CN112675126A

CN112675126A - 抗cd20抗体制剂及其应用

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Publication number: CN112675126A
Application number: CN201910991541.8A
Authority: CN
Inventors: 陈燕宇; 吴用; 周远清; 秦超; 萧翠珍; 吴志好; 黄丹丹; 刘育杰; 王盛武; 刘翠华; 李胜峰
Original assignee: Bio Thera Solutions Ltd
Current assignee: Bio Thera Solutions Ltd
Priority date: 2019-10-18
Filing date: 2019-10-18
Publication date: 2021-04-20

Abstract

本发明提供抗CD20抗体制剂及其应用，属于生物抗体技术领域，本发明抗体制剂包含以下浓度的组分：15～80mg/ml抗CD20抗体，10～30mM缓冲剂，80～240mM稳定剂，0.1～0.4mg/ml表面活性剂，液体制剂的pH值为5.5～6.2。本发明抗体制剂具有良好的稳定性。

Description

抗CD20抗体制剂及其应用

技术领域

本发明属于生物抗体技术领域，尤其涉及抗CD20抗体制剂及其应用。

背景技术

CD20分子是一种分子量约为35KD的疏水性跨膜蛋白，位于前B淋巴细胞和成熟淋巴细胞上。CD20可见于源自外周血或淋巴器官的多于 90％的B细胞的表面，且在早期前B细胞发育过程中表达，且保持直到血浆细胞分化。CD20在正常B细胞和恶性细胞中都存在，CD20特别是在多于90％的B细胞非何杰金氏淋巴瘤中表达。

尽管CD20在促进B细胞的增值和分化中的实际作用上尚不确定，但 CD20为抗体介导治疗提供一个重要的靶点，可用来控制癌症和自身免疫疾病中涉及的B细胞。

相对于传统的有机和无机药物，抗CD20抗体更大、更复杂。为保持抗体的生物学活性，制剂需要保持蛋白质的氨基酸核心序列的整体构象完整，同时防止抗体的多个官能团发生降解。

发明内容

基于此，本发明提供抗CD20抗体制剂及其应用。

在一个方面，本发明提供一种含抗CD20抗体的液体制剂，其包含以下浓度的组分：10～120mg/ml抗CD20抗体，缓冲剂，稳定剂，表面活性剂，液体制剂的pH值为5～7。

在一些实施方式中，抗体制剂的溶剂为水。在一些实施方式中，抗体制剂的溶剂为无菌注射用水。

在一些实施方案中，所述液体制剂包含10～120mg/ml抗CD20抗体， 10～30mM缓冲剂，58～292mM稳定剂，0.1～0.5mg/ml表面活性剂，液体制剂的pH值为5.5～6.5。

在一些实施方案中，所述液体制剂包含15～80mg/ml抗CD20抗体， 10～30mM缓冲剂，80～240mM稳定剂，0.1～0.4mg/ml表面活性剂，液体制剂的pH值为5.5～6.2。

在一些实施方案中，所述缓冲剂选自琥珀酸缓冲剂、柠檬酸缓冲剂、磷酸缓冲剂、组氨酸缓冲剂和醋酸缓冲剂。

在一些实施方案中，所述稳定剂选自蔗糖、海藻糖、山梨醇、甘露醇和甲硫氨酸；所述表面活性剂选自聚山梨酯-80和聚山梨酯-20。

在一些实施方案中，所述琥珀酸缓冲剂包含琥珀酸和琥珀酸纳，所述柠檬酸缓冲剂包含柠檬酸和柠檬酸钠，所述组氨酸缓冲剂包含L-组氨酸和 L-组氨酸盐酸盐，所述醋酸缓冲剂包含醋酸和醋酸钠。

在一些实施方案中，抗CD20抗体的浓度为约15mg/ml，40mg/ml， 60mg/ml，80mg/ml(80mg/ml即为8％)，或任何两个数值之间的范围(包括终点值)；缓冲剂的浓度为约10mM，15mM，26mM，30mM，或任何两个数值之间的范围(包括终点值)；稳定剂的浓度为约80mM，140mM，190mM，240mM，或任何两个数值之间的范围(包括终点值)；表面活性剂的浓度为约0.1mg/ml，0.3mg/ml，0.4mg/ml(0.4mg/ml即为 0.04％)，或任何两个数值之间的范围(包括终点值)；pH值为约5.5，5.6， 5.7，6.0，6.2，或任何两个数值之间的范围(包括终点值)。

在一些实施方案中，所述抗CD20抗体选自单克隆抗体和与CD20结合的片段。

在一些实施方案中，所述抗CD20抗体的重链包含SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列或与所述SEQ ID NO:1具有至少90％同一性的氨基酸序列，所述抗CD20抗体的轻链包含SEQID NO:2所示的氨基酸序列或与所述 SEQ ID NO:2具有至少90％同一性的氨基酸序列。

在一些实施方案中，液体制剂包含20～50mg/ml的抗CD20抗体；抗 CD20抗体的浓度为约20mg/ml，30mg/ml，40mg/ml，50mg/ml，或任何两个数值之间的范围(包括终点值)。

在一些实施方案中，液体制剂包含18～22mM的组氨酸缓冲剂；组氨酸缓冲剂的浓度为约18mM，19mM，20mM，22mM，或任何两个数值之间的范围(包括终点值)。

