CN112724236A - 一种两性蛋白1的抗原肽及其抗体与应用 - Google Patents

一种两性蛋白1的抗原肽及其抗体与应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种两性蛋白1的抗原肽及其抗体与应用，属于生物技术领域。本发明的抗原肽为两性蛋白1(1‑278)片段的抗原肽，其氨基酸序列为CLPSPTASPN。以该抗原肽为抗原制备的抗体能够特异性识别两性蛋白1(1‑278)片段、而不识别两性蛋白1全长，可以用于检测人脑标本及动物标本中两性蛋白1被剪切的程度，用于阿尔兹海默病发病机制的研究，用于阿尔兹海默病的早期诊断等。

Description

一种两性蛋白1的抗原肽及其抗体与应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种两性蛋白1(Amphiphysin I)的抗原肽及其抗体与应用。
背景技术
阿尔兹海默病(Alzheimer disease,AD)是临床上最常见的神经变性疾病，也是导致老年人痴呆最常见的原因。60岁以上老年人患病率高达5％，给社会和家庭带来沉重负担[1,2]。但迄今为止，AD发病的原因尚不清楚，因此也缺乏针对发病机制、延缓病程的治疗措施。
两性蛋白1(Amphiphysin I)广泛表达与神经末梢，参与网格蛋白介导的内吞过程[3,4]。Amphiphysin I介导了突触囊泡的内化和***，感受和促进膜的弯曲[5]，并刺激发动蛋白再膜上的GTP酶活性[6]。在tau病的小鼠模型JNPL3中发现了Amphiphysin I的蛋白水平降低[7]，但机制尚不清楚。并且申请人研究发现，AD患者脑组织中的Amphiphysin I被剪切成片段，介导Amphiphysin I剪切的蛋白酶为天冬酰胺内肽酶(AEP)。在AD发病过程中脑内的AEP异常激活[8,9]，剪切Amphiphysin I的N278位点，形成Amphiphysin I(1-278)片段，进一步介导神经损伤和AD的发病。
鉴于AEP剪切Amphiphysin I形成的Amphiphysin I(1-278)片段在AD发病中起到重要作用，检测实验动物标本及人体液中的Amphiphysin I(1-278)片段对AD发病机制的理解具有重要的作用。但目前为止，尚无检测脑内被AEP剪切产生的Amphiphysin I(1-278)片段的抗体，给相关研究带来了极大的不便。
参考文献：
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9.Zhang Z,Song M,Liu X,Su Kang S,Duong DM,Seyfried NT,Cao X,Cheng L,Sun YE,Ping Yu S,Jia J,Levey AI,Ye K.Delta-secretase cleaves amyloidprecursor protein and regulates the pathogenesis in Alzheimer's disease.NatCommun.2015,6:8762.
