CN112808257B - 海藻酸钠亲和层析介质的制备方法及在玻璃酸酶提取中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了海藻酸钠亲和层析介质的制备方法，包括以CNBr活化的琼脂糖凝胶与己二胺反应生成原料的步骤；以及将原料与羧甲基纤维素、海藻酸钠共混相容生成海藻酸钠亲和层析介质的步骤，本发明人经大量实验，以上述步骤合成了含海藻酸钠的亲和层析介质，并应用在玻璃酸酶的提取中，发现有助提取高效价玻璃酸酶，达到2000u/m l以上。

Description

海藻酸钠亲和层析介质的制备方法及在玻璃酸酶提取中的 应用

技术领域

本发明涉及玻璃酸梅提取技术领域，具体涉及海藻酸钠亲和层析介质的制备方法，以及制备的海藻酸亲和层析介质在玻璃酸酶提取中的应用。

背景技术

玻璃酸酶系从哺乳动物睾丸中提取的一种能水解玻璃黏多糖的酶，又称透明质酸酶，是一种碱性糖蛋白，属内切糖苷酶，能催化玻璃酸、硫酸软骨素A、硫酸软骨素C的β-N-乙酰氨基己糖糖苷键水解。它在哺乳动物的睾丸里含量很丰富，能水解透明质酸，使其粘滞性明显下降，有利于受精时***进入卵子，也存在于***、颌下腺、蜂毒、蛇毒、皮肤、脾脏、水蛭及细胞的溶酶体中。临床用于局部注射，可加速皮下、肌内注射药液的吸收，促进局麻药的浸润，促进手术及创伤后局部水肿或血肿的扩散，也用于肠粘连。

此外，玻璃酸酶还可用于肿瘤治疗可以降低人膀胱癌的复发率；用于心肌梗塞治疗可使心肌透明质酸含量显著降低，增加血流量；另外用玻璃酸酶的酶液滴注眼前房可以降低白内障病人术后过高的眼内压。玻璃酸酶不但在医药领域有着广泛的应用，而且在保健品领域也有卓越的贡献，人为补充玻璃酸酶可消除皱纹或使局部器官增厚增高，使皮肤保持弹性，从而达到整容效果。

较知名的透明质酸酶产品不多，以Amphadase、Hyase、Vitrase、Wydase、Hylenex为例，其中Hyase、Vitrase、Wydase已停产，其中Amphadase和Hyase提取自牛睾丸，Vitrase为羊睾丸来源的透明质酸酶，不含防腐剂，其中Hylenex为从仓鼠卵巢细胞表达的重组人员透明质酸酶，酶活达到200U/ml，其余产品为150U/ml，其酶活已不能满足需求，对此市面上不断有企业进行相关的研究，如常规的提取法、发酵法及基因工程法，其中根据报道提取法、发酵法的酶活普遍在1500U/ml以下，不能满足需求,如专利文献1中公开玻璃酸酶提取方法，其成品效价在1500u/ml，专利文献2中公开玻璃酸酶提取方法，其成品效价在300iu/ml，而基因工程法的技术难度高，如Berry等公开将重组肺炎菌基因在大肠杆菌内表达最终得到极高效价的玻璃酸酶，但目前并无量产的可能，而部分研究人员在采用重组化脓链球菌基因在大肠杆菌胞内表达，但得到的玻璃酸酶效价极低，可见基因工程尚处于探索阶段，并不能实际应用，对此需对提取法或发酵法进一步研究，以寻求改进。

专利文献1：牛或羊玻璃酸酶生产工艺，申请公布号：CN103103170A。

专利文献2：一种提取玻璃酸酶精品的方法，授权公告号：CN13740667B。

发明内容

为解决上述技术缺陷，本发明提供了如下技术方案：

本申请文件第一方面提供海藻酸钠亲和层析介质的制备方法，

包括以CNBr活化的琼脂糖凝胶与己二胺反应生成原料的步骤；

以及将原料与羧甲基纤维素、海藻酸钠共混相容生成海藻酸钠亲和层析介质的步骤。

本发明人经大量实验，以上述步骤制成了含海藻酸钠的亲和层析介质，并发现其在玻璃酸酶提取中功效明显，有助制取高效价玻璃酸酶。

进一步，原料的生成：以CNBr与琼脂糖凝胶在碱性条件下与己二胺反应，时间15-30h，之后将反应产物洗至中性。

如在一实施例中，以GE Health CNBr活化Sepharose 4B凝胶，之后在pH9.0碱性条件下与1,6-二氨基己烷反应，如15h、16h、17h、18h、19h、20h、21h、22h、24h、26h、28h、30h等，在其他实施例中，碱性条件pH也可根据需求进行调整，如8.5、9.5等，或对CNBr，或琼脂糖凝胶的厂家、型号进行调整。

