝胶微囊的制备方法为乳化聚合的方式，涉及溶剂挥发和温度调控等严酷的凝胶化过程，这就降低了细胞的生物活性，不同细胞间的配对的效率和精度度，组装细胞在单细胞水平上的差异。一种能够以可控和生物相容的方式实现单细胞封装和配对的技术，对于研究细胞间的调控信号线索具有很高的价值。
发明内容
本发明的目的在于提供一种基于双水相体系结合微流控技术制备双液核水凝胶微囊的平台，致力于发展一种用于单细胞配对的双液核水凝胶微囊制备方法。
本发明一种用于单细胞配对的双液核水凝胶微囊制备方法，所形成多液核水凝胶微囊的核均为水溶液，壳为水凝胶。
一种用于单细胞配对的双液核水凝胶微囊制备方法，本方法采用微流控技术和双水相体系，通过微流控芯片的制备、体系材料的选择、双液核水凝胶微囊合成及细胞配对步骤，一步形成负载细胞的双液核水凝胶微囊；其中所形成双液核水凝胶微囊的核均为水溶液，壳为水凝胶。
微流控芯片的制备具体如下：
该芯片利用常规软光刻的方法制成，由芯片上层、芯片中间层和芯片下层键合而成的三层PDMS芯片；其中，所述芯片上层主要由核流体入口3，壳流体入口2，连续相入口1，核流体分流口4，壳流体分流口5组成；芯片中间层主要由连续相入口6，连续相通道11，核流体入口9，壳流体入口7，核通道10，壳通道8，层流通道12，主通道13和反应通道14，流体出口15组成；芯片下层是没有结构的白板；
所述芯片上层的核流体分流口4与芯片中间层的核流体入口9相通；
所述芯片上层的壳流体分流口5与芯片中间层的壳流体入口7相通；
所述芯片上层的连续相入口1与芯片中间层的连续相入口6相通。
核流体从核流体入口3分别通过核流体分流口4进入核流体入口9，经过核通道10流入层流通道12；壳流体从壳流体入口2分别通过壳流体分流口5，经过芯片中间层的壳流体入口7，进入壳通道8，最终流入层流通道12；连续流从连续相入口1通过中间层连续相入口6经连续相通道11流入主通道13；核流体，壳流体，连续流体最终均通过通道13和反应通道14，制备的双液核水凝胶微囊从流体出口15流出并收集。
所述双水相体系的构建如下：
选用生物相容性较好的双水相体系葡聚糖(Dex)和聚乙二醇(PEG)；其中，所述PEG分子量范围：8-20kDa、浓度范围：10-50％；Dex分子量范围： 70k-500kDa、浓度范围：10-35％。
所述双液核水凝胶微囊制备时，在壳流体中加入水凝胶预聚体、乙二胺四乙酸钙二钠(Ca-EDTA)、连续相油；内交联的方式形成的CaA需要在油中加入冰醋酸(HAc)，HAc在油中扩散进入壳中将释放Ca-EDTA中的钙离子，实现钙离子与NaA反应，最终形成CaA水凝胶微囊。
所述水凝胶预聚体为海藻素钠(NaA)；
所述连续相为矿物油、醋酸(HAc)和司班80(Span 80)的混合物。
所述NaA浓度范围：0.1-2％，Ca-EDTA使用的浓度范围：0.5-2.5％，HAc的浓度范围0.05-0.25％，Span 80浓度范围为1％-5％。
所述双液核水凝胶微囊合成及细胞配对具体如下：
核流体为葡聚糖(Dex)；壳流体为PEG、NaA、Ca-EDTA的混合物；连续相流体为矿物油、Span 80、HAc的混合物；人肝癌细胞(HepG2细胞)和人脐静脉内皮细胞(HUVEC细胞)经消化后，分别用核流体重悬并充分混匀后，分别通过核流体入口3的两个入口进入芯片通道，壳流体从壳流体入口7进入芯片通道，连续相流体从连续相入口1通入微流控芯片，核流体和壳流体在层流通道 12处会形成稳定的双水相层流，之后通过主通道13被连续相截断形成稳定的含有细胞的液滴，在反应通道14中壳会交联形成CaA水凝胶，最终从出口处15可收集到含有两个液腔的水凝胶微囊，其中液腔中含有细胞，得到负载细胞的双液核水凝胶微囊。
