CN112823782B - 植物汁液用于提升心血管细胞中抗老化基因表现量的用途 - Google Patents

植物汁液用于提升心血管细胞中抗老化基因表现量的用途 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种植物汁液用于提升心血管细胞中抗老化基因表现量的用途，能够全面的提升的抗老化活性，能促进反转回青春有活力的状态。其中本发明的植物汁液为一天山雪莲(Smallanthus sonchifolius)愈伤组织汁液、一龙眼壳汁液及一荞麦汁液所组成。

Description

植物汁液用于提升心血管细胞中抗老化基因表现量的用途
技术领域
本发明涉及一种植物汁液用于提升CCT基因、Atg基因、NADSYN基因、MRPS5基因、SOD3基因、及TERT基因表现量与提升GSH含量的用途，尤其是一种为一天山雪莲汁液、一龙眼壳汁液、一荞麦汁液、及其任意组合所组成的植物汁液用于制备提升CCT2基因、CCT7基因、CCT8基因、Atg1基因、Atg8基因、NADSYN基因、MRPS5基因、SOD3基因、及TERT基因表现量，及/或提升GSH的含量的组合物的用途。
背景技术
在生物学及医学上，老化(aging)是指一个生物体的生理状态随时间而恶化的现象，老化会造成身体各部分组织或器官机能衰退或功能减弱，使得生物体的健康功能变差，最后导致生物体死亡，现代人生活压力大，长期压力的累积会加速身体机能老化，也衍生出许多慢性疾病。
另外，随着保健意识的抬头及医疗技术的进步，人均寿命增长，但老化所造成的机能退化依然伴随年龄的增长而加剧，因此除了在疾病的治疗及预防外，老化的预防也是高龄社会的重要课题之一。
虽然目前已研究出许多与老化相关的基因以及相关的机制，但是目前仍然没有能有效应用于推迟老化的药物或方法，大多只能建议从饮食上多摄取具抗氧化活性物质的食物，并维持适当运动与保持正常作息及心情愉悦。
综上所述，为了能方便又有效达到推迟老化的功效，开发一种能有效提升抗老化基因表现量、及抗氧化力的组合物，着实有其必要性。
发明内容
缘此，本发明的一目的在提供一种植物汁液用于制备提升含TCP1的折叠蛋白(Chaperonin containing TCP1,CCT)基因、自噬作用相关基因(Autophagy-related gene,Atg)基因、麸酰胺酸依赖性烟草酰胺腺嘌呤二核苷酸合成酶(Glutamine-dependent NAD+synthetase,NADSYN)基因、线粒体核糖体蛋白5(mitochondrial ribosomal protein S5,MRPS5)基因、超氧化物歧化酶3(Superoxide dismutase 3,SOD3)基因、及端粒酶反转录酶(Telomerase reverse transcriptase,TERT)基因表现量的组合物的用途；其中该植物汁液为由一天山雪莲汁液、一龙眼壳汁液、一荞麦汁液、及其任意组合所组成。
本发明的另一目的在提供一种植物汁液用于制备提升榖胱甘肽(Glutathione,GSH)含量的组合物的用途，其中该植物汁液为由一天山雪莲汁液、一龙眼壳汁液、一荞麦汁液、及其任意组合所组成。
在本发明的一实施例中，该CCT基因为含TCP1第2次单元的折叠蛋白(Chaperonincontaining TCP1 subunit 2,CCT2)基因、含TCP1第7次单元的折叠蛋白(Chaperonincontaining TCP1 subunit 7,CCT7)基因、含TCP1第8次单元的折叠蛋白(Chaperonincontaining TCP1 subunit 8,CCT8)基因、及其任意组合；且该Atg基因为自噬作用相关基因1(Autophagy-related gene 1,Atg1)基因、自噬作用相关基因8(Autophagy-relatedgene 8,Atg8)基因或其组合。
在本发明的又一实施例中，该植物汁液为增加抗老化活性。
在本发明的又一实施例中，该植物汁液为调节一细胞的调节NAD+浓度、及/或端粒长度。
在本发明的又一实施例中，该植物汁液为增加抗氧化活性。
在本发明的又一实施例中，该植物汁液为以一溶剂进行浸提，该溶剂为水、醇、或醇水混合物。
在本发明的又一实施例中，该植物汁液的浓度为至少0.5％(v/v)。
在本发明的另一实施例中，该植物汁液为该天山雪莲汁液、该龙眼壳汁液、该一荞麦汁液以2.4-3.6:129.6-194.4:128.8-193.2比例混合所组成。
本发明的植物汁液为一天山雪莲汁液、一龙眼壳汁液、一荞麦汁液、及其任意组合所组成；该天山雪莲汁液、该龙眼壳汁液、及该荞麦汁液皆能有效提升血球细胞、皮肤细胞、心血管细胞、及/或视网膜细胞中与线粒体或细胞抗老化相关的基因的表现量，且该三种汁液特别对心血管细胞有显著的抗老化功效。而该三种汁液的组合亦能够直接且有效的提升CCT2基因、CCT7基因、CCT8基因、Atg1基因、Atg8基因、NADSYN基因、MRPS5基因、SOD3基因、及TERT基因的表现量，能够全面的提升的抗老化活性，且本发明的植物汁液能同时提升GSH的含量，以全面的提升体内的抗氧化活性；本发明的植物汁液能有效促进体内反转回青春有活力的状态。因此，本发明的植物汁液可用于制备抗老化的组合物的用途，其中该组合物是一医药品、一食品或一保养品，可借由口服、皮肤涂抹等方式给予一个体。
