CN112795668A - 一种山羊cfap43基因***/缺失标记在性状早期选择中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种山羊CFAP43基因***/缺失标记在性状早期选择中的应用。以山羊全基因组DNA为模板，通过PCR扩增山羊CFAP43基因部分片段，经过琼脂糖凝胶电泳后鉴定该基因的6‑bp***突变位点在山羊群体中的多态性。根据关联分析结果，CFAP43基因的这一***/缺失多态性位点的基因型与山羊的胸围、管围显著相关，可用于快速建立遗传资源优良的山羊群体，从而可以通过山羊性状的早期标记辅助选择加快育种进程。

Description

一种山羊CFAP43基因***/缺失标记在性状早期选择中的 应用

技术领域

本发明属于生物技术与家畜育种领域，涉及山羊CFAP43基因***/缺失(InDel)多态性的分型检测及在分子标记辅助选择育种中的应用。

背景技术

绒肉兼用型山羊品种，如陕北白绒山羊对带动畜牧业及经济发展具有重要作用，但山羊品种自身存在的个体体型分布不均、遗传性能不稳定等问题是限制其产业升级的关键问题之一。目前，利用现代分子生物技术，如分子标记辅助选择(marker-assistedselection,MAS)方法对山羊生长性状进行遗传选育已经成为研究的热点。在MAS中，候选基因法是目前主要的研究方法之一，因此，确定与生长性状相关的重要候选基因就成为提高山羊生长性状、发展山羊产业的前提。

***鞭毛多发形态异常(multiple morphological abnormalities of thesperm flagella,MMAF)可显著影响雄性的繁殖性能，并可导致不育。纤毛和鞭毛相关蛋白(cilia and flagella associated protein 43，CFAP43)基因作为MMAF相关的主要基因，在卵巢、胎盘等多种组织中均有表达，从而影响动物的繁殖。

在家畜的生长性状方面，研究发现位于IGF2基因的关键QTL对猪肌肉含量影响较大，证明IGF2基因是控制猪肌肉含量的关键候选基因。利用InDel检测方法，研究发现IGF2BP1基因存在可用于山羊生长性状选育的有效分子标记，通过对IGF2BP1基因的两位点进行组合基因型分析发现，它们能显著影响山羊的体重性状。同样，作为生长性状的候选基因，PRDM6基因存在的12-bp的缺失突变能显著影响山羊的生长和发育。肌肉生成抑制素(Myostatin)基因，又名GDF8基因，研究发现其缺失突变会导致牛的肌肉肥大表型，因此该基因对于牛、山羊等家畜的生长性状遗传选育具有重要价值。

在MAS育种中，InDel检测方法与SNP检测方法相比，具有可操作性强、检测方便且快捷等多种优点。但目前尚未见到研究CFAP43基因多态性与山羊生长性状关系的报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种山羊CFAP43基因***/缺失标记在性状早期选择中的应用，以快速建立优良生长性状的山羊遗传资源群体。

为达到上述目的，本发明采用了以下技术方案：

一种山羊CFAP43基因***/缺失多态性的检测方法，包括以下步骤：

以待测山羊(例如，陕北白绒山羊个体)全基因组DNA为模板，通过PCR扩增山羊CFAP43基因的部分片段，然后对扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，根据琼脂糖凝胶电泳结果鉴定山羊个体CFAP43基因***/缺失多态性位点的基因型，所述***/缺失多态性位点选自山羊CFAP43基因NC_030833:g.27012996-27012997位6-bp***突变位点。

优选的，所述PCR的扩增引物对为：

上游引物：5’-GGACAGAGAGACAGAGTTTCAGGT-3’

下游引物：5’-CAAGACTCCCCTATCTTCAGATTA-3’。

优选的，所述PCR采用的反应程序为：95.0℃预变性5min；94.0℃变性30s，68.0℃复性30s，72.0℃延伸20s，每个循环复性温度减1℃，共18个循环；94.0℃变性30s，50.0℃复性30s，72.0℃延伸20s，共30个循环；72.0℃延伸10min。

优选的，根据琼脂糖凝胶电泳结果，所述***/缺失多态性位点有三个基因型，其中，***/***基因型表现为168bp一条带纹，***/缺失基因型表现为162bp和168bp两条带纹，缺失/缺失基因型表现为162bp一条带纹。

一种山羊CFAP43基因***/缺失多态性的检测试剂盒，该试剂盒包括用于PCR扩增山羊CFAP43基因NC_030833:g.27012996-27012997位6-bp***突变位点的引物对(例如，上述上游引物和下游引物)。

上述山羊CFAP43基因***/缺失多态性的检测方法在山羊分子标记辅助选择育种中的应用。

优选的，所述山羊CFAP43基因NC_030833:g.27012996-27012997位6-bp***突变位点的缺失/缺失基因型为提高山羊胸围和/或管围的DNA标记(具体为InDel标记)。

