CN111434688A - Cd73抗体及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种靶向CD73的抗体、其制备方法和用途。具体地，本发明公开了一种新的靶向CD73的鼠源或人鼠嵌合抗体。本发明还公开了制备所述的单克隆抗体的方法。本发明的单克隆抗体能够高特异性地结合CD73抗原，其具有很高的亲和力并且具有显著抗肿瘤等活性。

Description

CD73抗体及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于生物医药领域，具体地涉及一种CD73抗体及其制备方法和应用。
背景技术
近几年，肿瘤免疫治疗已成为肿瘤治疗领域的焦点，其中针对免疫检查点的治疗性单克隆抗体已在一些肿瘤类型如黑色素瘤和非小细胞肺癌等的治疗中显示了抗肿瘤活性，靶向细胞毒T淋巴细胞相关抗原4(cytotoxic T lymphocyte-associated antigen-4,CTLA-4)和程序性死亡分子1及其配体(programmed cell death 1/programmed celldeath ligand 1,PD-1/PD-L1)的免疫检查点抗体已获得美国FDA的批准。
然而，单一用药响应率低是现有肿瘤免疫疗法的主要问题。2000年，CTLA4 抗体开展临床实验，表现为存在毒性(引起组织特异的炎症反应)以及响应率低下。最明显的临床效果发生在黑色毒瘤的治疗中，但客观响应率仅为15％。在PD-1和PD-L1的临床实验中，霍奇金淋巴瘤、默克尔细胞癌、***增生性黑素瘤的客观响应率最高，达到50-90％；黑色素瘤治疗的响应率为35-40％；非小细胞肺癌、头颈癌、膀胱癌、肾癌、肝细胞癌的响应率仅有15-25％。肿瘤是一种多通路多靶点的疾病，单一的治疗药物客观响应率低，很可能是由于肿瘤细胞在某条信号通路被药物抑制时，选择其他代偿通路满足生长。为了提高现有的治疗效果、降低产生毒性的抗体用量，肿瘤免疫联合疗法将成为重要的发展趋势。
肿瘤使用多种手段来逃避免疫消除，因此更好地理解肿瘤微环境的免疫抑制是非常必要的。肿瘤微环境中氧含量低、缺乏营养物质、pH值常为酸性。肿瘤细胞有多种调节机制以适应恶劣的生存环境，其中最重要的途径之一是通过上调CD73(外-5’-核苷酸酶)表达量进而改变嘌呤代谢。CD73是一个70KD大小的蛋白，以非共价键形成二聚体，其C末端通过糖基磷脂酰肌醇(GPI)锚定在细胞膜上。CD73将细胞外的单磷酸核苷酸(AMP)脱磷酸化，产生腺苷。胞外的腺苷与多种细胞表面特异的腺苷受体(A1，A2A，A2B和A3)结合，激活腺苷通路，在免疫抑制、血管生成中有重要作用。
研究表明CD73在多种肿瘤细胞表面高表达，包括膀胱癌、血癌、神经胶质瘤、恶性胶质瘤、黑色素瘤、卵巢癌、结肠癌和乳腺癌等。CD73表达量上调与癌细胞增殖、转移、血管形成、和较短患者存活期相关。因此，CD73可作为一个新的药物作用靶点和生物标记，用于治疗癌症。
发明内容
为了克服目前缺少安全且特异性高的CD73抗体的不足，本发明提供一种亲和力高、特异性强的CD73抗体及其制备方法和应用。
在本发明的第一方面，提供了一种抗体的重链可变区，所述的重链可变区具有选自下组的互补决定区CDR：
SEQ ID NO.10n+3所示的VH-CDR1，
SEQ ID NO.10n+4所示的VH-CDR2，和
SEQ ID NO.10n+5所示的VH-CDR3；
其中，各n独立地为0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或13；
其中，上述氨基酸序列中任意一种氨基酸序列还包括任选地经过添加、缺失、修饰和/或取代至少一个氨基酸的，并能够保留CD73结合亲和力的衍生序列。
在另一优选例中，所述重链可变区具有SEQ ID NO.10n+1所示的氨基酸序列，其中，n为0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或13。
在另一优选例中，所述重链可变区具有SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列。
在另一优选例中，所述重链可变区具有SEQ ID NO.11所示的氨基酸序列。
在另一优选例中，所述重链可变区具有SEQ ID NO.21所示的氨基酸序列。
在本发明的第二方面，提供了一种抗体的重链，所述的重链具有如本发明的第一方面所述的重链可变区。
在另一优选例中，所述重链还包括重链恒定区。
在另一优选例中，所述重链恒定区为人源或鼠源的。
在另一优选例中，所述重链恒定区为人源抗体重链IgG1恒定区。
在另一优选例中，所述重链恒定区为人源抗体重链IgG1-TM恒定区。
在另一优选例中，所述IgG1-TM恒定区为IgG1含L234F,L235E和P331S三个位点突变。
在本发明的第三方面，提供了一种抗体的轻链可变区，所述的轻链可变区具有选自下组的互补决定区CDR：
SEQ ID NO.10n+8所示的VL-CDR1，
SEQ ID NO.10n+9所示的VL-CDR2，和
SEQ ID NO.10n+10所示的VL-CDR3；
其中，各n独立地为0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或13；
其中，上述氨基酸序列中任意一种氨基酸序列还包括任选地经过添加、缺失、修饰和/或取代至少一个氨基酸的，并能够保留CD73结合亲和力的衍生序列。
在另一优选例中，所述轻链可变区具有SEQ ID NO.10n+6所示的氨基酸序列，其中，n为0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或3。
在另一优选例中，所述轻链可变区具有SEQ ID NO.6所示的氨基酸序列。
在另一优选例中，所述轻链可变区具有SEQ ID NO.16所示的氨基酸序列。
在另一优选例中，所述轻链可变区具有SEQ ID NO.26所示的氨基酸序列。
在本发明的第四方面，提供了一种抗体的轻链，所述的轻链具有如本发明的第三方面所述的轻链可变区。
在另一优选例中，所述轻链还包括轻链恒定区。
在另一优选例中，所述轻链恒定区为人源或鼠源的。
在另一优选例中，所述轻链恒定区为人源抗体轻链kappa恒定区。
在本发明的第五方面，提供了一种抗体，所述抗体具有：
(1)如本发明的第一方面所述的重链可变区；和/或
(2)如本发明的第三方面所述的轻链可变区；
或者，所述抗体具有：如本发明的第二方面所述的重链；和/或如本发明的第四方面所述的轻链，
其中，上述氨基酸序列中任意一种氨基酸序列还包括任选地经过添加、缺失、修饰和/或取代至少一个氨基酸的，并能够保留CD73结合亲和力的衍生序列。
在另一优选例中，上述任一CDR的氨基酸序列中包含经过添加、缺失、修饰和/或取代1、2或3个氨基酸的衍生CDR序列，并且使得含有所述衍生CDR序列的 VH和VL所构成的衍生抗体能够保留与CD73结合的亲和力。
在另一优选例中，所述的衍生抗体与CD73结合的亲和力F1与相应非衍生的抗体与CD73结合的亲和力F0之比(F1/F0)为0.5-2，较佳地为0.7-1.5，和更佳地0.8-1.2。
在另一优选例中，所述添加、缺失、修饰和/或取代的氨基酸数量为1-5个(如 1-3个，较佳地1-2个，更佳地1个)。
在另一优选例中，所述的经过添加、缺失、修饰和/或取代至少一个氨基酸的，并能够保留CD73结合亲和力的衍生序列为同源性或序列相同性为至少96％的氨基酸序列。
在另一优选例中，所述的抗体还包括重链恒定区和/或轻链恒定区。
在另一优选例中，所述的重链恒定区为人源的，和/或所述的轻链恒定区为人源的。
在另一优选例中，所述重链恒定区为人源抗体重链IgG1恒定区，且所述轻链恒定区为人源抗体轻链kappa恒定区。
在另一优选例中，所述重链恒定区为人源抗体重链IgG1-TM恒定区，且所述轻链恒定区为人源抗体轻链kappa恒定区。
在另一优选例中，所述抗体的重链可变区还包括人源的框架区，和/或所述抗体的轻链可变区还包括人源的框架区。
在另一优选例中，所述抗体的重链可变区还包括鼠源的框架区，和/或所述抗体的轻链可变区还包括鼠源的框架区。
在另一优选例中，所述抗体选自下组：动物源抗体、嵌合抗体、人源化抗体、全人抗体、或其组合。
在另一优选例中，所述的嵌合抗体在人中的免疫原性Z1与非嵌合的抗体(如鼠源抗体)在人中的免疫原性Z0之比(Z1/Z0)为0-0.5，较佳地0-0.2，更佳地0-0.05(如 0.001-0.05)。
在另一优选例中，所述的抗体是部分或全人源化、或全人的单克隆抗体。
在另一优选例中，所述的抗体为双链抗体、或单链抗体。
在另一优选例中，所述抗体为抗体全长蛋白、或抗原结合片段。
在另一优选例中，所述抗体为双特异性抗体、或多特异性抗体。
在另一优选例中，所述的抗体为药物偶联物形式。
在另一优选例中，所述抗体具有选自下组的一个或多个特性：
(a)抑制CD73的酶活；
(b)促进CD73的内吞；
(c)恢复AMP所介导T细胞的增殖；
(d)改善肿瘤微环境，激活肿瘤特异免疫反应
(e)抑制肿瘤细胞迁移或转移；
(b)抑制肿瘤生长。
在另一优选例中，所述的抗体具有如本发明的第一方面所述的重链可变区和如本发明的第三方面所述的轻链可变区；
其中，所述的重链可变区和所述的轻链可变区包括选自下组的CDR：
Figure RE-GDA0001987075090000051
其中，上述氨基酸序列中任意一种氨基酸序列还包括任选地经过添加、缺失、修饰和/或取代至少一个氨基酸的，并能够保留CD73结合亲和力的衍生序列。
在另一优选例中，所述的抗体具有如本发明的第一方面所述的重链可变区和如本发明的第三方面所述的轻链可变区；其中，
所述的重链可变区包括以下三个互补决定区CDR：
SEQ ID NO.3所示的VH-CDR1，
SEQ ID NO.4所示的VH-CDR2，和
SEQ ID NO.5所示的VH-CDR3；
所述的轻链可变区包括以下三个互补决定区CDR：
SEQ ID NO.8所示的VL-CDR1，
SEQ ID NO.9所示的VL-CDR2，和
SEQ ID NO.10所示的VL-CDR3；
或
所述的重链可变区包括以下三个互补决定区CDR：
SEQ ID NO.13所示的VH-CDR1，
SEQ ID NO.14所示的VH-CDR2，和
SEQ ID NO.15所示的VH-CDR3；
所述的轻链可变区包括以下三个互补决定区CDR：
SEQ ID NO.18所示的VL-CDR1，
SEQ ID NO.19所示的VL-CDR2，和
SEQ ID NO.20所示的VL-CDR3；
或
所述的重链可变区包括以下三个互补决定区CDR：
SEQ ID NO.23所示的VH-CDR1，
SEQ ID NO.24所示的VH-CDR2，和
SEQ ID NO.25所示的VH-CDR3；
所述的轻链可变区包括以下三个互补决定区CDR：
SEQ ID NO.28所示的VL-CDR1，
SEQ ID NO.29所示的VL-CDR2，和
SEQ ID NO.30所示的VL-CDR3。
在另一优选例中，所述抗体的重链可变区含有SEQ ID NO.1、11、21、31、41、 51、61、71、81、91、101、111、121或131所示的氨基酸序列；和/或所述抗体的轻链可变区含有SEQID NO.6、16、26、36、46、56、66、76、86、96、106、116、 126或136所示的氨基酸序列。
在另一优选例中，所述抗体的重链可变区含有SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列；且所述抗体的轻链可变区含有SEQ ID NO.6所示的氨基酸序列。
在另一优选例中，所述抗体的重链可变区含有SEQ ID NO.11所示的氨基酸序列；且所述抗体的轻链可变区含有SEQ ID NO.16所示的氨基酸序列。
在另一优选例中，所述抗体的重链可变区含有SEQ ID NO.21所示的氨基酸序列；且所述抗体的轻链可变区含有SEQ ID NO.26所示的氨基酸序列。
在另一优选例中，所述的抗体选自下组：
Figure RE-GDA0001987075090000071
在另一优选例中，所述重链可变区的氨基酸序列与如序列表中SEQ ID NO.1、 11、21、31、41、51、61、71、81、91、101、111、121或131所示的氨基酸序列至少有80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同源性或序列相同性。
在另一优选例中，所述轻链可变区的氨基酸序列与如序列表中SEQ ID NO.6、 16、26、36、46、56、66、76、86、96、106、116、126或136所示的氨基酸序列至少有80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同源性或序列相同性。
在本发明的第六方面，提供了一种重组蛋白，所述的重组蛋白包括：
(i)如本发明的第一方面所述的重链可变区、如本发明的第二方面所述的重链、如本发明的第三方面所述的轻链可变区、如本发明的第四方面所述的轻链、或如本发明的第五方面所述的抗体；以及
(ii)任选的协助表达和/或纯化的标签序列。
在另一优选例中，所述的标签序列包括6His标签。
在另一优选例中，所述的重组蛋白(或多肽)包括融合蛋白。
在另一优选例中，所述的重组蛋白为单体、二聚体、或多聚体。
在另一优选例中，所述重组蛋白包括：
(i)选自下组的抗体，
Figure RE-GDA0001987075090000081
以及
(ii)任选的协助表达和/或纯化的标签序列。
在本发明的第七方面，提供了一种多核苷酸，所述多核苷酸编码选自下组的多肽：
(1)如本发明的第一方面所述的重链可变区、如本发明的第二方面所述的重链、如本发明的第三方面所述的轻链可变区、如本发明的第四方面所述的轻链、或如本发明的第五方面所述的抗体；以及
(2)如本发明的第六方面所述的重组蛋白。
在另一优选例中，编码所述重链可变区的多核苷酸如SEQ ID NO.2、12、22、 32、42、52、62、72、82、92、102、112、122或132所示；和/或，编码所述轻链可变区的多核苷酸如SEQ ID NO.7、17、27、37、47、57、67、77、87、97、107、 117、127或137所示。
在另一优选例中，编码所述重链可变区序列的多核苷酸和编码所述轻链可变区序列的多核苷酸选自下组：
Figure RE-GDA0001987075090000082
Figure RE-GDA0001987075090000091
在本发明的第八方面，提供了一种载体，所述载体含有本发明本发明的第七方面中任一项所述的多核苷酸。
在另一优选例中，所述的载体包括：细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒如腺病毒、逆转录病毒、或其他载体。
在本发明的第九方面，提供了一种遗传工程化的宿主细胞，所述宿主细胞含有本发明的第八方面所述的载体或基因组中整合有本发明的第七方面所述的多核苷酸。
在本发明的第十方面，提供了一种抗体偶联物，该抗体偶联物含有：
(a)抗体部分，所述抗体部分选自下组：如本发明的第一方面所述的重链可变区、如本发明的第二方面所述的重链、如本发明的第三方面所述的轻链可变区、如本发明的第四方面所述的轻链、或如本发明的第五方面所述的抗体、或其组合；和
(b)与所述抗体部分偶联的偶联部分，所述偶联部分选自下组：可检测标记物、药物、毒素、细胞因子、放射性核素、酶、或其组合。
在另一优选例中，所述的抗体部分与所述的偶联部分通过化学键或接头进行偶联。
在本发明的第十一方面，提供了一种免疫细胞，所述免疫细胞表达或在细胞膜外暴露有本发明的第五方面所述的抗体。
在另一优选例中，所述的免疫细胞包括NK细胞、T细胞。
在另一优选例中，所述的免疫细胞来自人或非人哺乳动物(如鼠)。
在本发明的第十二方面，提供了一种药物组合物，所述药物组合物含有：
(i)活性成分，所述活性成分选自下组：如本发明的第一方面所述的重链可变区、如本发明的第二方面所述的重链、如本发明的第三方面所述的轻链可变区、如本发明的第四方面所述的轻链、或如本发明的第五方面所述的抗体、如本发明的第六方面所述的重组蛋白、如本发明的第十方面所述的抗体偶联物、本发明的第十一方面所述的免疫细胞、或其组合；以及
(ii)药学上可接受的载体。