在一些实施例方案中，组氨酸缓冲剂中L-组氨酸与L-组氨酸盐酸盐的摩尔浓度比为1～2:2。

在一些实施方案中，液体制剂包含158～225mM的海藻糖；海藻糖的浓度为约158mM，158.6mM，170mM，220mM，224.6mM，225mM(224.6 mM即为7.68％)，或任何两个数值之间的范围(包括终点值)。

在一些实施方案中，液体制剂包含0.18～0.22mg/ml的聚山梨酯-80；聚山梨酯-80的浓度为约0.18mg/ml，0.19mg/ml，0.2mg/ml，0.22mg/ml (0.22mg/ml即为0.022％)，或任何两个数值之间的范围(包括终点值)。

在一些实施方案中，液体制剂的pH值为5.7～5.9；pH值为约5.7，5.8， 5.9，或任何两个数值之间的范围(包括终点值)。

在一些实施方案中，液体制剂包含以下浓度的组分：约20mg/ml抗 CD20抗体，约20mM组氨酸缓冲剂，约158.6mM海藻糖(即54mg/ml 海藻糖)，约0.2mg/ml聚山梨酯-80，液体制剂的pH值约为5.8；基于pH 值为5.8，组氨酸缓冲剂中L-组氨酸和L-组氨酸盐酸盐的物质量的比为 2:3。

在一些实施方案中，液体制剂包含以下浓度的组分：约20mg/ml抗 CD20抗体，约20mM组氨酸缓冲剂，约224.6mM海藻糖(即76.8mg/ml 海藻糖)，约0.2mg/ml聚山梨酯-80，液体制剂的pH值约为5.8；基于pH 值为5.8，组氨酸缓冲剂中L-组氨酸和L-组氨酸盐酸盐的物质量的比为 2:3。

在一些实施方案中，液体制剂包含以下浓度的组分：约50mg/ml抗 CD20抗体，约20mM组氨酸缓冲剂，约224.6mM海藻糖(即76.8mg/ml 海藻糖)，约0.2mg/ml聚山梨酯-80，液体制剂的pH值为5.8；基于pH 值为5.8，组氨酸缓冲剂中L-组氨酸和L-组氨酸盐酸盐的物质量的比为 2:3。

在一些实施方案中，液体制剂为根据处方1、处方2、处方3或处方4 配制的液体制剂。

在一些实施方案中，所述液体制剂可用于注射，比如静脉内或皮下注射。

在一些实施方案中，根据处方1配制的液体制剂为静脉注射制剂。

在一些实施方案中，根据处方2、3或4配制的液体制剂为皮下注射制剂。

在一些实施方案中，本发明还提供一种静脉注射用制剂，包含上述液体制剂和稀释溶剂(如水(比如无菌注射用水)、等渗溶液(如0.9％注射用NaCl溶液)等)。在一些实施方案中，上述液体制剂和稀释溶剂的比例为1:10-50，1:20-40,或1：25-35。

治疗哺乳动物中涉及细胞表达CD20的疾病的方法，其包括向需要的哺乳动物给药有效剂量的上述的液体制剂。

在一些实施方案中，所述哺乳动物为人。

在一些实施方案中，哺乳动物给药的方式为注射，比如静脉内或皮下注射。

在一些实施方案中，当哺乳动物采用注射的给药方式时，所述液体制剂包含以下浓度的组分：约20mg/ml抗CD20抗体，约20mM组氨酸缓冲剂，约158.6mM海藻糖，约0.2mg/ml聚山梨酯-80，液体制剂的pH值约为5.8。

在一些实施方案中，当哺乳动物采用注射的给药方式时，所述液体制剂包含以下浓度的组分：约20mg/ml抗CD20抗体，约20mM组氨酸缓冲剂，约224.6mM海藻糖，0.2mg/ml聚山梨酯-80，液体制剂的pH值约为5.8。

在一些实施方案中，当哺乳动物采用注射的给药方式时，所述液体制剂包含以下浓度的组分：约50mg/ml抗CD20抗体，约20mM组氨酸缓冲剂，约224.6mM海藻糖，约0.2mg/ml聚山梨酯-80，液体制剂的pH值约为5.8。

在一些实施方案中，所述涉及细胞表达CD20的疾病选自致瘤性疾病、免疫性疾病。

在一些实施方案中，所述抗CD20抗体为单克隆抗体1。

在一些实施例方案中，所述单克隆抗体1由仓鼠卵巢细胞CHO表达。

在一些实施例方案中，所述单克隆抗体1由编辑的CHO宿主细胞表达，其保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为CCTCC NO：C2017127，保藏日2017.8.10，保藏地址为：中国，武汉，武汉大学。分类命名为：中国仓鼠卵巢细胞CHO-BAT-KF fut8(-/-)。

