CN112680539A

CN112680539A - 一种通过小麦TaMTL基因敲除突变体诱导的小麦单倍体植株筛选方法

Info

Publication number: CN112680539A
Application number: CN202110015401.4A
Authority: CN
Inventors: 叶兴国; 唐华丽; 王轲; 刘会云; 林志珊; 贾子苗; 杜丽璞; 邱玉亮; 石磊; 梁小娜
Original assignee: Institute of Crop Sciences of Chinese Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Institute of Crop Sciences of Chinese Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2021-01-05
Filing date: 2021-01-05
Publication date: 2021-04-20

Abstract

本发明公开了一种通过小麦TaMTL基因敲除突变体诱导的小麦单倍体植株筛选方法。本发明提供鉴别待测小麦是否为单倍体小麦的方法，为检测待测小麦的基因组DNA中是否含有bar基因和/或Cas9基因；如果待测小麦的基因组DNA中不含有bar基因和Cas9基因，则所述待测小麦为单倍体小麦或候选为单倍体小麦；如果待测小麦的基因组DNA中含有bar基因和/或Cas9基因，则所述待测小麦为非单倍体小麦或候选为非单倍体小麦。本发明所提供的方法可用于小麦TaMTL纯合敲除突变体作为父本与其他小麦材料杂交诱导的单倍体的快速鉴定，对小麦单倍体育种、DH群体构建、基因定位和目标基因功能研究等具有重要意义。

Description

一种通过小麦TaMTL基因敲除突变体诱导的小麦单倍体植株筛选方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种通过小麦TaMTL基因敲除突变体诱导的小麦单倍体植株筛选方法。

背景技术

小麦是三大主粮作物之一，为人类提供了约20％的卡路里。随着人口增加和社会发展，人们对粮食产量和优质专用的需求越来越高。因此，培育高产、优质、抗病的小麦新品种尤为重要。传统育种中育成一个优良小麦品种至少需要6～7年，而单倍体育种采用孤雌生殖或雄核发育产生单倍体，经过加倍后直接产生纯合双单倍体，经过一次培养或诱导就能产生全部基因同质的纯合二倍体纯系，繁殖种子后就可参加产量鉴定和适应性试验，大大缩短了育种进程，提高了育种效率。

小麦单倍体植株最早是通过花药离体培养获得的，之后研究学者逐步建立了一些新的单倍体诱导方法，如小孢子培养、异源种属花粉诱导(包括玉米、高粱、珍珠稷、大麦等)、物理辐射和化学试剂处理诱导、延迟授粉诱导等。在玉米中发现，被称为单倍体诱导系的Stock 6作为父本可诱导母本产生2.0～3.0％的单倍体种子。随后培育了WS14、MHI、RWS、PHI、BHI306和CAU5等优良单倍体诱导系，玉米单倍体植株诱导率达8.0～16.0％。进一步通过精细定位、基因组测序和遗传互补等方法，证明玉米中的单倍体诱导是由于***细胞质特异性磷脂酶MTL编码基因的移码突变导致，并克隆了玉米ZmMTL(ZmPLA1)基因,发现该基因在水稻、小麦、大麦等作物中具有高度保守性。

与此同时，以CRISPR/Cas9为代表的基因编辑技术迅速发展，并在植物中得到了广泛应用。利用CRISPR/Cas9技术敲除玉米ZmPLA1基因，敲除植株自交或作为父本与其他自交系杂交，单倍体诱导率2.0-6.7％。采用胚特异型启动子ZmESP和胚乳特异性启动子HvASP，构建胚特异表达绿色荧光蛋白(eGFP)和胚乳特异表达红色荧光蛋白(DsRED)的双荧光单倍体筛选与标记鉴定***，获得的诱导系能够高效诱导单倍体，平均诱导率7.5％。针对水稻中ZmMTL基因的同源基因OsMTL，设计CRISPR/Cas9基因编辑的靶点gRNA进行突变，自交后代中平均单倍体诱导率为6.0％左右。最新研究表明，采用CRISPR/Cas9基因编辑技术敲除小麦中ZmMTL的同源基因TaPLA-4A和TaPLA-4B，单倍体诱导率2～3％(Liu et al.，PlantBiotechnology Journal，2020，18：316-318)。在优化小麦CRISPR/Cas9编辑***的基础上，利用小麦TaU6启动子和双靶点策略对小麦中ZmMTL的3个同源基因TaMTL-4A、TaMTL-4B、TaMTL-4D同时进行敲除，发现TaMTL-4A和TaMTL-4D发生突变时的单倍体诱导率为10％左右，TaMTL-4A、TaMTL-4B、TaMTL-4D同时发生突变时的单倍体诱导率为11.8～31.6％，并首次在禾谷类作物中发现了无胚型和胚及胚乳双无型籽粒(Liu et al.，Journal ofExperimental Botany，2020，71：1337-1349)。