发明内容
本发明的目的是开发针对Amphiphysin I(1-278)片段的抗体，提供一种Amphiphysin I(1-278)片段的抗原肽及其抗体和应用，用于AD及衰老相关疾病的发病机制研究和疾病早期诊断。
本发明的目的通过以下技术方案实现：
一种Amphiphysin I(1-278)片段的抗原肽，其氨基酸序列为：CLPSPTASPN。
一种抗体，以上述抗原肽为抗原制备得到。进一步地，所述的抗体以Ac-CLPSPTASPN与载体蛋白交联后得到的交联多肽为抗原制备得到，所述的载体蛋白优选为KLH。所述的抗体可以为单克隆抗体，也可以为多克隆抗体。
进一步地，所述的多克隆抗体为兔多克隆抗体。
进一步地，所述的兔多克隆抗体的制备方法包括以下步骤：以上述交联多肽为免疫原免疫家兔，收集家兔血液制备抗血清，将抗血清分离纯化得到兔多克隆抗体。所述的抗血清的分离纯化采用常规技术手段进行，即采用抗原亲和层析法对抗血清进行纯化，得到纯化的兔多克隆抗体。
本发明Amphiphysin I(1-278)片段的抗原肽具有很好的免疫原性，以其为免疫原得到的兔多克隆抗体特异性好、效价高，只识别AEP剪切形成的Amphiphysin I(1-278)片段，而不识别全长的Amphiphysin I；效价可以达到1∶512000。基于所述抗体的特异性，其可用于检测人脑标本及动物标本中Amphiphysin I蛋白被剪切的程度，用于AD发病机制的研究，用于AD的早期诊断等。
一种检测Amphiphysin I蛋白被剪切的程度的试剂，包括上述抗体。
一种AD早期诊断试剂，包括上述抗体。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
(1)现有的Amphiphysin I抗体都是无差异性地识别全长的Amphiphysin I蛋白，研究发现Amphiphysin I被剪切后形成的Amphiphysin I(1-278)片段才是具有神经毒性作用的部分，因此检测该片段具有重要的意义。目前尚无特异性识别Amphiphysin I(1-278)片段的抗体，基于本发明抗原肽得到的特异性识别Amphiphysin I(1-278)片段的抗体解决了这一问题。
(2)本发明的抗Amphiphysin I(1-278)片段的抗体能够用于AD的早期诊断。
附图说明
图1为酶联免疫吸附实验检测抗Amphiphysin I N278抗体滴度的结果图。
图2为抗Amphiphysin I-N278抗体(抗Amph1 N278)的特异性检测结果图。AEP剪切Amphiphysin I形成(1-278)片段，抗Amphiphysin I N278抗体能够特异性识别AEP剪切形成的Amphiphysin I(1-278)片段，而不识别全长的Amphiphysin I。
图3为使用抗Amphiphysin I N278抗体(抗Amph1 N278)进行免疫组织化学实验结果图。抗Amphiphysin I N278抗体可检测到AD患者脑内的Amphiphysin I(1-278)片段。
具体实施方式
以下实施例用于进一步说明本发明，但不应理解为对本发明的限制。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
实施例1兔多克隆抗体(抗Amphiphysin I N278抗体)的制备
本实施例所用抗原肽(Ac-CLPSPTASPN)由人工化学合成得到(南京金斯瑞生物科技有限公司)。合成的抗原肽进行质谱鉴定，鉴定正确后利用HPLC进行纯化和纯度鉴定。
将抗原肽偶联到载体蛋白KLH上得到抗原肽-KLH偶联物，以其作为免疫原免疫新西兰兔制备多克隆抗体。具体步骤如下：
(1)实验前采集动物血液，并制备免疫前血清。采集的血液离心后收集上清即得到血清。
(2)初次免疫：每只兔子皮下多点注射乳化的1mL抗原肽-KLH偶联物和弗氏完全佐剂的混合液(体积比1:1)，其中，抗原肽含量为0.5mg。
(3)初次免疫一周后，按照初次免疫的方法进行第二次加强免疫。
(4)第二次加强免疫一周后，按照初次免疫的方法进行第三次加强免疫。
(5)第三次加强免疫一周后，采集血液制备抗血清。
采用抗原亲和层析法对抗血清进行纯化，得到纯化的多克隆抗体抗AmphiphysinI N278抗体(1mg/mL)用于下述实验。
实施例2检测抗体滴度
