CN112852670B - 一种婴儿双歧杆菌dh231及其发酵产物、应用和微生态制剂 - Google Patents

一种婴儿双歧杆菌dh231及其发酵产物、应用和微生态制剂 Download PDF

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Abstract

本发明涉及生物医药领域，特别涉及一种婴儿双歧杆菌DH231及其发酵产物、应用和微生态制剂。该婴儿双歧杆菌的保藏编号为CGMCC No.18372。本发明婴儿双歧杆菌DH231微生态制剂防治自闭症、抗过敏、提高免疫力等疗效显著，相比其他治疗方式见效快，效果好，无不良反应及副作用。可作为药品、兽药和饲料添加剂等应用，社会意义巨大。

Description

一种婴儿双歧杆菌DH231及其发酵产物、应用和微生态制剂
技术领域
本发明涉及生物医药领域，特别涉及一种婴儿双歧杆菌DH231及其发酵产物、应用和微生态制剂。
背景技术
目前，随着生存环境的变化，自闭症、过敏等疾病发病率逐年上升。
一、自闭症
自闭症是一种神经发育障碍性疾病，自闭症谱系障碍(autism spectrumdisorder，ASD)是这类疾病的总称。其发病率逐年上升，美国疾病预防控制中心2014年发布的统计数据表明，2010年美国儿童ASD的患病率已达到14.7‰，相当于68名儿童中即有1例ASD。目前，还没有治疗自闭症核心障碍的有效方法。然而，医生、科研人员和患儿家长尝试了多种治疗方法，积累了很多经验。常见的治疗方法有行为干预法、特殊教育法、药物治疗法、生物医学干预法以及心理干预法等。但这些方法大多缺乏完整有效的安全性和有效性评估，仍需更多的***性的研究和评估。
据统计，约有50％-70％的自闭症患者会采用生物相关疗法，但大多缺乏完整有效的安全性和有效性评估，仍需更多的***性的研究和评估。随着对人体微生物和自闭症关系研究的发展，与之相对应的干预或治疗方法，如食物干预、益生菌以及粪菌移植等逐步显示出其独特的安全性和有效性，是具有广泛应用前景的生物干预方法。
1998年曾报道使用分泌素(secretin)来干预自闭症，并取得了一定的效果，但由于只有三个样本，随后的研究发现分泌素的效果并不显著，可能存在安慰剂效应，因此，并没有得以推广。目前，还没有针对自闭症的特效药。其中，利培酮(risperidone)和阿立哌唑(aripiprazole)是唯一通过美国食品药品监督管理局(Food and Drug Administration，FDA)认证的仅可用于5-16岁儿童的自闭症药物，其他选择性5-HT再摄取抑制剂西酞普兰(citalopram)、艾司西酞普兰(escitalopram)和氟西汀(fluoxetine)等可以用于治疗自伤行为和重复行为等严重的行为问题。虽然，医生会给自闭症患者开药，但药物并不能对自闭症的核心缺陷，即社交和沟通障碍起实质治疗作用。这些药物的有效性也低于其他类疾病，且都具有一定的副作用，在儿童用药方面仍欠缺足够的临床经验，因此，有必要限制对自闭症患者做大规模和长期用药治疗。
在发现一些自闭症的肠道症状后，人们开始尝试使用抗生素治疗肠道症状，并对自闭症症状也有所帮助。一些自闭症病人口服两种广泛用于厌氧菌感染的万古霉素(vancomy)和甲硝锉(metronidazole或flagyl)后都有一定的治疗效果。其中，万古霉素可能主要通过影响革兰氏阳性厌氧菌发挥作用，高浓度的万古霉素还会清除艰难梭菌和大部分革兰氏阴性厌氧菌。但研究发现，万古霉素停用后，所有受试者的肠道和行为症状均发生了逐步回归。万古霉素用于自闭症治疗时其有效性是短期的，一旦停用后就会出现反复，并且在治疗的每个疗程，每次中断都会复发，可能肠道中的某些微生物导致了自闭症症状。