小麦单倍体在植株水平可以利用细胞学、细胞遗传学、基因组学和形态学等方法进行鉴定，包括保卫细胞长度、染色体数目、DNA总量、流式细胞倍性、基因拷贝数和植株高度等。通过花药培养、子房培养和远缘杂交等技术诱导产生的小麦植株几乎全部为单倍体，可以全部直接进行染色体加倍处理获得纯合二倍体植株。但是，通过CRISPR/Cas9技术敲除TaMTL基因创制的小麦诱导系与其他品种杂交后的籽粒中既有单倍体又有二倍体，他们在外观形态上没有差异。由于源于TaMTL基因敲除诱导系诱导小麦单倍体的频率还比较低，从育种角度出发，需要在幼苗萌发阶段大量、快速、准确鉴定出单倍体，以便对单倍体及时进行染色体加倍。然而，在目前鉴定小麦单倍体的几种方法中，有的方法操作复杂、费时、需要特殊仪器设备，有的方法需要较多样品或在植株生长到足够大时才能进行，不适用于幼苗萌发阶段对单倍体进行大规模鉴定，急需开发一种在幼苗萌发阶段对利用CRISPR/Cas9技术敲除小麦TaMTL基因创制的单倍体诱导系诱导的单倍体进行快速、准确的鉴定方法。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是如何筛选利用CRISPR/Cas9技术敲除小麦TaMTL基因创制的单倍体诱导系诱导的单倍体植株。

为了解决上述技术问题，本发明首先提供了一种鉴别或辅助鉴别待测小麦是否为单倍体小麦的方法，为检测待测小麦的基因组DNA中是否含有bar基因和/或Cas9基因；如果待测小麦的基因组DNA中不含有bar基因和Cas9基因，则所述待测小麦为单倍体小麦或候选为单倍体小麦；如果待测小麦的基因组DNA中含有bar基因和/或Cas9基因，则所述待测小麦为非单倍体小麦或候选为非单倍体小麦；所述bar基因的核苷酸序列如序列表中SEQ IDNO：1所示；所述Cas9基因为的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：2所示。

上述方法中，所述检测待测小麦的基因组DNA中是否含有bar基因和/或Cas9基因的方法为如下(1)或(2)：

(1)测序；

(2)用引物组合对待测小麦样品进行PCR扩增；

所述引物组合由引物对A(用于扩增bar基因的特异片段)和引物对B(用于扩增Cas9基因的特异片段)；

所述引物对A由引物1和引物2组成；

所述引物1为如下a1)或a2)：

a1)SEQ ID NO：3所示的单链DNA分子；

a2)将a1)限定的单链DNA分子进行一个或几个碱基的缺失、***和/或改变得到的与a1)限定的单链DNA分子具有相同功能的单链DNA分子；

所述引物2为如下b1)或b2)：

b1)SEQ ID NO：4所示的单链DNA分子；

b2)将b1)限定的单链DNA分子进行一个或几个碱基的缺失、***和/或改变得到的与b1)限定的单链DNA分子具有相同功能的单链DNA分子；

所述引物对B由引物3和引物4组成；

所述引物3为如下c1)或c2)：

c1)SEQ ID NO：5所示的单链DNA分子；

c2)将c1)限定的单链DNA分子进行一个或几个碱基的缺失、***和/或改变得到的与c1)限定的单链DNA分子具有相同功能的单链DNA分子；

所述引物4为如下d1)或d2)：

d1)SEQ ID NO：6所示的单链DNA分子；

d2)将d1)限定的单链DNA分子进行一个或几个碱基的缺失、***和/或改变得到的与d1)限定的单链DNA分子具有相同功能的单链DNA分子。

为了解决上述技术问题，本发明还提供一种鉴别或辅助鉴别待测小麦是否为单倍体小麦的方法，包括如下步骤：以待测小麦的基因组DNA为模板，利用引物对A和引物对B分别进行PCR扩增，检测扩增产物的大小，根据扩增产物的大小按照下述方法确定所述待测小麦是否为单倍体小麦：如果所述待测小麦样品的扩增产物中含有大小为430bp和/或706bp的条带，所述待测小麦样品为非单倍体小麦或候选为非单倍体小麦；如果所述待鉴别小麦的扩增产物中不含有大小为430bp和706bp的条带，所述待测小麦样品为单倍体小麦或候选为单倍体小麦。

上述方法中，所述引物对A由引物1和引物2组成；

所述引物1为如下a1)或a2)：

a1)SEQ ID NO：3所示的单链DNA分子；

所述引物2为如下b1)或b2)：

b1)SEQ ID NO：4所示的单链DNA分子；

所述引物对B由引物3和引物4组成；

所述引物3为如下c1)或c2)：

c1)SEQ ID NO：5所示的单链DNA分子；

所述引物4为如下d1)或d2)：

d1)SEQ ID NO：6所示的单链DNA分子；

在本发明实施例中，所述PCR扩增采用的PCR反应程序分别为：

所述引物对A的PCR反应程序(扩增bar基因特异片段)：95℃预变性5min；然后进行如下3个反应程序：变性：95℃30s，退火：60℃20s，延伸：72℃30s，共28个循环；最后72℃延伸10min。