(1)将未交联的抗原肽按4μg/mL溶解于包被液(0.05M碳酸盐缓冲液pH 9.6)中。
(2)在96孔酶标板中加入100μL(1)中溶解抗原肽的包被液4℃过夜。
(3)次日，倒空液体并拍干残留液体，洗涤液每隔5分钟加入，冲洗三次。
(4)每孔加入150μL封闭液，37℃孵育1h。
(5)倒空液体并拍干残留液体，洗涤液冲洗三次。
(6)每孔加入按梯度稀释的抗Amphiphysin I N278抗体100μL，37℃孵育1h。
(7)倒空液体并拍干残留液体，洗涤液冲洗三次。
(8)每孔加入按1:10000稀释的辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG二抗(1mg/mL)，37℃孵育1h。
(9)倒空液体并拍干残留液体，洗涤液冲洗三到四次。
(10)拍干孔中残留液体，每孔加入100μL混合的显色液A、B，37℃避光显色30min。
(11)每孔加入50～100μL 2M H2SO4终止显色，并立即读取450nm OD值，检测结果见图1，抗Amphiphysin I N278抗体滴度达到1∶512000。
实施例3抗Amphiphysin I-N278抗体特异性的细胞学检测
(1)表达带GST标签的Amphiphysin I(GST-Amph1)的质粒的构建：以HEK293细胞cDNA文库为模板，使用引物FP和RP扩增得到Amphiphysin I基因序列，通过连接、转化DH5α将Amphiphysin I基因连接到带pcDNA3.1-N-GST载体上，构建得到表达带GST标签的Amphiphysin I的质粒。其中，引物FP、RP序列如下：
FP：GCGCGTCGACTATGGCAGAGATGGGCAGTAAAGGG；
RP：GCCGGCGGCCGCTCATGGGACCCTCTCAGTGAAGT。
(2)细胞转染：将表达带GST标签的Amphiphysin I(GST-Amph1)的质粒转染到HEK293细胞内。
(3)制样：细胞转染2d后，收集细胞，PBS洗一遍，加裂解液(50mM柠檬酸钠，5mMDTT，0.1％CHAPS，0.5％TX-100，pH＝6.0)冰上裂解30min，取上清至新的EP管中，加入20μLglutathione sepharose 4B GST-tagged protein purification resin(GEHealthcare)，4℃孵育过夜。用裂解液洗4次，1000rpm离心5min弃去上清。加入90μL裂解液，混匀后分成三管，30μL/管，其中一管加入5μL重组AEP酶(rAEP，北京义翘神州)，另外两管管作为对照，一管加入5μL pH 6.0的buffer(50mM柠檬酸钠，5mM DTT，0.1％CHAPS，0.5％TX-100，pH＝6.0)，一管加入5μL pH 7.4的buffer(50mM柠檬酸钠，5mM DTT，0.1％CHAPS，0.5％TX-100，pH＝7.4)，37℃孵育30min，加入5×SDS loading buffer，混匀，100℃沸水煮10min。
(4)跑胶：将制好的样品按照图2的顺序进行点样，80V恒压跑胶20min后，120V恒压跑胶到Marker分开至合适的位置，为了同时检测两个不同的抗体，在两块不同的胶上点同样的样品。
(5)转膜：提前配好转膜液，4℃预冷，按照负极-海绵-滤纸-胶-NC膜-滤纸-海绵-正极的顺序将胶和膜用转膜夹固定好，220mA恒流转膜75min。
(6)封闭：转膜完成后，将膜用TTBS溶液洗涤一次后，置于5％奶粉中，放置于摇床上室温封闭1h。
(7)孵育一抗：封闭完成后，孵育一抗，一抗采用3％的奶粉进行稀释(GST抗体(Proteintech，1mg/mL)：1:10000，抗Amphiphysin I N278抗体(抗Amph1 N278)：1:2000)，4℃摇床孵育过夜。
(8)洗膜：室温采用TTBS溶液洗膜40min，每10min换一次洗膜液。
(9)孵育二抗：采用3％的奶粉将辣根过氧化物酶标记的山羊抗鼠IgG二抗(用于抗GST抗体)或辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG二抗(用于抗Amphiphysin I N278抗体)按照1:10000比例进行稀释，室温孵育1h。
(10)洗膜：室温采用TTBS溶液洗膜1h，每10min换一次洗膜液。