以下结合附图和具体实施例对本发明进行详细描述，但不作为对本发明的限定。
附图说明
图1为本发明的一实施例的天山雪莲汁液提升血球细胞中CCT2基因、CCT5基因、及CCT6A基因表现量的效果的直方图。*p值<0.05。
图2为本发明的一实施例的龙眼壳汁液提升血球细胞中CCT5基因、CCT6A基因、CCT8基因、Pink1基因、Atg1基因、Atg8基因、及FOXO3基因表现量的效果的直方图。*p值<0.05；**p<0.01；***p<0.001。
图3为本发明的一实施例的荞麦汁液提升血球细胞中CCT2基因、及CCT5基因表现量的效果的直方图。*p值<0.05。
图4为本发明的一实施例的天山雪莲汁液提升皮肤细胞中CCT6A基因、CCT7基因、Atg1基因、Atg8基因、SIRT1基因、及FOXO3基因表现量的效果的直方图。*p值<0.05；**p<0.01。
图5为本发明的一实施例的龙眼壳汁液提升皮肤细胞中CCT2基因、CCT5基因、CCT7基因、Pink1基因、Atg1基因、Atg8基因、SIRT1基因、及FOXO3基因表现量的效果的直方图。*p值<0.05；**p<0.01；***p<0.001。
图6为本发明的一实施例的荞麦汁液提升皮肤细胞中CCT2基因、CCT5基因、CCT6A基因、CCT7基因、CCT8基因、及Pink1基因表现量的效果的直方图。***p值<0.001。
图7为本发明的一实施例的天山雪莲汁液提升心血管细胞中CCT2基因、CCT6A基因、CCT7基因、CCT8基因、Pink1基因、Atg1基因、及SIRT1基因表现量的效果的直方图。*p值<0.05；**p<0.01；***p<0.001。
图8为本发明的一实施例的龙眼壳汁液提升心血管细胞中CCT2基因、CCT5基因、CCT6A基因、CCT7基因、CCT8基因、Atg1基因、SIRT1基因、及FOXO3基因表现量的效果的直方图。*p值<0.05；**p<0.01；***p<0.001。
图9为本发明的一实施例的荞麦汁液提升心血管细胞中CCT2基因、CCT5基因、CCT6A基因、CCT7基因、CCT8基因、Pink1基因、Atg1基因、SIRT1基因、及FOXO3基因表现量的效果的直方图。*p值<0.05；**p<0.01；***p<0.001。
图10为本发明的一实施例的龙眼壳汁液及荞麦汁液提升视网膜细胞中CCTs基因、Pink1基因、Atg8基因、SIRT1基因、或FOXO3基因表现量的效果的直方图。**p<0.01；***p<0.001。
图11为本发明的一实施例的植物汁液的组合物提升CCTs基因表现量的效果的直方图。*p<0.05；***p<0.001。
图12为本发明的一实施例的植物汁液的组合物提升Atg1基因及Atg8基因表现量的效果的直方图。*p<0.05；***p<0.001。
图13为本发明的一实施例的植物汁液的组合物提升NADSYN基因、MRPS5基因、及SOD3基因表现量的效果的直方图。*p<0.05；***p<0.001。
图14为本发明的一实施例的植物汁液的组合物提升TERT基因表现量的效果的直方图。***p<0.001。
图15为本发明的一实施例的植物汁液的组合物提升GSH含量的效果的直方图。**p<0.01；***p<0.001。
具体实施方式
本文中所使用数值为近似值，所有实验数据皆表示在20％的范围内，较佳为在10％的范围内，最佳为在5％的范围内。
使用Excel软件进行统计分析。数据以平均值±标准偏差(SD)表示，个此之间的差异以学生t检验(student's t-test)分析。
天山雪莲(Smallanthus sonchifolius)为菊科(Compositae)菊薯属(Smallanthus)多年生草本植物，又称菊薯，英文名为Peruvian ground apple，地下块根肥大，可供食用且具有清凉解热、降脂、及帮助排便的功效。
龙眼(Euphoria longana Lam.)为无患子科(Sapindaceae)龙眼属(Euphoria)常绿乔木植物，英文名为Longan，龙眼根具有通经络功效；叶具有清热解毒之功效；果核具有止血、止痛之功效；果实味甜且具有补气血、安神之功效；果皮(即为龙眼壳)具有清热凉血的功效。
荞麦(Fagopyrum esculentum Moench.)为蓼科(Polygonaceae)荞麦属(Fagopyrum)一年生草本植物，又称三角麦，英文名为Common buckwheat，荞麦茎及叶具有止血、降血压之功效；种子则具有消肿、解毒、退烧之功效。
如本文中所使用的，用语「天山雪莲汁液」意为天山雪莲的愈伤组织与溶剂以1:1-5(w/w)比例经一特定时间与温度浸提而得。
如本文中所使用的，用语「龙眼壳汁液」意为龙眼壳与溶剂以1:5-10(w/w)比例经一特定时间与温度浸提而得。
如本文中所使用的，用语「荞麦汁液」意为荞麦的种皮与溶剂以1:10-15(w/w)比例经一特定时间与温度浸提而得。