当然优选以水洗至中性。

进一步，原料与羧甲基纤维素、海藻酸钠反应，时间15-30h，常温下反应,之后将反应产物洗至中性形成层析介质，按质量计，原料45-60％,羧甲基纤维素10-20％、海藻酸钠30-35％。

如在一实施例中,原料55％,羧甲基纤维素15％,海藻酸钠35％,常温下反应20h。

本申请文件第二方面公开上述制备的海藻酸钠亲和层析介质在玻璃酸酶提取中的应用。

如以常见的层析方式为例，包括以下步骤

1)平衡预装柱，将海藻酸钠亲和层析介质装柱，用待提取样品的缓冲液平衡；

2)以玻璃酸酶粗品水溶解液上样；

3)以洗脱缓冲液进行洗脱样品；

4)将收集到的洗脱液超滤浓缩，并冷冻干燥。

经检测，酶活力达到2000单位u/ml。

其中，步骤4)中还包括滤膜除菌步骤，超滤浓缩液通过滤膜除菌，如在一实施例中以0.22μm的滤膜进行过滤除菌，或0.25μm，0.20μm等。

其中，玻璃酸酶粗品来源于牛睾丸。

如在一实施例中，以牛睾丸去皮绞成糜浆，加入纯化水，如1:5,1:4,1:6等，并以稀盐酸调节pH至4-5，在2-8℃反应时间3h以上，之后过滤得到清液，加入硫酸铵搅拌，过滤得到玻璃酸酶粗品。

其中糜浆与纯化水的比例，如1:5,1:4,1:6等，稀盐酸调节pH如4.2、4.4、4.5、4.7、4.9、5.0等，反应温度如2℃、4℃、5℃、7℃、8℃等，反应时间如3h、4h、5h、6h等。

对于硫酸铵的量，如按清液每升加入300-400g硫酸铵。

优选，Tris-Hcl，pH8.0缓冲液进行平衡，以及用Tris-Hcl，pH8.0，氯化钠缓冲液洗脱。

如在一实施例中，以0.1M Tris-Hcl，pH8.0缓冲液进行平衡，平衡后以溶解液上样，如流速控制在25、30、35、40cm/h，洗脱时以0.1MTris-Hcl，pH8.0，1.0M氯化钠缓冲液进行洗脱，流速如40cm、45cm、50cm、55cm/h。

此外，在溶解液上样完毕后，以0.1MTris-Hcl，pH8.0缓冲液为平衡液进行冲柱，冲至流出液的OD₂₈₀值小于0.1，之后以0.1MTris-Hcl，pH8.0，1.0M氯化钠缓冲液进行洗脱。

与现有技术相比，本发明的有益效果：

1、本发明以全新方法制备海藻酸钠亲和层析介质，其在玻璃酸酶提取中功效显著。

2、本发明提供海藻酸钠亲和层析介质在玻璃酸酶提取中的具体应用方式，提取的玻璃酸酶酶活力达到2000u/ml以上。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步说明。

玻璃酸酶粗品的制备：100公斤新鲜冷冻牛睾丸，除去皮，绞成糜浆，按1：5加入纯化水，用稀盐酸调节PH4.5，在4℃反应5小时，过滤，得到清液，按每升加入360克硫酸铵，搅拌2小时，过滤得到玻璃酸酶粗品2公斤。

第一样品：取上述玻璃酸酶粗品1公斤，用10L去离子水溶解，调节pH到8.0，在4℃冷库中溶解4h，离心得到溶解液，备用。

玻璃酸酶粗品的制备：1000公斤新鲜冷冻牛睾丸，除去皮，绞成糜浆，按1：5加入纯化水，用稀盐酸调节PH4.5，在4℃反应5小时，过滤，得到清液，按每升加入360克硫酸铵，搅拌2小时，过滤得到玻璃酸酶粗品21公斤。