本发明的有益效果体现在：

本发明以山羊基因组DNA为模板，通过序列扩增、电泳鉴定，可以高效、精确、低成本地检测山羊CFAP43基因内含子区***/缺失多态性位点(NC_030833:g.27012996-27012997)在山羊(例如，陕北白绒山羊)群体中的基因型。根据对山羊CFAP43基因的上述***/缺失多态性位点与山羊的重要体尺性状进行关联分析，结果表明本发明检测的山羊CFAP43***/缺失多态性位点存在作为提高山羊胸围、管围性状的分子标记(InDel标记)，可以用于山羊胸围、管围等生长性状的早期选择，快速建立生长性状优良的山羊种群，从而加快良种选育速度。

附图说明

图1为山羊CFAP43基因PCR扩增产物(目的片段：6-bp***突变位点)琼脂糖凝胶电泳结果；其中：M表示Marker I。

图2为山羊CFAP43基因PCR扩增产物测序图，其中：黑色方框标出的部分表示6-bp***序列(NC_030833:g.27012996-27012997insAGTTGG)。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明做进一步详细说明。所述实施例仅用于解释本发明，而非对本发明保护范围的限制。

本发明利用PCR方法对山羊CFAP43基因(参考序列：NC_030833)6-bp***突变位点在陕北白绒山羊群体中可能产生的***/缺失多态性进行检测，并将其不同基因型与山羊生长性状进行关联分析，验证其是否可以作为山羊分子育种中辅助选择的分子标记，具体说明如下。

1.实验药品与试剂

1.1生化试剂与生物学试剂：①Taq DNA聚合酶(购自Fermantas即MBI公司)；②蛋白酶K(购自华美生物工程公司)；③Marker I(购自天根生化科技(北京)有限公司)。

1.2普通试剂：普通试剂从华美生物工程公司购买，为进口分装产品，包括柠檬酸、柠檬酸钠、葡萄糖、Tris、EDTA、NaCl、NaOH、KCl、Na₂HPO₄、KH₂PO₄、Tris饱和酚、氯仿、异戊醇、无水乙醇、醋酸钠、十二烷基磺酸钠(SDS)、溴化乙锭(EB)、溴酚蓝、二甲基苯氰FF、乙酸、蔗糖、硼酸、琼脂糖等。

1.3溶液与缓冲液：所有溶液与缓冲液均采用去离子超纯水配制。试剂配制方法均参考Sambrook等编著的《分子克隆实验指南》。高压灭菌条件为15bf/in(1.034×10⁵Pa)、25min。

1)提取组织样DNA所用溶液：

除了基因组DNA提取时的公用溶液外，还配制以下试剂：

①2mol/L NaCl：11.688g溶于水，定容至100mL，高压灭菌。

②组织DNA提取液(100mL)：l mol/L Tris-HCl(pH 8.0)l mL、0.5mol/L EDTA(pH8.0)20mL，及2mol/L NaCl 5mL，定容至100mL。

2)琼脂糖凝胶电泳分析所用溶液

①0.5×TBE缓冲液：取10×TBE 50mL定容至1000mL。

②上样缓冲液：含0.25％溴酚蓝以及0.25％二甲苯青FF，溶剂为40.0％(w/v)蔗糖水溶液。

2.合成山羊CFAP43基因6-bp***突变位点扩增引物

根据参考序列，合成能够扩增包含山羊CFAP43基因6-bp***突变(NC_030833:g.27012996-27012997insAGTTGG)位点的DNA片段的引物对，引物对序列如下：

上游引物：5’-GGACAGAGAGACAGAGTTTCAGGT-3’(24bp)，

下游引物：5’-CAAGACTCCCCTATCTTCAGATTA-3’(24bp)。

以上述引物对山羊基因组进行扩增，扩增产物包含山羊CFAP43基因(NC_030833)第12内含子区6-bp***突变区域，其***/***基因型可以扩增得到168bp一条带纹，***/缺失基因型可以扩增得到162bp和168bp两条带纹，缺失/缺失基因型可以扩增得到162bp一条带纹。

3.PCR扩增山羊CFAP43基因目的片段

3.1山羊组织样品的采集与性状数据收集

选择饲养、管理条件一致的成年陕北白绒山羊个体，采取耳组织样，在70％乙醇中保存，冰盒低温带回实验室后置于-80℃冻存。采样信息如下：陕北白绒山羊耳组织样885份，采用群体随机采样方式在陕西省榆林市横山县绒山羊养殖场完成采集(2017年6月至2017年9月)；