口服万古霉素不能进入血液***，几乎不被人体吸收，而主要通过影响肠道微生物发挥作用，停药之后出现反复可能是肠道微生物产生了芽孢，当停止使用万古霉素时，芽孢活化为细菌继续影响肠道和神经***，可产生芽孢的梭菌属最值得怀疑。此外，万古霉素和庆大霉素(gentamycin)通常用于其他抗生素无效时的严重疾病，被认为是对抗耐药菌的最后一道防线，一旦错误使用很容易引起细菌耐药性。所以，应慎重选择此类抗生素应用于自闭症治疗。
许多环境因素会影响菌肠脑轴，尤其是个体每天的食物摄入。研究表明，食物可以影响肠道菌群的组成。例如，在母乳喂养的婴儿肠道菌群中，梭状芽孢杆菌和大肠杆菌的数量明显低于配方奶粉喂养的婴儿，膳食乳化剂也可以改变肠道微生物群的定位、成分和促炎可能性。由饮食引起的微生物菌群变化可能会影响血清代谢，调节个体的大脑活动。因此，某些食物可能会恢复微生物-肠-脑轴的平衡，并对与自闭症谱系障碍相关的缺陷有治疗作用。虽然，已有大量相关研究显示GF/CF食物干预对自闭症症状具有较好的影响，但具体作用机制仍不是很清楚。阿片样物质过量理论(opioid-excesstheory)认为儿童摄入谷蛋白和酪蛋白会对其行为和发育造成的不利影响，或者是由于自闭症儿童对食物过敏或本身患有腹腔疾病，在食物进入肠道时会引起胃肠道不适，可能儿童表现出的不适应行为正是对胃肠道不适的一种反应。这一疗法在全球非常流行，但其作用机制仍不清楚，且并非对所有自闭症儿童有效，还可能引起营养不良等副作用，因此受到一些质疑。
二、过敏性疾病
截止到2015年，全球已有40-50％的人患有过敏症，WHO已把过敏性疾病列为21世纪需要重点研究和防治的三大疾病之一。据统计我国过敏性疾病的发病率高达37.3％，主要影响人群为婴幼儿。寻找有效的过敏防治措施迫在眉睫。目前针对治疗过敏性疾病比较普遍的方法是使用药物治疗。如组胺拮抗剂，可通过堵塞组胺感受器来抑制组胺反应，以及类固醇和抑制肥大细胞释放发炎物质的药物、气管扩张剂药物等。但是这类药物仅提供暂时的症状缓解，无法真正改变过敏免疫反应，治标不治本。
过敏原特异性脱敏治疗是世界卫生组织公认的过敏性疾病唯一对因治疗，其简单原理为按一定规律给患者间断皮下注射患者过敏的物质，剂量由小到大，使患者对此类过敏原逐渐耐受，再次接触时，不再产生过敏现象或过敏减轻。但脱敏治疗是一种长期的治疗方案，它见效较慢、疗程长，但疗效好，患者需耐心配合治疗。一般经3-4个月的治疗才见明显疗效，需持续2-5年的维持疗程。
针对治疗过敏性疾病比较普遍的方法是使用药物治疗。如组胺拮抗剂，可通过堵塞组胺感受器来抑制组胺反应，以及类固醇和抑制肥大细胞释放发炎物质的药物、气管扩张剂药物等。但是这类药物仅提供暂时的症状缓解，无法真正改变过敏免疫反应，治标不治本。
目前提高免疫力的措施有健康的饮食习惯、适当的运动、保持愉悦的心情以及中药治疗；多种中药中含有的有机酸类、多糖类、普类、生物碱类和挥发油类等物质，能够使机体自身的适应力和免疫功能得到充分发挥和全面调整进而达到预防疾病的目的。多糖在对机体的免疫力的调节上发挥一定的作用，可使免疫细胞得到激活对补体***也有重要的影响沮能诱发产生细胞因子。但这些疗法都见效慢、周期久，只有持续一段时间后才能有效果，因此对大部分人来说并不是很好的方式。
近期，中国举全国之力抗击新型冠状病毒肺炎，而人体免疫力在这场“战役”中起到了举足轻重的作用。在抗击新型冠状病毒肺炎时，个人防护最重要的一点是要增强体质，提高免疫力。