如本文中所使用的，用语「植物汁液的组合物」意为将前述之天山雪莲汁液、前述之龙眼壳汁液、及前述之荞麦汁液以2.4-3.6:129.6-194.4:128.8-193.2比例混合而得之组合物。
本发明提供一种植物汁液用于制备抗老化之组合物的用途，本发明之植物汁液为一天山雪莲汁液、一龙眼壳汁液、一荞麦汁液、及其任意组合所获得，其可用于提升与抗老化相关之基因的表现量，能够全面的提升抗老化活性，且能同时提升GSH的含量，能全面的提升人的的抗氧化活性，以使体内反转回青春有活力的状态。
同时，本发明用于制备抗老化之组合物，亦可包含一有效量之植物汁液及一医药上可接受之载体，该组合物为一医药品、一食品或一保养品。
以下将详细说明本发明天山雪莲汁液、龙眼壳汁液、及荞麦汁液之详细浸提方法；本发明天山雪莲汁液、龙眼壳汁液、及荞麦汁液分别提升全身性、皮肤细胞、心血管细胞、及/或视网膜细胞中抗老化基因表现量之功效测试；以及本发明植物汁液的组合物提升抗老化基因表现量、及提升GSH含量之功效测试。以证实本发明之植物汁液能有效且全面的提升抗老化其抗氧化，以使体内反转回青春有活力的状态。
实施例1本发明之天山雪莲汁液的制备方法
在本发明之一实施例中，首先将天山雪莲的愈伤组织与水、醇、或醇水混合物之浸提溶剂，浸提溶剂较佳为水，以1:1-5之重量比混合，均质后在溶剂中以50-100℃进行浸提0.5-2小时后，将粗汁液冷却至室温，并将该粗汁液以400mesh之滤网过滤以获得滤液，其中浸提温度较佳为70-100℃。最后，将该滤液于45-70℃进行减压浓缩后，即得到本发明之天山雪莲汁液。
实施例2本发明之龙眼壳汁液的制备方法
在本发明之一实施例中，首先将龙眼壳组织与水、醇、或醇水混合物之浸提溶剂，浸提溶剂较佳为水，以1:5-10之重量比混合，均质后在溶剂中以50-100℃进行浸提0.5-2小时后，将粗汁液冷却至室温，并将该粗汁液以400mesh之滤网过滤以获得滤液，其中浸提温度较佳为70-100℃。最后，将该滤液于45-70℃进行减压浓缩后，即得到本发明之龙眼壳汁液。
实施例3本发明之荞麦汁液的制备方法
在本发明之一实施例中，首先将荞麦的种皮与水、醇、或醇水混合物之浸提溶剂，浸提溶剂较佳为水，以1:10-15之重量比混合，均质后在溶剂中以50-100℃进行浸提0.5-2小时后，将粗汁液冷却至室温，并将该粗汁液以400mesh之滤网过滤以获得滤液，其中浸提温度较佳为70-100℃。最后，将该滤液于45-70℃进行减压浓缩后，即得到本发明之荞麦汁液。
实施例4本发明之天山雪莲汁液、龙眼壳汁液、及荞麦汁液提升全身性抗老化基因表现量之功效
本发明之一实施例以人类周边血液单核球细胞(Human peripheral bloodmononuclear cell,PBMC)测试本发明之天山雪莲汁液、龙眼壳汁液、及荞麦汁液提升全身性抗老化基因表现量之功效测试。其中，该人类周边血液单核球细胞为购自美国典型培养物保藏中心，编号为
Figure GDA0004209613620000061
PCS-800-011TM，且培养于X-VIVOTM10Serum-freehematopoietic cell medium(购自Lonza，瑞士，编号BE02-055Q)中。
首先，将1×105个PBMC细胞培养于含有2mL上述细胞培养液之6孔培养盘中，于37℃培养16-18小时，接着将细胞分成以下四组：(1)仅加入细胞培养液之控制组、(2)加入0.5％(v/v)本发明之天山雪莲汁液之实验组、(3)加入0.25％(v/v)本发明之龙眼壳汁液之实验组、及(4)加入0.125％(v/v)本发明之荞麦汁液之实验组，并将该些组别之细胞分别于37℃下作用24小时或48小时后，测试各组PBMC细胞中目标基因的表现量；其中，该天山雪莲汁液、该龙眼壳汁液、及该荞麦汁液为以水为浸提溶剂。首先，将PBMC细胞以细胞裂解液(RBbuffer，购自Geanaid公司，中国台湾，Cat No.RBD300)回收细胞后，使用RNA浸提试剂套组(购自Geneaid公司，中国台湾，Cat No.RBD300)分别收集该四组细胞内之RNA，接着利用
Figure GDA0004209613620000071
III反转录酶(购自Invitrogene公司，美国，编号18080-051)以2000ng之浸提RNA为模板，并以表1之组合引子及反转录酶进行反转录作用，以产生该些基因之mRNA所相应之cDNA产物，接着利用ABI StepOnePlusTM Real-Time PCR system(Thermo FisherScientific公司，美国)，以及KAPA SYBR FAST(购自Sigma公司，美国，编号38220000000)将该四组反转录后产物分别以表1之组合引子进行定量实时聚合酶连锁反应(Quantitativereal-time polymerase chain reaction,qPCR)试验，条件为95℃反应1秒，60℃反应20秒，总共40个循环。