在一些实施例方案中，所述单克隆抗体1的糖基化方式的特征满足如下条件中的一种或者多种：

所述抗体岩藻糖含量很低(0～5％)；

所述抗体含半乳糖水平较低(≤30％)；

所述抗体甘露糖水平较低(≤5％)；

所述抗体高甘露糖水平较低(≤5％)；

所述抗体G0水平较高。

在一些实施方案中，所述致瘤性疾病包括B细胞淋巴瘤，所述B细胞淋巴瘤包括前体B细胞淋巴细胞性白血病/淋巴瘤和成熟B细胞肿瘤，淋巴浆细胞性淋巴瘤，套细胞淋巴瘤(MCL)，低度、中度和高度滤泡性淋巴瘤，皮肤滤泡中心淋巴瘤，MALT型、结节型和脾型边缘区B细胞淋巴瘤，毛细胞性白血病，弥漫性大B细胞淋巴瘤，伯基特淋巴瘤，浆细胞瘤，浆细胞性骨髓瘤，移植后淋巴增生性障碍，瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症和间变性大细胞淋巴瘤(ALCL)。

在一些实施方案中，所述致瘤性疾病包括免疫性疾病，所述免疫性疾病包括银屑病，银屑病性关节炎，皮炎，全身性硬皮病和硬化症，炎性肠病(IBD)，节段性回肠炎，溃疡性结肠炎，呼吸窘迫综合征，脑膜炎，脑炎，葡萄膜炎，肾小球性肾炎，湿疹，哮喘，动脉粥样硬化，白细胞粘附缺陷，多发性硬化，雷诺综合征，舍格伦综合征，青少年型糖尿病，莱特尔病，贝赫切特病，免疫复合物肾炎，IgA肾病，IgM多神经病，视神经脊髓炎，免疫介导的血小板减少症，溶血性贫血，重症肌无力，狼疮性肾炎，***性红斑狼疮，类风湿性关节炎(RA)，特应性皮炎，天疱疮，格雷夫斯病，桥本氏甲状腺炎，韦氏肉芽肿病，Omenn′s综合征，慢性肾衰竭，急性传染性单核细胞增多症，慢性阻塞性肺病。

本发明还提供上述的液体制剂在制备用于治疗哺乳动物中涉及细胞表达CD20的疾病的药物中的应用，所述涉及细胞表达CD20的疾病选自致瘤性疾病、免疫性疾病。

在一些实施方案中，所述哺乳动物为人。

在制剂处方开发过程中，发现pH对于制剂的稳定性影响较大，因此维持一个特定的pH范围对于本制剂是必要的，本发明选择合适的缓冲剂体系，如琥珀酸缓冲剂、柠檬酸缓冲剂、磷酸盐缓冲剂、组氨酸缓冲剂或醋酸缓冲剂，并使pH值维持在5.5～6.2。作为稳定剂的海藻糖更能降低抗体蛋白的聚集和降解，有效保护制剂中活性成分的活性。聚山梨酯80作为表面活性剂，在防止抗体蛋白聚集方面起重要作用。本发明抗体制剂具有良好的稳定性。

附图说明

图1显示含有不同表面活性剂的样品的微粒数(个/mL)；

图2显示含有不同表面活性剂的样品震荡后的浊度；

图3显示含有不同表面活性剂的样品反复冻融5次后的微粒。

术语

除非另作说明，否则下列的每一个术语应当具有下文所述的含义。

“约”指相关技术领域技术人员容易知道的相应数值的常规误差范围。在一些实施方式中，本文中提到“约”指所描述的数值以及其±10％、±5％或±1％的范围。

“氨基酸”是指羧基α-氨基酸，其可直接或以前体的形式由核酸编码。单个氨基酸由三个核苷酸(所谓的密码子或碱基三联体)组成的核酸编码。每一个氨基酸由至少一个密码子编码。相同氨基酸由不同密码子编码称为“遗传密码的简并性”。本申请中所用的术语“氨基酸”是指天然发生的羧基α-氨基酸，其包括丙氨酸(三字母代码：ala，一字母代码：A)、精氨酸(arg， R)、天冬酰胺(asn，N)、天冬氨酸(asp，D)、半胱氨酸(cys，C)、谷氨酰胺 (gln，Q)、谷氨酸(glu，E)、甘氨酸(gly，G)、组氨酸(his，H)、异亮氨酸(ile， I)、亮氨酸(leu，L)、赖氨酸(lys，K)、甲硫氨酸(met，M)、苯丙氨酸(phe， F)、脯氨酸(pro，P)、丝氨酸(ser，S)、苏氨酸(thr，T)、色氨酸(trp，W)、酪氨酸(tyr，Y)和缬氨酸(val，V)。

术语“抗体”以其广义使用，且具体涵盖单克隆抗体(包括全长单克隆抗体)、多克隆抗体、多特异性抗体(例如双特异性抗体)和抗体片段，只要它们显示期望的生物学活性。

“抗体片段”包括(comprise)全长抗体的一部分，通常包括其抗原结合区。抗体片段的实例包括Fab，Fab’，F(ab’)₂和Fv片段；双抗体(diabodies)；线性抗体(linearantibody)；单链抗体分子；和由抗体片段形成的多特异性抗体。

“单克隆抗体”(mAb)是由相同的免疫细胞制备的抗体，所述免疫细胞是单一亲本细胞的所有克隆。单克隆抗体可以具有单价亲和力，因为它们结合相同的表位(抗体识别的抗原部分)。相反，多克隆抗体与多个表位结合，并且通常由几种不同的浆细胞分泌。还可以通过将一种单一单克隆抗体的治疗靶标增加至两个表位来改造成双特异性单克隆抗体。单克隆抗体可以通过杂交瘤、重组、转基因或本领域技术人员已知的其他技术制。