在另一优选例中，所述的药物组合物为液态制剂。
在另一优选例中，所述的药物组合物为注射剂。
在另一优选例中，所述的药物组合物包括0.01～99.99％的如本发明的第五方面所述的抗体、如本发明的第六方面所述的重组蛋白、如本发明的第十方面所述的抗体偶联物、本发明的第十一方面所述的免疫细胞、或其组合和0.01～99.99％的药用载体，所述百分比为占所述药物组合物的质量百分比。
在本发明的第十三方面，提供了一种活性成分的用途，所述活性成分选自下组：如本发明的第一方面所述的重链可变区、如本发明的第二方面所述的重链、如本发明的第三方面所述的轻链可变区、如本发明的第四方面所述的轻链、或如本发明的第五方面所述的抗体、如本发明的第六方面所述的重组蛋白、如本发明的第十方面所述的抗体偶联物、本发明的第十一方面所述的免疫细胞、或其组合，其中所述活性成分被用于(a)制备诊断试剂或试剂盒；和/或(b)制备预防和/或治疗与 CD73表达或功能异常相关的疾病的药物。
在另一优选例中，所述的诊断试剂为检测片或检测板。
在另一优选例中，所述CD73表达或功能异常相关的疾病为肿瘤。
在另一优选例中，所述肿瘤选自下组：膀胱癌、血癌、神经胶质瘤、恶性胶质瘤、黑色素瘤、卵巢癌、结肠癌、乳腺癌、肺癌、头颈癌、***癌、胰腺癌。
在另一优选例中，所述诊断试剂或试剂盒用于：
(1)检测样品中CD73蛋白；和/或
(2)检测肿瘤细胞中内源性的CD73蛋白；和/或
(3)检测表达CD73蛋白的肿瘤细胞；
而所述药物用于预防和/或治疗与CD73表达或功能异常相关的疾病，所述与 CD73表达或功能异常相关的疾病为肿瘤。
在另一优选例中，所述肿瘤选自下组：膀胱癌、血癌、神经胶质瘤、恶性胶质瘤、黑色素瘤、卵巢癌、结肠癌、乳腺癌肺癌、头颈癌、***癌、胰腺癌。
在另一优选例中，所述的抗体为药物偶联物(ADC)形式。
在另一优选例中，所述的诊断试剂或试剂盒用于诊断CD73相关疾病。
在另一优选例中，所述的诊断试剂或试剂盒用于检测样品中CD73蛋白。
在本发明的第十四方面，提供了一种体外检测(包括诊断性或非诊断性)样品中CD73蛋白的方法，所述方法包括步骤：
(1)在体外，将所述样品与如本发明的第五方面所述的抗体接触；
(2)检测是否形成抗原-抗体复合物，其中形成复合物就表示样品中存在CD73 蛋白。
在本发明的第十五方面，提供了一种体外检测样品中CD73蛋白的组合物，其包括如本发明的第五方面所述的抗体、如本发明的第六方面所述的重组蛋白、如本发明的第十方面所述的抗体偶联物、本发明的第十一方面所述的免疫细胞、或其组合作为活性成分。
在本发明的第十六方面，提供了一种检测板，所述的检测板包括：基片(支撑板)和测试条，所述的测试条含有如本发明的第五方面所述的抗体、如本发明的第六方面所述的重组蛋白、如本发明的第十方面所述的抗体偶联物、本发明的第十一方面所述的免疫细胞、或其组合。
在本发明的第十七方面，提供了一种试剂盒，所述试剂盒中包括：
(1)第一容器，所述第一容器中含有本发明的抗体；和/或
(2)第二容器，所述第二容器中含有抗本发明抗体的二抗；
或者，
所述试剂盒含有如本发明的第十六方面所述的检测板。
在本发明的第十八方面，提供了一种重组多肽的制备方法，该方法包括：
(a)在适合表达的条件下，培养如本发明的第九方面所述的宿主细胞；
(b)从培养物中分离出重组多肽，所述的重组多肽是如本发明的第五方面所述的抗体或如本发明的第六方面所述的重组蛋白。
在本发明的第十九方面，提供了一种药物组合，包括：
(i)第一活性成分，所述第一活性成分包括如本发明的第五方面所述的抗体1、或如本发明的第六方面所述的重组蛋白、或如本发明的第十方面所述的抗体偶联物、或如本发明的第十一方面所述的免疫细胞、或如本发明的第十二方面所述的药物组合物、或其组合；
(ii)第二活性成分，所述第二活性成分包括第二抗体、或化疗剂。
在另一优选例中，所述第二抗体选自下组：CTLA4抗体、PD-1抗体、PD-L1 抗体。
在另一优选例中，所述的第二抗体为PD-1抗体。
在另一优选例中，所述的第二活性成分为A2AR抑制剂。
在另一优选例中，所述化疗剂选自下组：多西他赛、卡铂、或其组合。
在本发明的第二十方面，提供了本发明的第五方面所述的抗体，或本发明的第六方面所述的重组蛋白、或本发明的第十方面所述的抗体偶联物、或本发明的第十一方面所述的免疫细胞、和/或本发明的第十二方面所述的药物组合物与第二抗体或化疗剂的组合在制备用于治疗CD73表达或功能异常相关的疾病的药物中的用途。
在另一优选例中，所述第二抗体选自下组：CTLA4抗体、PD-1抗体、PD-L1 抗体。
在另一优选例中，所述的第二抗体为PD-1抗体。
在另一优选例中，所述的第二活性成分为A2AR抑制剂。
在本发明的第二十一方面，提供了一种治疗与CD73表达或功能异常相关的疾病的方法，向有需要的对象施用有效量的如本发明的第五方面所述的抗体、或如本发明的第六方面所述的重组蛋白、或如本发明的第十方面所述的抗体偶联物、或如本发明的第十一方面所述的免疫细胞、或如本发明的第十二方面所述的药物组合物、或其组合。
在另一优选例中，所述与CD73表达或功能异常相关的疾病为肿瘤。
在另一优选例中，所述肿瘤选自下组：膀胱癌、血癌、神经胶质瘤、恶性胶质瘤、黑色素瘤、卵巢癌、结肠癌、乳腺癌、肺癌、头颈癌、***癌、胰腺癌。
在另一优选例中，所述的方法还包括：在施用第一活性成分之前、之中和/或之后，向所述对象施用安全有效量的第二抗体。
在另一优选例中，所述的第二抗体选自下组：CTLA4抗体、PD-1抗体、PD-L1 抗体。
在另一优选例中，所述的第二抗体为PD-1抗体。
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例) 中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
附图说明
图1及图1(续)流式细胞实验(FACS)检测鼠源抗体与人CD73、食蟹猴 CD73和鼠CD73的结合。其中mIgG1为同型对照；MFI(mean fluorescence intensity)为平均荧光强度。
图2及图2(续)抗CD73鼠源抗体抑制人CD73的酶活。其中mIgG1为同型对照。
图3及图3(续)抗CD73鼠源抗体介导CD73内吞。其中mIgG1为同型对照。
图4抗CD73鼠源抗体恢复AMP介导的抑制T细胞增殖。其中，Control是指：activated或activated+AMP，Activated为无AMP和抗体时T细胞的增殖百分比； Activated+AMP 500uM为有AMP、无抗体时T细胞的增殖百分比；mIgG1为同型对照。
图5流式细胞实验(FACS)检测嵌合抗体与人CD73、食蟹猴CD73和鼠 CD73的结合。其中hIgG1为对照；MFI(mean fluorescence intensity)为平均荧光强度。
图6及图6(续)抗CD73嵌合抗体抑制人CD73的酶活。其中hIgG1为对照。
图7及图7(续)抗CD73嵌合抗体介导CD73内吞。其中hIgG1为对照。
图8抗CD73嵌合抗体恢复CD4+ T细胞增殖。其中Control是指activated或activated+AMP；Activated为无AMP和抗体时T细胞的增殖百分比； Activated+AMP 800uM为有AMP、无抗体时T细胞的增殖百分比；hIgG1为对照； Tab2为Innate Pharma的抗人CD73抗体11E1。
具体实施方式
本发明人通过广泛而深入的研究，采用不同免疫策略(不同小鼠品系、多种抗原、不同施用途径)获得了多样性的抗体序，从中挑选得到了与人CD73 相结合的、各类性质都更为出色(如体外活性各方面都优异)的特异性抗CD73 单克隆抗体。具体而言，本发明采用免疫SJL小鼠、杂交瘤、分子生物学(测序、构建载体)等技术，提供了一组与CD73结合的人鼠嵌合抗体，含有小鼠源抗体重链和轻链可变区和人源抗体恒定区。所有可变区均含有CDR1，CDR2， CRR3三个互补决定区或高变区。该类抗体可变区可进行人源化，与人源抗体恒定区组合为全人抗体分子。CD73酶活实验、内吞实验和T细胞增殖实验证明所得CD73抗体具有优异的生物活性：相比于MEDI9447能明显地抑制CD73的酶活、促进CD73的内吞，相比于BMS-986179能更有效地恢复AMP所介导T细胞的增殖。此外，本发明还提供了所述抗CD73单克隆抗体的用途，包括改善肿瘤微环境，激活肿瘤特异免疫反应，抑制肿瘤生长，单独或与其它抗肿瘤药物联合应用于用于肿瘤免疫治疗。本发明还提供了所述抗CD73单克隆抗体与多种免疫检查点抗体或化疗剂联用有效抑制肿瘤生长，从而用于制备用于治疗CD73表达或功能异常相关的疾病的药物的用途。在此基础上完成了本发明。
术语
本发明中，“VH-CDR1”与“CDR-H1”可互换使用，均指重链可变区的 CDR1；“VH-CDR2”与“CDR-H2”可互换使用，均指重链可变区的CDR2；“VH-CDR3”与“CDR-H3”可互换使用，均指重链可变区的CDR3。“VL-CDR1”与“CDR-L1”可互换使用，均指轻链可变区的CDR1；“VL-CDR2”与“CDR-L2”可互换使用，均指轻链可变区的CDR2；“VL-CDR3”与“CDR-L3”可互换使用，均指轻链可变区的CDR3。
抗体
如本文所用，术语“抗体”或“免疫球蛋白”是有相同结构特征的约150000道尔顿的异四聚糖蛋白，其由两个相同的轻链(L)和两个相同的重链(H)组成。每条轻链通过一个共价二硫键与重链相连，而不同免疫球蛋白同种型的重链间的二硫键数目不同。每条重链和轻链也有规则间隔的链内二硫键。每条重链的一端有可变区(VH)，其后是多个恒定区。每条轻链的一端有可变区(VL)，另一端有恒定区；轻链的恒定区与重链的第一个恒定区相对，轻链的可变区与重链的可变区相对。特殊的氨基酸残基在轻链和重链的可变区之间形成界面。
如本文所用，术语“可变”表示抗体中可变区的某些部分在序列上有所不同，它形成了各种特定抗体对其特定抗原的结合和特异性。然而，可变性并不均匀地分布在整个抗体可变区中。它集中于轻链和重链可变区中称为互补决定区 (CDR)或超变区中的三个片段中。可变区中较保守的部分称为构架区(FR)。天然重链和轻链的可变区中各自包含四个FR区，它们大致上呈β-折叠构型，由形成连接环的三个CDR相连，在某些情况下可形成部分β折叠结构。每条链中的 CDR通过FR区紧密地靠在一起并与另一链的CDR一起形成了抗体的抗原结合部位(参见Kabat等,NIH Publ.No.91-3242,卷I，647-669页(1991))。恒定区不直接参与抗体与抗原的结合，但是它们表现出不同的效应功能，例如参与抗体的依赖于抗体的细胞毒性。
脊椎动物抗体(免疫球蛋白)的“轻链”可根据其恒定区的氨基酸序列归为明显不同的两类(称为κ和λ)中的一类。根据其重链恒定区的氨基酸序列，免疫球蛋白可以分为不同的种类。主要有5类免疫球蛋白：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，其中一些还可进一步分成亚类(同种型)，如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA和IgA2。对应于不同类免疫球蛋白的重链恒定区分别称为α、δ、ε、γ、和μ。不同类免疫球蛋白的亚单位结构和三维构型是本领域人员所熟知的。
一般，抗体的抗原结合特性可由位于重链和轻链可变区的3个特定的区域来描述，称为可变区域(CDR)，将该段间隔成4个框架区域(FR)，4个FR的氨基酸序列相对比较保守，不直接参与结合反应。这些CDR形成环状结构，通过其间的FR形成的β折叠在空间结构上相互靠近，重链上的CDR和相应轻链上的 CDR构成了抗体的抗原结合位点。可以通过比较同类型的抗体的氨基酸序列来确定是哪些氨基酸构成了FR或CDR区域。
本发明不仅包括完整的抗体，还包括具有免疫活性的抗体的片段或抗体与其他序列形成的融合蛋白。因此，本发明还包括所述抗体的片段、衍生物和类似物。
在本发明中，抗体包括用本领域技术人员熟知技术所制备的鼠的、嵌合的、人源化的或者全人的抗体。重组抗体，例如嵌合的和人源化的单克隆抗体，包括人的和非人的部分，可以通过标准的DNA重组技术获得，它们都是有用的抗体。嵌合抗体是一个分子，其中不同的部分来自不同的动物种，例如具有来自鼠的单克隆抗体的可变区，和来自人免疫球蛋白的恒定区的嵌合抗体(见例如美国专利4,816,567和美国专利4,816,397,在此通过引用方式整体引入本文)。人源化的抗体是指来源于非人物种的抗体分子，具有一个或多个来源于非人物种的互补决定区(CDRs)和来源于人免疫球蛋白分子的框架区域(见美国专利 5,585,089，在此通过引用方式整体引入本文)。这些嵌合和人源化的单克隆抗体可以采用本领域熟知的DNA重组技术制备。
在本发明中，抗体可以是单特异性、双特异性、三特异性、或者更多的多重特异性。
在本发明中，本发明的抗体还包括其保守性变异体，指与本发明抗体的氨基酸序列相比，有至多10个，较佳地至多8个，更佳地至多5个，最佳地至多3 个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成多肽。这些保守性变异多肽最好根据表1进行氨基酸替换而产生。
表1
Figure RE-GDA0001987075090000161
Figure RE-GDA0001987075090000171
抗CD73的抗体
本发明中，所述抗体为抗CD73的抗体。本发明提供一种针对CD73的高特异性和高亲和力的抗体，其包括重链和轻链，所述重链含有重链可变区(VH)氨基酸序列，所述轻链含有轻链可变区(VL)氨基酸序列。
优选地，
所述的重链可变区(VH)具有选自下组的互补决定区CDR：
SEQ ID NO.10n+3所示的VH-CDR1，
SEQ ID NO.10n+4所示的VH-CDR2，和
SEQ ID NO.10n+5所示的VH-CDR3；
其中，各n独立地为0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或13；
所述的轻链可变区(VL)具有选自下组的互补决定区CDR：
SEQ ID NO.10n+8所示的VL-CDR1，
SEQ ID NO.10n+9所示的VL-CDR2，和
SEQ ID NO.10n+10所示的VL-CDR3；
其中，各n独立地为0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或13；
其中，上述氨基酸序列中任意一种氨基酸序列还包括任选地经过添加、缺失、修饰和/或取代至少一个氨基酸的，并能够保留CD73结合亲和力的衍生序列。
优选地，重链可变区(VH)包括以下三个互补决定区CDR：
SEQ ID NO.10n+3所示的VH-CDR1，
SEQ ID NO.10n+4所示的VH-CDR2，和
SEQ ID NO.10n+5所示的VH-CDR3；
轻链可变区(VL)包括以下三个互补决定区CDR：
SEQ ID NO.10n+8所示的VL-CDR1，
SEQ ID NO.10n+9所示的VL-CDR2，和
SEQ ID NO.10n+10所示的VL-CDR3；
各n独立地为0、1、2或3；较佳地n为0或1；
其中，上述氨基酸序列中任意一种氨基酸序列还包括任选地经过添加、缺失、修饰和/或取代至少一个氨基酸的，并能够保留CD73结合亲和力的衍生序列。
在另一优选例中，所述经过添加、缺失、修饰和/或取代至少一个氨基酸序列所形成的序列优选为同源性或序列相同性为至少80％，较佳地至少85％，更佳地至少为90％，最佳地至少95％的氨基酸序列。
