CN112695102B - 山羊prnt基因单核苷酸多态性在产羔性状早期选择中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了山羊PRNT基因单核苷酸多态性在产羔性状早期选择中的应用。以山羊全基因组DNA为模板，参照山羊PRNT基因CDS区的单核苷酸多态性位点设计引物，通过对扩增片段测序，鉴定PRNT基因单核苷酸多态性位点的基因型。根据性状关联分析结果，PRNT基因突变位点c.71A>G的不同基因型与山羊个体产羔数显著相关，可以用于快速建立遗传资源优良的山羊种群。

Description

山羊PRNT基因单核苷酸多态性在产羔性状早期选择中的应用

技术领域

本发明属于家畜育种技术领域，涉及山羊PRNT基因单核苷酸多态性在山羊繁殖性状的标记辅助选择(MAS)，具体涉及山羊产羔性状早期选择。

背景技术

单核苷酸多态性(SNP)就是指基因组DNA序列中由于单个核苷酸(A/T/C/G)的替换而引起的多态性。SNP属于第三代分子标记，具有密度高、双等位基因、易实现自动化检测等优点，已经在生命科学的各个领域得到广泛应用。SNPs根据在基因组中分布的位置可分为基因编码区SNPs(cSNPs)、基因周边SNPs(pSNPs)和基因间SNPs(iSNPs)三类。总的说来，cSNP比较少，因为在外显子内的变异率仅占周围序列的1/5。根据对遗传性状的影响，cSNPs又可分为两种：一种是同义cSNPs，即SNP所致编码序列的改变并不影响其所翻译的氨基酸序列，突变碱基与未突变碱基的“含义”相同；另一种是非同义cSNPs，即碱基序列的改变将导致编码氨基酸的改变，可能最终影响到蛋白质的功能。两种cSNPs对个体的表现型都具有重要意义，例如，对于分布在编码基因的3’UTR区域的SNPs来说，它们可能对基因表达起到重要调控作用，比如：影响mRNA的稳定性。

朊病毒睾丸特异性基因(PRNT)是朊病毒基因家族的成员，编码蛋白质(PRNT)在睾丸特异性表达。PRNT基因在成年反刍动物中表达较弱而最初被认为是假基因，但PRNT蛋白随后在公羊的睾丸和***中被鉴定出。其他研究发现PRNT蛋白参与了***顶体反应并降低了受精率。另外，免疫组织化学分析表明，绵羊PRNT蛋白在生发细胞发育过程中在生精小管中表达。在山羊中也有研究表明，PRNT基因不仅在睾丸中表达，在卵巢中也有表达。

目前，国内外未见关于PRNT基因遗传变异与山羊繁殖性能的相关研究报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种山羊PRNT基因单核苷酸多态性在产羔性状早期选择中的应用，以快速建立优良繁殖性状的山羊遗传资源种群。

为达到上述目的，本发明采用了以下技术方案：

一种山羊PRNT基因SNP的检测方法，包括以下步骤；

以待测山羊个体全基因组DNA为模板，利用引物对P进行PCR扩增，将PCR扩增产物(山羊个体PRNT基因CDS区域中包含SNP位点的部分片段)进行测序，根据测序结果鉴定山羊个体PRNT基因CDS区域的SNP位点的基因型。

优选的，所述引物对P为：

上游引物PRNT-F：5’-GCCTTCTATATCTCTCTCCTCAC-3’

下游引物PRNT-R：5’-ATACTGCACTTCCCTATCTTCTT-3’。

优选的，所述SNP位点为突变位点c.71A>G(即位于山羊PRNT基因的cDNA序列第71位位点，为A/G单核苷酸多态性)；所述突变位点c.71A>G的基因型根据测序结果分为三种：A/A型、A/G型及G/G型。

优选的，所述PCR扩增采用的反应程序为：95℃预变性5min；94℃变性30s，68℃退火30s，72℃延伸30s，18个循环，每循环后退火温度减1℃；94℃变性30s，50℃退火30s，72℃延伸30s，25个循环；72℃延伸10min。