本发明中缓冲剂的量，是指组成缓冲剂的缓冲体系中缓冲对的总量。在一些实施方式中，采用摩尔浓度作为缓冲剂的量的单位，其数值指缓冲剂的缓冲体系中缓冲对的摩尔浓度。如，由L-组氨酸和L-组氨酸盐酸盐组成的组氨酸缓冲剂作为缓冲剂时，给定浓度的组氨酸缓冲剂(如10mM) 是L-组氨酸和L-组氨酸盐酸盐的组合浓度(如L-组氨酸为5mM，L-组氨酸盐酸盐为5mM；或者L-组氨酸为6mM，L-组氨酸盐酸盐为4mM；或者L-组氨酸为3.46mM，L-组氨酸盐酸盐为6.54mM等)。

本发明所述的制剂可以用所述辅料或其水合物配制。比如组氨酸盐酸盐，又称盐酸组氨酸，可以是无水组氨酸盐酸盐，也可以是组氨酸盐酸盐水合物，如组氨酸盐酸盐一水合物。如所述的“5mM组氨酸盐酸盐”，可以为5mmol组氨酸盐酸盐或组氨酸盐酸盐水合物溶解在溶剂里形成1L溶液；958mg组氨酸盐酸盐，包括958mg组氨酸盐酸盐或相应量的水合物。

以下是部分无水海藻糖对应于海藻糖水合物的量几个例子：1)海藻糖158.6mM表示可以加入158.6mM无水海藻糖(158.6mM无水海藻糖即相当于约为5.4％无水海藻糖)或158.6mM海藻糖二水合物(158.6mM 海藻糖二水合物相当于约为6％海藻糖二水合物)；2)海藻糖224.6mM表示可以加入224.6mM无水海藻糖(224.6mM无水海藻糖即相当于约为 7.68％无水海藻糖)或158.6mM海藻糖二水合物(224.6mM海藻糖二水合物相当于约为8.5％海藻糖二水合物)。

“治疗有效量”是可以治疗疾病或病症的量。本发明的抗体制剂对人体的施用量会随着患者的年龄、体重、性别、用药形态、健康状况及疾病危重程度而不同。

本发明中浓度“％”表示质量体积浓度，单位为g/ml。如0.9％氯化钠溶液表示0.9g氯化钠溶于溶解在溶剂里形成100ml溶液，即溶液含 0.9g/100ml氯化钠。

具体实施方式

以下通过具体的实施例进一步说明本发明的技术方案，具体实施例不代表对本发明保护范围的限制。其他人根据本发明理念所做出的一些非本质的修改和调整仍属于本发明的保护范围。

除特别说明，以下实例中液体制剂溶剂为水，比如注射用水。

实施例1

本发明提供的制剂含抗CD20抗体，为单克隆抗体1，其重链如SEQ ID NO:1所示，其抗体的轻链如SEQ ID NO:2所示；

EVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFNDYAMHWVRQAPGKG LEWVSTISWNSGSIGYADSVKGRFTISRDNAKKSLYLQMNSLRAEDTAL YYCAKDIQYGNYYYGMDVWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPGSSKS TSGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSS VVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPE LLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDG VEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKA LPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIA VEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK，SEQ ID NO:1；

EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLAWYQQKPGQAPRLL IYDASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSNWPITF GQGTRLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQ WKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACE VTHQGLSSPVTKS FNRGEC，SEQ ID NO:2。

pH范围筛选

选取pH覆盖5.0～6.5范围的两种缓冲液：20mM组氨酸缓冲剂(His) 和20mM醋酸缓冲剂(NaAc)。对纯化后的抗CD20单克隆抗体1(抗体的重链如SEQ ID NO:1所示，抗体的轻链如SEQ ID NO:2所示)进行超滤换液，制备出pH为His5.5、His6.0、His6.5、NaAc5.0、NaAc5.5、NaAc6.0 的六组溶液样品，抗体浓度为18mg/mL，具体组成成分见表1。分装，进行高温试验(40℃)。

将样品分装后置于40℃条件下进行高温试验，于第0天、第1周、第 2周、第3周取样，进行SEC-HPLC、IEC-HPLC检测，结果见表2。

表1缓冲液组成信息

表2 40℃条件下不同pH样品SEC、IEC随着时间的变化情况

如表2所示，1)从SEC-HPLC单体纯度数据结可知，六组样品的SEC 单体纯度均呈现下降趋势，但是各组的下降幅度有明显区别，His6.0和 His5.5下降幅度最小，优于His6.5、NaAc5.5、NaAc5.0和NaAc6.0，His 缓冲液中pH5.5～pH6.0时的单体纯度稳定性较好；2)从IEC-HPLC主峰含量数据可知，His6.0、His5.5和NaAc6.0优于NaAc5.5、NaAc5.0和 His6.5，表明抗体样品在pH5.5～pH6.0的缓冲液中，IEC主峰含量稳定性较好。

