CN113943821A

CN113943821A - Fgf7基因与山羊生长性状关联的***缺失标记及应用

Info

Publication number: CN113943821A
Application number: CN202111309688.8A
Authority: CN
Inventors: 吴贤锋; 刘远; 李文杨
Original assignee: Institute of Animal Husbandry and Veterinary of Fujian Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Institute of Animal Husbandry and Veterinary of Fujian Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2021-11-06
Filing date: 2021-11-06
Publication date: 2022-01-18
Anticipated expiration: 2041-11-06
Also published as: CN113943821B

Abstract

本发明公开了FGF7基因中一种与山羊生长性状关联的***缺失标记及应用。所述的***缺失标记位于山羊FGF7基因第二内含子区，其核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，5’端起第93‑114位***或缺失，***或缺失片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。本发明所提供的***缺失标记可用于山羊生长性状分子标记辅助选育领域中，用于对山羊生长性状的筛选，为选育或培育具有优良生长性状的山羊品种提供理论依据和遗传基础，有利于提高育种效率，加快山羊育种进程。

Description

FGF7基因与山羊生长性状关联的***缺失标记及应用

技术领域

本发明涉及山羊分子标记筛选技术领域，尤其涉及FGF7基因与山羊生长性状关联的***缺失标记及应用。

背景技术

山羊肉中含有丰富的蛋白质、维生素B₁、B₂、B₆以及铁、锌、硒等微量元素，随着人们生活水平的提高和膳食结构的改善，山羊肉在人们食物结构中的比例也越来越高。且由于近年猪肉的供不应求，优质山羊肉将在未来市场竞争中占有一席之地。随着山羊产业的快速发展，业内各方都在打造迎合不同需求的专门化品系间的杂交配套，以有限的品种资源实现专一化和高产化。在选择杂交配套的父母本时，包括体重体尺在内的生长性状是山羊生产中最为重要的经济性状。因此，研究如何通过选育提高山羊的生长性状对于山羊杂交选育研究来说具有十分重要的意义。

分子标记多指 DNA 标记，是能够鉴定区别个体或物种差异的染色体上的 DNA 序列，其源自于不同类型的突变，如***、缺失、替换、重构等。分子标记种类很多，如扩增片段长度多态性（Amplified fragment length polymorphism, AFLP）、限制性片段长度多态性（Restriction fragment length polymorphism, RFLP）和***缺失多态性（Insertion/deletion polymorphism，InDel）标记等。***缺失多态性是指在近缘种或同一物种不同个体之间基因组同一位点的序列发生了不同大小核苷酸片段的***或缺失，即一个序列上某一位点相比同源的另一个序列***或缺失了一个或多个碱基。 InDel标记具有数量多、分布广、遗传稳定性好、适用于高通量自动化检测等特点，是作为分子育种、基因定位等研究的首选工具。分子标记辅助选择（Marker-assisted selection，MAS）利用与特定性状相关联的分子标记作为辅助手段进行选择育种，其具有快速、准确、不受环境影响的优点，从而可加快育种进程，尤其对于低遗传力的生长性状具有更大的优势，随着高尖端生物技术手段如RNA-Seq，非编码RNA测序等的不断发展，MAS技术能更快捷有效的加快山羊经济性状的选择进程，可有助于我国山羊产业又好又快地发展，并将带来巨大的经济效益。

成纤维细胞生长因子7（Fibroblast growth factor 7，FGF7）基因最初被发现与胚胎发生期间干细胞的生长和存活、组织再生与癌变密切相关。随后，越来越多的研究发现FGF7基因在动物生长发育中也发挥着重要作用。研究表明，FGF7基因作为小鼠体型性状的QTL候选基因，在小鼠的骨骼生长分化中可能发挥重要作用，同时也有研究发现，FGF7基因与家禽的胴体重和肉品质性状密切相关。上述研究提示，在山羊中，FGF7基因是否可能通过影响骨骼生长发育进而影响山羊的生产性能。而迄今为止，尚无有关将山羊FGF7基因做为生长性状的分子标记的研究的相关报道。