所述引物对B的PCR反应程序(扩增Cas9基因特异片段)：95℃预变性5min；然后进行如下3个反应程序：变性：95℃30s，退火：56℃20s，延伸：72℃40s，共35个循环；最后72℃延伸10min。

为了解决上述技术问题，本发明还提供上述方法鉴别获得的单倍体小麦在小麦育种和/或功能基因组研究中的应用。

本发明还提供了一种小麦的育种方法，为方法甲或方法乙；

所述方法甲包括如下步骤：检测待测小麦基因组是否含有bar基因和Cas9基因，选择基因组不含有bar基因和Cas9基因的待测小麦进行育种；

所述方法乙包括如下步骤：采用上述方法筛选出单倍体小麦进行育种。

本发明还开发了鉴别待测小麦是否为单倍体小麦的引物组合，由引物对A和引物对B组成；

所述引物对A由引物1和引物2组成；

所述引物1为如下a1)或a2)：

a1)SEQ ID NO：3所示的单链DNA分子；

所述引物2为如下b1)或b2)：

b1)SEQ ID NO：4所示的单链DNA分子；

所述引物对B由引物3和引物4组成；

所述引物3为如下c1)或c2)：

c1)SEQ ID NO：5所示的单链DNA分子；

所述引物4为如下d1)或d2)：

d1)SEQ ID NO：6所示的单链DNA分子；

本发明还提供上述引物组合的应用，为如下(1)-(3)中的任一种：

(1)筛选或辅助筛选小麦单倍体；

(2)制备筛选或辅助筛选小麦单倍体的产品；

(3)小麦育种。

本发明中，所述待测小麦为以小麦TaMTL基因敲除纯合突变体为父本，普通小麦材料为母本，进行杂交获得杂交后代。所述杂交后代具体为杂交F₁代。

所述小麦TaMTL基因敲除纯合突变体为利用CRISPR/Cas9技术敲除小麦中的TaMTL基因得到的含有所述bar基因和所述Cas9基因的目的小麦。

为了解决上述技术问题，本发明还提供上述方法在鉴定单倍体诱导系诱导的小麦单倍体中的应用；所述单倍体诱导系是利用CRISPR/Cas9技术敲除小麦TaMTL基因创制获得的。

本发明的具体实施例中采用的CRISPR/Cas9技术涉及两个靶序列，分别为CCCGTCCAGCTCCTGCAGCTTGG和CCTCAGCGATGCGGTCACCGCGG。

进一步具体的，本发明中使用了能表达向导RNA和Cas9的重组载体pWMB110-SpCas9-TaU3-RRU(TaMTL)。

本发明提供一种快速鉴定利用CRISPR/Cas9技术敲除小麦TaMTL基因创制的单倍体诱导系诱导的单倍体植株的方法。并通过实验证明，该方法能够有效的鉴别出利用CRISPR/Cas9技术敲除小麦TaMTL基因创制的单倍体诱导系诱导的单倍体植株，且适用于大批量单倍体幼苗的快速鉴定。可见，本发明所提供的方法可用于小麦TaMTL纯合敲除突变体(携带bar基因和Cas9基因)做为父本与其他小麦材料作为母本杂交诱导的单倍体幼苗的快速鉴定，对小麦单倍体育种、DH群体构建、基因定位和目标基因功能研究等具有重要意义。

附图说明

图1为利用bar基因特异性引物对小麦品种Fielder×纯合TaMTL敲除突变体F₁代植株的检测结果；其中，M：DNAmarker；泳道1：含有bar基因的转基因植株，作为阳性对照；泳道2：小麦品种Fielder，作为阴性对照；泳道3-16：小麦品种Fielder×纯合TaMTL敲除突变体F₁代植株。

图2为利用Cas9基因特异性引物对小麦品种Fielder×纯合TaMTL敲除突变体杂交F₁代植株的检测结果；其中，M：DNA marker；泳道1：含有Cas9基因的转基因植株，作为阳性对照，泳道2：小麦品种Fielder，作为阴性对照；泳道3-16：小麦品种Fielder×纯合TaMTL敲除突变体F₁代植株。

图3为小麦品种Fielder×纯合TaMTL敲除突变体杂交F₁代中单倍体植株染色体检测结果；其中，a：小麦品种Fielder，染色体数目为42条；b-f：小麦品种Fielder×纯合TaMTL敲除突变体F₁代中检测出的单倍体植株，染色体数目为21条。

图4为TaMTL基因双靶点定点编辑载体pWMB110-SpCas9-TaU3-RRU(TaMTL)图谱。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中的小麦品种为Fielder(Riaz et al.Overexpression of maizeZmC1 and ZmR transcription factors in wheat regulates anthocyaninbiosynthesis in a tissue-specific manner.International Journal of MolecularScience，2019，20：5806；Wang et al.Generation of marker-free transgenichexaploid wheat via an Agrobacterium-mediated co-transformation strategy incommercial Chinese wheat varieties.Plant Biotechnology Journal，2017，15：614-623)，公众可以从中国农科学作物研究所获得，以重复本申请实验，不可作为其它用途使用。