核流体中细胞密度范围为102-1010个/ml，核流速范围：0.01-2.0μL/min,壳流速范围：1-10μL/min；连续相流速范围：10-60μL/min。
水凝胶微囊为双液核结构，可进行单个液核负载单细胞的操作，也可以实现双液核的分区域同时负载，实现单细胞配对。
所述芯片层流通道12宽度为100-600μm，高为100-500cm；主通道13宽度为 100-500μm，高为50-500cm；核通道10与壳通道8宽度为20-200μm，高为20-200μm；连续相通道11宽度为100-400μm，高为50-300cm。
水凝胶预聚体材料是可快速交联的物质，为海藻酸钠(NaA)。
进行负载的细胞包括有肿瘤细胞、ips来源的细胞、内皮细胞。为了产生双液核水凝胶微囊，需要在壳流体中加入水凝胶预聚体，可选用海藻素钠(NaA)，为使得水凝胶能固化需要加入乙二胺四乙酸钙二钠(Ca-EDTA)提供钙离子，由于双液核水凝胶微囊的形成主要基于Dex和PEG双水相的相分离原理，对于液滴的形成需要借助连续相油来实现，可选用矿物油和表面活性剂Span 80来将双水截断形成液滴，此外，内交联的方式形成的CaA需要在油中加入冰醋酸(HAc)来提供酸性条件，HAc油中扩散进入壳中将释放Ca-EDTA中的钙离子，实现钙离子与NaA反应，最终形成CaA水凝胶微囊。
水凝胶微囊为双液核结构，可进行单个液核单个细胞负载的操作，也可以实现双液核的单细胞配对。
细胞的3D培养：经过上述步骤制备负载细胞的双液核水凝胶微囊经过离心 (离心速率300-800rpm)收集后转移到培养基中；即可在常规细胞培养条件下进行培养，每天换液，保证细胞营养，期间可以进行相关生物学表征。
所述芯片层流通道宽度100-600μm，高100-500cm；主通道宽度100-500μm，高50-500cm，核、壳通道宽度20-200μm，高20-200μm，连续相通道宽度100-400μm，高50-300cm。
壳使用的水凝胶材料是可快速交联的物质；具体为海藻酸钠(NaA)、明胶甲基丙烯酰胺(GelMA)、聚乙二醇双丙烯酸酯(PEGDA)；进行负载的细胞包括有肿瘤细胞、ips来源的细胞、内皮细胞等。
本发明利用生物相容性较好的微流控双水相材料可控制备双液核水凝胶微囊，并用于单细胞配对，基于双水相良好的生物相容性和微流控技术的精准确调控，该方法在体外细胞微载体制备、体外为组织构建、体外单细胞配对等方面具有极大的应用价值。
附图说明
图1是制备双液核水凝胶微囊芯片示意图。
其中1为上层连续相入口，2壳流体入口，3核流体入口，4核流体分流口，5 壳流体分流口，6中间层连续相入口，7中间层壳流体入口，8壳通道，9中间层核流体入口，10核通道，11连续相通道，12层流通道，13主通道，14反应通道， 15流体出口。
图2是实施例1中双液核水凝胶微囊单细胞配对表征结果，其中：a单细胞配对荧光图，b单细胞配对明场图(标尺：100μm)。
图3是实施例2中双液核水凝胶微囊单细胞配对表征结果。
具体实施方式
结合实际需要，一步法制备出负载单细胞的双液核水凝胶微囊。下面结合附图和实施例对本发明作进一步说明。
实施例1
一种用于单细胞配对的双液核水凝胶微囊制备方法，水凝胶微囊为双液核结构，可进行液核细胞的单细胞配对操作，其特征在于所形成多液核水凝胶微囊的核均为水溶液，壳为水凝胶。
一种用于单细胞配对的双液核水凝胶微囊制备方法，包括下列步骤：
(1)微流控芯片的制备:该芯片由三层PDMS芯片(上层、中间层、下层)键合而成的。
主要由上层连续相入口1，壳流体入口2，核流体入口3，核流体分流口4，壳流体分流口5；中间层连续相入口6，中间层壳流体入口7，壳通道8，中间层核流体入口9，核通道10，连续相通道11，层流通道12，主通道13，反应通道14，流体出口15组成；
