CN113649095B - 一种用于核酸检测的高度集成式微流控芯片及使用方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种用于核酸检测的高度集成式微流控芯片及使用方法，属于微流控技术领域以及生物检测领域。该微流控芯片由基片与盖片组成，基片与盖片通过胶粘接方式连接。本发明设有多个独立的反应池，可以实现对单一样品进行多靶标检测。本发明采用磁珠法实现核酸的提纯，通过离心驱动的方式实现对液体的操控。芯片上设置油相池进行必要位置生物试剂隔离。并且该微流控芯片上设有毛细阀，以控制液体的通断。本发明对检测所需的样品量和试剂使用量需求更少、检测过程耗时更短。并且可以实现从待测样品到检测结果的全自动操作。
Description
技术领域
本发明属于微流控技术领域以及生物检测领域，涉及一种用于核酸检测的高度集成式微流控芯片及使用方法。
背景技术
微流控芯片(Microfluidic Chip)是将储液池、通道、反应池等基本功能单元集成在方寸大小的操作平台上，用以完成不同的生物化学反应的一种芯片。在微流控芯片上，通过合理的芯片设计，可以实现液体的可控流动。
在核酸检测过程中，通常需要将采集到的生物标本(如鼻咽拭子、血液等)进行预处理，以去除大部分干扰检测的杂质，从而获得待测样品；随后，需要对待测样品进行裂解、清洗、洗脱等核酸提取纯化操作；之后将提纯后的核酸进行核酸扩增操作；最后利用专用仪器进行核酸检测。因此，核酸检测需要专业人员进行操作，并且所需检测时间较长。由于微流控芯片尺寸在微米级尺度，因此具有对检测所需的样品量和试剂使用量需求更少、检测过程耗时更短等优点。因此，微流控芯片在核酸检测领域具有更大的应用潜力。
发明内容
根据上述提出的技术问题，本发明的目的是提供一种用于核酸检测的高度集成式微流控芯片。本发明设有多个独立的反应池，可以实现对单一样品进行多靶标检测。本发明采用磁珠法实现核酸的提纯，通过离心驱动的方式实现对液体的操控。芯片上为防止发生生物试剂的不必要混合，在其中间设置油相池进行隔离。并且该微流控芯片上设有毛细阀，以控制液体的通断。本发明可以实现从待测样品到检测结果的全自动操作。
为了达到上述目的，本发明采用的技术方案如下：
一种用于核酸检测的高度集成式微流控芯片，包括具有微结构的基片和盖片。基片与盖片通过胶粘接方式连接。
所述的盖片为圆形片状结构，其中心设有定位孔，用于连接驱动电机。
所述的具有微结构的基片主体为圆形结构，与盖片形状匹配，且基片中心也设有用于连接驱动电机的定位孔。所述的基片上设有进液孔1、油相池A2、裂解液池3、油相池B4、清洗液池A5、清洗液池B6、油相池C7、多个反应池8、洗脱液池9、毛细阀A10、出气孔11、废液池12、Mix溶液池13、毛细阀B14、“齿轮形”流道15、毛细阀C16，基片与盖片通过有效键合形成封闭空间，构成微流道和微腔室。具体如下：
所述油相池A2、裂解液池3、油相池B4、清洗液池A5、清洗液池B6、油相池C7、洗脱液池9、Mix溶液池13上均设有进液孔，废液池12上设有出气孔。所述油相池A2、裂解液池3、油相池B4、清洗液池A5、清洗液池B6、油相池C7、洗脱液池9依次通过沟道相连，且七个池均处于相同曲率半径处，设置油相池进行必要位置生物试剂隔离，保证裂解液、清洗液、洗脱液以及油相等液体在离心过程中不发生混合。所述Mix溶液池13一端与洗脱液池9通过沟道连通，另一端与“齿轮形”流道15的近轴心端连通；所述Mix溶液池13相较于洗脱液池9曲率半径更大，“齿轮形”流道15相较于Mix溶液池13曲率半径更大，从而保证流体离心过程中的分级流动。