本领域普通技术人员公知的测定序列同源性或相同性的方法包括但不限于：计算机分子生物学(Computational Molecular Biology)，Lesk，A.M.编，牛津大学出版社，纽约，1988；生物计算：信息学和基因组项目(Biocomputing:Informatics and GenomeProjects)，Smith，D.W.编，学术出版社，纽约，1993；序列数据的计算机分析(ComputerAnalysis of Sequence Data)，第一部分，Griffin，A.M.和Griffin，H.G.编，HumanaPress，新泽西，1994；分子生物学中的序列分析(Sequence Analysis in MolecularBiology)， von Heinje，G.，学术出版社，1987和序列分析引物(Sequence AnalysisPrimer)， Gribskov，M.与Devereux，J.编M Stockton Press，纽约，1991和Carillo，H.与Lipman， D.，SIAM J.Applied Math.，48:1073(1988)。测定相同性的优选方法要在测试的序列之间得到最大的匹配。测定相同性的方法编译在公众可获得的计算机程序中。优选的测定两条序列之间相同性的计算机程序方法包括但不限于：GCG程序包 (Devereux，J.等，1984)、BLASTP、BLASTN和FASTA(Altschul，S，F.等，1990)。公众可从NCBI和其它来源得到BLASTX程序(BLAST手册，Altschul，S.等，NCBI NLM NIH Bethesda，Md.20894；Altschul，S.等，1990)。熟知的Smith Waterman算法也可用于测定相同性。
较佳地，本文所述抗体为抗体全长蛋白、抗原抗体结合域蛋白质片段、双特异性抗体、多特异性抗体、单链抗体(single chain antibody fragment，scFv)、单域抗体(singledomain antibody，sdAb)和单区抗体(Signle-domain antibody) 中的一种或多种，以及上述抗体所制得的单克隆抗体或多克隆抗体。所述单克隆抗体可以由多种途径和技术进行研制，包括杂交瘤技术、噬菌体展示技术、单淋巴细胞基因克隆技术等，主流是通过杂交瘤技术从野生型或转基因小鼠制备单克隆抗体。
所述的抗体全长蛋白为本领域常规的抗体全长蛋白，其包括重链可变区、轻链可变区、重链恒定区和轻链恒定区。所述的蛋白质的重链可变区和轻链可变区与人源重链恒定区和人源轻链恒定区构成全人源抗体全长蛋白。较佳地，所述的抗体全长蛋白为IgG1、IgG2、IgG3或IgG4。
本发明中的抗体(抗CD73的抗体)可以是全长蛋白(如IgG1,IgG2a,IgG2b 或者IgG2c)，也可以是包含抗原抗体结合域的蛋白片段(例如Fab，F(ab’),sdAb, ScFv片段)。
本发明中的抗体(抗CD73的抗体)可以是野生型蛋白，也可以是经过特定突变已达到某种特定效果的突变型蛋白，例如利用突变消除抗体的效应子功能。
本发明的抗体可以是双链或单链抗体，并且可以是选自动物源抗体、嵌合抗体、人源化抗体，更优选为人源化抗体、人-动物嵌合抗体，更优选为全人源化抗体。
本发明所述抗体衍生物可以是单链抗体、和/或抗体片段，如：Fab、Fab'、 (Fab')2或该领域内其他已知的抗体衍生物等，以及IgA、IgD、IgE、IgG以及IgM 抗体或其他亚型的抗体中的任意一种或几种。
所述的单链抗体为本领域常规的单链抗体，其包括重链可变区、轻链可变区和15～20个氨基酸的短肽。
其中，所述动物优选为哺乳动物，如鼠。
本发明抗体可以是靶向CD73(例如人CD73)的嵌合抗体、人源化抗体、 CDR嫁接和/或修饰的抗体。
本发明上述内容中，所述添加、缺失、修饰和/或取代的氨基酸数量，优选为不超过初始氨基酸序列总氨基酸数量的40％，更优选为不超过35％，更优选为1-33％，更优选为5-30％，更优选为10-25％，更优选为15-20％。
本发明上述内容中，更优选地，所述添加、缺失、修饰和/或取代的氨基酸数量，可以是1-7个，更优选为1-5个，更优选为1-3个，更优选为1-2个。
在另一优选例中，所述抗体的重链可变区含有SEQ ID NO.1、11、21、31、 41、51、61、71、81、91、101、111、121或131所示的氨基酸序列。
在另一优选例中，所述抗体的轻链可变区含有SEQ ID NO.6、16、26、36、 46、56、66、76、86、96、106、116、126或136所示的氨基酸序列。
在另一优选例中，所述靶向CD73的抗体的重链可变区(VH)氨基酸序列，和/或，轻链可变区(VL)氨基酸序列如下表2所示：
表2
Figure RE-GDA0001987075090000201
在另一优选例中，所述靶向CD73的抗体为42A5A7、56F12H8、66H6C12、 24D6B4、37F8B7、57G8H7、60G1C8、69C9E12、47F12C11、71E10B3、77B9A3、 78E6G7、80H7D6、125A4E10。
在另一优选例中，所述靶向CD73的抗体为42A5A7、56F12H8、66H6C12。
在另一优选例中，所述靶向CD73的抗体为42A5A7。
重组蛋白
本发明还提供一种重组蛋白，其包括CD73抗体的重链CDR1(VH-CDR1)、重链CDR2(VH-CDR2)和重链CDR3(VH-CDR3)中的一种或多种，和/或， CD73抗体的轻链CDR1(VL-CDR1)、轻链CDR2(VL-CDR2)和轻链CDR3 (VL-CDR3)中的一种或多种，
所述重链CDR1-3的序列如下：
SEQ ID NO.10n+3所示的VH-CDR1，
SEQ ID NO.10n+4所示的VH-CDR2，
SEQ ID NO.10n+5所示的VH-CDR3；
所述轻链CDR1-3的序列如下：
SEQ ID NO.10n+8所示的VL-CDR1，
SEQ ID NO.10n+9所示的VL-CDR2，和
SEQ ID NO.10n+10所示的VL-CDR3；
各n独立地为0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或13；较佳地n为 0或1；
其中，上述氨基酸序列中任意一种氨基酸序列还包括任选地经过添加、缺失、修饰和/或取代至少一个氨基酸的，并能够保留CD73结合亲和力的衍生序列。
在另一优选例中，所述经过添加、缺失、修饰和/或取代至少一个氨基酸序列所形成的序列优选为同源性或序列相同性为至少80％，较佳地至少85％，更佳地至少为90％，最佳地至少95％的氨基酸序列。
在另一优选例中，本发明所述的重组蛋白包括CD73抗体的重链可变区和/ 或CD73抗体的轻链可变区，所述抗体的重链可变区含有SEQ ID NO.1、11、21、 31、41、51、61、71、81、91、101、111、121或131所示的氨基酸序列；所述抗体的轻链可变区含有SEQ ID NO.6、16、26、36、46、56、66、76、86、96、106、 116、126或136所示的氨基酸序列。
在另一优选例中，本发明所述的重组蛋白包括CD73抗体的重链可变区和 CD73抗体的轻链可变区，所述抗体的重链可变区含有SEQ ID NO.1、11、21、31、 41、51、61、71、81、91、101、111、121或131所示的氨基酸序列，且所述抗体的轻链可变区含有SEQ ID NO.6、16、26、36、46、56、66、76、86、96、106、116、 126或136所示的氨基酸序列。
在另一优选例中，所述重组蛋白及其包括的重链CDR1-3、轻链CDR1-3的氨基酸序列的序列编号如表3所示：
表3重链CDR1-3、轻链CDR1-3的氨基酸序列的序列编号
Figure RE-GDA0001987075090000221
其中，上述氨基酸序列中任意一种氨基酸序列还包括任选地经过添加、缺失、修饰和/或取代至少一个氨基酸的，并能够保留CD73结合亲和力的衍生序列。
较佳地，所述的重组蛋白还包括抗体重链恒定区和/或抗体轻链恒定区，所述的抗体重链恒定区为本领域常规，较佳地为大鼠源抗体重链恒定区或人源抗体重链恒定区，更佳地为人源抗体重链恒定区。所述的抗体轻链恒定区为本领域常规，较佳地为大鼠源轻链抗体恒定区或人源抗体轻链恒定区，更佳地为人源抗体轻链恒定区。
所述的重组蛋白为本领域常规的蛋白质，较佳地，其为抗体全长蛋白、抗原抗体结合域蛋白质片段、双特异性抗体、多特异性抗体、单链抗体(single chain antibodyfragment，scFv)、单域抗体(single domain antibody，sdAb)和单区抗体(Signle-domainantibody)中的一种或多种，以及上述抗体所制得的单克隆抗体或多克隆抗体。所述单克隆抗体可以由多种途径和技术进行研制，包括杂交瘤技术、噬菌体展示技术、单淋巴细胞基因克隆技术等，主流是通过杂交瘤技术从野生型或转基因小鼠制备单克隆抗体。
所述的抗体全长蛋白为本领域常规的抗体全长蛋白，其包括重链可变区、轻链可变区、重链恒定区和轻链恒定区。所述的蛋白质的重链可变区和轻链可变区与人源重链恒定区和人源轻链恒定区构成全人源抗体全长蛋白。较佳地，所述的抗体全长蛋白为IgG1、IgG2、IgG3或IgG4。
所述的单链抗体为本领域常规的单链抗体，其包括重链可变区、轻链可变区和15～20个氨基酸的短肽。
所述的抗原抗体结合域蛋白质片段为本领域常规的抗原抗体结合域蛋白质片段，其包括轻链可变区、轻链恒定区和重链恒定区的Fd段。较佳地，所述的抗原抗体结合域蛋白质片段为Fab和F(ab’)。
所述的单域抗体为本领域常规的单域抗体，其包括重链可变区和重链恒定区。
所述的单区抗体为本领域常规的单区抗体，其仅包括重链可变区。
其中，所述重组蛋白的制备方法为本领域常规的制备方法。所述制备方法较佳地为：从重组表达该蛋白质的表达转化体中分离获得或者通过人工合成蛋白质序列获得。所述的从重组表达该蛋白质的表达转化体中分离获得优选如下方法：将编码所述蛋白质并且带有点突变的核酸分子克隆到重组载体中，将所得重组载体转化到转化体中，得到重组表达转化体，通过培养所得重组表达转化体，即可分离纯化获得所述重组蛋白。
核酸
本发明还提供一种核酸，其编码上述的抗体(例如抗CD73的抗体)或重组蛋白或抗CD73的抗体的重链可变区或轻链可变区。
较佳地，编码所述重链可变区的核酸的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.2、 12、22、32、42、52、62、72、82、92、102、112、122或132所示；和/或，编码所述轻链可变区的核酸的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.7、17、27、37、47、57、 67、77、87、97、107、117、127或137所示。
更佳地，编码所述重链可变区的核酸的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.2、 12、22、32、42、52、62、72、82、92、102、112、122或132所示；且编码所述轻链可变区的核酸的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.7、17、27、37、47、57、67、 77、87、97、107、117、127或137所示。
所述核酸的制备方法为本领域常规的制备方法，较佳地，包括以下的步骤：通过基因克隆技术获得编码上述蛋白质的核酸分子，或者通过人工全序列合成的方法得到编码上述蛋白质的核酸分子。
本领域技术人员知晓，编码上述蛋白质的氨基酸序列的碱基序列可以适当引入替换、缺失、改变、***或增加来提供一个多聚核苷酸的同系物。本发明中多聚核苷酸的同系物可以通过对编码该蛋白序列基因的一个或多个碱基在保持抗体活性范围内进行替换、缺失或增加来制得。
载体
本发明还提供一种包含所述核酸的重组表达载体。
其中所述重组表达载体可通过本领域常规方法获得，即：将本发明所述的核酸分子连接于各种表达载体上构建而成。所述的表达载体为本领域常规的各种载体，只要其能够容载前述核酸分子即可。所述载体较佳地包括：各种质粒、粘粒、噬菌体或病毒载体等。
本发明还提供一种包含上述重组表达载体的重组表达转化体。
其中，所述重组表达转化体的制备方法为本领域常规的制备方法，较佳地为：将上述重组表达载体转化至宿主细胞中制得。所述的宿主细胞为本领域常规的各种宿主细胞，只要能满足使上述重组表达载体稳定地自行复制，且所携带所述的核酸可被有效表达即可。较佳地，所述宿主细胞为E.coli TG1或E.coli BL21细胞(表达单链抗体或Fab抗体)，或者HEK293或CHO细胞(表达全长IgG 抗体)。将前述重组表达质粒转化至宿主细胞中，即可得本发明优选的重组表达转化体。其中所述转化方法为本领域常规转化方法，较佳地为化学转化法，热激法或电转法。
抗体的制备
本发明抗体或其片段的DNA分子的序列可以用常规技术，比如利用PCR扩增或基因组文库筛选等方法获得。此外，还可将轻链和重链的编码序列融合在一起，形成单链抗体。
一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。
此外，还可用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。通常，通过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。
目前，已经可以完全通过化学合成来得到编码所述的本发明的抗体(或其片段，或其衍生物)的DNA序列。然后可将该DNA序列引入本领域中已知的各种现有的DNA分子(或如载体)和细胞中。此外，还可通过化学合成将突变引入本发明蛋白序列中。
本发明还涉及包含上述的适当DNA序列以及适当启动子或者控制序列的载体。这些载体可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质。
宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如哺乳动物细胞。优选的动物细胞包括(但并不限于)： CHO-S、HEK-293细胞。
通常，在适合本发明抗体表达的条件下，培养转化所得的宿主细胞。然后用常规的免疫球蛋白纯化步骤，如蛋白A-Sepharose、羟基磷灰石层析、凝胶电泳、透析、离子交换层析、疏水层析、分子筛层析或亲和层析等本领域技术人员熟知的常规分离纯化手段纯化得到本发明的抗体。
所得单克隆抗体可用常规手段来鉴定。比如，单克隆抗体的结合特异性可用免疫沉淀或体外结合试验(如放射性免疫测定(RIA)或酶联免疫吸附测定 (ELISA))来测定。单克隆抗体的结合亲和力例如可用Munson等,Anal. Biochem.,107:220(1980)的Scatchard分析来测定。
本发明的抗体可在细胞内、或在细胞膜上表达、或分泌到细胞外。如果需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化重组的蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于：常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超声处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(HPLC) 和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。
抗体-药物偶联物(ADC)
本发明还提供了基于本发明抗体的抗体偶联药物(antibody-drug conjugate，ADC)。
典型地，所述抗体偶联药物包括所述抗体、以及效应分子，所述抗体与所述效应分子偶联，并优选为化学偶联。其中，所述效应分子优选为具有治疗活性的药物。此外，所述效应分子可以是毒蛋白、化疗药物、小分子药物或放射性核素中的一种或多种。
本发明抗体与所述效应分子之间可以是通过偶联剂进行偶联。所述偶联剂的例子可以是非选择性偶联剂、利用羧基的偶联剂、肽链、利用二硫键的偶联剂中的任意一种或几种。所述非选择性偶联剂是指使效应分子和抗体形成共价键连接的化合物，如戊二醛等。所述利用羧基的偶联剂可以是顺乌头酸酐类偶联剂(如顺乌头酸酐)、酰基腙类偶联剂(偶联位点为酰基腙)中的任意一种或几种。
抗体上某些残基(如Cys或Lys等)用于与多种功能基团相连，其中包括成像试剂(例如发色基团和荧光基团)，诊断试剂(例如MRI对比剂和放射性同位素)，稳定剂(例如乙二醇聚合物)和治疗剂。抗体可以被偶联到功能剂以形成抗体-功能剂的偶联物。功能剂(例如药物，检测试剂，稳定剂)被偶联(共价连接)至抗体上。功能剂可以直接地、或者是通过接头间接地连接于抗体。