发明内容

本发明的目的在于提供FGF7基因中一种与山羊生长性状关联的***缺失标记及应用。本发明通过发掘与山羊生长性状关联的***缺失标记，为培育优质山羊以及山羊品种选育提供理论基础。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种与山羊生长性状关联的***缺失标记，所述***缺失标记位于FGF7基因第二内含子区，其核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，5’端起第93-114位***或缺失，***或缺失片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。

一种用于扩增上述与山羊生长性状关联的***缺失标记的特异性引物对，所述引物对的核苷酸序列如下：

上游引物InDel1-F：5’-GTTGCCATTTCCATCATAGTTG -3’，

下游引物InDel1-R：5’-CATGCCCTTATTATACTTGCATTAC -3’。

上述***缺失标记或特异性引物对在山羊生长性状分子标记辅助选育中的应用。

进一步的，上述生长性状为体重（BW）、身高（BH）、体长（BL）、胸围（ChC）、胸深（ChD）、胸宽（ChW）、尻宽（HhW）、管围（ChC）、体长指数（BLI）、胸围指数（ChCI）、管围指数（CaCI）、髋骨指数（HuWI）、体躯指数（TI）中的一种或多种。

进一步的，上述应用包括如下步骤：

提取待测山羊基因组DNA，利用上述的特异性引物对进行PCR扩增，得到上述的***缺失标记。

进一步的，上述应用还包括如下步骤：

根据扩增片段的长度差异和/或PCR产物测序结果，判断山羊的生长优势；如果扩增片段中包含有216 bp大小的片段，或包含序列如SEQ ID NO. 1所示的片段，则判定待测山羊为具有生长优势的个体，确定其作为后备亲本进行育种。

进一步的，上述PCR扩增体系为10μL：基因组DNA（50ng/μL）0.8μL，上下游引物（10pmol）各0.2μL，2×Premix Taq Mix 5μL，去离子水3.8μL。

进一步的，上述PCR反应条件为：95℃预变性3min；95℃变性30s，退火30s，72℃延伸15s，40个循环，72℃延伸5 min。

进一步的，通过对上述PCR产物进行3.5%琼脂糖凝胶电泳，InDel1存在3个基因型：***型（II）、缺失型（DD）和杂合型（DI）；不同基因型的电泳结果为：II型为216 bp的一个条带， DD型为194 bp的一个条带，DI型为216 bp和194 bp的两个条带。