下述实施例中的pWMB110载体(Wang et al.Generation of marker-freetransgenic hexaploid wheat via an Agrobacterium-mediated co-transformationstrategy in commercial Chinese wheat varieties.Plant Biotechnology Journal，2017，15：614-623)，公众可以从中国农科学作物研究所获得，以重复本申请实验，不可作为其它用途使用。

实施例1、小麦TaMTL敲除突变体材料的获得

一、小麦TaMTL基因靶标位点的选择及敲除载体的构建

1、小麦TaMTL基因靶标位点的选择

根据小麦内源基因TaMTL-4A(TraesCS4A02G018100)、TaMTL-4B(TraesCS4B02G286000)、TaMTL-4D(TraesCS4D02G284700)序列设计2个gRNA靶点gM179(sgRNA1：CCCGTCCAGCTCCTGCAGCTTGG，分别靶向TaMTL-4A基因CDS区的第170-192位碱基；TaMTL-4B基因CDS区的第173-195位碱基；TaMTL-4D基因CDS区的第170-192位碱基)和gM471(sgRNA2：CCTCAGCGATGCGGTCACCGCGG，分别靶向TaMTL-4A基因CDS区的第374-396位碱基；TaMTL-4B基因CDS区的第377-399位碱基；TaMTL-4D基因CDS区的第374-396位碱基)。

2、TaMTL基因定点编辑载体的构建

将核酸序列如SEQ ID NO：2所示SpCas9的编码基因***到由玉米Ubi启动子驱动的pWMB110载体上，构建成pWMB110-SpCas9载体，之后将来源于小麦的TaU3启动子构建到pWMB110-SpCas9载体上，产生pWMB110-SpCas9-TaU3载体。利用MluI(FD0564，ThermoFisher Scientific)和SgsⅠ(FD1894，Thermo Fisher Scientific)对pWMB110-SpCas9-TaU3载体进行酶切，分别将sgRNA1和sgRNA2***，构建得到TaMTL基因双靶点定点编辑载体pWMB110-SpCas9-TaU3-RRU(TaMTL)(如图4所示，具体方法请参见“Liu et al.EditingTaMTL gene induces haploid plants efficiently by optimized Agrobacterium-mediated CRISPR system in wheat.Journal of Experimental Botany，2020，71：1337-1349”)。

二、小麦TaMTL敲除突变体材料的获得

将定点编辑载体pWMB110-SpCas9-TaU3-RRU(TaMTL)转入发根农杆菌C58C1中。利用农杆菌介导法将TaMTL的基因组定点编辑载体pWMB110-SpCas9-TaU3-RRU(TaMTL)转化小麦品种Fielder的幼胚，经愈伤组织诱导培养、筛选培养和分化培养获得转基因植株(具体方法请参见“Wang et al.Generation of marker-free transgenic hexaploid wheatvia an Agrobacterium-mediated co-transformation strategy in commercialChinese wheat varieties.Plant Biotechnology Journal，2017，15：614-623”)。

利用Cas9基因的特异引物对Cas9-F/R(Cas9F：AGGAGACTATCACCCCTTGGAAC；Cas9R：TTGAAGGTAAGAGAGTCATCGTGG)和bar基因的特异性引物对Bar-F/R(bar-F：ACCATCGTCAACCACTACATCG；bar-R：GCTGCCAGAAACCCACGTCATG)分别对获得的转基因植株进行检测。筛选含有Cas9基因(PCR扩增产物为706bp的DNA条带)和bar基因(PCR扩增产物为430bp的DNA条带)的转基因植株为阳性转基因植株。

利用基因特异性引物对TaMTL-4A-F和TaMTL-4A-R(TaMTL-4A-F：CTAGCAAACCCACCAATTAC，TaMTL-4A-R：GATCCAAGTATAAAATTAGCATAT)、TaMTL-4B-F和TaMTL-4B-R(TaMTL-4B-F：GTCAACCGAGGTGCCGTCAGTTTG，TaMTL-4B-R：CGTCATCGCCACCATCGTCTGC)、TaMTL-4D-F和TaMTL-4D-R(TaMTL-4D-F：TTCAATCGATGGCAAGCTACTGGG，TaMTL-4D-R：CGTCATCGCCACCATCGTCTGC)分别对阳性转基因植株的TaMTL-4A、TaMTL-4B和TaMTL-4D基因编辑靶点处的序列进行PCR扩增，再分别利用PstⅠ(Thermo Fisher Scientific公司产品，产品编号为FD0614)和Eco91Ⅰ(Thermo Fisher Scientific公司产品，产品编号为FD0394)对PCR产物进行酶切检测和测序检测，筛选获得了TaMTL-4A、TaMTL-4B和TaMTL-4D基因同时敲除的纯合突变体TM-17。测序结果表明，相对于野生型小麦(小麦品种Fielder)，纯合突变体TM-17在TaMTL-4A基因组DNA(TraesCS4A02G018100)的第777-1067位缺失291个碱基(即靶点gM179和gM471之间)，在TaMTL-4B基因组DNA(TraesCS4B02G286000)的第779-1070位上缺失了292个碱基(即靶点gM179和gM471之间)，在TaMTL-4D基因组DNA(TraesCS4D02G284700)的第775位上缺失了1个碱基(即靶点gM179上)。