抗体可以偶联药物从而形成抗体药物偶联物(ADCs)。典型地，ADC包含位于药物和抗体之间的接头。接头可以是可降解的或者是不可降解的接头。可降解的接头典型地在细胞内环境下容易降解，例如在目标位点处接头发生降解，从而使药物从抗体上释放出来。合适的可降解的接头包括，例如酶降解的接头，其中包括可以被细胞内蛋白酶(例如溶酶体蛋白酶或者内体蛋白酶)降解的含有肽基的接头，或者糖接头例如，可以被葡糖苷酸酶降解的含葡糖苷酸的接头。肽基接头可以包括，例如二肽，例如缬氨酸-瓜氨酸，苯丙氨酸-赖氨酸或者缬氨酸-丙氨酸。其它合适的可降解的接头包括，例如，pH敏感接头(例如pH小于 5.5时水解的接头，例如腙接头)和在还原条件下会降解的接头(例如二硫键接头)。不可降解的接头典型地在抗体被蛋白酶水解的条件下释放药物。
连接到抗体之前，接头具有能够和某些氨基酸残基反应的活性反应基团，连接通过活性反应基团实现。巯基特异性的活性反应基团是优选的，并包括：例如马来酰亚胺类化合物，卤代酰胺(例如碘、溴或氯代的)；卤代酯(例如碘、溴或氯代的)；卤代甲基酮(例如碘、溴或氯代)，苄基卤代物(例如碘、溴或氯代的)；乙烯基砜，吡啶基二硫化物；汞衍生物例如3,6-二-(汞甲基)二氧六环，而对离子是醋酸根、氯离子或者硝酸根；和聚亚甲基二甲基硫醚硫代磺酸盐。接头可以包括，例如，通过硫代丁二酰亚胺连接到抗体上的马来酰亚胺。
药物可以是任何细胞毒性，抑制细胞生长或者免疫抑制的药物。在实施方式中，接头连接抗体和药物，而药物具有可以和接头成键的功能性基团。例如，药物可以具有可以和连接物成键的氨基，羧基，巯基，羟基，或者酮基。在药物直接连接到接头的情况下，药物在连接到抗体之前，具有反应的活性基团。
有用的药物类别包括，例如，抗微管蛋白药物、DNA小沟结合试剂、DNA 复制抑制剂、烷化试剂、抗生素、叶酸拮抗物、抗代谢药物、化疗增敏剂、拓扑异构酶抑制剂、长春花生物碱等。特别有用的细胞毒性药物类的例子包括，例如，DNA小沟结合试剂、DNA烷基化试剂、和微管蛋白抑制剂、典型的细胞毒性药物包括、例如奥瑞他汀(auristatins)、喜树碱(camptothecins)、多卡霉素/ 倍癌霉素(duocarmycins)、依托泊甙(etoposides)、美登木素(maytansines)和美登素类化合物(maytansinoids)(例如DM1和DM4)、紫杉烷(taxanes)、苯二氮卓类 (benzodiazepines)或者含有苯二氮卓的药物(benzodiazepine containingdrugs)(例如吡咯并[1,4]苯二氮卓类(PBDs)，吲哚啉苯并二氮卓类(indolinobenzodiazepines) 和噁唑烷并苯并二氮卓类(oxazolidinobenzodiazepines))和长春花生物碱(vinca alkaloids)。
在本发明中，药物-接头可以用于在一个简单步骤中形成ADC。在其它实施方式中，双功能连接物化合物可以用于在两步或多步方法中形成ADC。例如，半胱氨酸残基在第一步骤中与接头的反应活性部分反应，并且在随后的步骤中，接头上的功能性基团与药物反应，从而形成ADC。
通常，选择接头上功能性基团，以利于特异性地与药物部分上的合适的反应活性基团进行反应。作为非限制性的例子，基于叠氮化合物的部分可以用于特异性地与药物部分上的反应性炔基基团反应。药物通过叠氮和炔基之间的 1,3-偶极环加成，从而共价结合于接头。其它的有用的功能性基团包括，例如酮类和醛类(适合与酰肼类和烷氧基胺反应)，膦(适合与叠氮反应)；异氰酸酯和异硫氰酸酯(适合与胺类和醇类反应)；和活化的酯类，例如N-羟基琥珀酰亚胺酯(适合与胺类和醇类反应)。这些和其它的连接策略，例如在《生物偶联技术》，第二版(Elsevier)中所描述的，是本领域技术人员所熟知的。本领域技术人员能够理解，对于药物部分和接头的选择性反应，当选择了一个互补对的反应活性功能基团时，该互补对的每一个成员既可以用于接头，也可以用于药物。
本发明还提供了制备ADC的方法，可进一步地包括：将抗体与药物-接头化合物，在足以形成抗体偶联物(ADC)的条件下进行结合。
在某些实施方式中，本发明方法包括：在足以形成抗体-接头偶联物的条件下，将抗体与双功能接头化合物进行结合。在这些实施方式中，本发明方法还进一步地包括：在足以将药物部分通过接头共价连接到抗体的条件下，将抗体接头偶联物与药物部分进行结合。
在一些实施方式中，抗体药物偶联物ADC如下分子式所示：
Figure RE-GDA0001987075090000281
其中：
Ab是抗体，
LU是接头；
D是药物；
而且下标p是选自1到8的值。
应用
本发明还提供了本发明抗体、抗体偶联物ADC、重组蛋白、和/或免疫细胞的用途，例如用于制备诊断制剂或制备药物。
较佳地，所述的药物是用于预防和/或治疗与CD73表达或功能异常相关的疾病的药物。
本发明中，所述与CD73表达或功能异常相关的疾病是本领域常规的与 CD73表达或功能异常相关的疾病。较佳地，所述与CD73表达或功能异常相关的疾病为肿瘤/癌症。
本发明中，所述癌症为本领域常规的癌症，较佳地为膀胱癌、血癌、神经胶质瘤、恶性胶质瘤、黑色素瘤、卵巢癌、结肠癌、乳腺癌、肺癌、头颈癌、***癌、胰腺癌。
本发明抗体、ADC、重组蛋白、和/或免疫细胞的用途，包括(但并不限于)：
(i)诊断、预防和/或***发生、生长和/或转移，尤其是CD73高表达的肿瘤。所述肿瘤包括(但并不限于)：膀胱癌、血癌、神经胶质瘤、恶性胶质瘤、黑色素瘤、卵巢癌、结肠癌、乳腺癌、肺癌、头颈癌、***癌、胰腺癌。
检测用途和试剂盒
本发明的抗体或其ADC可用于检测应用，例如用于检测样本，从而提供诊断信息。
本发明中，所采用的样本(样品)包括细胞、组织样本和活检标本。本发明使用的术语“活检”应包括本领域技术人员已知的所有种类的活检。因此本发明中使用的活检可以包括例如肿瘤的切除样本、通过内窥镜方法或器官的穿刺或针刺活检制备的组织样本。
本发明中使用的样本包括固定的或保存的细胞或组织样本。
本发明还提供了一种指含有本发明的抗体(或其片段)的试剂盒，在本发明的一个优选例中，所述的试剂盒还包括容器、使用说明书、缓冲剂等。在优选例中，本发明的抗体可以固定于检测板。
药物组合物
本发明还提供了一种组合物。在优选例中，所述的组合物是药物组合物，它含有上述的抗体或其活性片段或其融合蛋白或其ADC或相应的免疫细胞，以及药学上可接受的载体。通常，可将这些物质配制于无毒的、惰性的和药学上可接受的水性载体介质中，其中pH通常约为5-8，较佳地pH约为6-8，尽管pH值可随被配制物质的性质以及待治疗的病症而有所变化。
配制好的药物组合物可以通过常规途径进行给药，其中包括(但并不限于)：瘤内、腹膜内、静脉内、或局部给药。典型地，本发明所述的药物组合物的给药途径较佳地为注射给药或口服给药。所述注射给药较佳地包括静脉注射、肌肉注射、腹腔注射、皮内注射或皮下注射等途径。所述的药物组合物为本领域常规的各种剂型，较佳地为固体、半固体或液体的形式，可以为水溶液、非水溶液或混悬液，更佳地为片剂、胶囊、颗粒剂、注射剂或输注剂等。
本发明所述抗体也可以是由核苷酸序列在细胞内表达用于的细胞治疗，比如，所述抗体用于嵌合抗原受体T细胞免疫疗法(CAR-T)等。
本发明所述的药物组合物是用于预防和/或治疗与CD73表达或功能异常相关的疾病的药物组合物。
本发明的药物组合物可直接用于结合CD73蛋白分子，因而可用于预防和***等疾病。
本发明的药物组合物含有安全有效量(如0.001-99wt％,较佳地0.01-90wt％，更佳地0.1-80wt％)的本发明上述的单克隆抗体(或其偶联物)以及药学上可接受的载体或赋形剂。这类载体包括(但并不限于)：盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其组合。药物制剂应与给药方式相匹配。本发明的药物组合物可以被制成针剂形式，例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。药物组合物如针剂、溶液宜在无菌条件下制造。活性成分的给药量是治疗有效量，例如每天约1微克/千克体重-约5毫克/千克体重。此外，本发明的多肽还可与其他治疗剂一起使用。
本发明中，较佳地，本发明所述的药物组合物还包括一种或多种药用载体。所述的药用载体为本领域常规药用载体，所述的药用载体可以为任意合适的生理学或药学上可接受的药物辅料。所述的药物辅料为本领域常规的药物辅料，较佳的包括药学上可接受的赋形剂、填充剂或稀释剂等。更佳地，所述的药物组合物包括0.01～99.99％的上述蛋白质和0.01～99.99％的药用载体，所述百分比为占所述药物组合物的质量百分比。
本发明中，较佳地，所述的药物组合物的施用量为有效量，所述有效量为能够缓解或延迟疾病、退化性或损伤性病症进展的量。所述有效量可以以个体基础来测定，并将部分基于待治疗症状和所寻求结果的考虑。本领域技术人员可以通过使用个体基础等上述因素和使用不超过常规的实验来确定有效量。
使用药物组合物时，是将安全有效量的免疫偶联物施用于哺乳动物，其中该安全有效量通常至少约10微克/千克体重，而且在大多数情况下不超过约50 毫克/千克体重，较佳地该剂量是约10微克/千克体重-约20毫克/千克体重。当然，具体剂量还应考虑给药途径、病人健康状况等因素，这些都是熟练医师技能范围之内的。
本发明提供上述药物组合物在制备预防和/或治疗与CD73表达或功能异常相关的疾病的药物中的应用。较佳地，所述与CD73表达或功能异常相关的疾病为肿瘤/癌症。
检测样品中CD73蛋白的方法、组合物
本发明还提供一种检测样品中CD73蛋白(例如检测过表达CD73细胞)的方法，包括如下的步骤：上述的抗体与待检样品在体外接触，检测上述的抗体与所述待检样品是否结合形成抗原-抗体复合物即可。
所述的过表达的含义为本领域常规，指CD73蛋白在待检样品中的RNA或蛋白质的过表达(由于转录增加、转录后加工、翻译、翻译后加工以及蛋白质降解改变)，以及由于蛋白质运送模式改变(核定位增加)而导致的局部过表达和功能活性提高(如在底物的酶水解作用增加的情况下)。
本发明中，上述是否结合形成抗原-抗体复合物的检测方式是本领域常规的检测方式，较佳地为流式细胞实验(FACS)检测。
本发明提供一种检测样品中CD73蛋白的组合物，其包括上述的抗体、重组蛋白、抗体偶联物、免疫细胞、或其组合作为活性成分。较佳地，其还包括上述的抗体的功能片段组成的化合物作为活性成分。
在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。
本发明的主要优点在于：
(1)本发明所获得的抗体与MEDI9447和BMS anti-CD73识别不同的抗原表位；
(2)；本发明所获得的抗体可同时具备优异的介导CD73内吞能力和恢复 T细胞增殖的能力。
下面结合具体实施例，进一步详陈本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明详细条件的实验方法，通常按照常规条件如美国Sambrook.J等著《分子克隆实验室指南》(黄培堂等译，北京：科学出版社，2002年)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件(例如商品说明书)。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。以下实施例中所用的实验材料和试剂如无特别说明均可从市售渠道获得。
实施例中所述的室温为本领域常规的室温，一般为10～30℃。
若无特别说明，实施例中所述的PBS为PBS磷酸缓冲液，pH7.2。
材料和方法
本发明采用先进的抗体转基因小鼠技术平台以制备全人源序列单克隆抗体。
本发明所得到的抗CD73抗体可以由多种途径和方法制备，包括：
(1)传统的杂交瘤制备技术
该技术由Kohler and Milstein在40年前建立(Kohler and Milstein 1975，Nature 256:495)，现在已广泛应用于科研、诊断、治疗等许多相关的单克隆抗体的制备和生产之中。其基本方法虽然沿用至今，但在许多方面都有所变化、改进和创新，包括不同品系动物如转基因动物的使用、电融合技术的引入、高效筛选技术设备的应用如ClonePix设备等，使杂交瘤技术的应用更多样化和更加高效。从常规动物如小鼠等制备的单抗，可以通过常规分子生物学方法克隆抗体重链可变区和轻链可变区基因，可变区基因可以嫁接到人源抗体恒定区基因从而形成人鼠嵌合抗体(U.S.Pat.No.4,816,567，Cabilly et al)，以大大降低人体使用时的免疫原性。更进一步，鼠源抗体可变区的CDR结构域可以嫁接到人源抗体架构上，从而使鼠源抗体成分降低到5％以下，大大增加了抗体在人体内使用的安全性。这一途径得到抗体称为人源化抗体，并且是目前抗体药物市场的主要产品(U.S.Pat.No.5,225,539 to 55,Winter,and U.S.Pat.Nos.5,530,101； 5,585,089；5,693,762 and 6,180,370 to Queen et al)。
在本发明的一个优选实例中，本发明制备了一系列人鼠嵌合单克隆抗体。这些抗人CD73抗体的是通过免疫Balb/c和SJL小鼠、优化的杂交瘤技术制备、分子生物学和抗体工程技术制备，具有小鼠源抗体重链和轻链可变区和人源抗体恒定区。
(2)Balb/c和SJL小鼠免疫
制备包括胞外区CD73蛋白、CD73重组细胞株、CD73 DNA载体的表达质粒等免疫原。
免疫原1)，胞外区CD73蛋白氨基酸序列27-547C末端加了His6标签，然后克隆到pTT5载体中，得到pTT5-hCD73 ECD-His6。将其瞬时转染CHO细胞， 9天后收集细胞培养液，离心去除细胞成分，将上清培养基进行0.22微米滤头过滤。然后将含CD73蛋白的培养上清上样到镍亲和层析柱，同时用紫外(UV)检测仪监测紫外吸收值(A280nm)的变化。上样后用PBS(磷酸盐缓冲液，pH7.5) 和PBS(含0.1％Triton X114和0.1％Triton X100，pH7.5)清洗层析柱到紫外吸收回到基线，然后用含适量咪唑的PBS(pH7.5)洗脱，收集从柱上洗脱下来的带 His标签的CD73胞外区蛋白(hCD73 ECD-His),用PBS在4度冰箱透析过夜。透析后的蛋白经0.22微米无菌过滤后分装-80度保存。
CD73蛋白免疫采用6-8周龄Balb/c和SJL小鼠(斯莱克(SLAC)提供)，小鼠接收后在SPF条件下饲养。初次免疫PD-1蛋白用福氏完全佐剂乳化后腹腔注射0.25毫升，100微克蛋白每只小鼠。加强免疫PD-1蛋白用福氏不完全佐剂乳化后腹腔注射0.25毫升，50微克蛋白每只小鼠。初次免疫与第一次加强免疫之间隔2周，以后每次免疫间隔3周。每次加强免疫7天后采血，用ELISA和FACS 检测血清中抗体效价和特异性。
免疫原2)，人CD73全长氨基酸序列被克隆到pLVX-IRES-puro载体。对 HEK293细胞系进行质粒转染、CHOK1与BW5147细胞系进行慢病毒感染并在含 puromycin的培养基中选择性培养2周后，用有限稀释法在96孔培养板中亚克隆，大约2周后选择部分单克隆孔扩增到6孔板中。对扩增后的克隆用抗CD73特异性抗体经流式细胞分析法进行筛选。选择长势较好、荧光强度较高、单克隆的细胞系继续扩大培养并液氮冻存。
CD73细胞免疫采用6-8周龄雌性Balb/c和SJL/J(上海斯莱克繁殖提供)，小鼠接收后在SPF条件下饲养。人CD73转染的HEK293/Renca稳定细胞系在T-75 细胞培养瓶中扩大培养至75-90％汇合度，吸尽培养基，用DMEM/1640基础培养基洗涤1-2次，然后用胰酶处理和收集细胞。HEK293细胞用DMEM基础培养基洗涤1-2次,进行细胞计数后将细胞用PBS稀释至1x107细胞每毫升；Renca细胞用丝裂霉素处理4小时，用PBS洗2-3次，进行细胞计数后将细胞用PBS稀释至 1x107细胞每毫升。每只小鼠每次免疫时腹腔注射0.5毫升细胞悬液。第一次与第二次免疫之间隔2周，以后每次免疫间隔3周。每次加强免疫7天后采血，用 FACS检测血清中抗体效价和特异性。
免疫原3)，CD73全长氨基酸序列cDNA被克隆到pCP载体上，采用基因枪免疫或者体内电穿孔免疫方法。
基因枪免疫：质粒被包被到1.0μM金胶体子弹上，用Helios基因枪(Bio-rad) 免疫。详细方法根据Helios基因枪说明书进行制定。6-8周龄雌性Balb/c和SJL/J (上海斯莱克繁殖提供)接收后在SPF条件下饲养。所有小鼠经腹部用基因枪免疫3-4次，每次4枪，每枪1.0微克cDNA量。初次免疫与第一次加强免疫，以及加强免疫之间均隔2周。每次加强免疫7天后采血，用ELISA或FACS检测血清中抗体效价。通常大部分小鼠经2-3次免疫后FACS效价可达到1:1000以上。