陕北白绒山羊生长数据包括：体高、体长、十字部高、胸围、管围、胸深、胸宽，共7个体尺性状。

3.2组织样品基因组DNA的提取与分离

参考Sambrook等编著的《分子克隆实验指南》(2002)和参考以下文献：蓝贤勇.山羊重要功能基因遗传变异及其与经济性状的关系[D.]西北农林科技大学博士学位论文，2007，陕西杨凌。

3.3琼脂糖凝胶电泳检测DNA

参考Sambrook等编著的《分子克隆实验指南》(2002)。

3.4DNA的纯化

参考Sambrook等编著的《分子克隆实验指南》(2002)。

3.5分光光度法检测DNA

用紫外光光度计测定DNA样品在260nm、280nm处的OD值。计算DNA含量和OD₂₆₀/OD₂₈₀的比值。如OD₂₆₀/OD₂₈₀比值小于1.6，说明样品中含有较多的蛋白质或酚，则应进行纯化；若比值大于1.8，则应该考虑去除RNA纯化。

DNA浓度(ng/μL)＝50×OD₂₆₀值×稀释倍数。

DNA检测完毕后，取出一定的量稀释至30ng/μL作为模板，存于-20℃备用，其余的存放于-80℃。

3.6PCR扩增

PCR反应体系采用混合加样法，即根据每一个反应体系所需的各种组分的数量和1次反应所需的PCR反应的个数，算出各种反应组分的总量，加入到1个1.5mL离心管中，充分混匀后瞬时离心，再分装到每个0.2mL Eppendorf PCR管中，然后加入模板DNA，再瞬时离心后进行PCR扩增。

PCR反应体系：2×Taq PCR SuperMix(包括Taq DNA聚合酶、dNTPs和反应缓冲液，浓度为2×)6.5μL、上游引物0.5μL、下游引物0.5μL(上下游引物浓度为10pmol/μL)；模板DNA(浓度为30ng/μL山羊基因组DNA)0.6μL，及去离子水4.9μL；共13μL。

3.7PCR反应的程序

1)95.0℃预变性5min，然后进入步骤2)；

2)94.0℃变性30s，68.0℃复性30s(每个循环减1℃)，72.0℃延伸20s，共18个循环，然后进入步骤3)；

3)94.0℃变性30s，50.0℃复性30s，72.0℃延伸20s，共30个循环；

4)经过步骤3)后，72.0℃延伸10min。

4.琼脂糖凝胶电泳检测

琼脂糖凝胶电泳检测分3步：1)制作3.5％的琼脂糖凝胶，使用核酸染料染色，点样5.0μL，点样后120V电压电泳80-100min；2)待分子量不同的DNA片段分离清晰时，在BIO-RADGel Doc 2000凝胶成像***成像；3)根据琼脂糖凝胶电泳结果分析InDel多态性。

扩增后片段的电泳检测结果如图1所示，第1泳道为Marker I(由大到小依次为600bp、500bp、400bp、300bp、200bp)。2～8泳道为扩增产物检测结果：II为***/***基因型，表现为168bp一条带纹；ID为***/缺失基因型，表现为162bp和168bp两条带纹；DD为缺失/缺失基因型，表现为162bp一条带纹。对扩增的片段进行测序鉴定后，发现在存在6-bp***序列，测序峰图如图2所示。

5.山羊CFAP43基因6-bp***突变位点的频率统计分析

基因型频率是指一个群体中某一性状的某种基因型个体数占总个体数的比率：

P_YY＝N_YY/N

式中，P_YY代表某一位点的YY基因型频率；N_YY表示群体中具有YY基因型的个体数；N为检测群体的总数量。

基因频率是指一个群体中某一基因数对其等位基因总数的相对比率：

P_Y＝(2N_YY+N_Ya1+N_Ya2+N_Ya3+N_Ya4+……+N_Yan)/2N

式中，P_Y表示等位基因Y频率，N_YY表示群体中具有YY基因型的个体数量，N_Yai表示群体中具有Yai基因型个体数量，a1－an为等位基因Y的n个互不相同的复等位基因。统计结果如表1所示。

表1.山羊CFAP43基因6-bp***突变位点的群体遗传参数

根据对陕北白绒山羊CFAP43基因进行基因型和基因频率分析(表1)，陕北白绒山羊CFAP43基因6-bp***突变位点(NC_030833:g.27012996-27012997)为一个***/缺失(InDel)多态性位点。

6.山羊CFAP43基因InDel位点基因效应的关联分析

基因型数据：PCR扩增后琼脂糖凝胶电泳识别的基因型；

山羊生长性状数据：体高、体长、十字部高、胸围、管围、胸深、胸宽。

关联分析模型：利用SPSS(24.0)软件分析品种不同因素与生长性状相关性。

首先要对所得数据描述性的统计分析，来确定是不是存在离群值。然后根据数据的特性，利用方差分析、多元线性模型或者t分析进而来分析基因型的效应。在数据处理的过程中，考虑到个体的效应、基因之间的互作以及基因型的效应，采用固定模型来进行相关分析，具体分析结果如表2所示。