用以定量CCT2基因、CCT5基因、CCT6A基因、CCT7基因、CCT8基因、Pink1基因、Parkin基因、Atg1基因、Atg8基因、SIRT1基因、FOXO3基因、NADSYN基因、MRPS5基因、及UBL-5基因之mRNA的表现量，其中定量数值为取由阈值循环数(Ct)，而目标基因的mRNA相对量为推导自方程式2-ΔΔCt，其中ΔCT＝CT比较组或实验组目标基因/控制组目标基因-CT GAPDH(甘油醛-3-磷酸脱氢酶，Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase)；ΔΔCT＝CT比较组或实验组目标基因-CT控制组目标基因；各组中各基因的fold change则为2-ΔΔCt。接着，再利用Excel软件决定变异系数与是否在统计上具有显著差异(*p值<0.05；**p值<0.01；***p值<0.001)。
表1、定量实时反转录聚合酶连锁反应之组合引子
Figure GDA0004209613620000072
Figure GDA0004209613620000081
CCT基因为折叠蛋白(Chaperonin)的一种，主要功能为矫正错误折叠的蛋白质，并将无法成功修复之蛋白质送进蛋白质水解酶复合体(Proteasome)中进行水解，先前研究已指若此蛋白质调控之重复使用***发生故障，会导致错误折叠的蛋白质会聚集在细胞中，并造成细胞功能衰退及加速细胞的老化与死亡，因此被认为与个体之老化调节相关。
Pink1基因为一种位在线粒体的丝胺酸/苏胺酸蛋白激酶(Serine/threonineprotein kinase)，其功能为保护线粒体在细胞压力期间发生故障，已知该基因之突变与帕金森氏症有关，而先前研究更指出该基因的过量表现能够增加小鼠的寿命，因此也被认为与个体之老化调节有关。
Parkin基因为一种存在于泛素-蛋白酶体系(Ubiquitin-proteasome system)中之酵素，并作为蛋白质分解的调节剂，已知该基因之突变与帕金森氏症有关，且先前研究亦指出增加该基因的表现量能够推迟细胞的老化作用，因此被认为与细胞的老化作用相关。
Atg基因则为自噬作用相关基因，会参与细胞中废物降解、及循环的自噬作用，先前研究指出该基因的过量表现，能够延长小鼠的寿命，因此被认为与细胞的老化作用相关。
先前研究已指出和年老的小鼠相比，年轻的小鼠体内含有较多的NAD+；且增加年老小鼠体内的NAD+浓度，能使其生理状况更为年轻，因此NAD+被认为与推迟个体老化相关，研究结果已知SIRT1基因、FOXO3基因、NADSYN基因、MRPS5基因、UBL-5基因、及SOD3基因与调节NAD+相关。
本发明之天山雪莲汁液提升血球细胞中抗老化基因之表现量的实验结果如图1所示。经本发明之天山雪莲汁液作用48小时后，相较于控制组，能提升PBMC细胞中CCT2基因、CCT5基因、及CCT6A基因之表现量达约1.2-1.4倍不等，其它基因表现量则与控制组差异不大(结果未显示)，其中CCT6A基因之表现量具显著差异。此结果显示本发明之天山雪莲汁液能有效提升PBMC细胞中CCT2基因、CCT5基因、及CCT6A基因之表现量，能有效提升全身性抗老化的能力。
本发明之龙眼壳汁液提升血球细胞中抗老化基因之表现量的实验结果如图2所示。经本发明之龙眼壳汁液作用24小时后，相较于控制组，能显著提升PBMC细胞中CCT5基因、CCT6A基因、CCT8基因、Pink1基因、Atg1基因、Atg8基因、及FOXO3基因之表现量达约1.3-20倍不等，其它基因表现量则与控制组差异不大(结果未显示)。此结果显示本发明之龙眼壳汁液能有效提升PBMC细胞中CCT5基因、CCT6A基因、CCT8基因、Pink1基因、Atg1基因、Atg8基因、及FOXO3基因之表现量，能有效提升全身性抗老化的能力。
本发明之荞麦汁液提升血球细胞中抗老化基因之表现量的实验结果如图3所示。经本发明之荞麦汁液作用48小时后，相较于控制组，能提升PBMC细胞中CCT2基因、及CCT5基因之表现量达约1.2倍，其它基因表现量则与控制组差异不大(结果未显示)，其中CCT2基因之表现量具显著差异。此结果显示本发明之荞麦汁液能有效提升PBMC细胞中CCT2基因、及CCT5基因之表现量，能有效提升全身性抗老化的能力。
实施例5本发明之天山雪莲汁液、龙眼壳汁液、及荞麦汁液提升皮肤细胞中抗老化基因表现量之功效
本发明之一实施例以人类皮肤纤维母细胞(Human skin fibroblast)CCD-966SK细胞测试本发明之天山雪莲汁液、龙眼壳汁液、及荞麦汁液提升皮肤细胞中抗老化基因表现量之功效测试。其中，该CCD-966SK细胞系购自美国典型培养物保藏中心(ATCC，美国)，编号为
Figure GDA0004209613620000101
CRL-1881，且该细胞系培养于含有10％之胎牛血清(Fetal Bovine Serum)以及90％之Minimum Essential Medium(MEM)的培养液(购自Gibco，美国)，其中含有1mM之丙酮酸钠(Sodium pyruvate，购自Gibco，美国)、及1％之青霉素-链霉素(penicillin/streptomycin)。