益生菌是良好的免疫激活剂，可以同时促进特异性和非特异性免疫，能够在不引起炎症反应的情况下调节免疫***行使免疫功能，通过激活巨噬细胞、提高抗炎症细胞因子表达水平、增强自然杀伤细胞和免疫球蛋白活性而产生的。另外，益生菌在肠道内定植，抑制致病菌黏附肠黏膜，可有效降低致病菌的数量，维持肠道菌群平衡，从而间接影响免疫***。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了一种婴儿双歧杆菌DH231及其发酵产物、应用和微生态制剂。该婴儿双歧杆菌及微生态制剂具有预防或治疗机体过敏反应、缓解自闭症、提高免疫力等作用。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种婴儿双歧杆菌，其保藏编号为CGMCC No.18372。
本发明还提供了该婴儿双歧杆菌在制备具有缓解自闭症功效的微生态制剂中的应用。
本发明还提供了该婴儿双歧杆菌在制备具有缓解过敏功效的微生态制剂中的应用。
本发明还提供了该婴儿双歧杆菌在制备具有提高免疫力功效的微生态制剂中的应用。
本发明还提供了由该婴儿双歧杆菌制备的发酵产物。
本发明还提供了一种微生态制剂，包括上述婴儿双歧杆菌或上述发酵产物，以及制剂学上可接受的辅料。
作为优选，微生态制剂的剂型为散剂、粉剂、片剂、胶囊剂、水剂、凝胶剂、膏剂、滴丸剂、丸剂、颗粒剂中的一种。
作为优选，微生态制剂为固体制剂或液体制剂。
本发明微生态制剂制成固体制剂包含的总活菌数不低于1×106CFU/g，一般在1×109CFU/g以上，最高可达到1×1011CFU/g或1×1011CFU/g以上；制成液体制剂包含的总活菌数不低于1×106CFU/mL，一般在1×109CFU/mL以上，最高可达到1×1011CFU/mL或1×1011CFU/mL以上。
本发明微生态制剂可制成药品组合物、兽药或饲料添加剂等。
本发明微生态制剂所述婴儿双歧杆菌指活的生物个体。
本发明提供了一种婴儿双歧杆菌DH231及其发酵产物、应用和微生态制剂。该婴儿双歧杆菌的保藏编号为CGMCC No.18372。本发明具有的技术效果如下：
本发明婴儿双歧杆菌DH231微生态制剂防治自闭症、抗过敏、提高免疫力等疗效显著，相比其他治疗方式见效快，效果好，无不良反应及副作用。可作为药品、兽药和饲料添加剂等应用，社会意义巨大。
生物保藏说明
生物材料DH231，分类命名：婴儿双歧杆菌(Bifidobacterium infantis)，于2019年08月06日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏中心地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCCNo.18372。
具体实施方式
本发明公开了一种婴儿双歧杆菌DH231及其发酵产物、应用和微生态制剂，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
制备例说明：这里通婴儿双歧杆菌DH231保藏编号CGMCC18372散剂为例进行具体说明，其他婴儿双歧杆菌菌种制剂的制备方法本领域技术人员通过本实施例很容易掌握，其他剂型的制备方法本领域技术人员通过本实施很容易掌握，在此不再一一叙述说明。制备方法并不局限于本发明实施例所述，公知的能够达到制备目的的方法均可以，实施例的制备说明只是对本发明的说明，并不是对本发明保护范围的限制。
本发明提供的婴儿双歧杆菌DH231及其发酵产物、应用和微生态制剂中所用试剂、仪器或辅料均可由市场购得。
下面结合实施例，进一步阐述本发明：
实施例1菌粉的制备和菌种的鉴定
用无菌容器收集自然排出的新鲜粪便5-10g，迅速放入厌氧罐中，带回实验室进行菌种分离。取粪便样品1.5g，用15mL PBS缓冲液悬浮混匀，400g离心5min收集上清浊液，再加入适量PBS缓冲液8000g离心10min，收集上清浊液，即得到供试样品。