核流体从核流体入口3分别通过核流体分流口4进入核流体入口9，经过核通道10流入层流通道12；壳流体从壳流体入口2分别通过壳流体分流口5，经过壳通道8流入层流通道12；连续流从连续相入口1通过中间层连续相入口6经连续相通道11流入主通道13；核流体，壳流体，连续流体最终均通过通道13和反应通道14，制备的多液核水凝胶微囊从流体出口15流出并收集。
芯片层流通道宽度100μm，高100cm；主通道宽度120μm，高100cm，核、壳通道宽度30μm，高50μm，连续相通道宽度100μm，高100cm，如图1所示。
(2)体系材料的选择:选用生物相容性较好的双水相体系葡聚糖(Dex)和聚乙二醇(PEG)。PEG分子量：20kDa、浓度：17％；Dex分子量：500kDa、浓度： 15％；
为了产生双液核水凝胶微囊，需要在壳流体中加入水凝胶预聚体，可选用海藻素钠(NaA)，为使得水凝胶能固化需要加入乙二胺四乙酸钙二钠(Ca-EDTA) 提供钙离子，由于双液核水凝胶微囊的形成主要基于Dex和PEG双水相的相分离原理，对于液滴的形成需要借助连续相油来实现，可选用矿物油和表面活性剂 Span 80来将双水截断形成液滴，此外，内交联的方式形成的CaA需要在油中加入冰醋酸(HAc)来提供酸性条件，HAc油中扩散进入壳中将释放Ca-EDTA中的钙离子，实现钙离子与NaA反应，最终形成CaA水凝胶微囊。
所述NaA浓度：1％，Ca-EDTA使用的浓度：1％，HAc的浓度：0.15％，Span 80浓度：2％。
(3)双液核水凝胶微囊合成及细胞配对:核流体成分为Dex，壳流体成分为PEG、NaA、Ca-EDTA，连续相流体成分为矿物油、Span 80、HAc；细胞消化前先用红色和绿色细胞膜染料分别给细胞上色，以示区分，细胞经消化后，细胞经消化后，HepG2和HUVEC细胞经消化后，分别用核流体重悬并充分混匀后，分别通过核流体入口(3)的两个入口进入芯片通道，壳流体从壳流体入口(7)进入芯片通道，连续相流体从连续相入口(1)通入微流控芯片，核流体和壳流体在层流通道(12)处会形成稳定的双水相层流，之后通过主通道(13)被连续相截断形成稳定的含有细胞的液滴，在反应通道(14)中壳会交联形成CaA水凝胶，最终从出口处(15)可收集到含有两个液腔的水凝胶微囊。
核流体中负载的细胞为HepG2细胞，细胞密度为105个/ml，核流体中负载的细胞为HUVEC细胞，细胞密度为105个/ml，核流速：0.3μL/min,壳流速：6μL/min，连续相流：20μL/min；
(4)细胞的3D培养：经过上述步骤制备负载细胞的双液核水凝胶微囊经过离心(离心速率300-800rpm)收集后转移到培养基中；即可在常规细胞培养条件下进行培养，每天换液，保证细胞营养，期间可以进行相关生物学表征，如图2所示，a一个液核负载单个HepG2细胞，一个液核负载HUVEC细胞的荧光图，b一个液核负载单个HepG2细胞，一个液核负载HUVEC细胞的明场图。
实施例2
一种用于单细胞配对的双液核水凝胶微囊制备方法，水凝胶微囊为双液核结构，可进行液核细胞的单细胞配对操作，其特征在于所形成多液核水凝胶微囊的核均为水溶液，壳为水凝胶。
一种用于单细胞配对的双液核水凝胶微囊制备方法，包括下列步骤：
(1)微流控芯片的制备:该芯片由三层PDMS芯片(上层、中间层、下层)键合而成的，上层采用了分流的设计，由简避繁，避免了多个泵装置同时使用的局限。
主要由上层连续相入口1，壳流体入口2，核流体入口3，核流体分流口4，壳流体分流口5；中间层连续相入口6，中间层壳流体入口7，壳通道8，中间层核流体入口9，核通道10，连续相通道11，层流通道12，主通道13，反应通道14，流体出口15组成；