首先，将1.5x105个CCD-966SK细胞培养于每孔含有2mL上述培养液之6孔培养盘中，于37℃培养16-18小时，接着将细胞分成以下四组：(1)仅加入细胞培养液之控制组、(2)加入0.5％(v/v)本发明之天山雪莲汁液之实验组、(3)加入0.5％(v/v)本发明之龙眼壳汁液之实验组、及(4)加入0.125％(v/v)本发明之荞麦汁液之实验组，并将该些组别之细胞于37℃下作用24小时或48小时后，测试各组CCD-966SK细胞中目标基因的表现量；其中，该天山雪莲汁液、该龙眼壳汁液、及该荞麦汁液系以水为浸提溶剂。接着，将该四组之CCD-966SK细胞以细胞裂解液回收细胞后，以实施例4中所述之步骤定量该四组CCD-966SK细胞中CCT2基因、CCT5基因、CCT6A基因、CCT7基因、CCT8基因、Pink1基因、Parkin基因、Atg1基因、Atg8基因、SIRT1基因、FOXO3基因、NADSYN基因、MRPS5基因、及UBL-5基因之mRNA表现量，再利用Excel软件决定变异系数与是否在统计上具有显著差异(*p值<0.05；**p值<0.01；***p值<0.001)。
本发明之天山雪莲汁液提升皮肤细胞中抗老化基因之表现量的实验结果如图4所示。经本发明之天山雪莲汁液作用24小时后，相较于控制组，能显著提升CCD-966SK细胞中CCT6A基因、CCT7基因、Atg1基因、及Atg8基因之表现量达约1.1-2.2倍不等，SIRT1基因、及FOXO3基因之表现量则约为1.05倍，其它基因表现量则与控制组差异不大(结果未显示)。此结果显示本发明之天山雪莲汁液能有效提升CCD-966SK细胞中CCT6A基因、CCT7基因、Atg1基因、Atg8基因、SIRT1基因、及FOXO3基因之表现量，能有效提升皮肤细胞抗老化的能力。
本发明之龙眼壳汁液提升皮肤细胞中抗老化基因之表现量的实验结果如图5所示。经本发明之龙眼壳汁液作用24小时后，相较于控制组，能提升CCD-966SK细胞中CCT2基因、CCT5基因、CCT7基因、Pink1基因、Atg1基因、Atg8基因、SIRT1基因、及FOXO3基因之表现量达约1.1-1.9倍不等，其它基因表现量则与控制组差异不大(结果未显示)，其中Pink1基因、SIRT1基因、及FOXO3基因之表现量具显著差异。此结果显示本发明之龙眼壳汁液能有效提升CCD-966SK细胞中CCT2基因、CCT5基因、CCT7基因、Pink1基因、Atg1基因、Atg8基因、SIRT1基因、及FOXO3基因之表现量，能有效提升皮肤细胞抗老化的能力。
本发明之荞麦汁液提升皮肤细胞中抗老化基因之表现量的实验结果如图6所示。经本发明之荞麦汁液作用48小时后，相较于控制组，能显著提升CCD-966SK细胞中CCT2基因、CCT6A基因、CCT7基因、及CCT8基因之表现量达约1.2-2.9倍不等，CCT5基因、及Pink1基因之表现量则约为1.2倍，其它基因表现量则与控制组差异不大(结果未显示)。此结果显示本发明之荞麦汁液能有效提升CCD-966SK细胞中CCT2基因、CCT5基因、CCT6A基因、CCT7基因、CCT8基因、及Pink1基因之表现量，能有效提升皮肤细胞抗老化的能力。
实施例6本发明之天山雪莲汁液、龙眼壳汁液、及荞麦汁液提升心血管细胞中抗老化基因表现量之功效
本发明之一实施例以人类脐带静脉/血管内皮细胞(Human umbilical vein/vascular endothelium cell,HUVEC)测试本发明之天山雪莲汁液、龙眼壳汁液、及荞麦汁液提升心血管细胞中抗老化基因表现量之功效测试。其中，该HUVEC细胞系购自中国台湾生物资源保存与研究中心，编号为BCRC No.H-UV001
Figure GDA0004209613620000111
CRL-1730TM，且该细胞系培养于含有10mL之50x LSGS(购自Gibco，美国)之培养液Medium 200(购自Thermo，美国，编号M200500)中，其中含有及1％之青霉素-链霉素(penicillin/streptomycin)。
首先，将1.5x105个HUVEC细胞培养于每孔含有2mL上述培养液之6孔培养盘中，于37℃培养16-18小时，接着将细胞分成以下四组：(1)仅加入细胞培养液之控制组、(2)加入0.5％(v/v)本发明之天山雪莲汁液之实验组、(3)加入0.5％(v/v)本发明之龙眼壳汁液之实验组、及(4)加入0.125％(v/v)本发明之荞麦汁液之实验组，并将该些组别之细胞分别于37℃下作用48小时后，测试各组HUVEC细胞中目标基因的表现量；其中，该天山雪莲汁液、该龙眼壳汁液、及该荞麦汁液系以水为浸提溶剂。接着，将该四组之HUVEC细胞以细胞裂解液回收细胞后，以实施例4中所述之步骤定量该四组HUVEC细胞中CCT2基因、CCT5基因、CCT6A基因、CCT7基因、CCT8基因、Pink1基因、Parkin基因、Atg1基因、Atg8基因、SIRT1基因、FOXO3基因、NADSYN基因、MRPS5基因、及UBL-5基因之mRNA表现量，再利用Excel软件决定变异系数与是否在统计上具有显著差异(*p值<0.05；**p值<0.01；***p值<0.001)。