上述山羊PRNT基因SNP的检测方法在山羊产羔性状分子标记辅助选择育种中的应用。

优选的，所述突变位点c.71A>G的基因型为A/A型的个体在产羔性状上较优(即c.71A>G位点的A/A型是产羔性状早期选择的cSNPs类分子标记)。

一种山羊PRNT基因SNP的检测试剂盒，该试剂盒包括上述引物对P。

优选的，所述试剂盒还包括Taq DNA聚合酶、反应缓冲液(Buffer)、dNTPs以及必要的测序试剂。

本发明的有益效果体现在：

本发明鉴定出一个新的位于山羊PRNT基因CDS区域的SNP位点(c.71A>G)，对其进行基因型、基因频率分析以及与山羊产羔性状的关联分析，结果表明本发明鉴定的SNP位点能够作为山羊产羔性状的分子标记位点，可以用于加快建立繁殖性状优良的山羊种群，从而提高良种选育速度。

本发明提供的检测方法及检测试剂盒利用序列扩增-直接测序法对SNP的分型情况进行鉴定，能够简便、精确地检测所述SNP位点的基因型，不仅为PRNT基因的单核苷酸多态性与地方山羊产羔性状关系的建立奠定了基础，更有利于地方山羊产羔性状的标记辅助选择，快速建立优良的山羊遗传资源种群。

附图说明

图1为扩增的山羊PRNT基因片段(含c.71A>G位点)样本的测序图。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明作进一步的详细说明，所述实施例仅用于解释本发明，而不是对本发明的保护范围的限制。

本发明以待测山羊全基因组DNA为模板，通过PCR扩增山羊PRNT基因CDS区域，再进行直接测序，根据测序结果鉴定出山羊PRNT基因上一个新的SNP位点(c.71A>G；参考序列GenBank登录号：AM412782.1)，发现其不同基因型对山羊产羔数性状有显著影响(P＝0.006)，并且存在提高山羊产羔数性状的DNA标记。基于此，本发明提供了检测山羊PRNT基因单核苷酸多态性的方法，该方法能够简单、快速、精确地检测所述SNP位点的基因型，可应用于山羊分子标记辅助选择育种中，加快建立繁殖性状优良的山羊遗传资源种群。并且检测不受山羊个体(母羊)年龄的限制，可用于早期选育，甚至在刚出生时就可进行选择。详见以下说明。

1.实验药品与试剂

1.1生化试剂与生物学试剂：①Taq DNA聚合酶(购自Fermantas，即MBI公司)；②蛋白酶K(购自华美生物工程公司)；③Marker(100-600bp，购自天根生化科技(北京)有限公司)。

1.2普通试剂：普通试剂从华美生物工程公司购买，为进口分装产品：柠檬酸、柠檬酸钠、葡萄糖、Tris、EDTA、NaCl、NaOH、KCl、Na₂HPO₄、KH₂PO₄、Tris饱和酚、氯仿、异戊醇、无水乙醇、醋酸钠、十二烷基磺酸钠(SDS)、溴化乙锭(EB)、溴酚蓝、二甲基苯氰FF、乙酸、蔗糖、硼酸、琼脂糖等。

1.3溶液与缓冲液：所有溶液与缓冲液均采用去离子超纯水配制；高压灭菌条件为：15bf/in(1.034×10⁵Pa)、25min。试剂配制方法均参考Sambrook等编著的《分子克隆实验指南》。

1)提取组织样DNA所用溶液

除了基因组DNA提取时的公用溶液外，还配制以下溶液：

①2mol/L NaCl：NaCl 11.688g溶于水，定容至100mL，高压灭菌。②组织DNA提取液(100mL)：l mol/L Tris-HCl(pH 8.0)l mL、0.5mol/L EDTA(pH 8.0)20mL，及2mol/L NaCl5mL，定容至100mL。