所述的“齿轮形”流道15为沿圆周呈齿轮形排列，由近轴心端和远轴心端构成，所述远轴心端与废液池12连通，废液池12上设有出气孔11。“齿轮形”流道15的深度为0.2-0.5mm。所述的反应池8通过毛细阀C16与“齿轮形”流道15连通，反应池8个数与“齿轮形”流道15的齿状突起个数相同。离心进样后每个齿状突起内的反应体系通过离心力进入与齿状突起相连的反应池8中。
所述油相池A2、裂解液池3、油相池B4、清洗液池A5、清洗液池B6、油相池C7、反应池8、洗脱液池9、废液池12、Mix溶液池13的腔室深度为0.5-1mm，各腔室间的连接沟道深度为0.2-0.5mm。
所述基片微结构中，所述的洗脱液池9与Mix溶液池13、Mix溶液池13与“齿轮形”流道15、“齿轮形”流道15与反应池8之间分别设置了毛细阀A10、毛细阀B14、毛细阀C16，其中毛细阀A10宽度为0.4-0.6mm，毛细阀B14宽度为0.2-0.4mm，毛细阀C16宽度为0.1-0.2mm、毛细阀深度为100-200μm。由于各个毛细阀的尺寸不同，因此具有不同的液体突破阈值，以实现洗脱液与Mix溶液混合以得到反应体系和随后的混合后反应体系的分配并离心进样至反应池的操作。
进一步的，所述的反应池8数量至少为两个；根据生物检测反应需要，其中，至少一个反应池8作为检测组，用于某一种核酸的特异性检测，不同的反应池中加入不同的特异性反应物质，可以实现单一样本中的不同核酸的特异性检测。如果要求设置对照组，反应池8中可以不添加特异性反应物质。所述多个反应池的尺寸相同，容积为1-2μL。
进一步的，所述进液孔1为圆形，其尺寸与生物实验中的移液枪的标准Tip头相匹配，操作人员可以通过使用移液枪或其他进样装置进行待测样本进样操作，以方便操作人员使用。
所述基片和盖片可以通过注塑成型等复制技术进行该微结构的制造，材料可选择大多数的高分子聚合物材料，如聚碳酸酯(Polycarbonate，PC)。
所述的油相、裂解液、清洗液、洗脱液、Mix溶液和特异性反应物质均为市售产品。
本发明所使用的胶粘剂需要具有较好的生物兼容性，对核酸检测过程不会产生负面影响；并且在不堵塞流道的前提下，所使用的胶粘剂可以提供较高的键合强度，并且可以耐受核酸检测过程中温度变化条件(如PCR，LAMP等)，以防止反应池间漏液串孔造成的样品污染导致的检测失败。
一种用于核酸检测的高度集成式微流控芯片的使用方法，高度集成式微流控芯片配合专用仪器进行使用，专用仪器包括磁驱动模块、离心驱动模块、温控模块、荧光检测模块。包括以下步骤：
(1)使用生物实验中的移液枪预先将油相、裂解液、清洗液、洗脱液、Mix溶液加入到相对应的腔室中，并手动粘贴聚四氟乙烯薄膜；
(2)使用生物实验中的移液枪将磁珠通过油相池A2上的进液孔，加入到油相池A2中。随后将待检测样本通过裂解液池3上的进液孔加入到裂解液池3中；
(3)磁珠存储在油相池A2中，其专用检测仪器中设有磁驱动模块用于磁珠的移动。磁珠依次通过裂解液池3、油相池B4、清洗液池A5、清洗液池B6、油相池C7、洗脱液池9，磁珠在各反应池停留数分钟，最终在洗脱液池9内将磁珠上吸附的目标核酸洗脱下来，完成核酸的提纯操作，得到含有核酸的洗脱液；随后磁珠转移到相邻的油相池C7中，避免下一步配置反应体系过程中，磁珠混入反应体系中；