吸取1mL上浊液加入一支装有9mL PBS稀释液(含有5‰L-半胱氨酸)的试管中涡旋混匀，作为10-2稀释液，用同样方法稀释至10-3，分别取粪便原液、10-2稀释液、10-3稀释液各0.1mL涂布于BBL平板上，置于37℃恒温培养箱中培养24小时后，选择培养基上呈圆形，光滑，边缘整齐，***，乳白色半透明，直径大小在0.5-2mm的菌落，接种于BBL液体培养基中，37℃培养24h后，将所得培养液离心(12000rpm)分离出菌体后，将菌体冷冻真空干燥，调制出干燥菌粉，活菌数均为1×109CFU/g以上。
同时对菌株展开生理生化特征鉴定。通过对分离获得的菌株分别进行接触酶实验及凝乳实验，去除接触酶阳性及无凝乳现象之菌株，排除非目的菌株后，对其余的菌株继续通过BIOLOG及API 50CH进行生理生化特征鉴定，最后通过提取DNA测序，进一步明确菌株的分类地位。
根据菌株的菌落、菌体形态特征，16SrDNA序列分析及API细菌鉴定***分析结果来确认菌株在分类学地位，发现编号DH231的菌株为婴儿双歧杆菌；该株菌在形态学及一般性质上的特征如下：
1、菌体及菌落形态
菌体形态：菌体在显微镜下呈各种分叉，V型、Y型、单个、成对等不规则形状，长1.5-3微米，宽0.6-0.8微米，不运动，无芽孢，革兰氏染色阳性。
菌落形态：固体培养基上菌落形态均为圆形，光滑，边缘整齐，***，乳白色半透明。菌落直径大小一般为0.5-2mm。
2、生理生化特征
最适生长温度为35-37℃，厌氧，菌株的最适生长pH值5.5-6.2。不具有致病性，不产毒素。
在糖发酵中，发酵D-核糖、D-木糖、D-半乳糖、D-葡萄糖、D-果糖、D-甘露糖、肌醇、麦芽糖、乳糖、蜜二糖、蔗糖、棉子糖、L-岩藻糖；不发酵甘油、赤藓醇、D-***糖、L-***糖、L-木糖、阿冬醇、β-甲基-D-木糖甙、L-山梨糖、L-鼠李糖、卫矛醇、甘露醇、山梨醇、α-甲基-D-甘露糖甙、α-甲基-D-葡萄糖甙、N-乙酰-葡萄糖胺、苦杏仁甙、熊果甙、七叶灵、水杨苷、纤维二糖、海藻糖、菊糖、松三糖、淀粉、糖原、木糖醇、龙胆二糖、D-松二糖、D-来苏糖、D-塔格糖、D-岩藻糖、D-***糖醇、葡萄糖酸盐、2-酮基-葡萄糖酸盐，接触酶阴性。
实施例2毒性试验
1、动物及分组
取20只SPF级别小鼠，6～8周龄，体重18～22g，随机分入各婴儿双歧杆菌组和未给药组，每组10只。
2、制备菌液
将上述婴儿双歧杆菌菌粉分别用纯化水调制为含菌数均为1×107CFU/mL的菌液。
3、方法
婴儿双歧杆菌组和未给药组均给予相同的基础饲料，且饲养条件均一致，婴儿双歧杆菌组每天灌服婴儿双歧杆菌菌液0.5mL，未给药组每天灌服纯化水0.5mL，饲喂6个月，观察毒性反应。
4、结果
各组小鼠均未出现异常情况，未发生振颤、痉挛、运动失调、姿态异常，无眼球突出，排尿正常，皮肤、呼吸正常，无死亡情况，表明婴儿双歧杆菌不存在毒性。
实施例3婴儿双歧杆菌散剂的制备
根据上述步骤和方法分离鉴定后，经实验检验无毒性，就可将婴儿双歧杆菌菌种制成菌粉，然后按照需要添加相关辅料制成各种剂型，优选根据婴儿双歧杆菌菌粉的活菌数，制成散剂，主要原料为：婴儿双歧杆菌，其他辅料为：水苏糖、麦芽糊精、木糖醇、结晶果糖、植脂末，添加食品添加剂包括微晶纤维素、甜菊糖苷，添加营养强化剂维生素B、维生素E粉、叶酸，通过粉碎或不粉碎、配料、混匀、包装等主要工艺加工制成。活菌数不低于1×107CFU/g，然后装袋。
应用效果实施例说明：本发明以婴儿双歧杆菌DH231保藏编号CGMCC13872为代表说明婴儿双歧杆菌的应用效果，但不是对本发明的限制。应用效果实施例1：婴儿双歧杆菌缓解自闭症试验研究