实施例2、小麦TaMTL敲除突变体诱导的小麦单倍体植株的鉴定

一、小麦品种Fielder×纯合TaMTL敲除突变体杂种F₁代种子的获得

利用实施例1创制的含有bar基因筛选标记和Cas9基因的TaMTL纯合突变体TM-17做为父本，与小麦品种Fielder做为母本进行杂交，获得F₁代种子。

二、小麦品种Fielder×纯合TaMTL敲除突变体杂种F₁代中单倍体植株检测

(一)PCR特异性引物设计

根据bar基因(SEQ ID NO：1)和Cas9基因序列(SEQ ID NO：2)，分别设计了一对特异性引物对Bar-F/R(由bar-F和bar-R组成)和Cas9-F/R(由Cas9F和Cas9R组成)，用于检测小麦品种Fielder×纯合TaMTL敲除突变体F₁代植株中的bar基因和Cas9基因。引物序列如下：

bar-F：ACCATCGTCAACCACTACATCG(SEQ ID NO：3)

bar-R：GCTGCCAGAAACCCACGTCATG(SEQ ID NO：4)

Cas9F：AGGAGACTATCACCCCTTGGAAC(SEQ ID NO：5)

Cas9R：TTGAAGGTAAGAGAGTCATCGTGG(SEQ ID NO：6)

(二)小麦品种Fielder×纯合TaMTL敲除突变体F₁代植株基因组提取

将小麦品种Fielder×纯合TaMTL敲除突变体F₁代种子萌发，幼苗阶段按单株进行基因组DNA的提取，具体操作步骤按江苏康为世纪生物科技股份有限公司生产的植物DNA提取试剂盒说明书(CW0531M NuClean Plant Genomic DNA Kit)中的描述进行操作。

(三)小麦品种Fielder×纯合TaMTL敲除突变体F₁代植株中bar基因和Cas9基因检测

利用bar基因引物Bar-F/R和Cas9基因引物Cas9-F/R分别检测小麦品种Fielder×纯合TaMTL敲除突变体F₁代植株中的bar基因和Cas9基因。引物由上海Sangong公司合成；PCR所用2×Es Taq MasterMix(Dye)(CW0690L)购自CWBIO试剂公司。

PCR具体扩增条件为：

bar基因：95℃预变性5min；然后进行如下3个反应程序：(1)变性：95℃30s，(2)退火：60℃20s，(3)延伸：72℃30s，共28个循环；最后72℃延伸10min。

Cas9基因：95℃预变性5min；然后进行如下3个反应程序：(1)变性：95℃30s，(2)退火：56℃20s，(3)延伸：72℃40s，共35个循环；最后72℃延伸10min。

PCR产物利用1％的琼脂糖凝胶进行分析。

电泳结果如图1和图2所示。从图1可以看出，泳道5、6、8、15、16没有扩增出bar基因特异条带，泳道3、4、7、9-14扩增出片段大小为430bp条带。从图2可以看出，泳道5、6、8、15、16都没有扩增出Cas9基因异条带，泳道3、4、7、9-14扩增出片段大小为706bp的条带，与利用bar基因特异性引物的检测结果一致。

结果表明，泳道5、6、8、15、16所对应的样品为小麦品种Fielder×纯合TaMTL敲除突变体F₁代中的单倍体，其泳道3、4、7、9-14所对应的样品为小麦品种Fielder×纯合TaMTL敲除突变体F₁代植株中的二倍体杂交种。

(四)小麦品种Fielder×纯合TaMTL敲除突变体F₁代中单倍体植株的细胞遗传学验证

利用滴片法对上述F₁代植株以及小麦品种Fielder进行染色体数目鉴定，以验证上述鉴定方法的准确性。具体操作步骤如下：

(1)小麦品种Fielder×纯合TaMTL敲除突变体F₁代种子用清水浸泡过夜，萌动后转移到放有滤纸的培养皿中发芽，并将滤纸用水进行湿润。随后将培养皿放入25℃培养箱中生长，待主根长度3-4cm时取样；

(2)准备0.5ml的离心管置于冰上，用喷壶湿润。剪取1cm左右的主根放入离心管中，与籽粒对应进行编号，取完根尖后的萌发籽粒种植与花盆中；然后将装有根尖样品的离心管放入笑气罐中，进气3min左右，关闭进气阀门，处理2h后将离心管从笑气罐中取出置于冰上；