体内电穿孔免疫：6-8周龄雌性Balb/c和SJL/J(上海斯莱克繁殖提供)接收后在SPF条件下饲养。所有小鼠经备皮的尾巴根部两侧皮内注射3-4次CD73全长氨基酸序列cDNA，每次每侧注射50μg/20μl。随后立即使用AgilePμlse system 给予注射部位电穿孔，详细方法参照AgilePμlse(BTX Harvard apparatus)说明书进行。初次免疫与第一次加强免疫，以及加强免疫之间均隔2周。每次加强免疫7天后采血，用ELISA或FACS检测血清中抗体效价。通常大部分小鼠经3-4次免疫后FACS效价可达到1:1000以上。
(3)杂交瘤细胞的制备和抗体筛选
效价符合要求的小鼠可选择进行细胞融合和杂交瘤制备。细胞融合前，蛋白免疫和基因免疫的小鼠最后一次免疫用每只50微克纯化的hCD73 ECD-His腹腔注射，细胞免疫的小鼠最后一次免疫用每只0.5-1x107细胞腹腔注射。3-5天后处死小鼠，收集脾细胞或者淋巴细胞。加入NH4OH至终浓度1％以细胞悬液中的红细胞，用DMEM基础培养基离心清洗细胞2-3次，然后按5:1比率与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0混合，采用传统的PEG细胞融合方法或高效电融合方法进行细胞融合。融合后的细胞稀释到含20％胎牛血清、1xHAT的DMEM选择性培养基中，按1x105/20微升每孔加入到96孔细胞培养板中，放入5％CO2、37℃培养箱中。 10-14天后用Acumen(微孔板细胞检测法)筛选细胞融合板上清，阳性克隆扩增到24孔板扩大培养，2-3天后对24孔板上清进行抗体亚型分析，用FACS确定对 CD73阳性细胞的结合活性，CD73酶活实验确定抗体样品对CD73代谢AMP的抑制作用。
根据24孔板筛选结果，选择所需克隆用有限稀释法在96孔板进行亚克隆。亚克隆后7-10天用Acumen进行初步筛选，挑选3-4个阳性单克隆扩增到24孔板继续培养。2-3天后用FACS确定抗原结合阳性并用CD73酶活实验评估生物活性。根据24孔板样品检测结果，挑选一个最优克隆进行扩大培养、液氮冻存、抗体生产和纯化。
(4)小鼠杂交瘤细胞单克隆抗体的生产和纯化
将杂交瘤细胞扩增到T-75细胞培养瓶并用生产培养基(Hybridoma seruM freemediuM,Invitrogen)顺化传代2-3代。待杂交瘤细胞生长状态良好，接种细胞培养转瓶。每个2升的培养转瓶加入200-500毫升生产培养基，接种细胞密度为0.5-1.0x105/毫升。盖紧瓶盖，将转瓶置于37℃培养箱中的转瓶机上，调到转速3转/分钟。连续旋转培养10-14天后，收集细胞培养液，用离心或过滤去除细胞，并用0.22-0.45微米的滤膜过滤澄清。处理后的细胞培养上清可马上进行纯化或-30℃冻存。
杂交瘤细胞培养上清中的单克隆抗体可用蛋白A(Protein A)亲和层析柱进行纯化。根据样品量的大小，准备相应的体积的层析柱。对于200-300ml的小体积纯化，需要1-2ml蛋白A柱。蛋白A柱先用平衡缓冲液(Tris-HCl,pH7.4)平衡，然后将培养上清加到层析柱，控制流速在3-4ml/分钟。上样完毕，用平衡缓冲液清洗层析柱3-5柱床体积。用洗脱液(0.1M柠檬酸钠缓冲液，pH4.5)洗脱IgG1；用洗脱液(0.1M柠檬酸钠缓冲液，pH3.5)洗脱其他亚类的IgG。结合在柱上的抗体，用紫外检测器监测洗脱情况。收集洗脱的抗体(紫外吸收峰)，加入10％体积的1.0M Tris-HCl缓冲液中和pH，然后立即用PBS透析过夜，第二天换液一次并继续透析2-3小时。收集透析后的抗体，用0.22微米的滤器进行无菌过滤，无菌保存。分装小样进行蛋白浓度、纯度、内毒等检测分析。
(5)纯化后先导抗体的检定
a)抗原结合反应
流式细胞实验(FACS)检测抗体与人、食蟹猴、小鼠CD73表达细胞的结合。 CD73转染的CHOK1稳定细胞株在T-75细胞培养瓶中扩大培养至75-90％汇合度，吸尽培养基，用PBS洗涤1-2次，然后用胰酶(Tryple express:Life technology) 处理和收集细胞。用PBS缓冲液洗涤细胞1-2次,进行细胞计数后将细胞用PBS稀释至1-2x106细胞每毫升，加入2％胎牛血清(FBS)封闭液，冰上孵育20-30分钟，然后用HBSS离心洗涤2次。将收集的细胞用FACS缓冲液(PBS+2％FBS) 悬浮至2x106细胞/ml,按每孔100微升加入到96孔FACS反应板中，加入待测抗体样品每孔100微升，4度孵育1-2小时。用FACS缓冲液离心洗涤2次，加入每孔100 微升荧光(Alexa 488)标记的二抗，4度孵育0.5-1.0小时。用FACS缓冲液离心洗涤2-3次，加入每孔100微升固定液(4％Paraformaldehyde)悬浮细胞，5-10 分钟后用FACS缓冲液离心洗涤1-2次。用100微升FACS缓冲液悬浮细胞，用 FACS(FACSCalibur,BD)检测和分析结果。
b)生物学功能分析
CD73酶活实验。将CHOK1-hCD73细胞消化后，用TM缓冲液(25mM Tris, 5mM MgCl2,pH 7.5)稀释至2×104细胞每毫升，按每孔100毫升加入到96孔反应板(Corning Cat #3799)中，离心，去除上清。同时，用TM缓冲液将待测抗体配置成4×溶液，以50微升每孔重悬96孔板中的细胞，37度孵育30分钟。用TM 缓冲液将AMP配置成4×溶液(800μM)，以50微升每孔加入96孔板，混匀，37 度孵育30分钟。300×g离心96孔板，取出50微升上清(不能吸到细胞)，转移至96孔检测板(Corning Cat #3903)中。先后加入50微升每孔2×ATP溶液(130 μM)和100微升每孔CellTiter Glo反应液，混匀。暗处放置10分钟后在酶标仪上读取荧光值。
内吞实验。将CHOK1-hCD73细胞消化后，用FACS缓冲液悬浮至2x106细胞/ml,按每孔100毫升加入到96孔反应板中，离心，去除上清。加入20ug/ml待测抗体每孔100微升，4度孵育1-2小时，用FACS缓冲液洗去未结合的抗体。在 37度/4度放置0,1,2,4小时后取出，加入识别表位不同于待测抗体的检测抗体 1ug/ml，4度孵育1小时后，用FACS缓冲液离心洗涤1-2次。用100微升FACS缓冲液悬浮细胞，用FACS(FACSCalibur,BD)检测和分析结果。
T细胞增殖实验。用CD4+T细胞分离试剂盒从人外周血细胞(PBMC)中分离CD4阳性T细胞。用PBS+1％BSA重悬至2×106细胞每毫升，加入同体积的 2×CFSE溶液(4μM)，混匀后放置37度10分钟。加入40％体积的FBS，混匀后放置37度10分钟。用大体积的PBS溶液离心洗涤2次。用含有anti-CD2/CD3/CD28 磁珠(Miltenyi Biotec,130-091-441)的T细胞培养液重悬至1.5×106细胞每毫升，按照100毫升每孔加入至96孔板中。加入50微升每孔4×待测抗体溶液，混匀， 37度孵育0.5小时。再加入50微升每孔4×AMP溶液(2mM)。CD4+ T细胞放置于37度5％CO2培养箱中3-5天，用FACS(FACSCalibur,BD)检测和分析结果。
(6)抗体重链和轻链可变区基因和氨基酸序列测定和CDR结构域分析
轻重链可变区氨基酸序列测定。总RNA分离：亚克隆培养的上清检验过抗原结合后，通过离心搜集1-5×107杂交瘤细胞。加入1mL Trizol混匀并转移到 1.5ml离心管中，室温静置5min；加0.2ml氯仿，振荡15s，静置2min后于4℃离心，12000g×5min，取上清转移到新的1.5ml离心管中；加入0.5ml异丙醇，将管中液体轻轻混匀，室温静置10min后于4℃离心，12000g×15min，弃上清；加入 1ml 75％乙醇，轻轻洗涤沉淀。4℃，12000g×5min，弃上清并晾干，加入适量的DEPC H2O溶解(55℃水浴促溶10min)。
逆转录与PCR：取1μg tRNA，配置20μl体系，加入逆转录酶后于42℃反应 60min，于70℃反应10min终止反应。配置50μl PCR体系，包括1μl cDNA、每种引物25pmol、1μl DNA聚合酶以及相配的缓冲体系、250μmol dNTPs；设置 PCR程序，预变性95℃3min，变性95℃30s，退火55℃30s，延伸72℃35s， 35个循环后再额外于72℃延伸5min。注：延伸温度可根据实际情况有所调整。
克隆与测序：取5μl PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，将检测阳性样品使用柱回收试剂盒纯化；进行连接反应：样品50ng，T载体50ng，连接酶0.5μl，缓冲液1μl，反应体系10μl，于16℃反应半小时；取5μl连接产物加入100μl的感受态细胞中，冰浴5min，而后于42℃水浴热激1min，放回冰上1min后加入650μl 无抗生素SOC培养基，于37℃摇床上以200RPM的速度复苏30min，取出200μl 涂布于含抗生素的LB固体培养基上于37℃孵箱过夜培养；次日，使用T载体上引物M13F和M13R配置30μl PCR体系，进行菌落PCR，用移液器枪头蘸取菌落于PCR反应体系中吹吸，并吸出0.5μl点于另一块含抗生素的LB固体培养皿上以保存菌株；PCR反应结束后，取出5μl进行琼脂糖凝胶电泳检测，将阳性样品进行测序。
具体实施例：
实施例1：CD73特异性抗体的制备
制备包括胞外区CD73蛋白、CD73重组细胞株、CD73 DNA载体的表达质粒等免疫原。
用不同的免疫策略(蛋白免疫、细胞免疫、基因免疫)来免疫小鼠。自小鼠实施融合并筛选，并使用这些杂交瘤细胞上清进行克隆筛选。分离了尤其受关注的克隆并生产纯化，得到包括24D6、37F8、42A5、56F12、57G8、60G1、 66H6、69C9、47F12、71E10、77B9、78E6、80H7及125A4的鼠源抗体。
实施例2：流式细胞实验(FACS)检测鼠源抗体与人、食蟹猴、小鼠CD73 表达细胞的结合
使用CHOK1-hCD73(经人CD73转染)，CHOK1-cCD73(经食蟹猴CD73 转染)，CHOK1-mCD73(经鼠CD73转染)及CHOK1(人CD73、食蟹猴CD73、鼠CD73阴性)细胞，杂交瘤细胞表达并纯化的CD73抗体作为一抗，Alexa
Figure RE-GDA0001987075090000381
488驴抗鼠IgG(H+L)(Invitrogen，A21202)作为二抗，进行以下方法产生滴定结合曲线：
CD73转染的CHOK1稳定细胞株在T-75细胞培养瓶中扩大培养至75-90％汇合度，吸尽培养基，用PBS洗涤1-2次，然后用胰酶(Tryple express:Life technology)处理和收集细胞。用PBS缓冲液洗涤细胞1-2次,进行细胞计数后将细胞用PBS稀释至1-2x106细胞每毫升，加入2％胎牛血清(FBS)封闭液，冰上孵育20-30分钟，然后用HBSS离心洗涤2次。将收集的细胞用FACS缓冲液 (PBS+2％FBS)悬浮至2x106细胞/ml，按每孔100微升加入到96孔FACS反应板中，300g离心5分钟弃掉上清。抗CD73抗体用封闭液配置成初始浓度10ug/ml， 8点连续稀释。加入待测抗体样品每孔100微升，4度孵育1-2小时。用FACS缓冲液离心洗涤2次，加入每孔100微升荧光(Alexa 488)标记的二抗，4度孵育0.5-1.0 小时。用FACS缓冲液离心洗涤2-3次，加入每孔100微升固定液(4％ Paraformaldehyde)悬浮细胞，5-10分钟后用FACS缓冲液离心洗涤1-2次。用100 微升FACS缓冲液悬浮细胞，用FACS(FACSCalibur,BD)检测和分析结果，见图1和表4。
图1结果表明：mAb020、024、030、032、033、034、036、038、039、041、 042、043、044、065抗体均能结合到细胞表面的人CD73、食蟹猴CD73上，但是不能结合到鼠CD73上。每一抗体获得的结合的EC50显示于表4中。
表4流式细胞实验(FACS)检测鼠源抗体与人CD73、食蟹猴CD73和鼠CD73的结合
Figure RE-GDA0001987075090000391
实施例3：抗CD73抗体对酶活性的抑制实验
将CHOK1-hCD73细胞消化后，用TM缓冲液(25mM Tris,5mM MgCl2,pH 7.5)稀释至2×104细胞每毫升，按每孔100毫升加入到96孔反应板(Corning Cat #3799)中，离心，去除上清。同时，用TM缓冲液将待测抗体配置成4×溶液， 6点连续稀释，以50微升每孔重悬96孔板中的细胞，37度孵育30分钟。用TM缓冲液将AMP配置成4×溶液(800μM)，以50微升每孔加入96孔板，混匀，37 度孵育30分钟。300×g离心96孔板，取出50微升上清(不能吸到细胞)，转移至96孔检测板(Corning Cat #3903)中。先后加入50微升每孔2×ATP溶液(130 μM)和100微升每孔CellTiter Glo反应液，混匀。暗处放置10分钟后在酶标仪上读取荧光值。结果见图2和表5。
图2表示mAb020、024、030、032、033、034、036、038、039、041、042、043、044、065抗体均能抑制细胞表面人CD73的酶活性。每一抗体的最大抑制百分比和IC50显示于表5中。
表5抗CD73鼠源抗体抑制人CD73的酶活
Figure RE-GDA0001987075090000401
实施例4：抗CD73抗体介导的内吞实验
使用杂交瘤细胞表达并纯化的CD73抗体，在37度孵育CHOK1-hCD73细胞，用FACS检测抗体介导的CD73内吞。
将CHOK1-hCD73细胞消化后，用FACS缓冲液悬浮至2x106细胞/ml,按每孔100毫升加入到96孔反应板中，离心，去除上清。加入20ug/ml待测抗体每孔 100微升，4度孵育1-2小时，用FACS缓冲液洗去未结合的抗体。在37度/4度放置0,1,2,4小时后取出，加入识别表位不同于待测抗体的检测抗体(Alexa 488 标记)1ug/ml，4度孵育1小时后，用FACS缓冲液离心洗涤1-2次。用100微升FACS 缓冲液悬浮细胞，用FACS(FACSCalibur,BD)检测和分析结果。4度0h的数据 MFI读值作为对照，所有计算值均为与该对照相比的百分比。结果见图3。
图3展示了mAb020、024、030、032、033、034、036、038、039、041、 042、043、044、065抗体介导CD73内吞的时间曲线。结果表明：大部分抗体能有效并显著介导CD73内吞，例如mab020、030、033、034、042。
实施例5：T细胞增殖实验。
AMP经过CD73去磷酸化作用形成腺苷，通过被T细胞上的腺苷受体结合，抑制效应T细胞的增殖。本实施例通过抗CD73的抗体阻断CD73作用，抑制腺苷形成，恢复T细胞增殖。
用CD4+T细胞分离试剂盒从人外周血细胞(PBMC)中分离CD4阳性T细胞。用PBS+1％BSA重悬至2×106细胞每毫升，加入同体积的2×CFSE溶液(4μM)，混匀后放置37度10分钟。加入40％体积的FBS，混匀后放置37度10分钟。用PBS 溶液离心洗涤2次。用含有anti-CD2/CD3/CD28磁珠(Miltenyi Biotec, 130-091-441)的T细胞培养液(RMPI 1640+10％FBS+1％P/S)重悬至1.5×106细胞每毫升，按照100毫升每孔加入至96孔板中。加入50微升每孔4×待测抗体溶液，混匀，37度孵育0.5小时。再加入50微升每孔4×AMP溶液(2mM)。CD4+ T细胞放置于37度5％CO2培养箱中3-5天，用FACS(FACSCalibur,BD)检测和分析结果。结果见图4。
图4结果表明：mAb020、024、030、032、033、034、036、038、039、041、 042、043、044、065抗体均能恢复CD4+ T细胞增殖。
实施例6：轻重链可变区氨基酸序列测定