核流体从核流体入口3分别通过核流体分流口4进入核流体入口9，经过核通道10流入层流通道12；壳流体从壳流体入口2分别通过壳流体分流口5，经过壳通道8流入层流通道12；连续流从连续相入口1通过中间层连续相入口6经连续相通道11流入主通道13；核流体，壳流体，连续流体最终均通过通道13和反应通道14，制备的多液核水凝胶微囊从流体出口15流出并收集。
芯片层流通道宽度100μm，高100cm；主通道宽度120μm，高100cm，核、壳通道宽度30μm，高50μm，连续相通道宽度100μm，高100cm，如图1所示。
(2)体系材料的选择:选用生物相容性较好的双水相体系葡聚糖(Dex)和聚乙二醇(PEG)。PEG分子量：20kDa、浓度：17％；Dex分子量：500kDa、浓度： 15％；
为了产生双液核水凝胶微囊，需要在壳流体中加入水凝胶预聚体，可选用海藻素钠(NaA)，为使得水凝胶能固化需要加入乙二胺四乙酸钙二钠(Ca-EDTA) 提供钙离子，由于双液核水凝胶微囊的形成主要基于Dex和PEG双水相的相分离原理，对于液滴的形成需要借助连续相油来实现，可选用矿物油和表面活性剂 Span 80来将双水截断形成液滴，此外，内交联的方式形成的CaA需要在油中加入冰醋酸(HAc)来提供酸性条件，HAc油中扩散进入壳中将释放Ca-EDTA中的钙离子，实现钙离子与NaA反应，最终形成CaA水凝胶微囊。
所述NaA浓度：1％，Ca-EDTA使用的浓度：1％，HAc的浓度：0.15％，Span 80浓度：2％。
(3)双液核水凝胶微囊合成及细胞配对:核流体成分为Dex，壳流体成分为PEG、NaA、Ca-EDTA，连续相流体成分为矿物油、Span 80、HAc；细胞消化前先用红色和绿色细胞膜染料分别给细胞上色，以示区分，细胞经消化后，细胞经消化后，HepG2和HUVEC细胞经消化后，分别用核流体重悬并充分混匀后，分别通过核流体入口(3)的两个入口进入芯片通道，壳流体从壳流体入口(7)进入芯片通道，连续相流体从连续相入口(1)通入微流控芯片，核流体和壳流体在层流通道(12)处会形成稳定的双水相层流，之后通过主通道(13)被连续相截断形成稳定的含有细胞的液滴，在反应通道(14)中壳会交联形成CaA水凝胶，最终从出口处(15)可收集到含有两个液腔的水凝胶微囊。
核流体中负载的细胞为HepG2细胞，细胞密度为105个/ml，核流体中负载的细胞为HUVEC细胞，细胞密度为105个/ml，核流速：0.3μL/min,壳流速：6μL/min，连续相流：20μL/min；
(4)细胞的3D培养：经过上述步骤制备负载细胞的双液核水凝胶微囊经过离心(离心速率300-800rpm)收集后转移到培养基中；即可在常规细胞培养条件下进行培养，每天换液，保证细胞营养，期间可以进行相关生物学表征，如图3 所示，每个液核细胞的分布统计图。

Claims (7)

1.一种用于单细胞配对的双液核水凝胶微囊制备方法，其特征在于：本方法采用微流控技术和双水相体系，通过微流控芯片的制备、体系材料的选择、双液核水凝胶微囊合成及细胞配对步骤，一步形成负载细胞的双液核水凝胶微囊；其中所形成双液核水凝胶微囊的核均为水溶液，壳为水凝胶；
微流控芯片的制备具体如下：
该芯片利用常规软光刻的方法制成，由芯片上层、芯片中间层和芯片下层键合而成的三层PDMS芯片；其中，所述芯片上层主要由核流体入口（3），壳流体入口（2），连续相入口（1），核流体分流口（4），壳流体分流口（5）组成；芯片中间层主要由连续相入口（6），连续相通道（11），核流体入口（9），壳流体入口（7），核通道（10），壳通道（8），层流通道（12），主通道（13）和反应通道（14），流体出口（15）组成；芯片下层是没有结构的白板；
所述芯片上层的核流体分流口（4）与芯片中间层的核流体入口（9）相通；