综合SEC-HPLC和IEC-HPLC的结果，高温(40℃)条件下，抗体样品pH范围在5.5～6.0时，抗体样品的稳定性较好。

缓冲体系筛选

在pH5.5～pH6.0范围条件下，抗体的稳定性较好；故选取缓冲能力范围在pH5.5～pH6.0附近的缓冲液进行筛选试验。制备5种不同的缓冲液：琥珀酸-琥珀酸钠缓冲液(Sua)、柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液(CB)、磷酸缓冲液(PB)、组氨酸-组氨酸盐酸盐缓冲液(His)、醋酸-醋酸钠缓冲液 (NaAc)，见表3。将纯化后的抗CD20单克隆抗体1样品超滤换液到上述5种缓冲液中，调节浓度一致(抗体的浓度为20mg/mL)后，分装，置于40℃条件下进行高温试验，于第0天、第1周、第2周、第3周取样，分别进行SEC-HPLC、IEC-HPLC检测，结果见表4。

表3缓冲液组成信息

表4 40℃条件下不同缓冲液中抗体SEC、IEC随时间的变化情况

如表4所示，1)从SEC-HPLC单体纯度数据可知，五组样品的变化趋势基本一致，但是下降幅度有显著差异，His缓冲液最好，PB缓冲液相对较差，其他三组处于中间位置，相差不大；2)从IEC-HPLC主峰含量数据可知，抗体在40℃高温条件下不稳定，随着时间的增加，五组样品的主峰含量均有不同程度的下降，His缓冲液和NaAc缓冲液较好，优于其他组。

综合SEC-HPLC及IEC-HPLC的结果可知，高温(40℃)环境下，抗体样品在His缓冲液中，SEC-HPLC和IEC-HPLC的稳定性优于其他组缓冲液。

pH值优化筛选

(1)pH值优化筛选1

抗体样品在pH5.5～pH6.0附近的组氨酸缓冲液中稳定性较好，现对抗体样品进行pH值优化筛选试验，将纯化后的抗CD20单克隆抗体1样品进行超滤换液，制备出5个pH梯度的制剂处方：组氨酸缓冲液(pH5.6)、组氨酸缓冲液(pH5.8)、组氨酸缓冲液(pH6.0)、组氨酸缓冲液(pH6.2)、组氨酸缓冲液(pH6.4)。抗体浓度均调整至20mg/mL，将样品置于40℃条件下进行高温试验，于第0天、第1周、第2周、第3周取样，分别进行SEC-HPLC、IEC-HPLC检测，结果见表5。

表5不同pH条件下SEC-HPLC、IEC-HPLC随着时间的变化情况

如表5所示，1)从SEC-HPLC单体纯度数据可知，五组样品的变化趋势基本一致；2)从IEC-HPLC主峰含量数据可知，pH在5.6～6.2时，样品的IEC-HPLC主峰下降较缓，稳定性较好。

综合SEC-HPLC及IEC-HPLC的结果可知，缓冲液的pH在5.6～6.2 时，抗体样品的稳定性较好。

(2)pH值优化筛选2

从pH值优化筛选1可知，抗体样品的pH在5.6～6.2时稳定性比较好， pH超过6.2时IEC-HPLC表现比较差，但是无法确定pH低于5.6时样品稳定性，所以再次做pH筛选试验。由于His缓冲液pH受温度影响比较大，所以这次以柠檬酸-PB(C-P)为缓冲液，超滤换液6个不同pH的抗CD20 单克隆抗体1样品：pH5.0、pH5.3、pH5.6、pH5.9、pH6.2、pH6.5。将抗体样品置于40℃条件下进行高温试验，于第0天(D)、第1周(W)、第2 周、第3周取样，分别进行SEC-HPLC、IEC-HPLC检测，结果见表6。

表6不同pH条件下SEC-HPLC、IEC-HPLC随着时间的变化情况

如表6所示，1)从SEC-HPLC单体纯度数据可知，六组样品的变化趋势基本一致：高温条件下放置4周后，样品的单体纯度下降明显，pH<5.3 时样品单体纯度较差；2)从IEC-HPLC主峰含量数据可知，抗体样品在高温下不稳定，随着时间的延长，六组样品的主峰含量均有不同程度的下降，pH在5.6～6.5时，样品的IEC-HPLC主峰下降较缓，稳定性较好。

pH值是液体制剂处方中的一个关键因子，抗体在不同pH值的缓冲液中表现出不同的稳定性，但当pH值在某一个范围内波动时，并不会对抗体的质量产生显著性的影响。综合以上pH初筛和pH细筛研究初步判定，在pH 5.5～6.2范围内，抗体的稳定性较好。

稳定剂种类筛选

分别制备含氯化钠、蔗糖、海藻糖、甘露醇、山梨醇、精氨酸和甲硫氨酸七种稳定剂的抗CD20单克隆抗体1溶液，具体配方见表7；表7中 Tre(海藻糖)是指海藻糖二水合物。

表7不同稳定剂的配方

(1)高温试验

在高温(40℃)条件下，加有稳定剂的样品与未加稳定剂的样品进行对比试验，考察样品质量的变化情况，于第1周、第2周、第3周、第4 周取样进行SEC-HPLC检测，结果见表8。