总RNA分离：将实施例1亚克隆培养所得的上清液检验过抗原结合后(即经过实施例2～5的检定和活性测定后)，通过离心搜集5×107个杂交瘤细胞，加入 1mL Trizol混匀并转移到1.5mL离心管中，室温静置5分钟。加0.2mL氯仿，振荡 15秒，静置2分钟后于4℃，12000g离心5分钟，取上清转移到新的1.5mL离心管中。加入0.5mL异丙醇，将管中液体轻轻混匀，室温静置10分钟后于4℃，12000g 离心15分钟，弃上清。加入1mL 75％乙醇(所述百分比为体积百分比)，轻轻洗涤沉淀，4℃，12000g离心5分钟后弃上清，将沉淀物晾干，加入DEPC处理过的H2O溶解(55℃水浴促溶10分钟)，即得总RNA。
逆转录与PCR：取1μg总RNA，配置20μl体系，加入逆转录酶后于42℃反应 60分钟，于7℃反应10分钟终止反应。配置50μl PCR体系，包括1μl cDNA、每种引物25pmol、1μl DNA聚合酶以及相配的缓冲体系、250μmol dNTPs。设置PCR 程序，预变性95℃3分钟，变性95℃30秒，退火55℃30秒，延伸72℃35秒，35 个循环后再额外于72℃延伸5分钟，得PCR产物。其中逆转录所用的试剂盒为PrimeScript RT Master Mix，购自Takara，货号RR036；PCR所用的试剂盒为Q5 超保真酶，购自NEB，货号M0492。
克隆与测序：取5μl PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，将检测阳性样品使用柱回收试剂盒纯化，其中回收试剂盒为
Figure RE-GDA0001987075090000421
Gel&PCR Clean-up，购自MACHEREY-NAGEL，货号740609。进行连接反应：样品50ng，T载体50ng，连接酶0.5μl，缓冲液1μl，反应体系10μl，于16℃反应半小时得连接产物，其中连接的试剂盒为T4DNA连接酶，购自NEB，货号M0402；取5μl连接产物加入 100μl的感受态细胞(Ecos 101competent cells，购自Yeastern，货号FYE607)中，冰浴5分钟。而后于42℃水浴热激1分钟，放回冰上1分钟后加入650μl无抗生素 SOC培养基，于37℃摇床上以200RPM的速度复苏30分钟，取出200μl涂布于含抗生素的LB固体培养基上于37℃孵箱过夜培养。次日，使用T载体上引物M13F 和M13R配置30μl PCR体系，进行菌落PCR，用移液器枪头蘸取菌落于PCR反应体系中吹吸，并吸出0.5μl点于另一块含100nM氨苄青霉素的LB固体培养皿上以保存菌株。PCR反应结束后，取出5μl进行琼脂糖凝胶电泳检测，将阳性样品进行测序。其中，测序的步骤参见Kabat，Sequencesof Proteins of Immunological Interest，National Institutes of Health,Bethesda,Md.(1991)。
测序结果如表9和表10所示：
实施例7：制备鼠人嵌合抗体。
(一)质粒构建与准备：实施例1已从杂交瘤细胞的培养上清液中获得了纯化的CD73抗体，并根据实施例6的测序结果明确了CD73抗体的重链可变区和轻链可变区序列。将CD73抗体的重链可变区序列重组到包含信号肽和人源重链抗体IgG1-TM恒定区(IgG1含L234F,L235E和P331S三个位点突变，以减少 ADCC和CDC作用)的表达载体(其中IgG1表达载体购买自Invitrogen，点突变改造和重组步骤均为常规步骤，将CD73抗体的轻链可变区序列重组到包含信号肽和人源抗体轻链kappa恒定区的表达载体当中，得重组质粒并经测序验证(测序方法与实施例6中测序方法相同)。使用碱裂解法试剂盒(购自 MACHEREY-NAGEL)中量抽提高纯度的重组质粒，质量为500μg以上，经0.22 μm滤膜(购自Millopore)过滤，供转染使用。
(二)细胞转染：
在培养基Freestyle 293 expression medium(购自Invitrogen)培养293E细胞(购自Invitrogen)。摇床设置为37℃、130RPM，8％CO2(v/v)浓度。
Freestyle 293 expression medium在转染时添加10％(v/v)F68(购自Invitrogen)至F68终浓度为0.1％(v/v)，得含0.1％(v/v)F68的Freestyle 293 表达培养基，即培养基A。
取5mL培养基A和200μg/mL PEI(购自Sigma)混匀，得培养基B。取5mL 培养基A和100μg/mL步骤(1)所得的重组质粒混匀，得培养基C。5分钟后将培养基B和培养基C合并混匀，静置15分钟，得混合液D。将10mL混合液D缓缓加入100mL含293E细胞的培养基Freestyle293 expression medium中至293E的细胞密度为1.5×106/mL，边加边振荡，避免PEI过度集中，放入摇床培养。第二天加入蛋白胨至终浓度为0.5％(w/v)。第5～7天，测培养液抗体效价。第6～7 天，离心(3500RPM，30分钟)收集上清，经0.22μm滤膜过滤，得滤好的细胞上清液，以供纯化。
(三)抗体纯化：对于连续生产的无内毒素的层析柱和Protein A填料(购自GE)，使用0.1M NaOH处理30分钟或者5个柱体积的0.5M NaOH冲洗。对于长期未使用的柱料和层析柱至少使用1M NaOH浸泡1h，用无内毒的水冲洗至中性，用10倍柱体积的1％(v/v)Triton×100对柱料清洗。使用5个柱体积的PBS (PBS磷酸缓冲液，pH7.2)进行平衡，将步骤(2)所得过滤好的细胞上清液上柱，必要时收集流穿液。上柱完成后，使用5倍柱体积的PBS清洗。用5倍柱体积的0.1M pH3.0的Glycine-HCl进行洗脱，收集洗脱液，并用0.5倍柱体积洗脱液的pH8.5的1M Tris-HCl(1.5M NaCl)中和，收获鼠人嵌合CD73抗体。上述所用溶液均需要新配置。收获鼠人嵌合CD73抗体后，在1×PBS中透析4小时，避免内毒素污染。透析结束后，使用分光光度或试剂盒测定浓度，使用 HPLC-SEC测定抗体纯度，使用内毒素检测试剂盒检测抗体内毒素含量。
实施例8：流式细胞实验(FACS)检测嵌合抗体与人、食蟹猴、小鼠CD73 表达细胞的结合。
使用CHOK1-hCD73(经人CD73转染)，CHOK1-cCD73(经食蟹猴CD73 转染)，CHOK1-mCD73(经鼠CD73转染)及CHOK1(人CD73、食蟹猴CD73、鼠CD73阴性)细胞，杂交瘤细胞表达并纯化的CD73抗体作为一抗，Alexa
Figure RE-GDA0001987075090000431
488羊抗人IgG(H+L)(Invitrogen，A11013)作为二抗，进行以下方法产生滴定结合曲线：
CD73转染的CHOK1稳定细胞株在T-75细胞培养瓶中扩大培养至75-90％汇合度，吸尽培养基，用PBS洗涤1-2次，然后用胰酶(Tryple express:Life technology)处理和收集细胞。用PBS缓冲液洗涤细胞1-2次,进行细胞计数后将细胞用PBS稀释至1-2x106细胞每毫升，加入2％胎牛血清(FBS)封闭液，冰上孵育20-30分钟，然后用HBSS离心洗涤2次。将收集的细胞用FACS缓冲液 (PBS+2％FBS)悬浮至2x106细胞/ml，按每孔100微升加入到96孔FACS反应板中，300g离心5分钟弃掉上清。抗CD73抗体用封闭液配置成初始浓度10ug/ml， 8点连续稀释。加入待测抗体样品每孔100微升，4度孵育1-2小时。用FACS缓冲液离心洗涤2次，加入每孔100微升荧光(Alexa 488)标记的二抗，4度孵育0.5-1.0 小时。用FACS缓冲液离心洗涤2-3次，加入每孔100微升固定液(4％ Paraformaldehyde)悬浮细胞，5-10分钟后用FACS缓冲液离心洗涤1-2次。用100 微升FACS缓冲液悬浮细胞，用FACS(FACSCalibur,BD)检测和分析结果。结果见图5。
图5结果表明：mAb020,024,030,032,033,034,036,038,039,041,042,043, 044,065嵌合抗体均能结合到细胞表面的人CD73、食蟹猴CD73上，但是不能结合到鼠CD73上。每一抗体获得的结合的EC50显示于表6中。
表6流式细胞实验(FACS)检测嵌合抗体与人CD73、食蟹猴CD73和鼠CD73的结合
Figure RE-GDA0001987075090000441
实施例9：抗CD73嵌合抗体对酶活性的抑制实验
将CHOK1-hCD73细胞消化后，用TM缓冲液(25mM Tris,5mM MgCl2,pH 7.5)稀释至2×104细胞每毫升，按每孔100毫升加入到96孔反应板(Corning Cat #3799)中，离心，去除上清。同时，用TM缓冲液将待测抗体配置成4×溶液， 6点连续稀释，以50微升每孔重悬96孔板中的细胞，37度孵育30分钟。用TM缓冲液将AMP配置成4×溶液(800μM)，以50微升每孔加入96孔板，混匀，37 度孵育30分钟。300×g离心96孔板，取出50微升上清(不能吸到细胞)，转移至96孔检测板(Corning Cat #3903)中。先后加入50微升每孔2×ATP溶液(130 μM)和100微升每孔CellTiter Glo反应液，混匀。暗处放置10分钟后在酶标仪上读取荧光值。结果见图6。
图6结果表明：mAb020,024,030,032,033,034,036,038,039,041,042,043, 044,065嵌合抗体均能抑制细胞表面人CD73的酶活性。每一抗体的最大抑制百分比和EC50显示于表7中。
表7抗CD73嵌合抗体抑制人CD73的酶活
Figure RE-GDA0001987075090000451
实施例10：抗CD73嵌合抗体介导的内吞实验
使用杂交瘤细胞表达并纯化的CD73抗体，在37度孵育CHOK1-hCD73细胞，用FACS检测抗体介导的CD73内吞。
将CHOK1-hCD73细胞消化后，用FACS缓冲液悬浮至2x106细胞/ml,按每孔100毫升加入到96孔反应板中，离心，去除上清。加入20ug/ml待测抗体每孔 100微升，4度孵育1-2小时，用FACS缓冲液洗去未结合的抗体。在37度/4度放置0,1,2,4小时后取出，加入识别表位不同于待测抗体的检测抗体(Alexa 488 标记)1ug/ml，4度孵育1小时后，用FACS缓冲液离心洗涤1-2次。用100微升FACS 缓冲液悬浮细胞，用FACS(FACSCalibur,BD)检测和分析结果。4度0h的数据 MFI读值作为对照，所有计算值均为与该对照相比的百分比。结果见图7。
图7展示了mAb020,024,030,032,033,034,036,038,039,041,042,043, 044,065嵌合抗体介导CD73内吞的时间曲线。图7结果表明：嵌合抗体mab020、 030、034、042能有效并显著介导CD73内吞。
实施例11：T细胞增殖实验
AMP经过CD73去磷酸化作用形成腺苷，通过被T细胞上的腺苷受体结合，抑制效应T细胞的增殖。本实施例通过抗CD73的抗体阻断CD73作用，抑制腺苷形成，恢复T细胞增殖。
用CD4+T细胞分离试剂盒从人外周血细胞(PBMC)中分离CD4阳性T细胞。用PBS+1％BSA重悬至2×106细胞每毫升，加入同体积的2×CFSE溶液(4μM)，混匀后放置37度10分钟。加入40％体积的FBS，混匀后放置37度10分钟。用PBS 溶液离心洗涤2次。用含有anti-CD2/CD3/CD28磁珠(Miltenyi Biotec, 130-091-441)的T细胞培养液(RMPI 1640+10％FBS+1％P/S)重悬至1.5×106细胞每毫升，按照100毫升每孔加入至96孔板中。加入50微升每孔4×待测抗体溶液，混匀，37度孵育0.5小时。再加入50微升每孔4×AMP溶液(2mM)。CD4+ T细胞放置于37度5％CO2培养箱中3-5天，用FACS(FACSCalibur,BD)检测和分析结果。结果见图8。
图8结果表明：mAb020,024,030,032,033,034,036,038,041,042,044,065 嵌合抗体均能恢复CD4+ T细胞增殖。
实施例12：SPR
本实验选用Octet Red96为测试仪器，选用AHC生物传感器为测试传感器， AHC传感器上已固定有Anti-human IgG Fc抗体，可用其直接捕获本实验中的15 个抗体，紧接着将该传感器浸于分析物样品(抗原)中。本实验共运行五个步骤：1、Baseline(120s)2、Loading(捕获抗体)(300s)3、Baseline(120s)4、 Association(结合抗原)(180s)5、Dissociation(抗原解离)(1200s)。测试完成后使用再生缓冲液(Glycine PH1.5)与中和缓冲液(1*PBS buffer)交替浸润5秒，共循环五次对传感器进行再生。传感器再生次数最多为10次。本实验中的运行缓冲液为样品稀释液(含有0.02％Tween20及0.1％BSA的1*PBS缓冲液)，即Baseline步骤，Dissociation步骤，空白分析物样品中所使用的缓冲液。本实验一次运行使用4根传感器。
样品处理：使用样品稀释液(含有0.02％Tween20及0.1％BSA的1*PBS缓冲液)将所有的抗体稀释至10ug/mL的工作浓度，以及将分析物样品(抗原) 梯度稀释为三个工作浓度：200nM,100nM,50nM。
数据分析使用Octet Data Analysis(version 7.0 or the latest)计算响应信号值(偶联的分析物样品信号扣减掉空白的分析物样品信号)，并使用1:1结合模型拟合数据。结果见表8。
表8抗CD73嵌合抗体对hCD73 ECD-His亲和力
Figure RE-GDA0001987075090000471
表8结果表明：所测抗体的KD值均在纳摩水平，且与MEDI9447相当，表明这些抗体对人CD73ECD均有较好的亲和力。
实施例13：抗CD73抗体小鼠体内抗肿瘤活性评价
同系肿瘤是通过将悬浮于base DMEM的1×106个MC38细胞皮下注射至6-8 周大的动物右肋侧内建立的。通过卡尺测量肿瘤且使用以下公式计算肿瘤体积 (tumor volume)：＝(长x宽2)/2(即tumor volume＝(length x width2)/2)。接种后肿瘤后观察其生长，基于肿瘤大小50-80mm3将小鼠随机化到多个组中。在此研究中使用80只人CD73基因敲入的雌性C57BL/6小鼠。给药途径为腹腔注射，在分组后0、3、6、10天腹腔注射。
结果表明：抗CD73抗体单用效果不显著；抗CD73和抗PD-1/CTLA4抗体联用效果显著强于单用，说明抗CD73抗体能帮助抗PD-1/CTLA4抗体提高首次免疫响应，增强单一用药的响应率。
讨论
目前，MedImmune和BMS两家公司的抗CD73抗体处于临床阶段。其中， MedImmune公司的抗体MEDI9447处于临床一期，该抗体通过噬菌体展示技术得到；BMS公司的抗体BMS-986179处于临床一/二期，该抗体通过免疫人源化小鼠得到。动物体内实验数据表明，MEDI9447单独使用对于抑制CT26肿瘤生长无明显作用，与抗PD1抗体联用可大幅增加抗肿瘤效果；而BMS-986179由于不能识别鼠源CD73蛋白，故无可参考的体内数据。从体外实验数据可知，这两个抗体均能一定程度上抑制CD73的酶活，介导CD73的内吞，恢复AMP所介导 T细胞的增殖。但相比之下，MEDI9447促内吞的效果较弱，BMS-986179恢复 AMP所介导T细胞的增殖能力较弱。
目前，从MedImmune和BMS两家公司提供的体外实验数据可知，这两个抗体均能一定程度上抑制CD73的酶活，介导CD73的内吞，恢复AMP所介导T细胞的增殖。但相比之下，MEDI9447促内吞的效果较弱，BMS-986179恢复AMP 所介导T细胞的增殖能力较弱。而本发明得到的抗CD73抗体，例如mab030，既能表现出优异的促内吞效果，为减少细胞膜表面的CD73提供可能；也能强有力地恢复AMP所介导T细胞的增殖，成为一个全方面的表现出色的抗CD73抗体。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
本发明的序列信息
表9本发明抗体的VH、VH-CDR1、VH-CDR2、VH-CDR3，VL、VL-CDR1、 VL-CDR2、VL-CDR3的序列编号(SEQ ID NO.)