所述芯片上层的壳流体分流口（5）与芯片中间层的壳流体入口（7）相通；
所述芯片上层的连续相入口（1）与芯片中间层的连续相入口（6）相通；核流体从核流体入口（3）分别通过核流体分流口（4）进入核流体入口（9），经过核通道（10）流入层流通道（12）；壳流体从壳流体入口（2）分别通过壳流体分流口（5），经过芯片中间层的壳流体入口（7），进入壳通道（8），最终流入层流通道（12）；连续流从连续相入口（1）通过中间层连续相入口（6）经连续相通道（11）流入主通道（13）；核流体，壳流体，连续流体最终均通过通道（13）和反应通道（14），制备的双液核水凝胶微囊从流体出口（15）流出并收集；选用生物相容性较好的双水相体系葡聚糖（Dex）和聚乙二醇（PEG）；
所述双液核水凝胶微囊制备时，在壳流体中加入水凝胶预聚体、乙二胺四乙酸钙二钠（Ca-EDTA）、连续相油；所述水凝胶微胶囊为海藻酸钙水凝胶微胶囊，需要在油中加入冰醋酸（HAc），HAc在油中扩散进入壳中将释放Ca-EDTA中的钙离子，实现钙离子与海藻酸钠反应，最终形成CaA水凝胶微囊；
所述水凝胶预聚体为海藻酸钠；
所述连续相为矿物油、醋酸（HAc）和司班80（Span 80）的混合物。
2.根据权利要求1所述的一种用于单细胞配对的双液核水凝胶微囊制备方法，其特征在于：所述双水相体系的构建如下：
其中，所述PEG分子量范围：8-20 kDa、浓度范围：10-50%；Dex分子量范围：70k-500kDa、浓度范围：10-35%。
3.根据权利要求1所述的一种用于单细胞配对的双液核水凝胶微囊制备方法，其特征在于：所述NaA浓度范围：0.1-2%，Ca-EDTA使用的浓度范围：0.5-2.5%，HAc的浓度范围0.05-0.25%，Span 80浓度范围为1%-5%。
4.根据权利要求1所述的一种用于单细胞配对的双液核水凝胶微囊制备方法，其特征在于：所述双液核水凝胶微囊合成及细胞配对具体如下：
核流体为葡聚糖（Dex）；壳流体为PEG、NaA、Ca-EDTA的混合物；连续相流体为矿物油、Span 80、HAc的混合物；人肝癌细胞（HepG2细胞）和人脐静脉内皮细胞（HUVEC细胞）经消化后，分别用核流体重悬并充分混匀后，分别通过核流体入口（3）的两个入口进入芯片通道，壳流体从壳流体入口（7）进入芯片通道，连续相流体从连续相入口（1）通入微流控芯片，核流体和壳流体在层流通道（12）处会形成稳定的双水相层流，之后通过主通道（13）被连续相截断形成稳定的含有细胞的液滴，在反应通道（14）中壳会交联形成CaA水凝胶，最终从出口处（15）可收集到含有两个液腔的水凝胶微囊，其中液腔中含有细胞，得到负载细胞的双液核水凝胶微囊。
5.根据权利要求1所述的一种用于单细胞配对的双液核水凝胶微囊制备方法，其特征在于：核流体中细胞密度范围为102-1010个/ml，核流速范围：0.01-2.0 µL/min,壳流速范围：1-10 µL/min；连续相流速范围：10-60 µL/min。
6.根据权利要求1所述的一种用于单细胞配对的双液核水凝胶微囊制备方法，其特征在于：水凝胶微囊为双液核结构，可进行单个液核负载单细胞的操作，也可以实现双液核的分区域同时负载，实现单细胞配对。
7.根据权利要求1所述的一种用于单细胞配对的双液核水凝胶微囊制备方法，其特征在于：所述芯片层流通道（12）宽度为100-600μm，高为100-500cm；主通道（13）宽度为100-500μm，高为50-500cm；核通道（10）与壳通道（8）宽度为20-200μm，高为20-200μm；连续相通道（11）宽度为100-400μm，高为50-300cm。
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