表8不同稳定剂样品SEC-HPLC随着时间的变化情况

如表8所示，从SEC-HPLC单体纯度数据可知，八组样品的变化趋势基本一致，但是下降幅度略有不同，Tre、Sor和Suc三组样品最好。

(2)光照试验

对加有稳定剂的样品在光照条件下进行对比试验，考察样品质量的变化情况，于第1周、第2周取样进行SEC-HPLC、IEC-HPLC检测，结果见表9。

表9不同稳定剂样品SEC-HPLC、IEC-HPLC随着时间的变化情况

如表9所示，1)从SEC-HPLC单体纯度数据可知，八组样品的变化趋势基本一致，但是下降幅度略有不同，Met组样品下降最少，其次是Tre、 Suc等组样品；2)从IEC-HPLC主峰含量数据可知，抗体蛋白在光照条件下不稳定，随着时间的增加，八组样品的主峰含量均有不同程度的下降，从下降幅度来看，Met和Arg较好，其次是Tre、Suc和Sor等。

综合高温和光照的结果，海藻糖在SEC-HPLC和IEC-HPLC中表现均良好。

表面活性剂筛选

与生理盐水相容性试验

当抗体制剂采用静脉注射给药方式，临床上需要与生理盐水配伍，故进行此相容性试验。制备含不同浓度、不同种类表面活性剂的抗体样品溶液，具体配方见表10。样品溶液中的抗CD20单克隆抗体1浓度为 30mg/mL，分别取相同体积含不同浓度表面活性剂剂的样品溶液，按配伍比例(1mL样品：29mL生理盐水)加入到0.9％氯化钠溶液中，轻微、充分混匀后观察其性状，并对放置2h后的抗体溶液进行不溶性微粒检测，检测结果见图1。

表10抗体溶液配方

如图1所示，未加表面活性剂的空白组微粒数最高，而加有表面活性剂(聚山梨酯-80或聚山梨酯-20)的样品的微粒数普遍较低，且表面活性剂含量高一些时，微粒数略低；但当表面活性剂浓度到达一定程度后，样品的微粒数又会变大。当表面活性剂为聚山梨酯-80的浓度为0.02％时，制剂中微粒数较少。

震荡试验

样品在运输或转移过程中不可避免的会发生震荡，而震荡会加速蛋白聚集，制剂加入表面活性剂，可有效地防止蛋白聚集。制备含不同浓度、不同种类表面活性剂的抗CD20单克隆抗体1样品溶液，具体配方见表11。在在室温环境，以200rpm的转速将样品平躺放置在摇床上，对抗体溶液进行震荡试验。于第0h、第2h、第4h、第8h、第24h、第48h、第72h 对溶液进行灯检及浑浊度(OD340值)的检测，考察抗体溶液质量的变化情况，结果见图2(备注：OD值是在UV340nm对蛋白溶液进行检测所得到的数值)；表11中Tre(海藻糖)是指海藻糖二水合物。

表11抗体溶液配方

如图2所示，在震荡条件下放置4h后，空白样品和只加有6％Tre的样品开始出现浑浊，加有吐温的样品震荡至72h仍然保持澄明，说明聚山梨酯-80或聚山梨酯-20对样品在振荡条件下有一定的保护作用，可以防止蛋白聚集出现浑浊，起到增溶的作用；无论是聚山梨酯-80或聚山梨酯-20，在含量0.02％和0.03％的样品浊度是最低的，含量0.01％和0.04％的样品浊度相对较高，说明聚山梨酯含量不宜太少也不宜太高；0.02％聚山梨酯为优选。

反复冻融试验1

制备不同聚山梨酯(即吐温)含量及种类的抗CD20单克隆抗体1样品进行反复冻融试验(具体配方见表12，表12中Tre(海藻糖)是指海藻糖二水合物)，样品溶液在-80℃冷冻24h后，在25℃放置24h为一次冻融。对冻融后的样品进行不溶性微粒检测，结果见图3。

表12抗体溶液配方

如图3所示，在反复冻融5次后，加有吐温的样品微粒数明显比没加吐温的样品低，说明吐温在反复冻融过程中能有效地防止蛋白聚集。

实施例2

本发明提供一种含抗CD20单克隆抗体1的液体制剂，其由下浓度的组分组成：约15mg/ml抗CD20抗体，约10mM琥珀酸缓冲剂，约80mM 蔗糖，约0.1mg/ml聚山梨酯-20，液体制剂的pH值约为5.5。

实施例3

本发明提供一种含抗CD20单克隆抗体1的液体制剂，其由下浓度的组分组成：约40mg/ml抗CD20抗体，约15mM柠檬酸缓冲剂，约140mM 山梨醇，约0.3mg/ml聚山梨酯-80，液体制剂的pH值约为5.6。

实施例4

本发明提供一种含抗CD20单克隆抗体1的液体制剂，其由下浓度的组分组成：约60mg/ml抗CD20抗体，约26mM醋酸缓冲剂，约190mM 山梨醇，约0.35mg/ml聚山梨酯-20，液体制剂的pH值约为5.7。

实施例5

本发明提供一种含抗CD20单克隆抗体1的液体制剂，其由下浓度的组分组成：约70mg/ml抗CD20抗体，约26mM磷酸缓冲剂，约240mM 甲硫氨酸，约0.38mg/ml聚山梨酯-20，液体制剂的pH值约为6.0。

实施例6

本发明提供一种含抗CD20单克隆抗体1的液体制剂，其由下浓度的组分组成：约80mg/ml抗CD20抗体，约30mM磷酸缓冲剂，约158mM 甘露醇，约0.4mg/ml聚山梨酯-20，液体制剂的pH值约为6.2。