本发明之天山雪莲汁液提升心血管细胞中抗老化基因之表现量的实验结果如图7所示。经本发明之天山雪莲汁液作用后，相较于控制组，能显著提升HUVEC细胞中CCT2基因、CCT6A基因、CCT7基因、CCT8基因、Pink1基因、Atg1基因、及SIRT1基因之表现量达约1.6-4.4倍不等，其它基因表现量则与控制组差异不大(结果未显示)。此结果显示本发明之天山雪莲汁液能有效提升HUVEC细胞中CCT2基因、CCT6A基因、CCT7基因、CCT8基因、Pink1基因、Atg1基因、及SIRT1基因之表现量，能有效提升心血管细胞抗老化的能力。
本发明之龙眼壳汁液提升心血管细胞中抗老化基因之表现量的实验结果如图8所示。经本发明之龙眼壳汁液作用后，相较于控制组，能显著提升HUVEC细胞中CCT5基因、CCT6A基因、CCT7基因、CCT8基因、Atg1基因、SIRT1基因、及FOXO3基因之表现量达约1.8-4.3倍不等，CCT2基因之表现量则约为1.8倍、其它基因表现量则与控制组差异不大(结果未显示)。此结果显示本发明之龙眼壳汁液能有效提升HUVEC细胞中CCT2基因、CCT5基因、CCT6A基因、CCT7基因、CCT8基因、Atg1基因、SIRT1基因、及FOXO3基因之表现量，能有效提升心血管细胞抗老化的能力。
本发明之荞麦汁液提升心血管细胞中抗老化基因之表现量的实验结果如图9所示。经本发明之荞麦汁液作用后，相较于控制组，能显著提升HUVEC细胞中CCT5基因、CCT6A基因、CCT7基因、CCT8基因、Pink1基因、Atg1基因、SIRT1基因、及FOXO3基因之表现量达约2-4倍不等，CCT2基因之表现量则约为1.1倍，其它基因表现量则与控制组差异不大(结果未显示)。此结果显示本发明之荞麦汁液能有效提升HUVEC细胞中CCT2基因、CCT5基因、CCT6A基因、CCT7基因、CCT8基因、Pink1基因、Atg1基因、SIRT1基因、及FOXO3基因之表现量，能有效提升心血管细胞抗老化的能力。
实施例7本发明之龙眼壳汁液、及荞麦汁液提升视网膜细胞中抗老化基因表现量之功效
本发明之一实施例以人类视网膜色素上皮细胞(Human retinal pigmentepithelial)ARPE-19细胞测试本发明之天山雪莲汁液、龙眼壳汁液、及荞麦汁液提升皮肤细胞中抗老化基因表现量之功效测试。其中，该ARPE-19细胞系购自ATCC公司(美国)，编号为CRL-2302，且该细胞系培养于含有10％之胎牛血清以及90％之DMEM/F12培养液，其中该培养液含有1:1比例之DMEM培养液(Dulbecco's Modified Eagle Medium，购自Gibco，美国，12100-046)与汉氏F12培养液(Ham's F12 Nutrient Mixture，购自Gibco，美国，12500-026)，且含有0.5mM之丙酮酸钠(sodium pyruvate)及15mM之4-羟乙基哌嗪乙磺酸(hydroxyethyl piperazineethanesulfonic acid,HEPES)缓冲溶液。
首先，将1.5x105个ARPE-19细胞培养于每孔含有2mL上述培养液之6孔培养盘中，于37℃培养16-18小时，接着将细胞分成以下五组：(1)仅加入细胞培养液且未照射蓝光之空白控制组、(2)仅加入细胞培养液且照射蓝光之正控制组、(3)加入0.5％(v/v)本发明之天山雪莲汁液之实验组、(4)加入0.5％(v/v)本发明之龙眼壳汁液之实验组、及(5)加入0.5％(v/v)本发明之荞麦汁液之实验组；其中第(2)-(5)组细胞系先放置于蓝光箱中于室温下照射蓝光15分钟后，再分别以样品于37℃下作用48小时后，测试各组ARPE-19细胞中目标基因的表现量；其中，该龙眼壳汁液、及该荞麦汁液系以水为浸提溶剂。接着，将该五组之ARPE-19细胞以细胞裂解液回收细胞后，以实施例4中所述之步骤定量该五组ARPE-19细胞中CCT2基因、CCT5基因、CCT6A基因、CCT7基因、CCT8基因、Pink1基因、Parkin基因、Atg1基因、Atg8基因、SIRT1基因、FOXO3基因、NADSYN基因、MRPS5基因、及UBL-5基因之mRNA表现量，再利用Excel软件决定变异系数与是否在统计上具有显著差异(*p值<0.05；**p值<0.01；***p值<0.001)。
本发明之龙眼壳汁液及荞麦汁液提升视网膜细胞中抗老化基因之表现量的实验结果如图10所示。正控制组细胞内CCT2基因、CCT5基因、CCT6A基因、CCT7基因、CCT8基因、Pink1基因、Atg8基因、SIRT1基因、及FOXO3基因之表现量接低于空白控制组，显示照射蓝光确实会降低视网膜色素上皮细胞中抗老化基因之表现量；而经本发明之龙眼壳汁液作用后，相较于控制组，能提升ARPE-19细胞中CCT2基因、CCT5基因、CCT6A基因、CCT7基因、CCT8基因、Pink1基因、Atg1基因、SIRT1基因、及FOXO3基因之表现量达1.1-1.7倍不等，其它基因表现量则与控制组差异不大(结果未显示)；经本发明之荞麦汁液作用后，则能提升CCT2基因、CCT5基因、CCT6A基因、Atg1基因、及FOXO3基因之表现量达1.2-1.5倍不等，其它基因表现量则与控制组差异不大(结果未显示)；经本发明之天山雪莲汁液作用后，该些基因表现量皆与控制组差异不大(结果未显示)。此些结果显示本发明之龙眼壳汁液及荞麦汁液能有效提升ARPE-19细胞中CCTs基因、Pink1基因、Atg8基因、SIRT1基因、或FOXO3基因之表现量，能有效提升视网膜细胞抗老化的能力。