1.材料与方法
1.1材料
1.1.1试验产品
婴儿双歧杆菌活菌DH231散剂，活菌数均为1×107CFU/g以上。
1.1.2试验动物
SPF洁净级C57BL/6近交系小鼠，雌性5只，雄性10只，体质量20±2g，育龄期(8周龄)。实验小鼠词养于温度18-22℃，湿度55-60％，每日12小时光照的实验室内，喂饲普通型鼠饲料，实验开始前进行一般观察及检疫。
1.2方法
按雌雄比例2:1于晚5时合笼，次晨8时观察阴栓，若观察不到阴栓即进行***涂片，观察到***则记录为妊娠第1天，雌鼠受孕后分笼饲养，随机分为模型组和对照组；模型组孕后第12.5天给予腹腔注射丙戊酸钠(VPA)600mg/kg，同期给予对照组孕鼠注射等量生理盐水(生理盐水配成250mg/mL溶液)，幼鼠出生后21天断乳。
1.3建立自闭症动物模型
将断乳后的幼鼠随机分为阴性对照组、实验组，每组6只。
表1分组及给药方法
Figure GDA0003634204110000091
1.4观察指标
1.4.1旷场实验
(1)适应阶段：将受测小鼠轻轻放入装置中(材质：亚克力玻璃，40cm×40cm×30cm)，任其自由活动10min。
(2)测试阶段：记录接下来的10min内受测小鼠跨线次数。装置总分为16格，中间4格即为中央格，周围12格即为周围格。跨格标准为：4肢均跨过格子边线。测试结束后，轻轻取出受测小鼠放回笼子，然后用75％的酒精溶液擦拭装置，待其干燥后进行下一只小鼠的测试。
1.4.2三腔社交实验
(1)适应阶段：将受测小鼠放入装置中(材质：亚克力玻璃，120cm×20cm×22cm)，任其在3个连通的腔室中自由活动10min，以适应环境。
(2)测试阶段：取出适应好的受测小鼠，并在左右两侧腔室中分别放入笼子和带有陌生小鼠(与测试小鼠性别相同、年龄相仿的未同笼饲养过的同品系小鼠)的笼子(左右随机放)。轻轻将之前适应好的受测小鼠由中间的腔室中放入使其在内活动10min，结束后轻轻取出受测小鼠。向空笼子内放入另一只陌生小鼠，然后再次将受测小鼠轻轻放入中间的腔室内。记录接下来的10min内，受测小鼠在中间腔室内停留的时间。测试结束后依次取出受测小鼠及两侧空笼子中的陌生小鼠放回不同的笼中，并用75％的乙醇溶液清洗实验装置，待其干燥后进行下一受测小鼠的测试。Any-maze软件及配套摄像***自动记录其运动轨迹及在三箱的时间。
1.4.3水迷宫试验
安装实验所需MWM水迷宫***(SLY-WMS2.0)并设置好any-maze软件。
向黑色圆形水槽(直径130cm，深45cm)中注入清水，直至液面达到平台之上1cm。使用遮光布包围水槽四周，遮光布及池壁四周均贴有不同形状的标记，便于实验大鼠识别及记忆方向。将实验大鼠面朝池壁轻轻放入水中后实验人员迅速离开水槽周围并拉好遮光布，any-maze软件将自动记录实验大鼠从放入水中到找到平台所用的时间及在水中的运动轨迹。
整个实验过程持续7天，分为三个阶段的测试和训练。第1天，适应：拆除平台，将实验大鼠从第一象限放入水中，1min后取出大鼠。第2-6天，定位航行训练：将平台固定于第III象限正中位置，低于水面1cm，向水中加入墨汁至肉眼不能看清水下平台，将实验大鼠从N(north)，E(east)，S(south)，及W(west)4个不同的初始点放入水中，软件记录实验大鼠在迷宫内游动轨迹。若大鼠在1min内找到并爬上平台，软件将自动停止记录，找到平台所用的时间计为逃避潜伏期时间。若1min内未找到平台，则将实验大鼠引导至平台上增强记忆10s，潜伏期记为60s。第7天，平台探索测试：再次拆除平台，记录各实验大鼠在1min时间内游过原平台所在位置的总次数。