第二样品：取上述牛玻璃酸酶粗品5公斤，粗品用50L去离子水溶解，调节pH到8.0，在4度冷库中溶解4小时，离心得到溶解解液，备用。

一、海藻酸钠亲和层析介质的制备

其中羧甲基纤维素采购自安丘市雄鹰纤维素有限责任公司，海藻酸钠采购自青岛明月海藻团有限公司。

a、以GE HealthCNBr活化的Sepharose 4B凝胶与1，6-二氨基己烷，在pH9.0的碱性条件下反应24h，反应结束后用纯化水洗至中性，形成原料。

b、将原料与羧甲基纤维素、海藻酸钠混合反应，其中按质量计，原料55％，羧甲基纤维素15％，海藻酸钠30％，共混溶液以水为溶剂，共混物在水溶液中含量为10％，温度25℃，时间24h，反应结束后用纯化水洗至中性，形成海藻酸钠亲和层析介质。

当然也可采用如下比例，原料60％,羧甲基纤维素10％、海藻酸钠30％；或原料55％,羧甲基纤维素10％、海藻酸钠35％等。

当然可调整pH值、反应时间等，在实际测试中效果基本一致。

二、玻璃酸酶的提取

实施例1

玻璃酸酶的提取包括以下步骤：

1)平衡预装柱，取上述制备的海藻酸钠亲和层析介质4L装柱，用15L0.1MTris-Hcl,pH8.0缓冲液进行平衡；

2)以上述第一样品中玻璃酸酶粗品水溶解液上样，控制流速30cm/h，上样完毕后以15L0.1MTris-Hcl,pH8.0缓冲液冲柱，至流出液的OD₂₈₀值小于0.1；

3)以0.1M Tris-Hcl,pH8.0，1.0MNaCl缓冲液洗脱柱内样品，控制流速在50cm/h，收集洗脱峰12L；

4)将收集到的洗脱液用截流量10000的超滤膜装置进行超滤浓缩，浓缩至3L，之后将浓缩液通过0.22μm的滤膜过滤除菌，并真空冷冻干燥得到成品。

将上述制备的成品进行检测，参照中国药典2015年版第二部的要求，进行全项测定，全项指标完全符合中国药典的要求，酶活达到2150U/ml。

实施例2

玻璃酸酶的提取包括以下步骤：

1)平衡预装柱，取上述制备的海藻酸钠亲和层析介质20L装柱，用60L0.1MTris-Hcl,pH8.0缓冲液进行平衡；

2)以上述第二样品中玻璃酸酶粗品水溶解液上样，控制流速35cm/h，上样完毕后以60L0.1MTris-Hcl,pH8.0缓冲液冲柱，至流出液的OD₂₈₀值小于0.1；

3)以0.1M Tris-Hcl,pH8.0，1.0MNaCl缓冲液洗脱柱内样品，控制流速在45cm/h，收集洗脱峰50L；

4)将收集到的洗脱液用截流量10000的超滤膜装置进行超滤浓缩，浓缩至5L，之后将浓缩液通过0.20μm的滤膜过滤除菌，并真空冷冻干燥得到成品。

将上述制备的成品进行检测，参照中国药典2015年版第二部的要求，进行全项测定，全项指标完全符合中国药典的要求，酶活达到2530u/ml。

以上仅是本发明的优选实施方式，本发明的保护范围并不仅局限于上述实施例，凡属于本发明思路下的技术方案均属于本发明的保护范围。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理前提下的若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (4)

1.海藻酸钠亲和层析介质的制备方法，其特征在于：

包括以CNBr活化的琼脂糖凝胶与己二胺反应生成原料的步骤，原料的生成：以CNBr与琼脂糖凝胶在碱性条件下与己二胺反应，时间15-30h，之后将反应产物洗至中性；

以及将原料与羧甲基纤维素、海藻酸钠共混相容生成海藻酸钠亲和层析介质的步骤，原料与羧甲基纤维素、海藻酸钠常温反应，时间15-30h，之后将反应产物洗至中性形成层析介质，按质量计，原料45-60%,羧甲基纤维素10-20%、海藻酸钠30-35%。

2.权利要求1所述制备方法所制备的海藻酸钠亲和层析介质在玻璃酸酶提取中的应用，其特征在于：包括以下步骤

1）平衡预装柱，将海藻酸钠亲和层析介质装柱，用Tris-HCl，pH8.0缓冲液进行平衡；

2）以玻璃酸酶粗品水溶解液上样；

3）用Tris-HCl，pH8.0，氯化钠缓冲液洗脱样品；

4）将收集到的洗脱液超滤浓缩，并冷冻干燥。

3.如权利要求2所述的应用，其特征在于：步骤4）中还包括滤膜除菌步骤，超滤浓缩液通过滤膜除菌。

4.如权利要求2所述的应用，其特征在于：玻璃酸酶粗品来源于牛睾丸。