(3)用90％醋酸固定根尖5min，然后用清水清洗3次；放入70％乙醇中，置于-20℃冰箱中保存备用。

(4)用镊子将根尖取出，放在滤纸上吸干水分，在载玻片上切下根尖乳白色部分，将其放入提前准备好的酶解液中，37℃水浴50min；

(5)根尖酶解后用少量70％酒精清洗2次，加入60μl的酒精，用解剖针将根尖捣碎后溶于管内酒精。6000rpm离心2min，弃去上清液，室温倒置几分钟；

(6)向上述离心管中加入30μl的100％乙酸，置于涡旋仪上轻轻涡旋，使其充分混匀。

(7)预先准备好纸盒，用清水湿润，并在盒内放入载玻片，用移液器吸取7μl步骤6中的悬浮液，滴在载玻片上；

(8)待载玻片晾干后，于显微镜下进行染色体观察。

检测结果如图3所示：a为小麦品种Fielder的根尖染色体，数目为42条，图片b、c、d、e、f分别对应图1和图2中鉴定出来的5株单倍体(泳道5、6、8、15、16)，染色体数目为21条。

经过验证表明，利用bar基因和Cas9基因特异性引物进行扩增鉴定小麦材料与纯合TaMTL敲除突变体杂交F₁代中单倍体植株的方法准确可靠。

以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。

序列表

<110> 中国农业科学院作物科学研究所

<120> 一种通过小麦TaMTL基因敲除突变体诱导的小麦单倍体植株筛选方法

<130> GNCRJ210009

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 552

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 1

atgagcccag aacgacgccc ggccgacatc cgccgtgcca ccgaggcgga catgccggcg 60

gtctgcacca tcgtcaacca ctacatcgag acaagcacgg tcaacttccg taccgagccg 120

caggaaccgc aggagtggac ggacgacctc gtccgtctgc gggagcgcta tccctggctc 180

gtcgccgagg tggacggcga ggtcgccggc atcgcctacg cgggcccctg gaaggcacgc 240

aacgcctacg actggacggc cgagtcgacc gtgtacgtct ccccccgcca ccagcggacg 300

ggactgggct ccacgctcta cacccacctg ctgaagtccc tggaggcaca gggcttcaag 360

agcgtggtcg ctgtcatcgg gctgcccaac gacccgagcg tgcgcatgca cgaggcgctc 420

ggatatgccc cccgcggcat gctgcgggcg gccggcttca agcacgggaa ctggcatgac 480

gtgggtttct ggcagctgga cttcagcctg ccggtaccgc cccgtccggt cctgcccgtc 540

accgagattt ga 552

<210> 2

<211> 4203

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 2

atggctccta agaagaagcg gaaggttggt attcacgggg tgcctgcggc tgacaagaag 60

tactccatcg gcctcgacat cggcaccaac agcgtcggct gggcggtgat caccgacgag 120

tacaaggtcc cgtccaagaa gttcaaggtc ctgggcaaca ccgaccgcca ctccatcaag 180

aagaacctca tcggcgccct cctcttcgac tccggcgaga cggcggaggc gacccgcctc 240

aagcgcaccg cccgccgccg ctacacccgc cgcaagaacc gcatctgcta cctccaggag 300

atcttctcca acgagatggc gaaggtcgac gactccttct tccaccgcct cgaggagtcc 360

ttcctcgtgg aggaggacaa gaagcacgag cgccacccca tcttcggcaa catcgtcgac 420

gaggtcgcct accacgagaa gtaccccact atctaccacc ttcgtaagaa gcttgttgac 480

tctactgata aggctgatct tcgtctcatc taccttgctc tcgctcacat gatcaagttc 540

cgtggtcact tccttatcga gggtgacctt aaccctgata actccgacgt ggacaagctc 600

ttcatccagc tcgtccagac ctacaaccag ctcttcgagg agaaccctat caacgcttcc 660

ggtgtcgacg ctaaggcgat cctttccgct aggctctcca agtccaggcg tctcgagaac 720

ctcatcgccc agctccctgg tgagaagaag aacggtcttt tcggtaacct catcgctctc 780

tccctcggtc tgacccctaa cttcaagtcc aacttcgacc tcgctgagga cactaagctt 840

cagctctcca aggataccta cgacgatgat ctcgacaacc tcctcgctca gattggagat 900

cagtacgctg atctcttcct tgctgctaag aacctctccg atgctatcct cctttcggat 960

atccttaggg ttaacactga gatcactaag gctcctcttt ctgcttccat gatcaagctc 1020

tacgacgagc accaccagga cctcaccctc ctcaaggctc ttgttcgtca gcagctcccc 1080

gagaagtaca aggagatctt cttcgaccag tccaagaacg gctacgccgg ttacattgac 1140

ggtggagcta gccaggagga gttctacaag ttcatcaagc caatccttga gaagatggat 1200