实施例8本发明之植物汁液的组合的制备方法
在本发明之一实施例中，将本发明之天山雪莲汁液、本发明之龙眼壳汁液、及本发明之荞麦汁液以2.4-3.6:129.6-194.4:128.8-193.2之重量比例混合后，即为本发明之植物汁液的组合。
实施例9本发明之植物汁液的组合提升抗老化活性之功效
本发明之一实施例为测试本发明之植物汁液的组合于提升抗老化活性之功效，首先募集7位30-50岁以上之成人为受试者，每日服用2颗(每颗含2.4-3.6mg本发明之天山雪莲汁液、129.6-194.4mg本发明之龙眼壳汁液、128.8-193.2mg本发明之荞麦汁液)之本发明植物汁液的组合，在给予该植物汁液的第0周、第2周及第4周时，分别收集每位受试者的血液样本进行抗老化基因表现量分析及生化蛋白分析；其中本实施例使用之本发明植物汁液的组合中，该天山雪莲汁液、该龙眼壳汁液、该荞麦汁液皆为以水为溶剂之浸提汁液。
其中抗老化基因表现量分析系先分别将受试者血液中的周边血液单核细胞以淋巴球分离液分离，再以实施例4中所述之步骤、以及表1与表2之组合引子，定量该些周边血液单核球细胞中CCT2基因、CCT5基因、CCT6A基因、CCT7基因、CCT8基因、Pink1基因、Parkin基因、Atg1基因、Atg8基因、SIRT1基因、FOXO3基因、NADSYN基因、MRPS5基因、UBL-5基因、SOD3基因、TERT基因、及TERC基因之mRNA表现量，再利用Excel软件决定变异系数与是否在统计上具有显著差异(*p值<0.05；**p值<0.01；***p值<0.001)。
表2、定量实时反转录聚合酶连锁反应之组合引子
Figure GDA0004209613620000151
其中，生化蛋白分析系利用细胞内GSH测定试剂套组(Intracellular GSH assaykit，购自abcam，编号ab112132)分析血球中榖胱甘肽(Glutathione,GSH)的含量，其中系将受试者血液以PBS调整至106cells/mL，再以该细胞内GSH测定试剂套组于室温下进行染色15分钟，并以PBS清洗与回溶后，置于流式细胞仪(Accuri C6 Plus，BD)上机，侦测荧光为FL1 channel(Ex/Em＝490/525nm)，并以该荧光讯号作为受试者血液中榖胱甘肽的含量。
端粒为生物染色体末端的DNA重复序列，主要作用是保持染色体的完整性和控制细胞***周期，其中DNA每复制一次，端粒就会缩短一些，一旦端粒消耗殆尽，细胞则会走向凋亡，因此端粒的长度与细胞的年龄具相关，其中又已知TERT基因、及TERC基因与调节端粒的长短相关。
生化蛋白分析系分析受试者血液中榖胱甘肽(Glutathione,GSH)的含量。其中谷胱甘肽又称麸胱甘肽，为体内重要的抗氧化酵素，在肝脏中拥有较高的浓度，因此亦为重要的解毒剂，且榖胱甘肽也系体内新陈代谢重要的辅助成分，因此与维持体内各种生理代谢的稳定与顺畅相关。已有许多研究指出，体内的榖胱甘肽会随着老化、压力等而减少，若体内榖胱甘肽量不足，可能会增加心血管、肝脏及神经退化性疾病等疾病风险。
本发明之植物汁液的组合提升CCTs基因表现量之结果如图11所示；提升Atg1基因及Atg8基因表现量之结果如图12所示；提升NADSYN基因、MRPS5基因、及SOD3基因表现量之结果如图13所示；提升TERT基因表现量之结果如图14所示；其于提升血液中GSH含量之结果如图15所示。
服用本发明之植物汁液的组合共2周或4周后，受试者体内CCT2基因、及CCT7基因表现量皆显著高于受试前约2.4-3.9倍不等，CCT8基因表现量则分别高于受试前约1.8及1.3倍；而Atg1基因表现量则分别显著高于受试前约2.8及3.8倍，Atg8基因则分别高于受试前约1.4及2.5倍；NADSYN基因、及MRPS5基因表现量则皆显著高于受试前约3.9-15倍不等，SOD3基因表现量则分别高于受试前约1.04及1.2倍，其它基因表现量则与控制组差异不大(结果未显示)；而服用本发明之植物汁液的组合共4周后，TERT基因表现量亦显著高于受试前约1.5倍，其它基因表现量则与控制组差异不大(结果未显示)。该些结果显示本发明之植物汁液的组合能有效提升CCT2基因、CCT7基因、CCT8基因、Atg1基因、Atg8基因、NADSYN基因、MRPS5基因、SOD3基因、及TERT基因的表现量，能有效的全面提升抗老化的活性。
服用本发明之植物汁液的组合共2周或4周后，血液中GSH的含量皆显著高于受试前约1.16倍及1.4倍。该结果显示本发明之植物汁液的组合能有效提升血液中GSH的含量，能够有效且全面的提升抗氧化能力。