1.4.4重复刻板动作检测
分别取两组生后35d大鼠，每只大鼠均单独置于干净的观察箱10min，保持环境安静，光线暗。观察记录大鼠重复刻板动作的累积时间。在这里重复刻板动作指大鼠转圈、蹦跳、整理身体所有部位的皮毛。
1.5数据统计
采用SPSS19.0统计软件进行分析，计量资料采用均数±标准差表示，两组间比较采用t检验，多组间比较采用单因素方差分析检验，两两比较采用SNK-q检验。P<0.05差异有统计学意义。
2.试验结果及分析
2.1试验结果
表2婴儿双歧杆菌DH231菌株对小鼠自闭症行为的影响(n＝6)
Figure GDA0003634204110000111
2.2分析
婴儿双歧杆菌DH231能显著缓解自闭症行为，差别具有统计学意义(P＜0.05)。因此该株益生菌具有良好的缓解自闭症的功能。
应用效果实施例2：婴儿双歧杆菌缓解过敏试验研究
1.材料与方法
1.1材料
1.1.1试验产品
婴儿双歧杆菌活菌DH231散剂，活菌数均为1×107CFU/g以上。
1.1.2试验动物
清洁级3周龄断乳雄性BALB/c近交系小鼠14只。
1.2方法
将14只小鼠随机分为2组，每组各7只。将各组的益生菌溶于生理盐水中混匀制成混浊液，使终浓度为1×108cfu/mL。灌胃给予20mL/kg，每日剂量分两次灌胃。阴性对照组：将冻干保护剂溶于生理盐水中制成浑浊液，小鼠每天灌胃20mL/kg，每日剂量分两次灌胃。
1.3建立迟发型超敏反应动物模型
首次灌胃第二日小鼠腹部剃毛，3cm×3cm范围，以使致敏部位充分暴露。均匀涂布20μL 0.5％DNFB溶液(溶于4:1丙酮:橄榄油中)致敏。对各组小鼠按上述方法连续灌胃14天，末次给药1小时，在小鼠左耳两面均匀涂布0.25％DNFB溶液10μL进行攻击，诱发小鼠迟发型超敏反应模型。60min后剪下双耳称重。
1.4观察指标
耳重量：以打孔器取耳中部组织块，分析天平称重，计算左右耳组织块的重量差。比较各组数值，以样本均值差异显著性t检验作统计学处理。
1.5计算公式
肿胀度(mg)＝右耳片重量-左耳片重量
抑制率(％)＝(空白对照组平均肿胀度-各给药组平均肿胀度)/空白对照组平均肿胀度×100％
2试验结果及分析
2.1试验结果
表3婴儿双歧杆菌DH231菌株对小鼠迟发型超敏反应的影响(n＝7)
组号 肿胀度mg 肿胀抑制率％
婴儿双歧杆菌DH231 1.06±0.31 69.09％
阴性对照组 3.43±1.44 /
2.2分析
婴儿双歧杆菌DH231能显著抑制由DNFB诱发的小鼠迟发型超敏反应的耳肿胀程度，抑制率为69.09％，差别具有统计学意义(P＜0.05)。因此该株益生菌具有良好的抑制机体的过敏反应功能。
应用效果实施例3：婴儿双歧杆菌提高免疫力试验研究
1.材料与方法
1.1材料
1.1.1试验产品
婴儿双歧杆菌活菌DH231散剂，活菌数均为1×107CFU/g以上。
1.1.2试验动物
SPF级BALB/c小鼠24只，雄性，18-21g。
1.2实验方法
1.2.1动物分组与给药
小鼠适应性饲养1周，随机分为2组：阴性对照组、婴儿双歧杆菌干预组，每组12只，对照组灌胃给以蒸馏水，婴儿双歧杆菌干预组给以泡水冻干粉0.1g/kg，各组小鼠灌胃容积均为20mL/kg(活菌数1.5×107CFU/g)，每天1次，连续灌胃4周。每周称量动物体重，并根据体重调整灌胃剂量。
1.2.2脏器系数测定
连续灌胃给药28d，称量体重后脱颈椎处死小鼠，取胸腺和脾脏并称重，计算脏器质量与体重的比值分别作为胸腺系数和脾脏系数。
1.2.3细胞免疫功能测定(ConA诱导的小鼠淋巴细胞转化实验)