ggtactgagg agcttctcgt taagcttaac cgtgaggacc tccttaggaa gcagaggact 1260

ttcgataacg gcatcatccc tcaccagatc caccttggtg agcttcacgc catccttcgt 1320

aggcaggagg acttctaccc tttcctcaag gacaaccgtg agaagatcga gaagatcctt 1380

actttccgta ttccttacta cgttggtcct cttgctcgtg gtaactcccg tttcgcttgg 1440

atgactagga agtccgagga gactatcacc ccttggaact tcgagaaggt tgttgacaag 1500

ggtgcttccg cccagtcctt catcgagcgc atgaccaact tcgacaagaa cctccccaac 1560

gagaaggtcc tccccaagca ctccctcctc tacgagtact tcacggtcta caacgagctc 1620

accaaggtca agtacgtcac cgagggtatg cgcaagcctg ccttcctctc cggcgaccag 1680

aagaaggcta tcgttgacct cctcttcaag accaaccgca aggtcaccgt caagcagctc 1740

aaggaggact acttcaagaa gatcgagtgc ttcgactccg tcgagatcag cggcgttgag 1800

gaccgtttca acgcttctct cggtacctac cacgatctcc tcaagatcat caaggacaag 1860

gacttcctcg acaacgagga gaacgaggac atcctcgagg acatcgtcct cactcttact 1920

ctcttcgagg atagggagat gatcgaggag aggctcaaga cttacgctca tctcttcgat 1980

gacaaggtta tgaagcagct caagcgtcgc cgttacaccg gttggggtag gctctcccgc 2040

aagctcatca acggtatcag ggataagcag agcggcaaga ctatcctcga cttcctcaag 2100

tctgatggtt tcgctaacag gaacttcata cagctcatcc acgatgactc tcttaccttc 2160

aaggaggata ttcagaaggc tcaggtgtcc ggtcagggcg actctctcca cgagcacatt 2220

gctaaccttg ctggttcccc tgctatcaag aagggcatcc ttcagactgt taaggttgtc 2280

gatgagcttg tcaaggttat gggtcgtcac aagcctgaga acatcgtcat cgagatggct 2340

cgtgagaacc agactaccca gaagggtcag aagaactcga gggagcgcat gaagaggatt 2400

gaggagggta tcaaggagct tggttctcag atccttaagg agcaccctgt cgagaacacc 2460

cagctccaga acgagaagct ctacctctac tacctccaga acggtaggga tatgtacgtt 2520

gaccaggagc tcgacatcaa caggctttct gactacgacg tcgaccacat tgttcctcag 2580

tctttcctta aggatgactc catcgacaac aaggtcctca cgaggtccga caagaacagg 2640

ggtaagtcgg acaacgtccc ttccgaggag gttgtcaaga agatgaagaa ctactggagg 2700

cagcttctca acgctaagct cattacccag aggaagttcg acaacctcac gaaggctgag 2760

aggggtggcc tttccgagct tgacaaggct ggtttcatca agaggcagct tgttgagacg 2820

aggcagatta ccaagcacgt tgctcagatc ctcgattcta ggatgaacac caagtacgac 2880

gagaacgaca agctcatccg cgaggtcaag gtgatcaccc tcaagtccaa gctcgtctcc 2940

gacttccgca aggacttcca gttctacaag gtccgcgaga tcaacaacta ccaccacgct 3000

cacgatgctt accttaacgc tgtcgttggt accgctctta tcaagaagta ccctaagctt 3060

gagtccgagt tcgtctacgg tgactacaag gtctacgacg ttcgtaagat gatcgccaag 3120

tccgagcagg agatcggcaa ggccaccgcc aagtacttct tctactccaa catcatgaac 3180

ttcttcaaga ccgagatcac cctcgccaac ggcgagatcc gcaagcgccc tcttatcgag 3240

acgaacggtg agactggtga gatcgtttgg gacaagggtc gcgacttcgc tactgttcgc 3300

aaggtccttt ctatgcctca ggttaacatc gtcaagaaga ccgaggtcca gaccggtggc 3360

ttctccaagg agtctatcct tccaaagaga aactcggaca agctcatcgc taggaagaag 3420

gattgggacc ctaagaagta cggtggtttc gactccccta ctgtcgccta ctccgtcctc 3480

gtggtcgcca aggtggagaa gggtaagtcg aagaagctca agtccgtcaa ggagctcctc 3540

ggcatcacca tcatggagcg ctcctccttc gagaagaacc cgatcgactt cctcgaggcc 3600

aagggctaca aggaggtcaa gaaggacctc atcatcaagc tccccaagta ctctcttttc 3660