综上所述，本发明之植物汁液为一天山雪莲汁液、一龙眼壳汁液、一荞麦汁液、及其任意组合所组成；该天山雪莲汁液、该龙眼壳汁液、及该荞麦汁液皆能有效提升血球细胞、皮肤细胞、心血管细胞、及/或视网膜细胞中与线粒体或细胞抗老化相关之基因的表现量，且该三种汁液特别对心血管细胞有显著的抗老化功效。而该三种汁液的组合亦能够直接且有效的提升CCT2基因、CCT7基因、CCT8基因、Atg1基因、Atg8基因、NADSYN基因、MRPS5基因、SOD3基因、及TERT基因的表现量，能够全面的提升抗老化活性，且本发明之植物汁液能同时提升GSH的含量，以全面的提升的抗氧化活性；本发明之植物汁液能有效促进体内反转回青春有活力的状态。因此，本发明之植物汁液可用于制备抗老化之组合物的用途，其中该组合物是一医药品、一食品或一保养品，可借由口服、皮肤涂抹等方式给予一个体。
当然，本发明还可有其它多种实施例，在不背离本发明精神及其实质的情况下，熟悉本领域的技术人员可根据本发明作出各种相应的改变和变形，但这些相应的改变和变形都应属于本发明权利要求的保护范围。
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Figure GDA0004209613620000341
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【序列表】
<110> 大江生医股份有限公司
<120> 植物汁液用于提升抗老化基因表现量及/或提升GSH含量的用途
<130> 107B0618-I1
<160> 36
<170> PatentIn version 3.5
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cttggcgtac atgtctcgga t 21
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<213> Artificial Sequence
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<213> Artificial Sequence
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gtcggaagca gaggtcaggc a 21
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<213> Artificial Sequence
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aagagttggg ctctgtcagc 20
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<213> Artificial Sequence
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<223> 合成引子
<400> 36
gactcgctcc gttcctcttc 20

Claims (5)

1.一种植物汁液的用途，其特征在于，所述植物汁液用于制备提升心血管细胞中含TCP1的折叠蛋白基因、自噬作用相关基因、麸酰胺酸依赖性烟草酰胺腺嘌呤二核苷酸合成酶基因、线粒体核糖体蛋白5基因、超氧化物歧化酶3基因及端粒酶反转录酶基因表现量的组合物；该植物汁液由一天山雪莲(Smallanthus sonchifolius)愈伤组织汁液、一龙眼壳汁液及一荞麦汁液所组成；该天山雪莲愈伤组织汁液由一天山雪莲愈伤组织与一溶剂以1:1-5的重量比浸提所得，该龙眼壳汁液由一龙眼壳与该溶剂以1:5-10的重量比浸提所得，且该荞麦汁液由一荞麦与该溶剂以1:10-15的重量比浸提所得；该溶剂为水；该植物汁液的浓度为至少0.5% (v/v)；该植物汁液由该天山雪莲愈伤组织汁液、该龙眼壳汁液、该荞麦汁液以2.4-3.6:129.6-194.4:128.8-193.2比例混合所组成。
2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，该含TCP1的折叠蛋白基因含TCP1第2次单元的折叠蛋白基因、含TCP1第7次单元的折叠蛋白基因、含TCP1第8次单元的折叠蛋白基因及其任意组合。
3.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，该自噬作用相关基因含自噬作用相关基因1基因、自噬作用相关基因8基因或其组合。
4.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，该植物汁液增加抗老化活性。
5.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，该植物汁液调节一细胞的调节NAD+浓度、及/或端粒长度。
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