灌胃至28d，颈椎脱臼处死小鼠，无菌取脾，制备脾细胞悬液，用Hank’s液洗2次(1000r/min，10min)，用完全培养基重悬细胞，调整细胞浓度为3×106cell/mL，分两孔(1mL/孔)加至24孔板中，试验孔加入75μL ConA液(0.1mg/mL)，对照孔不作处理。置于CO2培养箱5％CO2、37℃培养68h后，每孔吸去上清0.7mL，加入RPMI1640培养液0.7mL和MTT(5mg/mL)50μL，继续培养4h。培养结束后每孔加入1mL酸性异丙醇，吹打至紫色结晶完全溶解后分装至96孔板中，570nm处测定吸光度，以试验孔与对照孔的吸光度差值表示淋巴细胞的增殖能力。
1.2.4体液免疫功能测定
1.2.4.1抗体生成细胞检测
灌胃至28d，腹腔注射2％绵羊红细胞(Sheepredbloodcell，SRBC)免疫小鼠，0.2mL/只。5d后，无菌取脾制备脾细胞悬液，调整细胞浓度为5×106cell/mL。向六孔板中加入含0.5％琼脂糖的生理盐水制备底层培养基。将含0.5％琼脂糖的Hank’s液以0.5mL/管加至50℃的恒温试管中备用。取50μL20％SRBC及200μL脾细胞悬液先后加入恒温试管中，立即混匀，倒入六孔板中，铺平后放入CO2培养箱中孵育1h，每孔加入500μL以完全培养基稀释11倍的补体，继续培养2h，吸除上层液体，拍照，用ImageJ软件统计每孔溶血空斑数，结果以空斑数/106脾细胞表示。
1.2.4.2半数溶血值HC50的测定
灌胃至28d，腹腔注射2％SRBC免疫小鼠，0.2mL/只。4d后，眼眶取血制备血清，取SA缓冲液稀释200倍后的血清1mL于试管内，依次加入0.5mL10％SRBC，1mL SA液稀释9倍的补体。对照管以SA液代替血清。37℃恒温水浴20min，冰浴终止反应。2000r/min离心10min，取1mL上清液，加3mL都氏试剂，同时取0.25mL 10％SRBC加3.75mL都氏试剂作为半数溶血对照管，充分混匀，静置10min后，以对照管作空白，540nm波长处，测定各管吸光度。
样品HC50＝样品吸光度/SRBC半数溶血时吸光度×200
1.2.5单核-巨噬细胞功能测定
1.2.5.1碳廓清实验
灌胃至30d，从小鼠尾静脉注入以生理盐水稀释4倍的印度墨汁，0.1mL/10g体质量。墨汁注入后2min(t1)、10min(t2)，先后从眼内眦取血20μL，立即加至2mL 0.1％Na2CO3
溶液中，混匀。以0.1％Na2CO3溶液作空白，用分光光度计在600nm波长处分别测得光密度值(OD1、OD2)。颈椎脱臼处死小鼠，取肝脏和脾脏，称重，以吞噬指数表示小鼠碳廓清能力。
Figure GDA0003634204110000141
1.2.5.2腹腔巨噬细胞吞噬荧光微球实验
灌胃至24d时，每只小鼠腹腔注射0.2mL 2％SRBC以激活小鼠巨噬细胞，4d后颈椎脱臼处死小鼠，剪开腹部皮肤暴露腹膜，腹腔注射含5％小牛血清的Hank's液3mL/只，轻揉腹部20次，将腹膜剪开一个小口，吸取2mL腹腔液经200目筛过滤至试管内，调整巨噬细胞数为4×105-6×105cell/mL。将稀释好的细胞悬液以1mL/孔加至6孔板中，加入1％BSA预调理过的荧光微球(1×107/板)，置于CO2细胞培养箱内避光孵育90min，用预冷的PBS缓冲液轻轻洗涤2次(1000r/min，5min)，加入PBS缓冲液0.3mL，用细胞刮刮下贴壁细胞，吹打均匀，经200目筛过滤后用流式细胞仪检测，用CytExpert2.0软件分析统计未吞噬荧光微球和吞噬不同数量荧光微球的巨噬细胞的比例，计算荧光微球吞噬百分率和吞噬指数。
吞噬百分率(％)＝吞噬荧光微球的巨噬细胞数/计数的巨噬细胞数×100％