2)琼脂糖凝胶电泳分析所用溶液

①0.5×TBE缓冲液：取10×TBE 50mL定容至1000mL。②上样缓冲液：含0.25％溴酚蓝以及0.25％二甲苯青FF，溶剂为40.0％(w/v)蔗糖水溶液。

2.设计山羊PRNT基因SNP位点引物

根据NCBI公布的山羊PRNT基因序列，设计能够扩增目的位点(c.71A>G位点)的引物，合成的引物对的序列如下：

上游引物PRNT-F：5’-GCCTTCTATATCTCTCTCCTCAC-3’(23nt)，

下游引物PRNT-R：5’-ATACTGCACTTCCCTATCTTCTT-3’(23nt)。

以上述引物对山羊基因组进行扩增，扩增的目的片段中包含山羊PRNT基因CDS区域的突变位点c.71A>G。

3.PCR扩增山羊PRNT基因目的片段

3.1陕北白绒山羊耳组织样采集

采集陕北白绒山羊(母羊)个体耳组织样品共501份(采集时间：2017年7月，采集地点：陕西省榆林市横山县)，用于后续DNA提取。所有样品均包含产羔数数据。

3.2组织样品中基因组DNA的提取与分离

参考Sambrook等编著的《分子克隆实验指南》(2002)和参考以下文献：蓝贤勇.山羊重要功能基因遗传变异及其与经济性状的关系[D]西北农林科技大学博士学位论文，2007，陕西杨凌。

3.3琼脂糖凝胶电泳检测DNA

参考Sambrook等编著的《分子克隆实验指南》(2002)。

3.4DNA的纯化

参考Sambrook等编著的《分子克隆实验指南》(2002)。

3.5分光光度法检测DNA

用紫外光光度计测定DNA样品在260nm、280nm处的OD值。计算DNA含量和OD₂₆₀/OD₂₈₀的比值。如OD₂₆₀/OD₂₈₀比值小于1.6，说明样品中含有较多的蛋白质或酚，则应进行纯化；若比值大于1.8，则应该考虑去除RNA纯化。

DNA浓度(ng/μL)＝50×OD₂₆₀值×稀释倍数。

DNA检测完毕后，取出一定的量稀释至20ng/μL，存于-20℃备用，其余的存放于-80℃。

3.6PCR的反应体系

PCR反应体系采用混合加样法，即根据每一个反应体系所需的各种组分的数量和1次反应所需的PCR反应的个数，算出各种反应组分的总量，加入到1个1.5mL离心管中，充分混匀后瞬时离心，再分装到每个0.2mL Eppendorf PCR管中，然后加入模板DNA，再瞬时离心后进行PCR扩增；PCR反应体系组成(体积共13μL)：2×Taq PCR SuperMix(包括Taq DNA聚合酶、dNTPs、Mg2⁺和反应缓冲液，浓度为2×)6.5μL、上游引物0.4μL、下游引物0.4μL(上、下游引物浓度均为10pmol/μL)、模板DNA(浓度为20ng/μL的山羊基因组DNA)0.5μL，以及去离子水5.2μL。

3.7PCR的反应程序

1)95.0℃预变性5min，然后进入步骤2)；

2)94.0℃变性30s，68.0℃退火30s(每个循环减1℃)，72.0℃延伸30s，共18个循环，每循环后退火温度减1℃，然后进入步骤3)；

3)94.0℃变性30s，50.0℃退火30s，72.0℃延伸30s，共25个循环；

4)经过步骤3)后，72.0℃延伸10min。

4.测序鉴定分型

PCR产物经过琼脂糖凝胶电泳分离，然后回收目的条带并通过直接测序法进行分型鉴定(图1)。

5.山羊PRNT基因突变位点(c.71A>G)的频率统计分析

1)基因型频率

基因型频率是指一个群体中某一性状的某种基因型个体数占总个体数的比率：

P_YY＝N_YY/N

其中，P_YY代表某一位点的YY基因型频率；N_YY表示群体中具有YY基因型的个体数；N为检测群体的总数量。

2)基因频率

基因频率是指一个群体中某一基因数对其等位基因总数的相对比率，计算的公式可以写成：

P_Y＝(2N_YY+N_Ya1+N_Ya2+N_Ya3+N_Ya4+……+N_Yan)/2N

其中，P_Y表示等位基因Y频率，N_YY表示群体中具有YY基因型的个体数量，N_Yai表示群体中具有Yai基因型的个体数量，a1-an为等位基因Y的n个互不相同的复等位基因。