Figure RE-GDA0001987075090000501
表10本发明序列信息
Figure RE-GDA0001987075090000502
Figure RE-GDA0001987075090000511
Figure RE-GDA0001987075090000521
Figure RE-GDA0001987075090000531
Figure RE-GDA0001987075090000541
Figure RE-GDA0001987075090000551
Figure RE-GDA0001987075090000561
Figure RE-GDA0001987075090000571
序列表
<110> 上海开拓者生物医药有限公司
<120> CD73抗体及其制备方法和应用
<130> P2018-1214
<160> 140
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 117
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 1
Asp Ile Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln
1 5 10 15
Ser Leu Ser Leu Thr Cys Ser Val Thr Gly Tyr Ser Ile Thr Ser Arg
20 25 30
Tyr Tyr Trp Asn Trp Ile Arg Gln Phe Pro Gly Asn Lys Leu Glu Trp
35 40 45
Met Gly Tyr Ile Thr Tyr Asp Asp Asn Asn Asn Tyr Asn Pro Ser Leu
50 55 60
Lys Asn Arg Ile Ser Ile Thr Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Phe
65 70 75 80
Leu Lys Leu Asn Ser Val Thr Pro Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Gly Trp Asp Pro Phe Leu Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100 105 110
Val Thr Val Ser Ala
115
<210> 2
<211> 351
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 2
gatattcaac ttcaggagtc aggacctggc ctcgtgaaac cttctcagtc tctgtctctc 60
acctgctctg tcactggcta ctccatcacc agtcgttatt actggaactg gatccggcag 120
tttccaggaa acaaactgga atggatgggc tacataacct acgatgataa caataactac 180
aacccatctc tcaaaaatcg aatctccatc actcgtgaca cttctaagaa tcagtttttc 240
ctgaagttga attctgtgac tcctgaggac acagccacat attactgtgc aagagggggc 300
tgggaccctt ttctttactg gggccaaggg actctggtca ctgtctctgc a 351
<210> 3
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 3
Ser Arg Tyr Tyr Trp Asn
1 5
<210> 4
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 4
Tyr Ile Thr Tyr Asp Asp Asn Asn Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Asn
1 5 10 15
<210> 5
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 5
Gly Gly Trp Asp Pro Phe Leu Tyr
1 5
<210> 6
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 6
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Glu Thr Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Asp Asn Ile Tyr Ser Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Gln Gly Lys Ser Leu Gln Leu Leu Val
35 40 45
Asp Ser Ala Lys Asn Leu Gly Glu Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Gln Phe Tyr Leu Lys Ile Asn Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Gly Val Tyr Tyr Cys Gln His Tyr Tyr Gly Thr Pro Phe
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys
100 105
<210> 7
<211> 321
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 7
gacatccaga tgactcagtc tccagcctcc ctatctgcat ctgtgggaga aactgtcacc 60
atcacatgtc gagcaagtga caacatttac agttatttag catggtatca acagaaacag 120
ggaaaatctc ttcagctcct ggtcgattct gcaaaaaact taggagaagg tgtgccatca 180
agattcagtg gcagtggatc aggcacacag ttttatctga agatcaacag cctgcagcct 240
gaggattttg gggtttatta ctgtcaacat tattatggga ctccgttcac gttcggtggt 300
gggaccaagc tggagctgaa a 321
<210> 8
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 8
Arg Ala Ser Asp Asn Ile Tyr Ser Tyr Leu Ala
1 5 10
<210> 9
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 9
Ser Ala Lys Asn Leu Gly Glu
1 5
<210> 10
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 10
Gln His Tyr Tyr Gly Thr Pro Phe Thr
1 5
<210> 11
<211> 122
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 11
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr His
20 25 30
Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Asp Lys Arg Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Ile Ile Ser Ser Asp Arg Ser Asp Ile Asp Tyr Thr Asp Asn Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Gly Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Ser Ser Leu Lys Ser Glu Asp Thr Ala Ile Tyr His Cys
85 90 95
Ala Arg His Arg Gly Tyr Asp Gly Phe Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 12
<211> 366
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 12
gaggtgcagc tggtggaatc tgggggagac ttagtgaagc ctggagggtc cctgaaactc 60
tcctgtgcag cctctggatt cactttcagt acccatggca tgtcttgggt tcgtcagact 120
ccagacaaga ggctggagtg ggtcgcaatt attagtagtg ataggagtga catcgattat 180
acagacaatg tgaaggggcg attcaccatc tccagagaca atggcaagaa caccctgtat 240
ttgcaaatga gcagtctgaa gtctgaggac acagccatat atcactgtgc aagacatagg 300
ggttacgacg gcttttacta tgctatggac tactggggtc aaggaacctc agtcaccgtc 360
tcctca 366
<210> 13
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 13
Thr His Gly Met Ser
1 5
<210> 14
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 14
Ile Ile Ser Ser Asp Arg Ser Asp Ile Asp Tyr Thr Asp Asn Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 15
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 15
His Arg Gly Tyr Asp Gly Phe Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr
1 5 10
<210> 16
<211> 113
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 16
Asp Ile Leu Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Thr Val Thr Ala Gly
1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Met Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser
20 25 30
Gly Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Thr Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Arg
35 40 45
Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Ile Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Ala Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ile Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Asn
85 90 95
Asp Tyr Ser Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Leu
100 105 110
Arg
<210> 17
<211> 339
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 17
gacattctga tgacacagtc tccatcctcc ctgactgtga cagcaggaga gaaggtcact 60
atgagctgca ggtccagtca gagtctgtta aacagtggaa atcaaaagaa ctacttgacc 120
tggtatcagc agagaccagg gcggcctcct aaattgttga tctattgggc atccactagg 180
atatctgggg tccctgatcg cttcgcaggc agtggatctg gaacagattt cactctcacc 240
atcagcattg tgcaggctga ggacctggca gtttattact gtcagaatga ttatagttat 300
ccgctcacgt tcggttctgg gaccaaactg gagctgaga 339
<210> 18
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 18
Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser Gly Asn Gln Lys Asn Tyr Leu
1 5 10 15
Thr
<210> 19
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 19
Trp Ala Ser Thr Arg Ile Ser
1 5
<210> 20
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 20
Gln Asn Asp Tyr Ser Tyr Pro Leu Thr
1 5
<210> 21
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 21
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Val Val Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Val Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Trp Ile Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Lys Ile Phe Pro Gly Asn Gly Asp Thr Asp Tyr Asn Gly Asn Phe
50 55 60
Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Gly Phe Ala Asp Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala
100 105 110
<210> 22
<211> 336
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 22
caggttcagc tgcagcagtc tggggctgag gtggtgaagc ctggggcctc agtgaagatt 60
tcctgcaaag cttctggcta cgtattcagt agttactgga taaactgggt gaagcagagg 120
cctggaaagg gtcttgagtg gattggaaag atttttcctg gaaatggtga tactgactat 180
aacggaaact ttaagggcaa ggccacactg actgcagaca aatcctccag cacagcctat 240
atgcagctca gtagcctgac ctctgaagac tctgcggtct atttctgtgc tggctttgct 300
gactggggcc aagggactct ggtcactgtc tctgca 336
<210> 23
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 23
Ser Tyr Trp Ile Asn
1 5
<210> 24
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 24
Lys Ile Phe Pro Gly Asn Gly Asp Thr Asp Tyr Asn Gly Asn Phe Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 25
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 25
Phe Ala Asp
1
<210> 26
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 26
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Arg Val Ser Leu Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Gly Glu Arg
20 25 30
Leu Ile Trp Leu Gln Gln Glu Pro Asp Gly Thr Phe Lys Arg Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Thr Ser Ser Leu Asp Ser Gly Val Pro Lys Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Ser Ser Gly Ser Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu Ser
65 70 75 80
Glu Asp Phe Val Asp Tyr Tyr Cys Leu Gln Tyr Ala Ser Ser Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 27
<211> 321
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 27
gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ttatctgcct cgctgggaga aagagtcagt 60
ctcacttgtc gggcaagtca ggacattggt gaaaggttaa tctggcttca gcaggaacca 120
gatggaactt ttaaacgcct gatctacgcc acatccagtt tagattctgg tgtccccaaa 180
aggttcagtg gcagttcgtc tgggtcagat tattctctca ccatcagcag acttgagtct 240
gaagattttg ttgactatta ctgtctacaa tatgctagtt ctccgtacac gttcggaggg 300
gggaccaaac tggaaataaa a 321
<210> 28
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 28
Arg Ala Ser Gln Asp Ile Gly Glu Arg Leu Ile
1 5 10
<210> 29
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 29
Ala Thr Ser Ser Leu Asp Ser
1 5
<210> 30
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 30
Leu Gln Tyr Ala Ser Ser Pro Tyr Thr
1 5
<210> 31
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 31
Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Ile Pro Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
Asn Met Asp Trp Val Lys Gln Arg His Gly Lys Ser Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Asp Ile Asn Pro Asn Asn Gly Gly Thr Val Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Arg Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ile Ser Gly Thr Gly Tyr Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly Thr
100 105 110
Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 32
<211> 360
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 32
gaggtccagc tgcaacagtc tggacctgag ctggtgaagc ctggggcttc agtgaagata 60
ccctgcaagg cttctggata cacattcact gactacaaca tggactgggt gaagcagcgc 120
catggaaaga gccttgagtg gattggagat attaatccta acaatggtgg tactgtctac 180
aaccagaagt tcaagggcaa ggccacattg actgtagaca agtcctccaa cacagcctac 240
atggagctcc gcagcctgac atctgaggac actgcagtct attactgtgc aagaatttcc 300
ggaactggat actggtactt cgatgtctgg ggcacaggga ccacggtcac cgtctcctca 360
<210> 33
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 33
Asp Tyr Asn Met Asp
1 5
<210> 34
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 34
Asp Ile Asn Pro Asn Asn Gly Gly Thr Val Tyr Asn Gln Lys Phe Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 35
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 35
Ile Ser Gly Thr Gly Tyr Trp Tyr Phe Asp Val
1 5 10
<210> 36
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 36
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ser Val Ser Val Gly
1 5 10 15
Glu Thr Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Asn Ile Tyr Ser Asn
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Gln Gly Lys Ser Pro Gln Leu Leu Val
35 40 45
Tyr Gly Ala Thr Asn Leu Ala Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Asp Ser Gly Thr Gln Tyr Ser Leu Lys Ile Asn Ser Leu Gln Ser
65 70 75 80
Glu Asp Phe Gly Ser Tyr Tyr Cys Gln His Phe Trp Gly Thr Pro Trp
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 37
<211> 321
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 37
gacatccaga tgactcagtc tccagcctcc ctatctgtat ctgtgggaga aactgtcacc 60
atcacatgtc gagcaagtga gaatatttac agtaatttag catggtatca gcagaaacag 120
ggaaaatctc ctcagctcct ggtctatggt gcaacaaact tagcagatgg tgtgccatca 180
agattcagtg gcagtgattc aggcacacag tattccctca agatcaacag cctgcagtct 240
gaagattttg ggagttatta ctgtcaacat ttttggggta ctccgtggac gttcggtgga 300
ggcaccaagc tggaaatcaa a 321
<210> 38
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 38
Arg Ala Ser Glu Asn Ile Tyr Ser Asn Leu Ala
1 5 10
<210> 39
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 39
Gly Ala Thr Asn Leu Ala Asp
1 5
<210> 40
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 40
Gln His Phe Trp Gly Thr Pro Trp Thr
1 5
<210> 41
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 41
Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Asn Ile Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
Tyr Leu His Trp Val Lys Gln Ser His Gly Lys Ser Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Tyr Ile Tyr Pro Asn Thr Gly Val Asn Gly Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Lys Ala Ser Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Arg Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ser Asp Ser Trp Phe Phe Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Ser Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 42
<211> 354
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 42
gaggtccagc tgcaacagtc tggacctgag ttggtgaagc ctggggcttc agtgaagatg 60
tcctgcaagg cttctggcaa cattttcact gactactacc ttcactgggt gaagcagagc 120
catggaaaga gccttgagtg gataggatat atttatccta acactggtgt taatggctac 180
aaccagaagt tcaagggcaa ggcctcattg actgtagaca agtcctccag cacagcctac 240
atggaactcc gcagcctgac atctgaggac tctgcagtct attattgtgc aagcgacagc 300
tggttctttg ctatggacta ctggggtcaa ggaacctcag tcaccgtctc ctca 354
<210> 43
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 43
Asp Tyr Tyr Leu His
1 5
<210> 44
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 44
Tyr Ile Tyr Pro Asn Thr Gly Val Asn Gly Tyr Asn Gln Lys Phe Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 45
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 45
Asp Ser Trp Phe Phe Ala Met Asp Tyr
1 5
<210> 46
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 46
Leu Leu Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Ile Asn Asp Met
20 25 30
Asn Trp Phe Gln Gln Arg Pro Gly Thr Ser Pro Lys Arg Trp Ile Ser
35 40 45
Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Met Glu Ala Glu
65 70 75 80
Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys His Gln Arg Ser Ser Tyr Pro Trp Thr
85 90 95
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 47
<211> 318
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 47
ctacttgttc tcacccagtc tccagcaatc atgtctgctt ctccagggga gaaggtcacc 60
atgacctgca gtgccagctc aagtataaat gacatgaatt ggttccagca aaggccaggc 120
acctccccca aaagatggat ttctgacaca tccaaactgg cttctggagt ccctgctcgc 180
ttcagtggca gtgggtctgg gacctcttat tctctcacaa tcagcagcat ggaggctgaa 240
gatgctgcca cttattactg ccatcagcgg agtagttacc cgtggacgtt cggtggaggc 300
accaagctgg aaatcaaa 318
<210> 48
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 48
Ser Ala Ser Ser Ser Ile Asn Asp Met Asn
1 5 10
<210> 49
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 49
Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser
1 5
<210> 50
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 50
His Gln Arg Ser Ser Tyr Pro Trp Thr
1 5
<210> 51
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 51
Glu Val Gln Leu Arg Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Thr
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
Asn Ile His Trp Val Lys Gln Ser His Gly Lys Ser Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Tyr Ile Asn Pro Asn Asn Gly Gly Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Val Ser Lys Ser Ser Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Arg Ser Pro Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asn Asp Ala Tyr Tyr His Arg Tyr Phe Asp Val Trp Gly Thr
100 105 110
Gly Thr Pro Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 52
<211> 360
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 52
gaggtccagc tgcgacagtc tggacctgag ttggtgaagc ctgggacttc agtgaaggtg 60
tcctgcaagg cttctggata caccttcact gactataaca tacattgggt gaaacagagc 120
catggaaaga gccttgagtg gattggttat attaacccta acaatggtgg cactagttac 180
aatcagaagt tcaaggacaa ggccacattg actgtaagta agtcttccaa cacagcctac 240
atggaactcc gcagcccgac atcggaggac tctgcagtct attactgtgc aagaaatgat 300
gcttattatc atcgctactt cgatgtctgg ggcacaggga ccccggtcac cgtctcctca 360
<210> 53
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 53
Asp Tyr Asn Ile His
1 5
<210> 54
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 54
Tyr Ile Asn Pro Asn Asn Gly Gly Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe Lys
1 5 10 15
Asp
<210> 55
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 55
Asn Asp Ala Tyr Tyr His Arg Tyr Phe Asp Val
1 5 10
<210> 56
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 56
Asp Ile Val Met Thr Gln Ala Ala Phe Ser Ser Pro Val Thr Leu Gly
1 5 10 15
Thr Ser Ser Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu His Ser
20 25 30
Asn Gly Ile Thr Tyr Leu Tyr Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Gln Met Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Ser Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Arg Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Ala Gln Tyr
85 90 95
Leu Glu Leu Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Asn Leu Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 57
<211> 336
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 57
gatattgtga tgacgcaggc tgcattctcc agcccagtca ctcttggaac atcatcttcc 60
atctcctgca ggtcgagtaa gagtctccta catagtaatg gcatcactta tttgtattgg 120
tatctgcaga agccaggcca gtctcctcag ctcctgattt atcagatgtc caaccttgcc 180
tcaggagtcc cagacaggtt cagtagcagt gggtcaggga ctgatttcac actgagaatc 240