吞噬指数＝被吞噬的荧光微球总数/计数的巨噬细胞数
1.2.6 NK细胞活性测定
灌胃至28d，脱颈椎处死小鼠，无菌取脾，制备单细胞悬液。经200目筛过滤至10mL离心管中，Hank’s液洗2次(1000r/min，10min)，弃上清，裂解红细胞后加入8mL Hank’s液，1000r/min离心10min，弃上清，用完全培养液调整细胞浓度为2×107cell/mL。按50:1的效靶比将靶细胞(YAC-1细胞，实验前24h传代)和效应细胞(脾细胞)各100μL，加至U型96孔培养板中，靶细胞自然释放孔和靶细胞最大释放孔中均加入靶细胞和完全培养液各100μL；背景空白孔中加入完全培养液200μL。上述各项均设三个复孔，于37℃CO2培养箱中培养3h后，向靶细胞最大释放孔中加入20μL LDH释放试剂，吹打混匀，继续培养1h。将培养板静置10min，每孔吸取100μL加至平底96孔板中，同时加入LDH检测工作液50μL，避光反应30min，在酶标仪490nm波长处测定吸光度(OD)。按下式计算NK细胞活性：
NK细胞活性(％)＝(反应孔OD值-自然释放孔OD值)/(最大释放孔OD值-自然释放孔OD值)×100％
1.3数据处理
实验数据以均数±标准差表示，每组实验动物数n＝12，采用GraphPadPrism7统计软件，体重采用双因素方差分析，其他指标采用单因素方差分析，均进行Tukey事后检验(多重比较)，当P<0.05时差异有统计学意义。
2.试验结果及分析
2.1试验结果
表4婴儿双歧杆菌DH231菌株对小鼠免疫力的影响(n＝12)
项目 阴性对照组 婴儿双歧杆菌干预组
胸腺系数(mg/g) 1.82±0.33 2.02±0.28
脾脏系数(mg/g) 4.8±0.4 5.4±0.5
淋巴细胞增殖能力 0.28±0.05 0.36±0.06
抗体细胞生成能力 980±90 1150±173
HC50 127±5 136±4
碳廓清能力 3.5±0.5 4.4±0.6
荧光微球百分率(％) 48.00±7.09 59.01±5.49
吞噬指数 0.78±0.11 1.01±0.09
NK细胞活性(％) 30.47±7.07 45.21±0.62
2.2分析
婴儿双歧杆菌DH231能显著提高小鼠各项机体免疫力，差别具有统计学意义(P＜0.05)。因此该株益生菌具有良好的提高免疫力功能。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种婴儿双歧杆菌，其特征在于，其保藏编号为CGMCC No.18372。
2.权利要求1所述的婴儿双歧杆菌在制备具有缓解自闭症功效的微生态制剂中的应用。
3.权利要求1所述的婴儿双歧杆菌在制备具有缓解过敏功效的微生态制剂中的应用。
4.权利要求1所述的婴儿双歧杆菌在制备具有提高免疫力功效的微生态制剂中的应用。
5.一种微生态制剂，其特征在于，包括权利要求1所述的婴儿双歧杆菌，以及制剂学上可接受的辅料。
6.根据权利要求5所述的微生态制剂，其特征在于，所述微生态制剂的剂型为粉剂、片剂、胶囊剂、水剂、凝胶剂、膏剂、丸剂、颗粒剂中的一种。
7.根据权利要求6所述的微生态制剂，其特征在于，所述微生态制剂的剂型为滴丸剂。
8.根据权利要求5所述的微生态制剂，其特征在于，所述微生态制剂为固体制剂或液体制剂。
9.根据权利要求8所述的微生态制剂，其特征在于，所述固体制剂的总活菌数不低于1×106CFU/g。
10.根据权利要求8所述的微生态制剂，其特征在于，所述液体制剂的总活菌数不低于1×106CFU/mL。
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