(4)磁驱动模块工作结束，离心驱动模块启动，此时毛细阀A10保持开启，毛细阀B14和毛细阀C16保持关闭，通过离心驱动的方式，使得洗脱液池9中的含有核酸的洗脱液与Mix溶液池13中的Mix溶液发生充分混合后，得到反应体系；
(5)程序控制离心驱动模块增大离心转速，进行进一步离心，此时毛细阀B14由关闭状态变为开启状态，毛细阀C16依旧保持关闭状态，将步骤(4)得到的反应体系通过近轴心端分配入“齿轮形”流道15中，充满“齿轮形”流道，最后多余的液体从远轴心端流入废液池12，离心过程中气体通过出气孔11排除；
(6)程序控制离心驱动模块再次增大离心转速，再进行进一步离心，此时毛细阀C16由关闭状态变为开启状态，将“齿轮形”流道15单个齿状突起中的反应体系离心进样至反应池8中，完成核酸的分配以及进样操作。
(7)离心驱动模块工作结束，温控模块和荧光检测模块启动，根据温控模块预先设定的程序，完成反应所需的温度循环。过程中，荧光检测模块实时检测反应产生的荧光强度，完成核酸检测。
本发明的有益效果为：
(1)相较于实验室中核酸检测过程，该微流控芯片对检测所需的样品量和试剂使用量需求更少、检测过程耗时更短。
(2)将复杂繁琐的核酸检测流程高度集成在该微流控芯片上，可以实现从待测样品到检测结果的全自动操作。
附图说明
为了更清楚地说明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图做以简单的介绍。
图1为本发明提供的用于核酸检测的高度集成式微流控芯片的基片示意图。
图2为本发明提供的用于核酸检测的高度集成式微流控芯片的盖片示意图。
图3为本发明提供的用于核酸检测的高度集成式微流控芯片的装配示意图。
图中，1进液孔；2油相池A；3裂解液池；4油相池B；5清洗液池A；6清洗液池B；7油相池C；8反应池；9洗脱液池；10毛细阀A；11出气孔；12废液池；13Mix溶液池；14毛细阀B；15“齿轮形”流道；16毛细阀C。
具体实施方式
需要说明的是，在不冲突的情况下，本发明中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。下面将参考附图并结合实施例来详细说明本发明。
本发明所提供的基片与盖片采用胶粘接键合方法，需选用具有一定生物兼容性并且可以提供足够键合强度的胶粘剂。基片与盖片通过密封键合形成封闭腔室。该微流控芯片包括油相池A2、裂解液池3、油相池B4、一号清洗液池A5、二号清洗液池B6、油相池C7、洗脱液池9、Mix溶液池13、“齿轮形”流道15、反应池8、废液池12结构。进液孔设为与生物实验中的移液枪的标准Tip头相匹配的圆形，出气孔11则略小于进液孔1。该微流控芯片上设有多个反应池8，根据生物检测反应需要，在特定的反应池8内预先置入特异性反应物质或材料或是核酸序列。
如图1、2所示，在基片上设有定位孔，用于微流控芯片的定位。在基片与盖片完成胶粘接键合后，在盖片上同样有相同形状的定位孔，其位置对应基片上定位孔位置。
如图1所示该微流控芯片基片示意图，具体描述了该微流控芯片的微结构。在本发明使用前，从油相池A2至Mix溶液池13顺时针先后将市售的油相、裂解液、清洗液、洗脱液、Mix溶液利用移液枪分别加入到相应的腔室中，磁珠存储在油相池A2中。