实施例7

本发明提供一种含抗CD20单克隆抗体1的液体制剂，其由以下浓度的组分组成：约20mg/ml抗CD20抗体，约20mM组氨酸缓冲剂，约158.6 mM海藻糖，约20mg/ml聚山梨酯-80，液体制剂的pH值约为5.8；基于 pH值为5.8，组氨酸缓冲剂中L-组氨酸和L-组氨酸盐酸盐的物质量的比为2:3。

实施例8

本发明提供一种含抗CD20单克隆抗体1的液体制剂，其由以下浓度的组分组成：约20mg/ml抗CD20抗体，约20mM组氨酸缓冲剂，约224.6 mM海藻糖，约0.2mg/ml聚山梨酯-80，液体制剂的pH值约为5.8；基于 pH值为5.8，组氨酸缓冲剂中L-组氨酸和L-组氨酸盐酸盐的物质量的比为2:3。

实施例9

本发明提供一种含抗CD20单克隆抗体1的液体制剂，其由以下浓度的组分组成：约50mg/ml抗CD20抗体，约20mM组氨酸缓冲剂，约224.6 mM海藻糖，约0.2mg/ml聚山梨酯-80，液体制剂的pH值约为5.8；基于 pH值为5.8，组氨酸缓冲剂中L-组氨酸和L-组氨酸盐酸盐的物质量的比为2:3。

实施例10

本发明提供一种含抗CD20单克隆抗体1的液体制剂，其由以下浓度的组分组成：约30mg/ml抗CD20抗体，约18mM组氨酸缓冲剂，约170 mM海藻糖，约0.18mg/ml聚山梨酯-80，液体制剂的pH值约为5.7。

实施例11

本发明提供一种含抗CD20单克隆抗体1的液体制剂，其由以下浓度的组分组成：约40mg/ml抗CD20抗体，约19mM组氨酸缓冲剂，约225 mM海藻糖，约0.19mg/ml聚山梨酯-80，液体制剂的pH值约为5.9。

实施例12

本发明提供一种含抗CD20单克隆抗体1的液体制剂，其由以下浓度的组分组成：约46mg/ml抗CD20抗体，约22mM组氨酸缓冲剂，约220 mM海藻糖，约0.22mg/ml聚山梨酯-80，液体制剂的pH值约为6.0。

稳定性对比

以CN101820912B专利公开的处方(抗体浓度为20mg/mL，处方A)、对比配方(与CN101820912B处方辅料相同，但其抗体为单克隆抗体1，处方B)、处方1(实施例6)、处方2(实施例7)、处方3(实施例8)和处方4(其抗体为单克隆抗体1，抗体浓度为100mg/mL)为研究对象进行稳定检测，配方见表13。

表13制剂配方

1)溶解温度、聚集温度和粒径

表14溶解温度、聚集温度和粒径

如表14所示，1)将原研处方A中抗CD20抗体替换为抗体1，两制剂的Tm1、Tagg、DLS(粒径与均一度)基本没有差别；2)与原研处方 A相比，处方1制剂的Tm1和Tagg都高，粒径的PDI满足小于0.25以下，均一度好，可见处方1制剂的稳定性好；3)将海藻糖从158.6mM调到224.6mM，其他不变，处方2和处方3制剂的Tm1、Tagg、DLS与处方1 制剂基本一致，稳定性相对较好。

2)40℃高温试验测定

将制剂分装后置于40℃条件下进行高温试验，于第0天、第1周、第 2周、第3周和第4周取样，进行SEC-HPLC，结果见表15。

如表15所示，从SEC-HPLC单体纯度数据可知，处方1、处方2和处方3制剂的单体纯度稳定性较好；尤其与处方B相比，处方1、下处方 2的稳定性更好。

表15制剂单体纯度随着时间的变化情况

3)光照试验测定

将制剂分装后置于光照条件下进行试验，于第0天、第5天、和第10 天取样，进行SEC-HPLC，结果见表16。

如表16所示，从SEC-HPLC单体纯度数据可知，处方1、处方2和处方3制剂的单体纯度稳定性较好；尤其与处方B相比，处方1、处方2 的稳定性更好。

表16制剂单体纯度随着时间的变化情况

相容性检测

通过加速稳定性试验以及长期稳定性试验，得出本发明液体制剂与药瓶具有有良好的相容性，符合包装的要求。

序列表

<110> 百奥泰生物制药股份有限公司

<120> 抗CD20抗体制剂及其应用

<130> 2019.9.24

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 452

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Asp Tyr

20 25 30

Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Thr Ile Ser Trp Asn Ser Gly Ser Ile Gly Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Lys Ser Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Lys Asp Ile Gln Tyr Gly Asn Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp

100 105 110

Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro

115 120 125

Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Gly Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Thr