本发明的显著优点在于：

（1）本发明提供的山羊FGF7基因***缺失变异检测方法，不受年龄的限制，可用于山羊的早期选育，甚至在刚出生时就可进行选择。

（2）检测山羊FGF7基因***缺失变异的方法操作简便、快速准确，成本低廉且不受养殖环境条件因素影响。

（3）通过优选山羊FGF7基因InDel1位点的优势等位基因，能够快速筛选出优势个体，增加山羊生长性状的遗传进展，缩短选育时间，从而提高有效山羊个体的经济效益。

附图说明

图1为山羊FGF7基因InDel1（rs671485500）位点测序（正向）及序列对比图；图中三角代表***位置，灰色部分代表***序列。

图2为山羊FGF7基因InDel1位点分型电泳图。

具体实施方式

为了使本发明所述的内容更加便于理解，下面结合具体实施方式对本发明所述的技术方案做进一步的说明，但是本发明不仅限于此。

实施例1与生长性状关联的***缺失标记的开发

1 样品采集和DNA提取

本发明具体以437只成年母山羊为检测对象，福清山羊F1代（FQF1）87只，福清山羊F2代（FQF2）85只，努比亚山羊（NB）144只，简阳大耳羊（JY）121只。血液样本采集自福建农业科学院畜牧兽医研究所福清养羊平台（采样时间：2016年12月1日）。采用常规苯酚-氯仿法提取血液中的基因组DNA，超纯水溶解后用NanoDrop-2000微量核酸测定仪测定其浓度和纯度，根据其浓度用超纯水稀释成50 ng/μL，-20℃保存备用。与此同时，依据尔伯特等的方法（具体方法参照：Linear body measurements of cattle before and after twentyyears of selection for post weaning gain when fed two different diets）测定测量上述437只成年母山羊个体的体尺数据，具体包括体重（BW）、身高（BH）、体长（BL）、胸围（ChC）、胸深（ChD）、胸宽（ChW）、尻宽（HhW）和管围（ChC），并计算体长指数（BLI）、胸围指数（ChCI）、管围指数（CaCI）、髋骨指数（HuWI）和体躯指数（TI）。

2 引物设计和合成

以山羊FGF7基因全长序列（NC_030817.1）为参考序列，利用NCBI在线引物设计软件和Premier 5.0软件设计***缺失筛查引物，且委托福州博尚生物技术有限公司合成所设计的引物。本发明所设计的特异性引物序列如下：

上游引物InDel1-F（SEQ ID NO.1）：5'-GTTGCCATTTCCATCATAGTTG-3'，

下游引物InDel1-R（SEQ ID NO.2）：5'-CATGCCCTTATTATACTTGCATTAC-3'。

3 PCR扩增

以上述提取的基因组DNA为模板，利用上述合成的特异性引物对进行PCR扩增。

PCR扩增体系为10μL：基因组DNA（50ng/μL）0.8μL，上下游引物（10pmol）各0.2μL，2×Premix Taq Mix 5μL，去离子水3.8μL。

PCR反应条件为：95℃预变性3min；95℃变性30s，退火30s，72℃延伸15s，40个循环，72℃延伸5min。

4 PCR产物的琼脂糖凝胶电泳分析

将PCR扩增产物进行3.5%琼脂糖凝胶电泳，以溴化乙锭（ethidium bromide，EB）染色对扩增产物进行分型鉴定。将PCR 产物交送生工生物工程（上海）股份有限公司进行测序，测序结果通过DNAStar进行序列比对，挑选潜在InDel位点。

经测序后发现（图1），在山羊FGF7基因第二内含子区域内存在一个***缺失标记（InDel1），其核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，5’端起第93-114位***或缺失，***或缺失片段的核苷酸序列如 SEQ ID NO.4所示。

PCR产物电泳结果见图2。在琼脂糖凝胶电泳结果中，InDel1位点存在3个基因型：***型（II）、缺失型（DD）和杂合型（DI），***型（II）表现为216bp的一条条带，缺失型（DD）表现为194bp的一条条带，杂合型（DI）表现为216bp和194 bp的两条条带。

5 基因型频率及等位基因频率分布及遗传参数分析

利用excel软件计算山羊FGF7基因***缺失位点的基因型频率和等位频率，利用GDIcall在线计算器（http://www.msrcall.com/Gdicall.aspx）检测和多态性信息含量（PIC）。使用χ ²检验来确定FGF7基因位点多态性是否处于HardyWeinberg平衡（HWE）。

结果如表1所示，福清山羊F1代和努比亚山羊存在***型（II）、缺失型（DD）和杂合型（DI）三种基因型，而简阳大耳羊仅存在***型（II）和杂合型（DI）两种基因型。优势基因型II的基因型频率在福清山羊F1代、努比亚山羊和简阳大耳羊群体中分别为11.5%、35%和95.4%。

表1 FGF7基因InDel1位点基因型频率和等位基因频率

6 ***缺失标记（Indel1）与生长性状的关联性分析

采用方差分析（ANOVA）计算***缺失标记与山羊群体生长性状之间的相关性。所使用的统计软件为SPSS（18.0版）（IBM公司，Armonk, NY, USA）。采用基本线性模型分析山羊基因型与生长性状之间的关系：