在使用时，将待测样品通过移液枪加入至裂解液池3中，本发明所使用的专用仪器中的磁驱动模块操纵磁珠转移，在磁珠转移流程中，磁珠在裂解液池3中移动10min，随后通过油相池B4进入一号清洗液池A5中，在一号清洗液池A5在停留清洗2min后，进入二号清洗液池B6中停留清洗2min，两次清洗结束后，磁珠通过油相池C7进入洗脱液池9中，在洗脱液池9中停留10min后，磁珠返回油相池C7，完成核酸的提纯操作；随后，离心驱动***启动，在转速为500rpm下，毛细阀A10保持开启，毛细阀B14和毛细阀C16保持关闭。此时，带有核酸的洗脱液与Mix溶液充分混合，配成反应体系；进一步地，离心驱动***转速提高，在转速为1000rpm下，毛细阀B14由关闭状态变为开启状态。毛细阀C16依旧保持关闭状态。此时，配好的反应体系进入到“齿轮形”流道中15，充满“齿轮形”流道，多余反应体系流入废液池12中；进一步地，离心驱动***转速提高，在转速为2000rpm下，毛细阀C16由关闭状态变为开启状态。此时，单个齿状突起中的反应体系离心进样至与之相通的反应池8中，完成核酸的分配以及进样操作；最终，专用仪器中温控模块开始工作，最终通过荧光检测模块得到检测结果。
以上所述实施例仅表达本发明的实施方式，但并不能因此而理解为对本发明专利的范围的限制，应当指出，对于本领域的技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些均属于本发明的保护范围。
Claims (7)
1.一种用于核酸检测的高度集成式微流控芯片，其特征在于，所述的高度集成式微流控芯片包括具有微结构的基片和盖片；
所述的盖片为圆形片状结构，其中心设有定位孔，用于连接驱动电机；
所述的具有微结构的基片主体为圆形结构，与盖片形状匹配，且基片中心也设有用于连接驱动电机的定位孔；所述的基片上设有进液孔(1)、油相池A(2)、裂解液池(3)、油相池B(4)、清洗液池A(5)、清洗液池B(6)、油相池C(7)、多个反应池(8)、洗脱液池(9)、毛细阀A(10)、出气孔(11)、废液池(12)、Mix溶液池(13)、毛细阀B(14)、“齿轮形”流道(15)、毛细阀C(16)，基片与盖片通过有效键合形成封闭空间，构成微流道和微腔室；具体如下：
所述油相池A(2)、裂解液池(3)、油相池B(4)、清洗液池A(5)、清洗液池B(6)、油相池C(7)、洗脱液池(9)、Mix溶液池(13)上均设有进液孔，废液池(12)上设有出气孔；所述油相池A(2)、裂解液池(3)、油相池B(4)、清洗液池A(5)、清洗液池B(6)、油相池C(7)、洗脱液池(9)依次通过沟道相连，七个池均处于相同曲率半径处，保证裂解液、清洗液、洗脱液以及油相等液体在离心过程中不发生混合；所述Mix溶液池(13)一端与洗脱液池(9)通过沟道连通，另一端与“齿轮形”流道(15)的近轴心端连通；所述Mix溶液池(13)相较于洗脱液池(9)曲率半径更大，“齿轮形”流道(15)的曲率半径大于Mix溶液池(13)，保证流体离心过程中的分级流动；
所述的“齿轮形”流道(15)为沿圆周呈齿轮形排列，由近轴心端和远轴心端构成，所述远轴心端与废液池(12)连通，废液池(12)上设有出气孔(11)；所述的反应池(8)通过毛细阀C(16)与“齿轮形”流道(15)连通，反应池(8)个数与“齿轮形”流道(15)的齿状突起个数相同；离心进样后每个齿状突起内的反应体系通过离心力进入与齿状突起相连的反应池(8)中；
所述基片微结构中，所述的洗脱液池(9)与Mix溶液池(13)、Mix溶液池(13)与“齿轮形”流道(15)、“齿轮形”流道(15)与反应池(8)之间分别设置毛细阀A(10)、毛细阀B(14)、毛细阀C(16)。