gagctcgaga acggtcgtaa gaggatgctg gcttccgctg gtgtgctcca gaagggtaac 3720

gagcttgctc ttccttccaa gtacgtgaac ttcctctacc tcgcctccca ctacgagaag 3780

ctcaagggtt cccctgagga taacgagcag aagcagctct tcgtggagca gcacaagcac 3840

tacctcgacg agatcatcga gcagatctcc gagttctcca agcgcgtcat cctcgctgac 3900

gctaacctcg acaaggtcct ctccgcctac aacaagcacc gcgacaagcc catccgcgag 3960

caggccgaga acatcatcca cctcttcacg ctcacgaacc tcggcgcccc tgctgctttc 4020

aagtacttcg acaccaccat cgacaggaag cgttacacgt ccaccaagga ggttctcgac 4080

gctactctca tccaccagtc catcaccggt ctttacgaga ctcgtatcga cctttcccag 4140

cttggtggtg ataagcgtcc tgctgccacc aaaaaggccg gacaggctaa gaaaaagaag 4200

tag 4203

<210> 3

<211> 22

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 3

accatcgtca accactacat cg 22

<210> 4

<211> 22

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 4

gctgccagaa acccacgtca tg 22

<210> 5

<211> 23

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 5

aggagactat caccccttgg aac 23

<210> 6

<211> 24

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 6

ttgaaggtaa gagagtcatc gtgg 24

Claims

1.一种鉴别或辅助鉴别待测小麦是否为单倍体小麦的方法，为检测待测小麦的基因组DNA中是否含有bar基因和/或Cas9基因；

如果待测小麦的基因组DNA中不含有bar基因和Cas9基因，则所述待测小麦为单倍体小麦或候选为单倍体小麦；

如果待测小麦的基因组DNA中含有bar基因和/或Cas9基因，则所述待测小麦为非单倍体小麦或候选为非单倍体小麦；

所述bar基因的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：1所示；

所述Cas9基因的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：2所示。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述检测待测小麦的基因组DNA中是否含有bar基因和/或Cas9基因的方法为如下(1)或(2)：

(1)测序；

(2)用引物组合物分别对待测小麦样品进行PCR扩增；

所述引物组合物由引物对A和引物B组成；

所述引物对A由引物1和引物2组成；

所述引物1为如下a1)或a2)：

a1)SEQ ID NO：3所示的单链DNA分子；

所述引物2为如下b1)或b2)：

b1)SEQ ID NO：4所示的单链DNA分子；

所述引物对B由引物3和引物4组成；

所述引物3为如下c1)或c2)：

c1)SEQ ID NO：5所示的单链DNA分子；

所述引物4为如下d1)或d2)：

d1)SEQ ID NO：6所示的单链DNA分子；

3.一种鉴别或辅助鉴别待测小麦是否为单倍体小麦的方法，包括如下步骤：以待测小麦的基因组DNA为模板，利用引物对A和引物对B进行PCR扩增，检测扩增产物的大小，根据扩增产物的大小按照下述方法确定所述待测小麦是否为单倍体小麦：

如果所述扩增产物中含有大小为430bp和/或706bp的条带，所述待测小麦样品为非单倍体小麦或候选为非单倍体小麦；

如果所述扩增产物中不含有大小为430bp和706bp的条带，所述待测小麦样品为单倍体小麦或候选为单倍体小麦；

所述引物对A由引物1和引物2组成；

所述引物1为如下a1)或a2)：

a1)SEQ ID NO：3所示的单链DNA分子；

所述引物2为如下b1)或b2)：

b1)SEQ ID NO：4所示的单链DNA分子；

所述引物对B由引物3和引物4组成；

所述引物3为如下c1)或c2)：

c1)SEQ ID NO：5所示的单链DNA分子；

所述引物4为如下d1)或d2)：

d1)SEQ ID NO：6所示的单链DNA分子；

4.利用权利要求1-3任一所述的方法鉴别获得的单倍体小麦在小麦育种和/或功能基因组研究中的应用。

5.小麦的育种方法，为方法甲或方法乙；

所述方法乙包括如下步骤：采用权利要求1-3任一所述的方法筛选出单倍体小麦进行育种。

6.一种引物组合，由引物对A和引物对B组成；

所述引物对A由引物1和引物2组成；

所述引物1为如下a1)或a2)：

a1)SEQ ID NO：3所示的单链DNA分子；

所述引物2为如下b1)或b2)：

b1)SEQ ID NO：4所示的单链DNA分子；

所述引物对B由引物3和引物4组成；

所述引物3为如下c1)或c2)：

c1)SEQ ID NO：5所示的单链DNA分子；

所述引物4为如下d1)或d2)：

d1)SEQ ID NO：6所示的单链DNA分子；

7.权利要求6所述引物组合的应用，为如下(1)-(3)中的任一种：

(1)筛选或辅助筛选小麦单倍体；

(2)制备筛选或辅助筛选小麦单倍体的产品；

(3)小麦育种。

8.权利要求1或2或3或5所述的方法，其它特征在于：所述待测小麦为小麦TaMTL基因敲除纯合突变体为父本，普通小麦材料为母本，进行杂交获得杂交后代。

9.根据权利要求8所述的方法，其它特征在于：所述小麦TaMTL基因敲除纯合突变体为利用CRISPR/Cas9技术敲除小麦中的TaMTL基因得到的含有所述bar基因和所述Cas9基因的目的小麦。

10.权利要求1-3任一所述的方法在鉴定单倍体诱导系诱导的小麦单倍体中的应用；所述单倍体诱导系是利用CRISPR/Cas9技术敲除小麦TaMTL基因创制获得的。