Y _i=u+G _i+e

其中Y _i为各动物性状的实测数据；u是每个特征的过平均值；G _i为基因型影响，e为随机误差。

结果如表2所示，在福清山羊F1代群体中，InDel1与体重、体斜长、胸围、胸深、胸宽、体长指数和胸围指数极显著相关；在努比亚山羊群体中，InDel1与体斜长显著相关，与体长指数和体躯指数极显著相关；在简阳大耳羊群体中，InDel1与胸围指数和管围指数显著相关。

表2 山羊FGF7基因InDel位点与生长性状关联分析表

注：标有不同小写字母(a,b)表示差异显著，标有不同大写字母(A,B)表示差异极显著。

***缺失标记（Indel1）在福清山羊F2代群体中的遗传多态性分析

将福清山羊F2代（FQF2)群体分为两组，1组为InDel1位点选育组（该组中只有II基因型，41只），2组为自繁组（44只）。按照自由采食的方式养殖，待两组群体个体成年后，采用前述方法收集所有个体的DNA和体尺数据，并采用签署基本线性模型分析山羊***缺失标记（Indel1）与生长性状之间的关系。

结果如表3所示，通过FQF2群体选育组和自繁组比对分析结果显示：选育组的体重、体高、体斜长、胸围、胸深、胸宽、和髋骨指数均极显著高于自繁组。通过福清山羊F1代和F2代的关联分析发现，***基因型（II）为优势基因型，通过筛选该基因型的个体可增进山羊的生长势，加速山羊的选育进程。

表3 FQF2群体两组间生长性状对比分析表

以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 福建省农业科学院畜牧兽医研究所

<120> FGF7基因与山羊生长性状关联的***缺失标记及应用

<130>

<160> 4

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

gttgccattt ccatcatagt tg 22

<210> 2

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

catgccctta ttatacttgc attac 25

<210> 3

<211> 216

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

gttgccattt ccatcatagt tgttatgaat ttctctagca tgaaaatcaa agtcaatcta 60

tatgtctata ttttttcttt tgttaaatat ctgtttttct tttgttacat atgggttctt 120

tgatgaacac catatgtaaa aaacatgcat caaaattcag tatttttcaa aacaattttg 180

tattctctga agtaatgcaa gtataataag ggcatg 216

<210> 4

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

gtttttcttt tgttacatat gg 22

Claims

1.一种与山羊生长性状关联的***缺失标记，其特征在于：所述***缺失标记位于山羊FGF7基因第二内含子区，其核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，5’端起第93-114位***或缺失，***或缺失片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。

2.一种用于扩增如权利要求1所述的与山羊生长性状关联的***缺失标记的特异性引物对，其特征在于：所述引物对的核苷酸序列如下：

上游引物InDel1-F：5’-GTTGCCATTTCCATCATAGTTG-3’，

下游引物InDel1-R：5’-CATGCCCTTATTATACTTGCATTAC -3’。

3.权利要求1所述的与山羊生长性状关联的***缺失标记或权利要求2所述的特异性引物对在山羊生长性状分子标记辅助选育中的应用。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：所述生长性状为体重、身高、体长、胸围、胸深、胸宽、尻宽、管围、体长指数、胸围指数、管围指数、髋骨指数、体躯指数中的一种或多种。

5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：所述应用包括以下步骤：提取待测山羊基因组DNA，利用权利要求2所述的特异性引物对进行PCR扩增，得到所述的***缺失标记。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：所述应用还包括以下步骤：根据扩增片段的长度差异和/或PCR产物测序结果，判断山羊的生长优势；如果扩增片段中包含有216 bp大小的片段，或包含序列如SEQ ID NO.3所示的片段，则判定待测山羊为具有生长优势的个体，确定其作为后备亲本进行育种。

7.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：所述PCR扩增体系为10μL：50ng/μL基因组DNA0.8μL，10pmol上游引物InDel1-F 0.2μL，10pmol下游引物InDel1-R 0.2μL，2×PremixTaq Mix 5μL，去离子水3.8μL。

8.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：所述PCR反应条件为：95℃预变性3min；95℃变性30s，退火30s，72℃延伸15s，40个循环，72℃延伸5 min。