2.根据权利要求1所述的一种用于核酸检测的高度集成式微流控芯片，其特征在于，所述的反应池(8)数量至少为两个；根据生物检测反应需要，其中，至少一个反应池(8)作为检测组，用于某一种核酸的特异性检测，不同的反应池中加入不同的特异性反应物质，用于实现单一样本中的不同核酸的特异性检测；如果要求设置对照组，反应池(8)中可以不添加特异性反应物质。
3.根据权利要求1所述的一种用于核酸检测的高度集成式微流控芯片，其特征在于，所述的多个反应池的尺寸相同，容积为1-2μL。
4.根据权利要求1所述的一种用于核酸检测的高度集成式微流控芯片，其特征在于，所述的“齿轮形”流道(15)的深度为0.2-0.5mm。
5.根据权利要求1所述的一种用于核酸检测的高度集成式微流控芯片，其特征在于，所述的油相池A(2)、裂解液池(3)、油相池B(4)、清洗液池A(5)、清洗液池B(6)、油相池C(7)、反应池(8)、洗脱液池(9)、废液池(12)、Mix溶液池(13)的腔室深度为0.5-1mm，各腔室间的连接沟道深度为0.2-0.5mm。
6.根据权利要求1所述的一种用于核酸检测的高度集成式微流控芯片，其特征在于，所述的毛细阀A(10)宽度为0.4-0.6mm，毛细阀B(14)宽度为0.2-0.4mm，毛细阀C(16)宽度为0.1-0.2mm、毛细阀深度为100-200μm。
7.一种权利要求1-6任一所述的用于核酸检测的高度集成式微流控芯片的使用方法，使用过程中配合专用仪器实现，所述专用仪器包括：磁驱动模块、离心驱动模块、温控模块、荧光检测模块；其特征在于，包括以下步骤：
(1)使用生物实验中的移液枪预先将油相、裂解液、清洗液、洗脱液、Mix溶液加入到相对应的腔室中，并粘贴聚四氟乙烯薄膜；
(2)使用生物实验中的移液枪将磁珠通过油相池A(2)上的进液孔，加入到油相池A(2)中；随后将待检测样本通过裂解液池(3)上的进液孔加入到裂解液池(3)中；
(3)磁珠存储在油相池A(2)中，通过磁驱动模块驱动磁珠移动：磁珠依次通过裂解液池(3)、油相池B(4)、清洗液池A(5)、清洗液池B(6)、油相池C(7)、洗脱液池(9)，磁珠在各反应池停留数分钟，最终在洗脱液池(9)内将磁珠上吸附的目标核酸洗脱下来，完成核酸的提纯操作，得到含有核酸的洗脱液；随后磁珠转移到相邻的油相池C(7)中，避免下一步配置反应体系过程中，磁珠混入反应体系中；
(4)磁驱动模块工作结束，启动离心驱动模块，此时毛细阀A(10)开启，毛细阀B(14)和毛细阀C(16)关闭，通过离心驱动的方式，使洗脱液池(9)中的含有核酸的洗脱液与Mix溶液池(13)中的Mix溶液发生充分混合后，得到反应体系；
(5)通过离心驱动模块增大离心转速，进一步离心，此时毛细阀B(14)由关闭状态变为开启状态，毛细阀C(16)保持关闭状态，将步骤(4)得到的反应体系通过近轴心端分配入“齿轮形”流道(15)中充满“齿轮形”流道，多余的液体流入废液池(12)，离心过程中气体通过出气孔(11)排除；
(6)通过离心驱动模块再次增大离心转速，再进一步离心，此时毛细阀C(16)由关闭状态变为开启状态，将“齿轮形”流道(15)单个齿状突起中的反应体系离心进样至反应池(8)中，完成核酸的分配以及进样操作；
(7)离心驱动模块工作结束，启动温控模块和荧光检测模块，由温控模块完成反应所需的温度循环；过程中，荧光检测模块实时检测反应产生的荧光强度，完成核酸检测。
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