其中，根据实际条件进行取舍，完整模型如下所示：

Y＝μ+G+E

式中，Y表示个体表型记录；u表示总体均值；G表示标记基因型效应；E表示随机误差。

表2.CFAP43基因InDel位点与陕北白绒山羊生长性状的关联分析(平均值±标准误差)

注：同一行数据平均值肩上字母不同，表示具有统计学差异；数据单位均为厘米

由表2可以看出，对陕北白绒山羊的生长性状关联分析结果显示CFAP43基因6-bp***突变位点(NC_030833:g.27012996-27012997)与胸围(P<0.05)和管围(P<0.05)显著相关，DD基因型个体性状优于ID和II基因型个体。因此，山羊CFAP43基因NC_030833:g.27012996-27012997位6-bp***突变位点的缺失/缺失(DD)基因型可作为提高山羊胸围、管围性状的DNA分子标记，可用于对山羊性状的早期标记辅助选择。

总之，本发明利用PCR扩增方法检测山羊CFAP43基因NC_030833:g.27012996-27012997位***/缺失多态性位点，并将其与陕北白绒山羊的生长性状进行关联分析，发现其存在山羊分子育种中辅助选择的分子标记，可以用于快速建立生长性状优良的山羊种群，从而加快良种选育速度。

<110> 西北农林科技大学

<120> 一种山羊CFAP43基因***/缺失标记在性状早期选择中的应用

<160> 3

<210> 1

<211> 24

<212> DNA

<213> 上游引物

<400> 1

ggacagagag acagagtttc aggt 24

<210> 2

<211> 24

<212> DNA

<213> 下游引物

<400> 2

caagactccc ctatcttcag atta 24

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> NC_030833: g.27012996-27012997***序列

<400> 3

agttgg 6

Claims (10)

1.一种山羊CFAP43基因***/缺失多态性的检测方法，其特征在于：包括以下步骤：

以山羊基因组DNA为模板，通过PCR扩增山羊CFAP43基因的部分片段，然后对扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，根据电泳结果鉴定山羊CFAP43基因***/缺失多态性位点的基因型，所述***/缺失多态性位点选自山羊CFAP43基因NC_030833:g.27012996-27012997位6-bp***突变位点。

2.根据权利要求1所述一种山羊CFAP43基因***/缺失多态性的检测方法，其特征在于：所述PCR的扩增引物对为：

上游引物：5’-GGACAGAGAGACAGAGTTTCAGGT-3’

下游引物：5’-CAAGACTCCCCTATCTTCAGATTA-3’。

3.根据权利要求1所述一种山羊CFAP43基因***/缺失多态性的检测方法，其特征在于：所述PCR采用的反应程序为：95.0℃预变性5min；94.0℃变性30s，68.0℃复性30s，72.0℃延伸20s，每个循环复性温度减1℃，共18个循环；94.0℃变性30s，50.0℃复性30s，72.0℃延伸20s，共30个循环；72.0℃延伸10min。

4.根据权利要求1所述一种山羊CFAP43基因***/缺失多态性的检测方法，其特征在于：根据电泳结果，所述***/缺失多态性位点有三个基因型，其中，***/***基因型表现为168bp一条带纹，***/缺失基因型表现为162bp和168bp两条带纹，缺失/缺失基因型表现为162bp一条带纹。

5.山羊CFAP43基因NC_030833:g.27012996-27012997位6-bp***突变位点在山羊分子标记辅助选择育种中的应用。

6.一种山羊CFAP43基因***/缺失多态性的检测试剂盒，其特征在于：该试剂盒包括用于PCR扩增山羊CFAP43基因NC_030833:g.27012996-27012997位6-bp***突变位点的引物对。

7.根据权利要求6所述一种山羊CFAP43基因***/缺失多态性的检测试剂盒，其特征在于：所述引物对为：

上游引物：5’-GGACAGAGAGACAGAGTTTCAGGT-3’

下游引物：5’-CAAGACTCCCCTATCTTCAGATTA-3’。

8.如权利要求1所述的山羊CFAP43基因***/缺失多态性的检测方法在山羊分子标记辅助选择育种中的应用。

9.根据权利要求5或8所述的应用，其特征在于：所述山羊CFAP43基因NC_030833:g.27012996-27012997位6-bp***突变位点的缺失/缺失基因型为提高山羊胸围和/或管围的DNA标记。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于：所述山羊选自陕北白绒山羊。

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