130 135 140

Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr

145 150 155 160

Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro

165 170 175

Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr

180 185 190

Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn

195 200 205

His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser

210 215 220

Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu

225 230 235 240

Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu

245 250 255

Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser

260 265 270

His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu

275 280 285

Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr

290 295 300

Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn

305 310 315 320

Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro

325 330 335

Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln

340 345 350

Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val

355 360 365

Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val

370 375 380

Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro

385 390 395 400

Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr

405 410 415

Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val

420 425 430

Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu

435 440 445

Ser Pro Gly Lys

450

<210> 2

<211> 214

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Asn Trp Pro Ile

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala

100 105 110

Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly

115 120 125

Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala

130 135 140

Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln

145 150 155 160

Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser

165 170 175

Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr

180 185 190

Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser

195 200 205

Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210

Claims

1.一种含抗CD20抗体的液体制剂，其特征在于，包含以下浓度的组分：15～80mg/ml抗CD20抗体，10～30mM缓冲剂，80～240mM稳定剂，0.1～0.4mg/ml表面活性剂，液体制剂的pH值为5.5～6.2；

所述缓冲剂选自琥珀酸缓冲剂、柠檬酸缓冲剂、磷酸缓冲剂、组氨酸缓冲剂和醋酸缓冲剂；

所述稳定剂选自蔗糖、海藻糖、山梨醇、甘露醇和甲硫氨酸；

所述表面活性剂选自聚山梨酯-80和聚山梨酯-20。

2.如权利要求1所述的液体制剂，其特征在于，所述抗CD20抗体选自单克隆抗体和与CD20结合的片段。

3.如权利要求2所述的液体制剂，其特征在于，所述抗CD20抗体的重链包含SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列或与所述SEQ ID NO:1具有至少90％同一性的氨基酸序列，所述抗CD20抗体的轻链包含SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列或与所述SEQ ID NO:2具有至少90％同一性的氨基酸序列。

4.如权利要求1～3任一项所述的液体制剂，其特征在于，液体制剂包含20～50mg/ml的抗CD20抗体。

5.如权利要求1～3任一项所述的液体制剂，其特征在于，液体制剂包含18～22mM的组氨酸缓冲剂。

6.如权利要求1～3任一项所述的液体制剂，其特征在于，液体制剂包含158～225mM的海藻糖。

7.如权利要求1～3任一项所述的液体制剂，其特征在于，液体制剂包含0.18～0.22mg/ml的聚山梨酯-80。

8.如权利要求1～3任一项所述的液体制剂，其特征在于，液体制剂的pH值为5.7～5.9。

9.如权利要求1所述的液体制剂，其特征在于，包含以下浓度的组分：20mg/ml抗CD20抗体，20mM组氨酸缓冲剂，158.6mM海藻糖，0.2mg/ml聚山梨酯-80，液体制剂的pH值为5.8。

10.如权利要求1所述的液体制剂，其特征在于，包含以下浓度的组分：20mg/ml抗CD20抗体，20mM组氨酸缓冲剂，224.6mM海藻糖，0.2mg/ml聚山梨酯-80，液体制剂的pH值为5.8。

11.如权利要求1所述的液体制剂，其特征在于，包含以下浓度的组分：50mg/ml抗CD20抗体，20mM组氨酸缓冲剂，224.6mM海藻糖，0.2mg/ml聚山梨酯-80，液体制剂的pH值为5.8。

12.一种用于治疗哺乳动物中涉及细胞表达CD20的疾病的方法，其特征在于，包括给药有效剂量的如权利要求1～11任一项所述的液体制剂。

13.如权利要求12所述的方法，其特征在于，哺乳动物给药的方式为静脉内或皮下注射。

14.如权利要求13所述的方法，其特征在于，当哺乳动物采用注射的给药方式时，所述液体制剂包含以下浓度的组分：20mg/ml抗CD20抗体，20mM组氨酸缓冲剂，158.6mM海藻糖，0.2mg/ml聚山梨酯-80，液体制剂的pH值为5.8。

15.如权利要求13所述的方法，其特征在于，当哺乳动物采用注射的给药方式时，所述液体制剂包含以下浓度的组分：20mg/ml抗CD20抗体，20mM组氨酸缓冲剂，224.6mM海藻糖，0.2mg/ml聚山梨酯-80，液体制剂的pH值为5.8。

16.如权利要求13所述的方法，其特征在于，当哺乳动物采用注射的给药方式时，所述液体制剂包含以下浓度的组分：50mg/ml抗CD20抗体，20mM组氨酸缓冲剂，224.6mM海藻糖，0.2mg/ml聚山梨酯-80，液体制剂的pH值为5.8。

17.如权利要求12～16所述的方法，其特征在于，所述涉及细胞表达CD20的疾病选自致瘤性疾病、免疫性疾病。

18.如权利要求17所述的方法，其特征在于，所述致瘤性疾病包括B细胞淋巴瘤，B细胞淋巴瘤包括霍奇金淋巴瘤和非霍奇金淋巴瘤；所述免疫性疾病包括多发性硬化症、免疫性血小板减少症、视神经脊髓炎、重症肌无力、类风湿性关节炎、银屑病和银屑病性关节炎。

19.如权利要求1～11任一项所述的液体制剂在制备用于治疗哺乳动物中涉及细胞表达CD20的疾病的药物中的应用，其特征在于，所述涉及细胞表达CD20的疾病选自致瘤性疾病、免疫性疾病。

20.如权利要求19所述的应用，其特征在于，所述致瘤性疾病包括B细胞淋巴瘤，B细胞淋巴瘤包括霍奇金淋巴瘤和非霍奇金淋巴瘤；所述免疫性疾病包括多发性硬化症、免疫性血小板减少症、视神经脊髓炎、重症肌无力、类风湿性关节炎、银屑病和银屑病性关节炎。