(11)显影：使用ECL显影液对膜进行曝光显影。
结果见图2，抗Amphiphysin I N278抗体(抗Amph1 N278)能够识别AEP剪切形成的Amphiphysin I(1-278)片段，而不识别全长的Amphiphysin I。
实施例4抗Amphiphysin I N278抗体在人脑组织切片中的特异性检测
(1)脑片：AD患者和非AD脑组织石蜡切片来自于美国Emory大学痴呆研究中心。
(2)脱蜡，水化脑片：将脑组织石蜡切片放入二甲苯中，进行脱蜡，将蜡脱干净后，脑片依次放入95％、85％、75％的无水乙醇中，分别放置5min，然后放入ddH2O中。
(3)抗原修复：将脑片放入100mM柠檬酸钠(pH＝6.0)抗原修复液中，于92℃修复20min，待自然冷却后，PBS洗三遍，每次5min。
(4)3％双氧水孵育10min，阻断内源性过氧化物酶，以减少非特异性背景染色，PBS洗三遍，每次5min。
(5)封闭：3％BSA封闭30min。
(6)孵一抗：孵育抗Amphiphysin I N278抗体，抗体采用3％BSA溶液按照1:500的比例稀释，4℃孵育过夜。
(7)洗一抗：PBS洗三遍，每次5min。
后面步骤采用absin公司的免疫组化试剂盒进行实验：
(8)加入100μL一抗放大剂(试剂盒中的C液)，孵育10min，PBS洗三遍，每次5min。
(9)加入100μL二抗(试剂盒中的D液)，避光，孵育10min，PBS洗三遍，每次5min。
(10)配制新鲜显色液：将试剂盒中的E液和F液按照3:100的比例进行配制，混匀，待用。
(11)显色：在脑片上加入100μL新鲜显色液进行孵育，并在显微镜下观察，脑片被染上色后用去离子水进行冲洗，终止显色反应。
(12)苏木素染核。
(13)透明，将组织片子依次放入75％无水乙醇-85％无水乙醇-95％无水乙醇-二甲苯，分别放置5min。
(14)封片：中性树胶封片。
(15)显微镜观察，拍照。
结果见图3，使用抗Amphiphysin I N278抗体可检测到AD患者脑内的AmphiphysinI(1-278)片段。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 武汉大学
<120> 一种两性蛋白1的抗原肽及其抗体与应用
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Cys Leu Pro Ser Pro Thr Ala Ser Pro Asn
1 5 10
<210> 2
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gcgcgtcgac tatggcagag atgggcagta aaggg 35
<210> 3
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
gccggcggcc gctcatggga ccctctcagt gaagt 35

Claims (10)

1.一种两性蛋白1 1-278片段的抗原肽，其特征在于：氨基酸序列为：CLPSPTASPN。
2.一种抗体，其特征在于：以权利要求1中所述的抗原肽为抗原制备得到。
3.一种抗体，其特征在于：以Ac-CLPSPTASPN与载体蛋白交联后得到的交联多肽为抗原制备得到。
4.根据权利要求3所述的抗体，其特征在于：所述的载体蛋白为KLH。
5.根据权利要求2-4任一项所述的抗体，其特征在于：所述的抗体为单克隆抗体或多克隆抗体。
6.根据权利要求5所述的抗体，其特征在于：所述的多克隆抗体为兔多克隆抗体。
7.根据权利要求6所述的抗体，其特征在于：所述的兔多克隆抗体的制备方法包括以下步骤：以权利要求3或4中的交联多肽为免疫原免疫家兔，收集家兔血液制备抗血清，将抗血清分离纯化得到兔多克隆抗体。
8.权利要求2-7任一项所述的抗体的应用，其特征在于：所述的应用包括检测人脑标本或动物标本中两性蛋白1被剪切程度，阿尔兹海默病发病机制的研究。
9.一种检测两性蛋白1被剪切程度的试剂，其特征在于：包括权利要求2-7任一项所述的抗体。
10.一种阿尔兹海默病早期诊断试剂，其特征在于：包括权利要求2-7任一项所述的抗体。
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