agtagagtgg aggctgagga tgtgggtgtt tattactgtg ctcaatatct tgaacttccg 300
tggacgttcg gtggaggcac caacctggaa attaaa 336
<210> 58
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 58
Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu His Ser Asn Gly Ile Thr Tyr Leu Tyr
1 5 10 15
<210> 59
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 59
Gln Met Ser Asn Leu Ala Ser
1 5
<210> 60
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 60
Ala Gln Tyr Leu Glu Leu Pro Trp Thr
1 5
<210> 61
<211> 117
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 61
Asp Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln
1 5 10 15
Ser Leu Ser Leu Thr Cys Ser Val Thr Gly Tyr Ser Ile Thr Ser Arg
20 25 30
Tyr Tyr Trp Asn Trp Ile Arg Gln Phe Pro Gly Asn Lys Leu Glu Trp
35 40 45
Met Gly Tyr Met Thr Tyr Asp Gly Thr Asn Asn Tyr Asn Pro Ser Leu
50 55 60
Thr Asn Arg Ile Ser Ile Thr Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Phe
65 70 75 80
Leu Lys Leu Asn Ser Val Thr Ala Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Gly Trp Asp Pro Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr
100 105 110
Leu Thr Val Ser Ser
115
<210> 62
<211> 351
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 62
gatgtacagc ttcaggagtc aggacctggc ctcgtgaaac cttctcagtc tctgtctctc 60
acctgctctg tcactggcta ctccatcacc agtcgttatt actggaactg gatccggcag 120
tttccaggaa acaaactgga atggatgggg tacatgacct acgatggtac caataactac 180
aacccatctc tcacaaatcg aatctccatc actcgtgaca catctaagaa ccagtttttc 240
ctgaagttga attctgtgac tgctgaggac acagccacat atttctgtgc aagagggggg 300
tgggaccctt ttgactattg gggccaaggc accactctca cagtctcctc a 351
<210> 63
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 63
Ser Arg Tyr Tyr Trp Asn
1 5
<210> 64
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 64
Tyr Met Thr Tyr Asp Gly Thr Asn Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Thr Asn
1 5 10 15
<210> 65
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 65
Gly Gly Trp Asp Pro Phe Asp Tyr
1 5
<210> 66
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 66
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ala Ala Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Glu Thr Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Asp Asn Ile Tyr Ser Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Gln Gly Lys Cys Pro Gln Leu Leu Val
35 40 45
Lys Asn Ala Lys Thr Leu Ala Glu Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Gln Phe Ser Leu Arg Ile Asn Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Asp Asp Phe Gly Thr Tyr Tyr Cys Gln His Tyr Tyr Gly Thr Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys
100 105
<210> 67
<211> 321
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 67
gacatccaga tgactcagtc tccagccgcc ctatctgcat ctgtgggaga gactgtcacc 60
atcacatgtc gagcaagtga caatatttac agttatttag catggtatca acagaaacag 120
ggaaaatgtc ctcagctcct ggtcaaaaat gcaaaaacct tagcagaagg tgtgccatca 180
aggttcagtg gcagtggatc aggcacacag ttttctctga ggatcaacag cctgcagcct 240
gacgattttg gtacttatta ctgtcaacat tattacggaa ctccactcac gttcggtgct 300
gggaccaaac tggagctgaa a 321
<210> 68
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 68
Arg Ala Ser Asp Asn Ile Tyr Ser Tyr Leu Ala
1 5 10
<210> 69
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 69
Asn Ala Lys Thr Leu Ala Glu
1 5
<210> 70
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 70
Gln His Tyr Tyr Gly Thr Pro Leu Thr
1 5
<210> 71
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 71
Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Thr Glu Leu Val Asn Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Trp Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Asn Ile Asn Pro Ser Asn Gly Gly Thr His Tyr Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Asn Asn Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Phe Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Asp Tyr Ala Tyr Asp Trp Tyr Phe Thr Val Trp Gly Thr
100 105 110
Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 72
<211> 360
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 72
caggtccaac tgcagcagcc tgggactgaa ctggtgaacc ctggggcttc agtgaagctg 60
tcctgcaagg cttctggcta caccttcacc agctactgga tgcactgggt gaagcagagg 120
cctggacaag gccttgagtg gattggaaat attaatccta gcaatggtgg tactcactac 180
aatgagaaat tcaacaacaa ggccacactg actgtagaca aatcctccag cacagcctac 240
atgcagctca gcagcctgac atctgaggac tctgcggtct tttattgtgc aagaggggac 300
tatgcttacg actggtactt cactgtctgg ggcacgggga ccacggtcac cgtctcctca 360
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1 5
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Asn Ile Asn Pro Ser Asn Gly Gly Thr His Tyr Asn Glu Lys Phe Asn
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Asn
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Gly Asp Tyr Ala Tyr Asp Trp Tyr Phe Thr Val
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Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Gln Arg Ala Ile Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Ser Phe Ala
20 25 30
Gly Thr Gly Leu Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Gln Pro
35 40 45
Lys Leu Leu Ile Tyr Arg Val Ser Asn Leu Glu Ala Gly Ile Pro Thr
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Arg Thr Asp Phe Thr Leu Asn Ile His
65 70 75 80
Pro Val Glu Glu Asp Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Asn Arg
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caacagaaac caggacagca acccaaactc ctcatctatc gtgtatccaa cctagaagct 180
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Lys Ala Ser Gln Ser Val Ser Phe Ala Gly Thr Gly Leu Met His
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Arg Val Ser Asn Leu Glu Ala
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Gln Gln Asn Arg Glu Phe Pro Trp Thr
1 5
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Gln Ala Tyr Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Asn Met His Trp Val Lys Gln Thr Pro Ser Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Ser Thr Tyr Pro Gly Asn Gly Asp Thr Phe Tyr Asn Gln Gln Phe
50 55 60
Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys
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Ser Arg Ala Asp Leu Gly Asp Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly Thr Gly
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Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
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atgcagctca gcagcctgac atctgaagac tctgcggtct atttttgttc aagagcggac 300
ctgggggact ggtacttcga tgtctggggc acagggacca cggtcaccgt ctcctca 357
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Ser Tyr Asn Met His
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Ser Thr Tyr Pro Gly Asn Gly Asp Thr Phe Tyr Asn Gln Gln Phe Lys
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Gly
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Ala Asp Leu Gly Asp Trp Tyr Phe Asp Val
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Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Ser Ser Ser Phe Ser Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Glu Asp Ile Tyr Asn Arg
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Asn Ala Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Ser Gly Ala Thr Ser Leu Glu Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Lys Asp Tyr Thr Leu Tyr Ile Thr Ser Leu Gln Thr
65 70 75 80
Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Trp Ser Ile Pro Trp
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Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
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gacatccaga tgacacaatc ttcatcctcc ttttctgtat ctctaggaga cagagtcacc 60
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gaagatgttg ctacttatta ctgtcaacag tattggagta ttccgtggac gttcggtgca 300
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Lys Ala Ser Glu Asp Ile Tyr Asn Arg Leu Ala
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Trp Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
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Gly Asn Ile Asn Pro Ser Asn Gly Gly Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Ser Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Asn Thr Ala Ser
65 70 75 80
Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
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Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
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Gln Arg Ala Ile Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Ser Phe Ala
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Gly Pro Ser Leu Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Gln Pro
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gacattgtgc tgacccaatc tccagcttct ttggctgtgt ctctagggca gagggccatc 60
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Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Gly Leu Val Lys Pro Gly Ala
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Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr
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Trp Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
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Gly Met Ile His Pro Asn Ser Gly Ser Thr Asn Asn Asn Glu Lys Phe
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Asn
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Asp Arg Val Ser Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asn Val Gly Thr Ala
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
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50 55 60
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65 70 75 80
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Gln Gln Tyr Ser Ser Phe Pro Leu Phe Thr
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Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Thr Val Leu Ala Arg Pro Gly Thr
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Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Thr Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ala Tyr
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Trp Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
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Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser
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Gly
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Gly Asp Tyr Gly Ser Asn Pro Phe Asp Trp
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Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Ser Ser Ser Phe Ser Val Ser Leu Gly
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Asp Arg Val Thr Ile Ile Cys Lys Ala Ser Glu Asp Ile Tyr Asn Arg
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65 70 75 80
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<400> 119
Gly Ala Thr Ser Leu Glu Thr
1 5
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Gln Gln Tyr Trp Ser Ile Pro Phe Thr
1 5
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Glu Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
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Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Asp Tyr
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gacattgtga tgtcacagtc tccatcctcc ctagctgtgt cagttggaga gaaggttact 60
atgacctgca agtccagtca gagcctttta tatagtaaca atcaaaagaa ctacttggcc 120
tggtaccagc aaaaaccagg gcagtctcct aaactgctga tttactgggc atccactagg 180
gaatctgggg tccctgatcg cttcacaggc agtggatctg ggacagattt cactctcacc 240
ctcagcagtg tgaaggctga agacctggca gtttattact gtcagcaata ttatagctat 300
ccattcacgt tcggctcggg gacaaagttg gaaataaaa 339
<210> 128
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 128
Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Ser Asn Asn Gln Lys Asn Tyr Leu
1 5 10 15
Ala
<210> 129
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 129
Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser
1 5
<210> 130
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 130
Gln Gln Tyr Tyr Ser Tyr Pro Phe Thr
1 5
<210> 131
<211> 117
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 131
Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
Tyr Met Asn Trp Val Lys Gln Ser His Gly Lys Ser Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Asn Ile Asn Pro Asn Asn Gly Asp Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Ser
65 70 75 80
Met Glu Leu Arg Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Asn Ser Gly Tyr Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr
100 105 110
Leu Thr Val Ser Ser
115
<210> 132
<211> 351
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 132
gaggtccagc tgcaacaatc tggacctgag ctggtgaagc ctggggcttc agtgaagata 60
tcctgtaagg cttctggata cacgttcact gactactaca tgaactgggt gaaacagagc 120
catggaaaga gccttgagtg gattggaaat attaatccta acaatggtga tactaactac 180
aaccagaagt tcaagggcaa ggccacattg actgtagaca agtcctccag cacagcctcc 240
atggagctcc gcagcctgac atctgaggac tctgcagtct attactgtgc aaattcaggc 300
tactattact ttgactactg gggccaaggc accactctca cagtctcctc a 351
<210> 133
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 133
Asp Tyr Tyr Met Asn
1 5
<210> 134
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 134
Asn Ile Asn Pro Asn Asn Gly Asp Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 135
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 135
Ala Asn Ser Gly Tyr Tyr Tyr Phe Asp Tyr
1 5 10
<210> 136
<211> 113
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 136
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Thr Val Thr Ala Gly
1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser
20 25 30
Gly Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Thr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Pro Pro Lys Val Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Asn
85 90 95
Asp Tyr Ser Tyr Pro Pro Thr Phe Gly Gly Gly Thr Asn Leu Glu Ile
100 105 110
Lys
<210> 137
<211> 339
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 137
gacattgtga tgacacagtc tccatcctcc ctgaccgtga cagcaggaga gaaggtcact 60
atgagctgca agtccagtca gagtctgtta aacagtggaa atcaaaagaa ctacttgacc 120
tggtaccagc agaaaccagg gcagcctcct aaagtattga tctactgggc atccactagg 180
gaatctgggg tccctgatcg cttcacaggc agtggatctg gaacagattt cactctcacc 240
atcagcagtg tgcaggctga agacctggca gtttattact gtcagaatga ttatagttat 300
cctcccacgt tcggaggggg gaccaacctg gaaataaaa 339
<210> 138
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 138
Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser Gly Asn Gln Lys Asn Tyr Leu
1 5 10 15
Thr
<210> 139
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 139
Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser
1 5
<210> 140
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 140
Gln Asn Asp Tyr Ser Tyr Pro Pro Thr
1 5

Claims (17)

1.一种抗体的重链可变区，其特征在于，所述的重链可变区具有选自下组的互补决定区CDR：
SEQ ID NO.10n+3所示的VH-CDR1，
SEQ ID NO.10n+4所示的VH-CDR2，和
SEQ ID NO.10n+5所示的VH-CDR3；
其中，各n独立地为0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或13；
其中，上述氨基酸序列中任意一种氨基酸序列还包括任选地经过添加、缺失、修饰和/或取代至少一个氨基酸的，并能够保留CD73结合亲和力的衍生序列。
2.一种抗体的重链，其特征在于，所述的重链具有如权利要求1所述的重链可变区。
3.一种抗体的轻链可变区，其特征在于，所述的轻链可变区具有选自下组的互补决定区CDR：
SEQ ID NO.10n+8所示的VL-CDR1，
SEQ ID NO.10n+9所示的VL-CDR2，和
SEQ ID NO.10n+10所示的VL-CDR3；
其中，各n独立地为0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或13；
其中，上述氨基酸序列中任意一种氨基酸序列还包括任选地经过添加、缺失、修饰和/或取代至少一个氨基酸的，并能够保留CD73结合亲和力的衍生序列。
4.一种抗体的轻链，其特征在于，所述的轻链具有如权利要求3所述的轻链可变区。
5.一种抗体，其特征在于，所述抗体具有：
(1)如权利要求1所述的重链可变区；和/或
(2)如权利要求3所述的轻链可变区；
或者，所述抗体具有：如权利要求2所述的重链；和/或如权利要求4所述的轻链，
其中，上述氨基酸序列中任意一种氨基酸序列还包括任选地经过添加、缺失、修饰和/或取代至少一个氨基酸的，并能够保留CD73结合亲和力的衍生序列。
6.如权利要求5所述的抗体，其特征在于，所述的抗体具有如权利要求1所述的重链可变区和如权利要求3所述的轻链可变区；
其中，所述的重链可变区和所述的轻链可变区包括选自下组的CDR：
Figure FDA0001943392550000021
其中，上述氨基酸序列中任意一种氨基酸序列还包括任选地经过添加、缺失、修饰和/或取代至少一个氨基酸的，并能够保留CD73结合亲和力的衍生序列。
7.如权利要求5所述的抗体，其特征在于，所述抗体的重链可变区含有SEQ IDNO.1、11、21、31、41、51、61、71、81、91、101、111、121或131所示的氨基酸序列；和/或所述抗体的轻链可变区含有SEQ ID NO.6、16、26、36、46、56、66、76、86、96、106、116、126或136所示的氨基酸序列。
8.如权利要求6所述的抗体，其特征在于，所述的抗体选自下组：
Figure FDA0001943392550000022
9.一种重组蛋白，其特征在于，所述的重组蛋白包括：
(i)如权利要求1所述的重链可变区、如权利要求2所述的重链、如权利要求3所述的轻链可变区、如权利要求4所述的轻链、或如权利要求5-8中任一项所述的抗体；以及
(ii)任选的协助表达和/或纯化的标签序列。
10.一种多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸编码选自下组的多肽：
(1)如权利要求1所述的重链可变区、如权利要求2所述的重链、如权利要求3所述的轻链可变区、如权利要求4所述的轻链、或如权利要求5-8中任一项所述的抗体；以及
(2)如权利要求9所述的重组蛋白。
11.如权利要求10所述的多核苷酸，其特征在于，编码所述重链可变区的多核苷酸如SEQ ID NO.2、12、22、32、42、52、62、72、82、92、102、112、122或132所示；和/或，编码所述轻链可变区的多核苷酸如SEQ ID NO.7、17、27、37、47、57、67、77、87、97、107、117、127或137所示。
12.如权利要求11所述的多核苷酸，其特征在于，编码所述重链可变区序列的多核苷酸和编码所述轻链可变区序列的多核苷酸选自下组：
Figure FDA0001943392550000031
13.一种载体，其特征在于，所述载体含有本发明权利要求10-12中任一项所述的多核苷酸。
14.一种遗传工程化的宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞含有权利要求13所述的载体或基因组中整合有权利要求10-12中任一项所述的多核苷酸。
15.一种抗体偶联物，其特征在于，该抗体偶联物含有：
(a)抗体部分，所述抗体部分选自下组：如权利要求1所述的重链可变区、如权利要求2所述的重链、如权利要求3所述的轻链可变区、如权利要求4所述的轻链、或如权利要求5-8中任一项所述的抗体、或其组合；和
(b)与所述抗体部分偶联的偶联部分，所述偶联部分选自下组：可检测标记物、药物、毒素、细胞因子、放射性核素、酶、或其组合。
16.一种免疫细胞，其特征在于，所述免疫细胞表达或在细胞膜外暴露有权利要求5-8中任一项所述的抗体。
17.一种药物组合物，其特征在于，所述药物组合物含有：
(i)活性成分，所述活性成分选自下组：如权利要求1所述的重链可变区、如权利要求2所述的重链、如权利要求3所述的轻链可变区、如权利要求4所述的轻链、或如权利要求5-8中任一项所述的抗体、如权利要求9所述的重组蛋白、如权利要求15所述的抗体偶联物、权利要求16所述的免疫细胞、或其组合；以及
(ii)药学上可接受的载体。
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