山羊PRNT基因突变位点的基因型频率、基因频率及遗传多态性指数如表1所示。

表1.山羊PRNT基因突变位点c.71A>G的遗传参数分析

根据表1结果确定c.71A>G属于单核苷酸多态性(SNP)位点。

6.山羊PRNT基因SNP位点与产羔性状的关联性分析

基因型数据：PCR扩增后通过直接测序识别的基因型；

分析方法：利用SPSS进行性状的关联性分析，结果如表2所示。

表2.山羊PRNT基因单核苷酸多态性位点(c.71A>G)与产羔数的关联分析

注：数据值肩上的字母不同，表示具有显著统计学差异

参见表2，501头陕北白绒山羊个体的基因型(A/A型、A/G型、G/G型)与产羔数性状关联性分析结果表明，PRNT基因突变位点c.71A>G作为SNP位点对产羔数性状有显著影响(P＝0.006)。其中，山羊PRNT基因突变位点c.71A>G的基因型(例如，A/A型)可作为山羊产羔数性状的DNA分子标记。

总之，本发明利用PCR扩增-直接测序法检测山羊PRNT基因的SNP位点(c.71A>G)并将其与山羊的产羔性状进行关联性分析，发现其与山羊产羔性状显著相关，并且存在可以作为山羊分子育种中辅助选择的分子标记，快速建立繁殖性状优良的山羊(母羊)种群，从而加快良种选育速度。同时，根据本发明可以确定PRNT基因作为山羊(母羊)的繁殖性能候选基因，可以通过进一步分析PRNT基因调控山羊繁殖性能的机制为山羊育种(提高山羊繁殖性能)提供重要理论和实践基础。

<110> 西北农林科技大学

<120> 山羊PRNT基因单核苷酸多态性在产羔性状早期选择中的应用

<160> 2

<210> 1

<211> 23

<212> DNA

<213> PRNT-F

<400> 1

gccttctata tctctctcct cac 23

<210> 2

<211> 23

<212> DNA

<213> PRNT-R

<400> 2

atactgcact tccctatctt ctt 23

Claims (5)

1.一种山羊PRNT基因SNP的检测方法在山羊母羊分子标记辅助选择育种中的应用，所述山羊PRNT基因SNP的检测方法包括以下步骤：

以山羊基因组DNA为模板，利用PCR扩增山羊PRNT基因CDS区域中包含SNP位点的部分片段，将扩增产物进行测序，根据测序结果鉴定山羊PRNT基因SNP位点的基因型；

所述SNP位点选自突变位点c.71A>G；

所述突变位点c.71A>G的基因型为A/A型的个体在产羔性状上较优。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述突变位点c.71A>G的基因型根据测序结果分为三种：A/A型、A/G型及G/G型。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述PCR的扩增引物对为：

上游引物PRNT-F：5’-GCCTTCTATATCTCTCTCCTCAC-3’

下游引物PRNT-R：5’-ATACTGCACTTCCCTATCTTCTT-3’。

4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述PCR的反应程序为：95℃预变性5min；94℃变性30s，68℃退火30s，72℃延伸30s，18个循环，每循环后退火温度减1℃；94℃变性30s，50℃退火30s，72℃延伸30s，25个循环；72℃延伸10min。

5.山羊PRNT基因突变位点c.71A>G在山羊母羊分子标记辅助选择育种中的应用，其特征在于；所述突变位点c.71A>G的基因型为A/A型的个体在产羔性状上较优。

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